Name: Bioluminescencja i obrazowanie w bliskiej podczerwieni zapalenia nerwu wzrokowego i zapalenia mózgu w modelu EAE stwardnienia rozsianego u myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-01T10:10:00.000+00:00
Duration: 8 min 5 s
Description: Poznaj bioluminescencyjne obrazowanie zapalenia nerwu wzrokowego i mózgu w modelu EAE stwardnienia rozsianego u myszy. Ta metoda umożliwia wizualizację i ilościową ocenę postępu choroby oraz skuteczności terapii w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Te badania były wspierane przez Deutsche Forschungsgemeinschaft (CRC1039 A3) oraz program finansowania badań "Landesoffensive zur Entwicklung wissenschaftlich-ökonomischer Exzellenz" (LOEWE) kraju związkowego Hesja, Centrum Badawcze Medycyny Translacyjnej i Farmakologii TMP oraz Fundację Else Kröner-Fresenius (EKFS), Research Training Group Translational Research Innovation - Pharma (TRIP).

1. Indukcja EAE u myszy SJL/J
<ol>
	<li>Myszy
	<ol>
		<li>Użyj 11-tygodniowych samic myszy SJL/J i pozwól im przyzwyczaić się do pomieszczenia eksperymentalnego przez około 7 dni. Użyj n = 10 myszy na grupę.</li>
		<li>W celu oceny działania leku, lek i placebo należy podawać grupie kontrolnej w sposób ciągły przez wodę do picia lub granulki żywności, począwszy od 3 lub 5 dni po szczepieniu (n = 10 na grupę). W szczytowym okresie choroby podawaj leki lub placebo z mlekiem lub płatkami kukurydzianymi nasączonymi 3% cukrem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Materiał uodparniający
	<ol>
		<li>Użyć zestawu indukcyjnego EAE składającego się z antygenu (peptyd białka proteolipidowego, PLP139-151, emulsja 1 mg/ml) w emulsji z kompletnym adiuwantem Freunda (CFA, zabijane termicznie Mycobacterium tuberculosis H37 Ra) i 2 fiolkami (po 5 μg każda) liofilizowanej toksyny krztuśca (PTX).</li>
		<li>Rozpuścić PTX (2 μg/ml) w 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS; tj. dodać 1,5 ml PBS do każdej probówki PTX, dobrze wymieszać, usunąć tą samą końcówką pipety i dodać do 1 ml PBS w probówce o pojemności 50 ml); Dobrze wymieszaj.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>immunizacja
	<ol>
		<li>Wstrzyknąć PLP/CFA podskórnie w 2 porcjach, każda po 100 μl, obie u podstawy ogona. Nie należy wstrzykiwać leku w tylną część szyi, ponieważ jakiekolwiek reakcje immunologiczne w skórze w górnej części pleców lub szyi mogą zakłócić obrazowanie głowy i rdzenia kręgowego.</li>
		<li>Wstrzyknąć 100 μl PTX dootrzewnowo (i.p.), dwa razy na mysz, pierwsze 1-2 godziny po szczepieniu, a drugie po 24 godzinach.</li>
		<li>W przypadku myszy kontrolnych wstrzyknąć CFA bez PLP (2 porcje po 100 μl) oraz PTX bez PLP.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Postępowanie z myszami po szczepieniu
	<ol>
		<li>Waż myszy co drugi dzień do 7 dnia, a następnie waż je codziennie. 
		UWAGA: Myszy tracą około 1 - 2 g masy ciała podczas EAE. Spadek ten oznacza początek EAE.</li>
		<li>Oceniaj objawy kliniczne codziennie od 7 dnia zgodnie ze standardowymi systemami punktacji (tj. Wynik 0: brak oczywistych zmian w funkcjach motorycznych; wynik 0,5: dystalny paraliż ogona; wynik 1: całkowity paraliż ogona; wynik 1,5: łagodny niedowład jednej lub obu tylnych nóg; wynik 2: ciężki niedowład tylnych nóg; wynik 2,5: całkowity paraliż jednej tylnej nogi; wynik 3: całkowity paraliż obu tylnych nóg; Wynik 3,5: całkowity paraliż tylnych nóg i niedowład jednej przedniej nogi. Eutanazja myszy z wynikiem 3,5 lub wyższym przez > 12 godzin.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przebieg EAE i czas obrazowania
	<ol>
		<li>Pierwsze obrazowanie należy wykonać na początku choroby, gdy myszy osiągną wynik > 1, co nastąpi około 10 - 12 dnia po szczepieniu.</li>
		<li>Drugie obrazowanie należy wykonać w szczytowym momencie, który zostanie osiągnięty 1 lub 2 dni po wystąpieniu początkowych objawów i będzie utrzymywał się przez 1 - 3 dni. 
		UWAGA: Następnie myszy w pełni wyzdrowieją w ciągu 7 do 10 dni. Obrazowanie w odstępach czasu może nadal wykazywać przecieki naczyniowe, ale wskaźniki stanu zapalnego powinny być ujemne.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Bioluminescencyjne i w bliskiej podczerwieni obrazowanie zapalenia nerwu wzrokowego i zapalenia mózgu
<ol>
	<li>Konfiguracja systemu obrazowania
	<ol>
		<li>Wykonuj obrazowanie in vivo za pomocą dowolnego sprzętu, który pozwala na analizę sygnałów bioluminescencyjnych i bliskiej podczerwieni.</li>
		<li>Utrzymuj myszy poniżej 2 - 2,5% znieczulenia izofluranem podczas wszystkich procedur obrazowania.</li>
		<li>Umieść jedną lub dwie myszy obok siebie w aparacie, korzystając ze środkowego dopływu gazu. Ustaw górny kręgosłup pośrodku.</li>
		<li>Użyj dwóch myszy jednocześnie, po jednej na grupę, do oceny efektów leków w celu porównania par. Jest to ważne dla obrazowania bioluminescencyjnego.</li>
		<li>Osłoń miejsce szczepienia czarną szmatką i zrób zdjęcie oraz obraz bazowy, aby ocenić prawidłowe ułożenie myszy/myszy. W przypadku wszystkich zdjęć należy używać ostrości B z odległością 6.5 cm od aparatu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Iniekcja i obrazowanie bioluminescencyjnej sondy zapalnej
	<ol>
		<li>Użyj ustawień systemu obrazowania in vivo: Epi-BLI, filtr Em otwarty, blok filtra Ex, fstop 1, binning 8, ostrość B = 6,5 cm, ekspozycja ad 120 s; wykonaj zdjęcie bazowe.</li>
		<li>Wstrzyknąć 100 μl i.p. gotowego do użycia odczynnika chemiluminescencyjnego (40 mg/ml). Dobrze wymieszać przed napełnieniem strzykawki.</li>
		<li>Uchwyć obrazy bioluminescencji 5, 10 i 15 minut po wstrzyknięciu. Przebieg w czasie piku bioluminescencyjnego różni się u poszczególnych zwierząt. 
		UWAGA: Szczyt nastąpi 5 - 10 minut po wstrzyknięciu; Spadek po 15 minutach oznacza, że nie są wymagane żadne dalsze obrazy. Użyj par myszy w grupach kontrolnych i leczonych, aby wyeliminować drobne odchylenia wynikające z różnych przebiegów czasowych.</li>
		<li>Uzupełnij opisy związane z eksperymentem. Obserwuj, jak automatycznie pojawia się wyskakujące okno dialogowe; Zawiera informacje, takie jak szczep myszy, płeć, punkt czasowy, czas wstrzyknięcia sondy, grupa itp. Zapisz wszystkie pliki w jednym folderze; Będą one zawierały znaczniki czasu i wszystkie opisy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wstrzykiwanie i obrazowanie nanocząstek fluorescencyjnych w bliskiej podczerwieni w celu zapewnienia integralności BBB
	<ol>
		<li>Użyj obrazowania epifluorescencji w bliskiej podczerwieni w ognisku B (odległość: 6,5 cm). Maksima wzbudzenia/emisji pegylowanych nanocząstek fluorescencyjnych wynoszą 675/690 nm. Uchwyć dwa obrazy na różnych długościach fal, przy Ex640/Em700 i Ex675/Em720; Użyj ekspozycji 2-s, binningu 8 i fstop 2. Wykonaj obraz linii bazowej.</li>
		<li>Wstrzyknij 70 μl pegylowanych fluorescencyjnych nanocząstek podczerwieni dożylnie przez żyłę ogonową i wyobraź sobie myszy 3 godziny i 24 godziny po wstrzyknięciu, korzystając z powyższych ustawień. Dobrze wymieszać roztwór przed napełnieniem strzykawki.</li>
		<li>Wstrzyknij 0,9% chlorku sodu myszom kontrolnym, który będzie potrzebny do oceny swoistości sygnału.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wstrzykiwanie i obrazowanie sondy fluorescencyjnej w bliskiej podczerwieni pod kątem aktywności MMP
	<ol>
		<li>Ostrożnie ogol lub wypiluj okolicę głowy i górnego odcinka kręgosłupa na dzień przed wykonaniem zdjęcia podstawowego. Skóra nie może być uszkodzona.</li>
		<li>Użyj obrazowania epifluorescencji w bliskiej podczerwieni w ognisku B (odległość: 6,5 cm). Maksima wzbudzenia/emisji sondy aktywowanej MMP wynoszą 680/700 nm. Uchwyć dwa obrazy na różnych długościach fal, przy Ex640/Em700 i Ex675/Em720; Użyj ekspozycji 1-S, binningu 8 i fstop 2. Wykonaj obraz linii bazowej.</li>
		<li>Dodaj 200 μl 1x PBS do 1,5 ml probówki gotowego do użycia roztworu (20 nmol/1,5 ml w 1x PBS), tak aby wystarczyło dla 10 myszy; dobrze wymieszaj przed napełnieniem strzykawki. 
		UWAGA: Podana objętość nie uwzględnia faktu, że część objętości jest tracona podczas napełniania strzykawki i wstrzykiwania.</li>
		<li>Wstrzyknąć 150 μl sondy dożylnie przez żyłę ogonową 24 godziny przed obrazowaniem. PBS należy wstrzykiwać tylko zwierzętom kontrolnym w celu oceny swoistości sygnału.</li>
		<li>Po 24 godzinach od wstrzyknięcia wykonaj zdjęcia Epi-FL co najmniej na dwóch długościach fali, Ex640/Em700 i Ex 675/Em720, z ustawieniami opisanymi powyżej (ekspozycja 1 s, ostrość B, binning 8 i fstop 2). 
		UWAGA: Zastosowanie dwóch długości fal pozwala na rozmieszanie widma poprzez odjęcie sygnału niespecyficznego.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Analizy obrazów
<ol>
	<li>Analiza bioluminescencyjna (BLI)
	<ol>
		<li>Kliknij dwukrotnie oprogramowanie, aby je otworzyć.</li>
		<li>Na górnym pasku menu kliknij ikonę przeglądarki plików, przejdź do katalogu folderu eksperymentu i wybierz go; spowoduje to otwarcie wszystkich plików w folderze w tabeli.</li>
		<li>Skonfiguruj kolumny z opisami istotnymi dla eksperymentu.</li>
		<li>W celu kontroli jakości kliknij dwukrotnie plik myszy bez odpowiedzi bez objawów EAE i/lub myszy naiwnej, aby sprawdzić specyficzność sygnałów EAE. 
		UWAGA: U myszy nieleczonych wcześniej nie powinno być sygnału, a u myszy niereagujących na sygnał powinien być minimalny.
		<ol>
			<li>Sprawdź obraz linii bazowej przed wstrzyknięciem sondy dla każdej myszy jako dalszą kontrolę specyficzności sygnału; powinien być negatywny.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Aby wybrać obraz, kliknij dwukrotnie pierwszy plik pierwszej myszy EAE i sprawdź intensywność bioluminescencji (zakres pasków LUT) oraz lokalizację. Sprawdź wszystkie obrazy jeden po drugim. Zamknij plik z najniższą intensywnością dla każdej myszy (tj. zachowaj 2 z 3 obrazów dla każdej myszy).</li>
		<li>Regulacja i eksport obrazu
		<ol>
			<li>Kliknij dwukrotnie pierwszy plik, który ma zostać określony ilościowo. Obserwuj, jak pojawia się nowe wyskakujące okienko. W sekcji "opcje" (górne menu) dostosuj etykiety, które mają być wyświetlane na każdym obrazie.</li>
			<li>W prawej palecie narzędzi przejdź do "dopasowania obrazu". Domyślnie minimalne i maksymalne intensywności są ustawione na "auto" i wyświetlane w pseudokolorze tęczy. Wybierz "ręcznie", aby w razie potrzeby zmienić ustawienia. 
			UWAGA: Na przykład wszystkie eksportowane obrazy mogą mieć identyczne paski LUT (identyczne minima i maksima), aby można je było łatwo porównać. Korekta minimów i maksimów nie ma wpływu na wyniki ilościowe.</li>
			<li>Kliknij eksport obrazu, wybierz png, katalog i nazwę obrazu</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Kwantyfikacja regionów zainteresowania (ROI)
		<ol>
			<li>Przejdź do narzędzia "ROI" w palecie narzędzi. Wybierz metodę ROI (okrągła, prostokątna, automatyczna lub odręczna) oraz liczbę ROI. Obserwuj, jak w oknie obrazu pojawia się okno ROI.</li>
			<li>Za pomocą myszy dostosuj rozmiar i położenie. Użyj identycznych progów ROI dla wszystkich obrazów, jeśli używane jest narzędzie do automatycznego zwrotu z inwestycji. Użyj identycznych obszarów dla wszystkich obrazów, jeśli rozmiary i pozycje ROI są definiowane ręcznie (np. okrągłe ROI).</li>
			<li>Kliknij "zmierz RO.I. Obserwuj, jak pojawia się nowe okno. Dostosuj kolumny (np. nazwa pliku, liczba zwierząt, grupa, eksperyment, obszar, całkowita liczba, średnia liczba, liczba SD, minimalna i maksymalna liczba, obszar, punkt czasowy, czas wstrzyknięcia sondy itp.). Zapisz dostosowane ustawienia. Gdy wszystko będzie gotowe, zaznacz wszystko (Ctrl + A), a następnie skopiuj i wklej tabelę do arkusza kalkulacyjnego.</li>
			<li>Wyeksportuj obraz jako png z ustawionymi zwrotami akcji. Zapisz i zamknij plik obrazu.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Powtórz procedurę (kroki 3.1.6 - 3.1.7) dla wszystkich plików obrazów, które wymagają ilościowego określenia. Skopiuj wszystkie kwantyfikacje zwrotu z inwestycji do arkusza kalkulacyjnego. 
		UWAGA: Tutaj wyniki można sortować według grupy, punktu czasowego itp. i analizować statystycznie. Do analiz statystycznych należy wykorzystać łączną liczbę sygnałów bioluminescencyjnych w ROI.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analiza nanocząstek fluorescencyjnych w bliskiej podczerwieni (NIR)
	<ol>
		<li>Korzystając z elementów sterujących w oprogramowaniu, dostosuj próg obrazu. 
		UWAGA: Nie ma to wpływu na wynik ilościowy.</li>
		<li>Porównaj wizualnie obrazy zarejestrowane w Ex/Em 675/720 i Ex/Em 640/700, aby ocenić specyficzność sygnału.</li>
		<li>Do analizy ilościowej należy wykorzystać obrazy wykonane w Ex/Em 675/720 (maksimum wzbudzenia: 680 nm). Zdefiniuj ROI, dla których można użyć narzędzia do automatycznego zwrotu z inwestycji. Dostosuj próg automatycznego zwrotu z inwestycji i używaj go dla wszystkich obrazów. Określ ilościowo całkowitą wydajność promieniowania w ROI (patrz krok 3.1).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analiza w bliskiej podczerwieni (NIR) sondy czułej na proteazę
	<ol>
		<li>Korzystając z elementów sterujących oprogramowania, dostosuj próg obrazu. 
		UWAGA: Nie ma to wpływu na wynik ilościowy. Wykonaj demieszanie widmowe autofluorescencji. Narzędzie do rozłączania jest zaimplementowane w Living Image. Automatyczne rozmieszawanie wykorzystuje Ex/Em 640/700 jako obraz specyficzny i 675/720 jako obraz autofluorescencyjny.</li>
		<li>Wybierz niezmieszany obraz i zdefiniuj ROI, jak opisano powyżej. Wykorzystaj całkowitą wydajność promieniowania w ROI do analiz ilościowych i statystycznych.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Compston, A., Coles, A. <a target="_blank" href="http://www.thelancet.com/journals/lancet/article/PIIS0140-6736(08)61620-7/abstract">Multiple sclerosis.</a> Lancet. 372 (9648), 1502-1517 (2008).</li>
<li>Dunn, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+mobility+impairment+on+the+burden+of+caregiving+in+individuals+with+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Rev+Pharmacoecon+Outcomes+Res%22%5BJournal%5D)">Impact of mobility impairment on the burden of caregiving in individuals with multiple sclerosis.</a> Expert Rev Pharmacoecon Outcomes Res. 10 (4), 433-440 (2010).</li>
<li>Dutta, R., Trapp, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+neuronal+dysfunction+and+degeneration+in+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of neuronal dysfunction and degeneration in multiple sclerosis.</a> Prog Neurobiol. 93 (1), 1-12 (2011).</li>
<li>Sawcer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+risk+and+a+primary+role+for+cell-mediated+immune+mechanisms+in+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genetic risk and a primary role for cell-mediated immune mechanisms in multiple sclerosis.</a> Nature. 476 (7359), 214-219 (2011).</li>
<li>Schmitz, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((R-flurbiprofen+attenuates+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">R-flurbiprofen attenuates experimental autoimmune encephalomyelitis in mice.</a> EMBO Mol Med. 6 (11), 1398-1422 (2014).</li>
<li>Balls, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+origins+and+early+days+of+the+Three+Rs+concept%5BTitle%5D)+AND+%22Altern+Lab+Anim%22%5BJournal%5D)">The origins and early days of the Three Rs concept.</a> Altern Lab Anim. 37 (3), 255-265 (2009).</li>
<li>Barthelmes, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+Experimental+Autoimmune+Encephalomyelitis+in+Mice+and+Evaluation+of+the+Disease-dependent+Distribution+of+Immune+Cells+in+Various+Tissues%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Induction of Experimental Autoimmune Encephalomyelitis in Mice and Evaluation of the Disease-dependent Distribution of Immune Cells in Various Tissues.</a> J Vis Exp. (111), (2016).</li>
<li>Leahy, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+trajectory+of+osteoarthritis+development+in+a+mouse+model+by+serial+near-infrared+fluorescence+imaging+of+matrix+metalloproteinase+activities%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Rheumatol%22%5BJournal%5D)">Analysis of the trajectory of osteoarthritis development in a mouse model by serial near-infrared fluorescence imaging of matrix metalloproteinase activities.</a> Arthritis Rheumatol. 67 (2), 442-453 (2015).</li>
<li>Scales, H. E., et al. Assessment of murine collagen-induced arthritis by longitudinal non-invasive duplexed molecular optical imaging. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aScales%2C+HE+%22Rheumatology+%28Oxford%29%22">Rheumatology (Oxford)</a>. 55 (3), 564-572 (2016).</li>
<li>Nahrendorf, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+channel+optical+tomographic+imaging+of+leukocyte+recruitment+and+protease+activity+in+the+healing+myocardial+infarct%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Dual channel optical tomographic imaging of leukocyte recruitment and protease activity in the healing myocardial infarct.</a> Circ Res. 100 (8), 1218-1225 (2007).</li>
<li>Eaton, V. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+tomographic+imaging+of+near+infrared+imaging+agents+quantifies+disease+severity+and+immunomodulation+of+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Optical tomographic imaging of near infrared imaging agents quantifies disease severity and immunomodulation of experimental autoimmune encephalomyelitis in vivo.</a> J Neuroinflammation. 10, (2013).</li>
<li>Kandagaddala, L. D., Kang, M. J., Chung, B. C., Patterson, T. A., Kwon, O. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+activation+of+matrix+metalloproteinase-9+and+NADPH+oxidase+in+tissues+and+plasma+of+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Toxicol+Pathol%22%5BJournal%5D)">Expression and activation of matrix metalloproteinase-9 and NADPH oxidase in tissues and plasma of experimental autoimmune encephalomyelitis in mice.</a> Exp Toxicol Pathol. 64 (1-2), 109-114 (2012).</li>
<li>Wang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+fluorescence+imaging+of+myelination%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">In situ fluorescence imaging of myelination.</a> J Histochem Cytochem. 58 (7), 611-621 (2010).</li>
<li>Wang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.jneurosci.org/content/31/7/2382">Longitudinal near-infrared imaging of myelination.</a> J Neurosci. 31 (7), 2382-2390 (2011).</li>
<li>Engelhardt, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+involved+in+T+cell+migration+across+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neural+Transm%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms involved in T cell migration across the blood-brain barrier.</a> J Neural Transm. 113 (4), 477-485 (2006).</li>
<li>Badawi, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+of+EAE+and+prevention+of+blood-brain+barrier+breakdown+after+vaccination+with+novel+bifunctional+peptide+inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">Suppression of EAE and prevention of blood-brain barrier breakdown after vaccination with novel bifunctional peptide inhibitor.</a> Neuropharmacology. 62 (4), 1874-1881 (2012).</li>
<li>Simmons, S. B., Pierson, E. R., Lee, S. Y., Goverman, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+the+heterogeneity+of+multiple+sclerosis+in+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+immunology%22%5BJournal%5D)">Modeling the heterogeneity of multiple sclerosis in animals.</a> Trends in immunology. 34 (8), 410-422 (2013).</li>
<li>Lin, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diffusion+fMRI+detects+white-matter+dysfunction+in+mice+with+acute+optic+neuritis%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Dis%22%5BJournal%5D)">Diffusion fMRI detects white-matter dysfunction in mice with acute optic neuritis.</a> Neurobiol Dis. 67, 1-8 (2014).</li>
<li>Knier, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutralizing+IL-17+protects+the+optic+nerve+from+autoimmune+pathology+and+prevents+retinal+nerve+fiber+layer+atrophy+during+experimental+autoimmune+encephalomyelitis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Autoimmun%22%5BJournal%5D)">Neutralizing IL-17 protects the optic nerve from autoimmune pathology and prevents retinal nerve fiber layer atrophy during experimental autoimmune encephalomyelitis.</a> J Autoimmun. 56, 34-44 (2015).</li>
<li>Schellenberg, A. E., Buist, R., Yong, V. W., Del Bigio, M. R., Peeling, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetic+resonance+imaging+of+blood-spinal+cord+barrier+disruption+in+mice+with+experimental+autoimmune+encephalomyelitis%5BTitle%5D)+AND+%22Magn+Reson+Med%22%5BJournal%5D)">Magnetic resonance imaging of blood-spinal cord barrier disruption in mice with experimental autoimmune encephalomyelitis.</a> Magn Reson Med. 58 (2), 298-305 (2007).</li>
<li>Mori, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+pathological+alterations+of+lower+lumbar+cords+detected+by+ultrahigh-field+MRI+in+a+mouse+multiple+sclerosis+model%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Immunol%22%5BJournal%5D)">Early pathological alterations of lower lumbar cords detected by ultrahigh-field MRI in a mouse multiple sclerosis model.</a> Int Immunol. 26 (2), 93-101 (2014).</li>
<li>Bittner, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+TWIK-related+potassium+channel-1+%28TREK1%29+regulates+immune-cell+trafficking+into+the+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Endothelial TWIK-related potassium channel-1 (TREK1) regulates immune-cell trafficking into the CNS.</a> Nat Med. 19 (9), 1161-1165 (2013).</li>
<li>Theien, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+effects+of+treatment+with+a+small-molecule+VLA-4+antagonist+before+and+after+onset+of+relapsing+EAE%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Differential effects of treatment with a small-molecule VLA-4 antagonist before and after onset of relapsing EAE.</a> Blood. 102 (13), 4464-4471 (2003).</li>
<li>Hawkins, B. T., Davis, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+blood-brain+barrier%2Fneurovascular+unit+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol+Rev%22%5BJournal%5D)">The blood-brain barrier/neurovascular unit in health and disease.</a> Pharmacol Rev. 57 (2), 173-185 (2005).</li>
<li>Coisne, C., Mao, W., Engelhardt, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutting+edge%3A+Natalizumab+blocks+adhesion+but+not+initial+contact+of+human+T+cells+to+the+blood-brain+barrier+in+vivo+in+an+animal+model+of+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cutting edge: Natalizumab blocks adhesion but not initial contact of human T cells to the blood-brain barrier in vivo in an animal model of multiple sclerosis.</a> J Immunol. 182 (10), 5909-5913 (2009).</li>
<li>Andresen, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+intravital+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">High-resolution intravital microscopy.</a> PLoS One. 7 (12), e50915(2012).</li>
<li>Bukilica, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stress-induced+suppression+of+experimental+allergic+encephalomyelitis+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Stress-induced suppression of experimental allergic encephalomyelitis in the rat.</a> Int J Neurosci. 59 (1-3), 167-175 (1991).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Prezentowany film przedstawia techniki obrazowania bioluminescencji i fluorescencji w bliskiej podczerwieni in vivo EAE u myszy SJL/J. Pokazujemy, że obrazowanie bioluminescencyjne przy użyciu sondy wrażliwej na stan zapalny pokazuje głównie zapalenie nerwu wzrokowego, a kwantyfikacja zgadza się z kliniczną oceną ciężkości EAE i skutków leków. Jednak metoda obrazowania bioluminescencyjnego nie była w stanie wykryć stanu zapalnego lędźwiowego rdzenia kręgowego, który jest głównym miejscem manifestacji EAE<sup cla...

Stwardnienie rozsiane jest spowodowane przez autoimmunologiczny atak i zniszczenie osłonki mielinowej w mózgu i rdzeniu kręgowym1. Z ogólną częstością występowania około 3,6 przypadków na 100 000 osób rocznie u kobiet i około 2,0 u mężczyzn, stwardnienie rozsiane jest drugą najczęstszą przyczyną niepełnosprawności neurologicznej u młodych dorosłych, po urazach urazowych2,3. Do patologii choroby przyczyniają się czynniki genetyczne i środowiskowe4, ale nadal nie jest w pełni poznana. Autoreaktywne limfocyty T dostają się do ośrodkowego układu nerwowego i wywołują kaskadę zapalną, która powoduje ogniskowe nacieki w istocie białej mózgu, rdzenia kręgowego i nerwu wzrokowego. W większości przypadków nacieki te są początkowo odwracalne, ale trwałość wzrasta wraz z liczbą nawrotów. Opracowano szereg modeli gryzoni w celu zbadania patologii choroby. Najpopularniejszymi modelami są rzutowo-remisyjne EAE u myszy SJL / J i pierwotnie postępujące EAE u myszy C57BL6.
Kliniczne wyniki EAE, które opisują zakres deficytów funkcji motorycznych i masę ciała, są złotymi standardami do oceny ciężkości EAE. Te objawy kliniczne zgadzają się z zakresem infiltracji komórek odpornościowych i niszczenia mieliny w rdzeniu kręgowym i umiarkowanie przewidują skuteczność leczenia farmakologicznego u ludzi5. Jednak objawy te odzwierciedlają głównie zniszczenie brzusznych dróg włóknistych w rdzeniu kręgowym. Obecnie nie ma łatwej, nieinwazyjnej, niezawodnej i powtarzalnej metody oceny infiltracji mózgu in vivo i zapalenia nerwu wzrokowego u żywych myszy. 
Obrazowanie in vivo zgadza się z 3 zasadami "R" Russela i Burcha (1959), które twierdzą, że eksperymenty na zwierzętach mają miejsce R, edukację Ri udoskonalenieR6, ponieważ obrazowanie zwiększa odczyty jednego zwierzęcia w kilku punktach czasowych i pozwala na zmniejszenie ogólnej liczby. Obecnie stan zapalny lub stan mieliny jest głównie oceniany ex vivo za pomocą immunohistochemii, analizy FACS lub różnych metod biologii molekularnej7, z których wszystkie wymagają eutanazji myszy w określonych punktach czasowych. 
Opracowano wiele sond systemu obrazowania in vivo do oceny stanu zapalnego skóry, stawów i układu naczyniowego. Techniki te opierają się na aktywacji bioluminescencyjnych lub fluorescencyjnych substratów w bliskiej podczerwieni przez peroksydazy tkankowe, w tym mieloperoksydazę (MPO), metaloproteinazy macierzy (MMPs)8 i katepsyny9 lub cyklooksygenazę2. Sondy te zostały głównie zweryfikowane w modelach zapalenia stawów lub miażdżycy9,10. Czuła na katepsynę sonda została również wykorzystana do fluorescencyjnego obrazowania tomograficznego molekularnego EAE11. MMP, szczególnie MMP2 i MMP9, przyczyniają się do zaburzenia BBB za pośrednictwem proteazy w EAE i są regulowane w górę w miejscach infiltracji komórek odpornościowych12, co sugeruje, że te sondy mogą być przydatne do obrazowania EAE. To samo dotyczy sond opartych na peroksydazie lub katepsynach. Technicznie rzecz biorąc, obrazowanie stanu zapalnego w mózgu lub rdzeniu kręgowym jest znacznie trudniejsze, ponieważ czaszka lub kręgosłup pochłaniają sygnały bioluminescencyjne i bliskiej podczerwieni. 
Oprócz wskaźników stanu zapalnego, opisano fluorescencyjne substancje chemiczne, które specyficznie wiążą się z mieliną i mogą pozwolić na ilościowe określenie mielinizacji13. Stwierdzono, że sonda fluorescencyjna w bliskiej podczerwieni, jodek 3,3'-dietylotiotrikarbocyjaniny (DBT), specyficznie wiąże się z włóknami mielinowymi i została zwalidowana jako narzędzie ilościowe w mysich modelach pierwotnych defektów mielinizacji oraz w demielinizacji wywołanej miedziizonem14. W EAE sygnał DBT był raczej zwiększony, co odzwierciedlało stan zapalny włókien mielinowych5. 
Dodatkowym znakiem rozpoznawczym EAE i MS jest rozpad BBB, co skutkuje zwiększoną przepuszczalnością naczyń krwionośnych i wynaczynieniem komórek krwi, płynu pozakomórkowego i makrocząsteczek do miąższu OUN. Może to prowadzić do obrzęku, stanu zapalnego, uszkodzenia oligodendrocytów i ostatecznie demielinizacji15,16. W związku z tym wizualizacja przecieku BBB za pomocą sond fluorescencyjnych, takich jak albumina surowicy bydlęcej znakowana fluorochromem5, która normalnie rozprowadza się bardzo wolno z krwi do tkanki, może być przydatna do oceny EAE.
W obecnym badaniu oceniliśmy przydatność różnych sond w EAE i pokazaliśmy procedurę dla najbardziej niezawodnej i solidnej techniki bioluminescencyjnej. Ponadto omawiamy zalety i wady sond bliskiej podczerwieni pod kątem aktywności MMP i integralności BBB.

<table><tbody><tr><td>AngioSpark-680</td><td>Perkin Elmer, Inc., Waltham, Stany Zjednoczone</td><td>NEV10149</td><td>Sonda obrazująca, pegylowane nanocząstki, przydatne do obrazowania integralności bariery krew-mózg</td></tr><tr><td>MMP-sense 680</td><td>Perkin Elmer, Inc., Waltham, Stany Zjednoczone</td><td>NEV10126</td><td>Sonda do obrazowania, aktywowana przez metaloproteinazy macierzy, przydatna do obrazowania stanu zapalnego</td></tr><tr><td>Sonda zapalna XenoLight RediJect</td><td>Perkin Elmer, Inc., Waltham, Stany Zjednoczone</td><td>760535</td><td>Sonda obrazująca, aktywowana przez oksydazy, przydatna do obrazowania stanu zapalnego</td></tr><tr><td>Emulsja PLP139-151/CFA&nbsp;</td><td>Hooke Labs, St Lawrence, MA</td><td>EK-0123</td><td>Zestaw indukcyjny EAE</td></tr><tr><td>Toksyna krztuśca</td><td>Hooke Labs, St Lawrence, MA</td><td>EK-0123</td><td>Zestaw indukcyjny EAE</td></tr><tr><td>IVIS Lumina Spectrum</td><td>Perkin Elmer, Inc., Waltham, USA</td><td></td><td>System obrazowania bioluminescencji i podczerwieni</td></tr><tr><td>Oprogramowanie LivingImage 4.5&nbsp;</td><td>Perkin Elmer, Inc., Waltham, Stany Zjednoczone</td><td>CLS136334</td><td>Oprogramowanie do analizy IVIS</td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Abbott Labs, Illinois, USA</td><td>26675-46-7</td><td>Znieczulenie</td></tr></tbody></table>

bioluminescencja i obrazowanie w bliskiej podczerwieni zapalenia nerwu wzrokowego i zapalenia mózgu w modelu eae stwardnienia rozsianego u myszy

Bioluminescence and Near-infrared Imaging of Optic Neuritis and Brain Inflammation in the EAE Model of Multiple Sclerosis in Mice

Eksperymentalne autoimmunologiczne zapalenie mózgu i rdzenia (EAE) u myszy SJL/J jest modelem rzutowo-remisyjnego stwardnienia rozsianego (RRMS). Kliniczne wyniki EAE opisujące deficyty funkcji motorycznych są podstawowymi odczytami zapalenia rdzenia kręgowego o podłożu immunologicznym. Jednak wyniki i masa ciała nie pozwalają na ocenę in vivo zapalenia mózgu i zapalenia nerwu wzrokowego. Ta ostatnia jest wczesną i częstą manifestacją u około 2/3 pacjentów ze stwardnieniem rozsianym. Tutaj pokazujemy metody bioluminescencji i obrazowania na żywo w bliskiej podczerwieni w celu oceny zapalenia nerwu wzrokowego wywołanego przez EAE, zapalenia mózgu i zakłócenia bariery krew-mózg (BBB) u żywych myszy za pomocą systemu obrazowania in vivo. Bioluminescencyjny substrat aktywowany przez oksydazy wykazywał przede wszystkim zapalenie nerwu wzrokowego. Sygnał był specyficzny i pozwalał na wizualizację efektów leków i przebiegów choroby w czasie, które pokrywały się z wynikami klinicznymi. Pegylowane nanocząstki fluorescencyjne, które pozostawały w układzie naczyniowym przez dłuższy czas, wykorzystano do oceny integralności bariery krew-mózg. Obrazowanie w bliskiej podczerwieni ujawniło wyciek z bariery krew-mózg w szczytowym momencie choroby. Sygnał był najsilniejszy w okolicach oczu. Do oceny stanu zapalnego wywołanego przez EAE wykorzystano substrat bliskiej podczerwieni dla metaloproteinaz macierzy. Autofluorescencja interferowała sygnał, wymagając rozmieszania widma w celu określenia ilościowego. Ogólnie rzecz biorąc, obrazowanie bioluminescencyjne było wiarygodną metodą oceny zapalenia nerwu wzrokowego związanego z EAE i efektów leków oraz przewyższało techniki bliskiej podczerwieni pod względem specyficzności sygnału, solidności, łatwości kwantyfikacji i kosztów.

Przebieg czasowy bioluminescencji w zapaleniu nerwu wzrokowego
Sygnał bioluminescencji sondy stanu zapalnego był najsilniejszy w okolicach oczu i występował wyłącznie u myszy z EAE z zapaleniem nerwu wzrokowego. Sygnał nie wystąpił ani u myszy bez EAE, ani u myszy, którym nie wstrzyknięto sondy stanu zapalnego. Sygnał zanikł w miarę powrotu myszy do zdrowia. Zatem sygnał jest specyficzny dla zapalenia nerwu wzro...

Pokazujemy technikę obrazowania in vivo na żywo bioluminescencji i bliskiej podczerwieni zapalenia nerwu wzrokowego i zapalenia mózgu w eksperymentalnym modelu autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia (EAE) dla stwardnienia rozsianego u myszy SJL/J.

Bioluminescencja i obrazowanie w bliskiej podczerwieni zapalenia nerwu wzrokowego i zapalenia mózgu w modelu EAE stwardnienia rozsianego u myszy

Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in SJL/J mice is a model for relapsing-remitting multiple sclerosis (RRMS). Clinical EAE scores describing ...

Ogólnym celem tej techniki obrazowania jest wizualizacja i ilościowe określenie zapalenia nerwu wzrokowego oraz stanu zapalnego mózgu w modelu EAE stwardnienia rozsianego u żywych myszy. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania z dziedziny neuroimmunologii, takie jak nowe mechanizmy wpływające na przebieg EAE i stwardnienia rozsianego. Główną zaletą tej techniki jest możliwość obserwacji i kwantyfikacji zapalenia nerwu wzrokowego oraz stanu zapalnego mózgu wywołanego przez EAE u żywych myszy w trakcie całego przebiegu choroby.Zastosowanie tej techniki ma znaczenie terapeutyczne, ponieważ pozwala na obserwację efektów działania leków, które nie są widoczne w wynikach punktowych EAE. W tej procedurze należy rozpuścić PTX w stężeniu 2 µg/mL w 1x PBS i dokładnie wymieszać. Następnie, podczas krótkiej anestezji izofluranem, wstrzyknąć myszom podskórnie 100 µL PLP/CFA dwukrotnie w nasadzie ogona.Nie wstrzykiwać w kark, ponieważ wszelkie reakcje immunologiczne w skórze górnej części pleców lub szyi będą zakłócać obrazowanie głowy i rdzenia kręgowego. Od jednej do dwóch godzin po immunizacji wstrzyknąć myszom 100 µL PTX drogą dosytroniczną. Następnie 24 godziny po immunizacji ponownie wstrzyknąć myszom 100 µL PTX.W przypadku myszy kontrolnych wstrzyknij 100 µL CFA bez PLP dwukrotnie w nasadę ogona. Od siódmego dnia po immunizacji codziennie oceniaj objawy kliniczne zgodnie ze standardowymi systemami punktacji. Gdy myszy osiągną wynik większy niż jeden, co nastąpi około 10–12 dnia po immunizacji, wykonaj pierwsze badanie obrazowe w momencie wystąpienia choroby.Następnie należy wykonać drugie obrazowanie w szczytowej fazie choroby, co następuje około jednego do dwóch dni po wystąpieniu pierwszych objawów i trwa od jednego do trzech dni. Następnie myszy w pełni wyzdrowieją w ciągu siedmiu do 10 dni. Obrazowanie w odstępach czasowych może nadal wykazywać przecieki naczyniowe, jednak wskaźniki stanu zapalnego powinny być negatywne.Aby przeprowadzić obrazowanie in vivo, należy utrzymywać myszy w znieczuleniu izofluranem w stężeniu od 2% do 2,5% podczas wszystkich procedur obrazowania. Umieść dwie myszy obok siebie w aparacie, pozycjonując ich grzbiety w centrum. Następnie osłoń miejsce immunizacji czarnym materiałem.Uruchom oprogramowanie do przechwytywania obrazów i zainicjuj kamerę. Następnie wykonaj obraz bazowy, aby ocenić prawidłowe ustawienie myszy. W dalszej kolejności do przechwytywania wszystkich obrazów zastosuj ostrzenie B przy zachowaniu odległości 6,5 centymetra od kamery.Następnie wymieszać gotowy do użycia odczynnik chemiluminescencyjny o stężeniu 40 mg/mL przed napełnieniem strzykawki. Następnie wstrzyknąć myszom 100 µL odczynnika do jam brzusznych i zarejestrować obrazy bioluminescencji w 5., 10. i 15. minucie po iniekcji. W tej procedurze należy uruchomić oprogramowanie do analizy bioluminescencji.W górnym pasku menu kliknij ikonę Przeglądarki plików. Przejdź do katalogu folderu eksperymentu i otwórz pliki, a następnie skonfiguruj kolumny wyświetlające opisy istotne dla eksperymentu. W celu kontroli jakości kliknij plik myszy nieodpowiadającej, niewykazującej objawów EAE, lub myszy naiwnej, aby sprawdzić specyficzność sygnałów EAE.W celu dodatkowej kontroli specyficzności sygnału, należy sprawdzić obraz bazowy przed wstrzyknięciem sondy dla każdej myszy, który powinien być negatywny. Aby wybrać obraz, kliknij pierwszy plik pierwszej myszy z EAE i sprawdź intensywność oraz lokalizację bioluminescencji. Przejrzyj wszystkie obrazy jeden po drugim.Do kwantyfikacji należy użyć obrazu z najsilniejszym sygnałem dla każdej myszy. Aby dostosować i wyeksportować obraz, należy dwukrotnie kliknąć pierwszy plik przeznaczony do kwantyfikacji. W nowym wyskakującym oknie, w sekcji przycisku Options, można dostosować etykiety wyświetlane na każdym ekranie.W prawym panelu narzędzi przejdź do sekcji Image Adjustment. Domyślnie minimalna i maksymalna intensywność są ustawione na auto i wyświetlane w tęczowej pseudokolorystyce. Wybierz Manual, aby w razie potrzeby zmienić ustawienia.Następnie kliknij Image Export, wybierz format PNG, katalog oraz nazwę obrazu. Aby przeprowadzić kwantyfikację obszarów zainteresowania, przejdź do narzędzia ROI Tool w palecie narzędzi. Wybierz metodę ROI oraz liczbę obszarów ROI.W oknie ROI wewnątrz okna obrazu dostosuj rozmiar i położenie ROI. W przypadku korzystania z narzędzia auto ROI zastosuj identyczne progi ROI dla wszystkich obrazów. Jeśli rozmiary i położenia ROI są definiowane ręcznie, zastosuj identyczne obszary dla wszystkich obrazów.Następnie kliknij Measure ROI. Dostosuj kolumny w szczegółach eksperymentu w nowym oknie pop-up i zapisz zmiany. Po zakończeniu zaznacz wszystko, skopiuj i wklej tabelę do arkusza kalkulacyjnego.Następnie wyeksportuj obraz w formacie PNG z naniesionymi obszarami ROI. Po tym zapisz i zamknij plik obrazu. Poniżej przedstawiono przykłady dwóch myszy szczepu SJL/J, których obrazowanie wykonano w 10. i 14. dniu po indukcji EAE.Sygnał bioluminescencyjny wokół oczu był najsilniejszy w 10. dniu i zanikł, gdy myszy zaczęły wracać do zdrowia. Przedstawione wykresy słupkowe obrazują ilościową ocenę sygnałów bioluminescencyjnych w 10. i 14. dniu, natomiast tutaj pokazano kliniczne oceny EAE. Na tej ilustracji obrazy bioluminescencyjne pięciu myszy z każdej grupy ukazują efekt zastosowania leku, w wyniku którego zapalenie nerwu wzrokowego uległo zmniejszeniu u myszy leczonych R-flurbiprofenem.Kwantyfikacja całkowitej liczby zliczeń bioluminescencyjnych w obszarach ROI potwierdziła istotną skuteczność leczenia. Po opanowaniu techniki, procedura ta może zostać przeprowadzona w ciągu dwóch do trzech godzin, w zależności od liczby myszy poddawanych obrazowaniu. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o użyciu białych myszy oraz o uważnej obserwacji klinicznego przebiegu EAE.Po zastosowaniu tej procedury można przeprowadzić inne metody, takie jak analiza FACS lub immunohistochemia, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, na przykład dotyczące nacieku komórek odpornościowych do rdzenia kręgowego. Po obejrzeniu filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat oceny zapalenia nerwu wzrokowego i stanu zapalnego mózgu w modelu EAE stwardnienia rozsianego z wykorzystaniem obrazowania bioluminescencyjnego.

bioluminescence-near-infrared-imaging-optic-neuritis-brain

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Ten film demonstruje procedurę oceny przerwania bariery krew-mózg w mysim modelu EAE. Barwniki fluorescencyjne o różnych rozmiarach są wstrzykiwane po ortopie i krążą w naczyniach krwionośnych mózgu. Mniejszy barwnik przecieka przez szczeliny do tkanki mózgowej, podczas gdy większy barwnik dostaje się tylko wtedy, gdy zakłócenie jest poważne, co koreluje z zakresem uszkodzenia bariery.

Określanie przerwania bariery krew-mózg za pomocą barwników fluorescencyjnych w mysim modelu EAE

W tym filmie mysi model stwardnienia rozsianego jest tworzony za pomocą eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia (EAE). Myszowi wstrzykuje się emulsję zawierającą peptyd neuronalny i adiuwant, wywołując odpowiedź immunologiczną, która aktywuje autoreaktywne limfocyty T. Następnie podaje się wstrzyknięcie toksyny krztuścowej (PTX) w celu zwiększenia przepuszczalności bariery krew-mózg, umożliwiając autoreaktywnym limfocytom T infiltrację mózgu. Ten naciek inicjuje kaskadę...

Indukcja eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia kręgowego w modelu mysim

Źródło: Breid, S.,  et. al. Obrazowanie bioluminescencyjne zapalenia układu nerwowego u myszy transgenicznych po obwodowej inokulacji włókienek alfa-synukleiny. J. Vis. Exp. (2017)Ten film demonstruje obrazowanie bioluminescencyjne zapalenia układu nerwowego u myszy transgenicznych, prezentując reakcje lucyferazy-lucyferyny w aktywowanych astrocytach. Protokół umożliwia nieinwazyjną kwantyfikację aktywacji astrocytarnej, wspomagając badania nad zapaleniem OUN i skutecznością terapeutyczną.

Obrazowanie bioluminescencyjne zapalenia nerwów u myszy transgenicznej

Źródło: Schmitz, K., et al., Bioluminescencja i obrazowanie w bliskiej podczerwieni zapalenia nerwu wzrokowego i mózgu w modelu EAE stwardnienia rozsianego u myszy. J. Vis. Exp. (2017).Ten film pokazuje metodę wizualizacji i monitorowania eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia kręgowego lub zapalenia nerwu wzrokowego wywołanego EAE za pomocą obrazowanie bioluminescencyjne. Obejmuje to pozycjonowanie myszy, wstrzykiwanie odczynnika i przechwytywanie sekwencyjnych...

Obrazowanie bioluminescencyjne w modelu myszy EAE

Opisujemy metodę wszczepiania i utrzymywania szklanych okien nad odsłoniętymi rdzeniami kręgowymi dorosłych myszy do badania eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia. Okna te zapewniają przewlekły dostęp optyczny do rdzenia kręgowego w celu monitorowania dynamiki komórek na poziomie subkomórkowym u żywych zwierząt za pomocą mikroskopii dwufotonowej.

Wszczepianie szklanych okien rdzenia kręgowego dorosłym myszom z eksperymentalnym autoimmunologicznym zapaleniem mózgu i rdzenia kręgowego

Ten manuskrypt opisuje metody indukcji i oceny eksperymentalnego modelu autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia kręgowego (EAE), wraz z oceną rozmieszczenia komórek odpornościowych i poziomów cytokin mRNA w węzłach chłonnych, śledzionie, krwi i rdzeniu kręgowym za pomocą cytometrii przepływowej i ilościowego PCR, odpowiednio, w różnych fazach choroby.

Indukcja eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia kręgowego u myszy i ocena zależnej od choroby dystrybucji komórek odpornościowych w różnych tkankach

Obwodowe wstrzyknięcie włókienek alfa-synukleiny do otrzewnej lub języka myszy Tg(M83+/-:Gfap-luc+/-), które wykazują ekspresję ludzkiej alfa-synukleiny z rodzinną mutacją A53T i lucyferazą świetlika, może wywołać neuropatologię, w tym zapalenie nerwów, w ich ośrodkowym układzie nerwowym.

Obrazowanie bioluminescencyjne zapalenia układu nerwowego u myszy transgenicznych po obwodowej inokulacji włókien alfa-synukleiny

Ten protokół opisuje, jak techniki obrazowania o wysokiej rozdzielczości, takie jak optyczna koherentna tomografia w domenie spektralnej i skaningowa oftalmoskopia laserowa, mogą być wykorzystane u małych gryzoni, przy użyciu systemu platformy obrazowania okulistycznego, aby uzyskać informacje odpowiednio o grubości siatkówki i rozmieszczeniu komórek mikrogleju.

In vivo (in vivo) Obrazowanie myszy reporterowych Cx3cr1gfp/gfp z optyczną koherentną tomografią w domenie spektralnej i skaningową oftalmoskopią laserową

Tutaj prezentujemy protokoły do badania upośledzenia jednostki nerwowo-naczyniowej podczas eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia in vivo. W szczególności zajmujemy się tym, jak określić przepuszczalność bariery krew-mózg i aktywność żelatynazy zaangażowaną w migrację leukocytów przez limity gleju.

Wizualizacja upośledzenia barier śródbłonkowych i glejowych jednostki nerwowo-naczyniowej podczas eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia mięśniowego in vivo

Niniejszy protokół opisuje indukcję eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia w modelu mysim przy użyciu glikoproteiny oligodendrocytów mieliny i monitorowanie procesu chorobowego za pomocą systemu punktacji klinicznej. Eksperymentalne objawy związane z autoimmunologicznym zapaleniem mózgu i rdzenia kręgowego są analizowane za pomocą analizy mikrotomografii komputerowej kości udowej myszy i testu terenowego w celu kompleksowej oceny procesu chorobowego.

Indukcja i zróżnicowane wskaźniki oceny eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia kręgowego

Eksperymentalne autoimmunologiczne zapalenie mózgu i rdzenia (EAE) służy jako zwierzęcy model stwardnienia rozsianego. W tym artykule opisano podejście do oceny zapalenia rdzenia kręgowego, demielinizacji i uszkodzenia aksonów w EAE. Dodatkowo przedstawiono metodę ilościowego określania poziomu rozpuszczalnego światła neurofilamentów w surowicy myszy, ułatwiającą ocenę uszkodzenia aksonów u żywych myszy.

Ocena zapalenia ośrodkowego układu nerwowego, demielinizacji i uszkodzenia aksonów w eksperymentalnym autoimmunologicznym zapaleniu mózgu i rdzenia

Poznaj bioluminescencyjne obrazowanie zapalenia nerwu wzrokowego i mózgu w modelu EAE stwardnienia rozsianego u myszy. Ta metoda umożliwia wizualizację i ilościową ocenę postępu choroby oraz skuteczności terapii w czasie rzeczywistym.

Bioluminescencja i obrazowanie w bliskiej podczerwieni zapalenia nerwu wzrokowego i zapalenia mózgu w modelu EAE stwardnienia rozsianego u myszy (Wideo) | JoVE Journal

Bioluminescencja i obrazowanie w bliskiej podczerwieni zapalenia nerwu wzrokowego i zapalenia mózgu w modelu EAE stwardnienia rozsianego u myszy

Przeglądaj więcej filmów