Name: Synteza biokompatybilnych pianek elastomerowych ciekłokrystalicznych jako rusztowań komórkowych do przestrzennych hodowli komórkowych 3D (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 38 s
Description: Poznaj metodę syntezy biokompatybilnych pianek elastomerowych ciekłokrystalicznych jako rusztowań 3D do hodowli komórkowej. Technika umożliwia badanie przestrzennych interakcji międzykomórkowych i proliferacji komórek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować Kent State University (wspólny grant badawczy i wsparcie dla Inicjatywy Medycyny Regeneracyjnej w Kent State − ReMedIKS) za wsparcie finansowe tego projektu.

<ol><li>Khor, E., Lim, L. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implantable+applications+of+chitin+and+chitosan%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Implantable applications of chitin and chitosan.</a> Biomaterials. 24 (13), 2339-2349 (2003).</li>
<li>Chung, H. J., Park, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+engineered+and+drug+releasing+pre-fabricated+scaffolds+for+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Drug+Deliv.+Rev%22%5BJournal%5D)">Surface engineered and drug releasing pre-fabricated scaffolds for tissue engineering.</a> Adv. Drug Deliv. Rev. 59 (4-5), 249-262 (2007).</li>
<li>Yakacki, C. M., Gall, K. <a target="_blank" href="http://link.springer.com/chapter/10.1007%2F12_2009_23">Shape-Memory Polymers for Biomedical Applications.</a> Shape-Memory Polymers. 226, 147-175 (2010).</li>
<li>Agrawal, A., et al. <a target="_blank" href="https://www.cambridge.org/core/journals/journal-of-materials-research/article/stimuli-responsive-liquid-crystal-elastomers-for-dynamic-cell-culture/5FE74776C3838EF9F1069067EAD9812A">Stimuli-responsive liquid crystal elastomers for dynamic cell culture.</a> J. of Mat. Res. 30 (4), 453-462 (2015).</li>
<li>Agrawal, A., Yun, T. H., Pesek, S. L., Chapman, W. G., Verduzco, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shape-responsive+liquid+crystal+elastomer+bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">Shape-responsive liquid crystal elastomer bilayers.</a> Soft Matter. 10 (9), 1411-1415 (2014).</li>
<li>Sharma, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biodegradable+and+Porous+Liquid+Crystal+Elastomer+Scaffolds+for+Spatial+Cell+Cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Macromol.+Biosci%22%5BJournal%5D)">Biodegradable and Porous Liquid Crystal Elastomer Scaffolds for Spatial Cell Cultures.</a> Macromol. Biosci. 15 (2), 200-214 (2015).</li>
<li>Yakacki, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://pubs.rsc.org/en/Content/ArticleLanding/2015/RA/c5ra01039j">Tailorable and programmable liquid-crystalline elastomers using a two-stage thiol-acrylate reaction.</a> RSC Adv. 5 (25), 18997-19001 (2015).</li>
<li>deGennes, P. G., Hebert, M., Kant, R. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/masy.19971130107/abstract">Artificial muscles based on nematic gels.</a> Macromolecular Symposia. 113, 39-49 (1997).</li>
<li>Fleischmann, E. -K., Zentel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liquid-Crystalline+Ordering+as+a+Concept+in+Materials+Science%3A+From+Semiconductors+to+Stimuli-Responsive+Devices%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Liquid-Crystalline Ordering as a Concept in Materials Science: From Semiconductors to Stimuli-Responsive Devices.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 52 (34), 8810-8827 (2013).</li>
<li>Finkelmann, H., Kim, S. T., Munoz, A., Palffy-Muhoray, P., Taheri, B. <a target="_blank" href="http://mpalffy.lci.kent.edu/PAPERS/elastomer.pdf">Tunable mirrorless lasing in cholesteric liquid crystalline elastomers.</a> Adv. Mater. 13 (14), 1069-1072 (2001).</li>
<li>Artal, C., et al. <a target="_blank" href="http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/ma001928e">SHG characterization of different polar materials obtained by in situ photopolymerization.</a> Macromolecules. 34 (12), 4244-4255 (2001).</li>
<li>Camacho-Lopez, M., Finkelmann, H., Palffy-Muhoray, P., Shelley, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+liquid-crystal+elastomer+swims+into+the+dark%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Mater%22%5BJournal%5D)">Fast liquid-crystal elastomer swims into the dark.</a> Nat. Mater. 3 (5), 307-310 (2004).</li>
<li>Yamada, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photomobile+polymer+materials%3A+Towards+light-driven+plastic+motors%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Photomobile polymer materials: Towards light-driven plastic motors.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 47 (27), 4986-4988 (2008).</li>
<li>Ohm, C., Brehmer, M., Zentel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liquid+Crystalline+Elastomers+as+Actuators+and+Sensors%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Mater%22%5BJournal%5D)">Liquid Crystalline Elastomers as Actuators and Sensors.</a> Adv. Mater. 22 (31), 3366-3387 (2010).</li>
<li>Fleischmann, E. -K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-piece+micropumps+from+liquid+crystalline+core-shell+particles%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Commun%22%5BJournal%5D)">One-piece micropumps from liquid crystalline core-shell particles.</a> Nat. Commun. 3, (2012).</li>
<li>Herzer, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Printable+Optical+Sensors+Based+on+H-Bonded+Supramolecular+Cholesteric+Liquid+Crystal+Networks%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Printable Optical Sensors Based on H-Bonded Supramolecular Cholesteric Liquid Crystal Networks.</a> J. Am. Chem. Soc. 134 (18), 7608-7611 (2012).</li>
<li>Lockwood, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/adfm.200500768/abstract">Thermotropic liquid crystals as substrates for imaging the reorganization of matrigel by human embryonic stem cells.</a> Adv. Funct. Mater. 16 (5), 618-624 (2006).</li>
<li>Sharma, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+structural+variations+on+the+cellular+response+and+mechanical+properties+of+biocompatible%2C+biodegradable%2C+and+porous+smectic+liquid+crystal+elastomers%5BTitle%5D)+AND+%22Macromol.+Biosci%22%5BJournal%5D)">Effects of structural variations on the cellular response and mechanical properties of biocompatible, biodegradable, and porous smectic liquid crystal elastomers.</a> Macromol. Biosci. , In press (2016).</li>
<li>Bera, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liquid+Crystal+Elastomer+Microspheres+as+Three-Dimensional+Cell+Scaffolds+Supporting+the+Attachment+and+Proliferation+of+Myoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Appl.+Mater.+Interfaces%22%5BJournal%5D)">Liquid Crystal Elastomer Microspheres as Three-Dimensional Cell Scaffolds Supporting the Attachment and Proliferation of Myoblasts.</a> ACS Appl. Mater. Interfaces. 7 (26), 14528-14535 (2015).</li>
<li>Bera, T., Malcuit, C., Clements, R. J., Hegmann, E. <a target="_blank" href="http://journal.frontiersin.org/article/10.3389/fmats.2016.00031/full">Role of Surfactant during Microemulsion Photopolymerization for the Creation of Three-Dimensional Liquid Crystal Elastomer Microsphere Spatial Cell Scaffolds.</a> Front. Mater. 3 (31), (2016).</li>
<li>McKee, C. T., Last, J. A., Russell, P., Murphy, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Indentation+Versus+Tensile+Measurements+of+Young%27s+Modulus+for+Soft+Biological+Tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Part+B+Rev%22%5BJournal%5D)">Indentation Versus Tensile Measurements of Young's Modulus for Soft Biological Tissues.</a> Tissue Eng. Part B Rev. 17 (3), 155-164 (2011).</li>
<li>Kung, C. -C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+and+characterization+of+three+dimensional+graphene+foam+supported+platinum-ruthenium+bimetallic+nanocatalysts+for+hydrogen+peroxide+based+electrochemical+biosensors%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens.+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">Preparation and characterization of three dimensional graphene foam supported platinum-ruthenium bimetallic nanocatalysts for hydrogen peroxide based electrochemical biosensors.</a> Biosens. Bioelectron. 52, 1-7 (2014).</li>
<li>Amsden, B. <a target="_blank" href="http://pubs.rsc.org/en/content/articlelanding/2007/sm/b707472g">Curable, biodegradable elastomers: emerging biomaterials for drug delivery and tissue engineering.</a> Soft Matter. 3 (11), 1335-1348 (2007).</li>
<li>Sinturel, C., Vayer, M., Morris, M., Hillmyer, M. A. <a target="_blank" href="http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/ma400735a">Solvent Vapor Annealing of Block Polymer Thin Films.</a> Macromolecules. 46 (14), 5399-5415 (2013).</li>
<li>Riboldi, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+myogenesis+on+highly+orientated+microfibrous+polyesterurethane+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Mater.+Res.+A%22%5BJournal%5D)">Skeletal myogenesis on highly orientated microfibrous polyesterurethane scaffolds.</a> J. Biomed. Mater. Res. A. 84 (4), 1094-1101 (2008).</li>
<li>Chung, S., Moghe, A. K., Montero, G. A., Kim, S. H., King, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanofibrous+scaffolds+electrospun+from+elastomeric+biodegradable+poly%28L-lactide-co-epsilon-caprolactone%29+copolymer%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed.+Mater%22%5BJournal%5D)">Nanofibrous scaffolds electrospun from elastomeric biodegradable poly(L-lactide-co-epsilon-caprolactone) copolymer.</a> Biomed. Mater. 4 (1), 9(2009).</li>
<li>Gao, Y. X., et al. <a target="_blank" href="http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/acsmacrolett.5b00729">Biocompatible 3D Liquid Crystal Elastomer Cell Scaffolds and Foams with Primary and Secondary Porous Architecture.</a> ACS Macro Lett. 5 (1), 14-19 (2016).</li>
<li>Lenoir, S., et al. <a target="_blank" href="http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/ma035003l">Ring-opening polymerization of alpha-chloro-is an element of-caprolactone and chemical modification of poly(alpha-chloro-is an element of-caprolactone) by atom transfer radical processes.</a> Macromolecules. 37 (11), 4055-4061 (2004).</li>
<li>Younes, H. M., Bravo-Grimaldo, E., Amsden, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis%2C+characterization+and+in+vitro+degradation+of+a+biodegradable+elastomer%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Synthesis, characterization and in vitro degradation of a biodegradable elastomer.</a> Biomaterials. 25 (22), 5261-5269 (2004).</li>
<li>Donaldson, T., Henderson, P. A., Achard, M. F., Imrie, C. T. <a target="_blank" href="http://pubs.rsc.org/en/content/articlelanding/2011/jm/c1jm10992h">Chiral liquid crystal tetramers.</a> J. Mater. Chem. 21 (29), 10935-10941 (2011).</li>
<li>Palmgren, R., Karlsson, S., Albertsson, A. C. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/(SICI)1099-0518(19970715)35:9%3C1635::AID-POLA5%3E3.0.CO;2-Q/abstract">Synthesis of degradable crosslinked polymers based on 1,5-dioxepan-2-one and crosslinker of bis-epsilon-caprolactone type.</a> J. Pol. Sci. A Polym. Chem. 35 (9), 1635-1649 (1997).</li>
<li>Rasband, W. S. ImageJ. , National Institutes of Health. Bethesda, Maryland, USA. Available from: 
 <a target="_blank" href="http://imagej.nih.gov/ij/">http://imagej.nih.gov/ij/</a> (2015).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Elastomery ciekłokrystaliczne zostały ostatnio przebadane jako biokompatybilne rusztowania komórkowe ze względu na ich reakcję na bodźce. Udowodniono, że są idealnymi platformami jako rusztowania komórkowe. Jednak ważnym czynnikiem, o którym należy pamiętać podczas przygotowywania i projektowania nowego rusztowania LCE, jest porowatość. Wprowadzanie wymywalnych ciał stałych23 lub gazów nie zawsze prowadzi do uzyskania jednorodnej porowatości lub w pełni połączonych porów. Zastosowanie metalowego s...

Istnieje kilka przykładów biologicznych i biokompatybilnych materiałów syntetycznych przeznaczonych do zastosowań w badaniach komórkowych i do regeneracji tkanek, mających na celu przyczepianie i proliferację komórek1,2,3,4,5. Istnieje kilka przykładów materiałów biokompatybilnych, znanych jako elastomery ciekłokrystaliczne (LCE), które mogą reagować na bodźce zewnętrzne za pomocą anizotropowego uporządkowania molekularnego6,7. LCE to materiały reagujące na bodźce, które łączą właściwości mechaniczne i sprężyste elastomerów z funkcjonalnością optyczną i porządkowaniem molekularnym ciekłych kryształów8,9. LCE mogą doświadczać zmian kształtu, odkształceń mechanicznych, zachowania sprężystego i właściwości optycznych w odpowiedzi na bodźce zewnętrzne (np. ciepło, naprężenie, światło itp.)10,11,12,13,14,15,16. Wcześniejsze badania wykazały, że ciekłe kryształy (LC) mogą wykrywać wzrost i orientację komórek4,17. Można zatem założyć, że LCE mogą być odpowiednie do zastosowań istotnych biologicznie i medycznie, w tym do rusztowania i wyrównywania komórek. Wcześniej informowaliśmy o przygotowaniu smektycznych biokompatybilnych, biodegradowalnych, formowanych i cienkich folii LCE o porowatej morfologii "typu sera szwajcarskiego"6,18. Przygotowaliśmy również nematyczne biokompatybilne LCE o morfologii kulistej jako rusztowania do wzrostu komórek19,20. Nasze prace miały na celu dostrojenie właściwości mechanicznych materiałów tak, aby odpowiadały właściwościom tkanki będącej przedmiotem zainteresowania21. Ponadto badania te koncentrują się na zrozumieniu interakcji elastomer-komórka, a także odpowiedzi komórkowej, gdy elastomery są poddawane bodźcom zewnętrznym.
Głównym wyzwaniem było częściowo dostosowanie porowatości LCE, aby umożliwić przyłączanie i przenikanie komórek przez matrycę elastomerową oraz lepszy transport masowy. Porowatość tych cienkich warstw6 pozwalała na przenikanie komórek przez większą część matrycy, ale nie wszystkie pory były w pełni połączone ze sobą lub miały bardziej regularny (jednorodny) rozmiar porów. Następnie opisaliśmy biokompatybilne nematyczne elastomery LCE o morfologii kulistej. Te nematyczne elastomery pozwalały na przyczepianie się i proliferację komórek, ale wielkość porów wahała się tylko od 10 do 30 μm, co uniemożliwiało lub ograniczało stosowanie tych elastomerów z szerszą gamą linii komórkowych19,20.
Poprzednia praca Künga i in. dotycząca tworzenia pianek grafenowych za pomocą "ofiarnego" metalowego szablonu wykazała, że uzyskana pianka grafenowa miała bardzo regularną porowatą morfologię podyktowaną przez wybrany metalowy szablon22. Metodologia ta zapewnia pełną kontrolę nad porowatością i wielkością porów. Jednocześnie plastyczność i elastyczność metalowego szablonu pozwala na tworzenie różnych kształtów szablonów przed przygotowaniem pianki. Inne techniki, takie jak ługowanie materiałów23, gas templating24 lub electro-spun fibers25,26 również oferują potencjał przygotowania materiałów porowatych, ale są bardziej czasochłonne, a w niektórych przypadkach rozmiar porów jest ograniczony do zaledwie kilku mikrometrów. Piankowe LCE 3D przygotowane przy użyciu metalowych szablonów pozwalają na większe obciążenie ogniw; poprawa tempa proliferacji; kokultura; i wreszcie, co nie mniej ważne, lepsze zarządzanie transportem masowym (tj. składnikami odżywczymi, gazami i odpadami) w celu zapewnienia pełnego rozwoju tkanek27. Wydaje się, że podobne do pianki LCE 3D również poprawiają wyrównanie komórek; jest to najbardziej prawdopodobne w odniesieniu do wisiorków LC wykrywających wzrost komórek i orientację komórek. Obecność ugrupowań LC w LCE wydaje się poprawiać wyrównanie komórek w odniesieniu do lokalizacji komórek w rusztowaniu LCE. Komórki wyrównują się w rozpórkach LCE, podczas gdy nie obserwuje się wyraźnej orientacji w miejscu, w którym rozpórki łączą się ze sobą (skrzyżowania)27.
Ogólnie rzecz biorąc, nasza platforma rusztowań komórkowych LCE jako nośnik do podtrzymywania komórek oferuje możliwości dostrojenia morfologii elastomeru i właściwości elastycznych oraz specyficznego kierowania wyrównaniem (indywidualnych) typów komórek w celu stworzenia uporządkowanych, przestrzennych układów komórek podobnych do żywych systemów. Oprócz zapewnienia rusztowania zdolnego do podtrzymywania i kierowania długoterminowym wzrostem i proliferacją komórek, LCE pozwalają również na dynamiczne eksperymenty, w których orientacja komórek i interakcje mogą być modyfikowane na bieżąco.

<table><tbody><tr><td>1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooktyltrietoksysilan</td><td>Alfa Aesar</td><td>L16606</td><td>Środek silanizujący</td></tr><tr><td>2-bis(4-hydroksy-cykloheksyl)propan</td><td>TCI</td><<td>a href="http://www.tcichemicals.com/eshop/en/us/commodity/B0928/">B0928</a></td><td>Odczynnik</td></tr><tr><td>2-chloroheksanon&nbsp;</td><td>Alfa</td><td>Aesar A18613</td><td>Odczynnik</td></tr><tr><td>2-heptanon&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>W254401</td><td>Rozpuszczalnik</td></tr><tr><td>2-propanol&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>278475</td><td>Rozpuszczalnik</td></tr><tr><td>Kwas 3-chloroperbenzoesowy, m-CPBA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>273031</td><td>Odczynnik</td></tr><tr><td>4-dimetyloaminopirydyna</td><td>Alfa</td><td>Aesar A13016</td><td>Odczynnik</td></tr><tr><td>4',6-diamidyn-2-fenyloindol, DAPI&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td>Barwnik jądrowy</td></tr><tr><td>Kwas 5-heksynowy&nbsp;</td><td>Alfa Aesar</td><td>B25132-06</td><td>Odczynnik</td></tr><tr><td>Kwas octowy</td><td>VWR</td><td>36289</td><td>Rozpuszczalnik</td></tr><tr><td>Aceton</td><td>Sigma Aldrich</td><td>34850</td><td></td></tr><tr><td>Rozpuszczalnik Alkohol 200 proof ACS Klasa&nbsp;</td><td>VWR</td><td>71001-866</td><td>Odczynnik</td></tr><tr><td>Benzen</td><td>Alfa Aesar</td><td>AA33290</td><td>Solvent</td></tr><tr><td>&epsilon;-kaprolakton&nbsp;</td><td>Odczynnik Alfa Aesar</td><td>A10299-0E</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>VWR</td><td>BDH1109</td><td>Rozpuszczalnik</td></tr><tr><td>Cholesterol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C8503</td><td>Odczynnik</td></tr><tr><td>Tlenek chromu(VI)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>232653</td><td>Odczynnik</td></tr><tr><td>Jodek miedzi(I)</td><td>Strem Chemicals</td><td>100211-060</td><td>Odczynnik</td></tr><tr><td>D,L-Laktyd&nbsp;</td><td>Alfa Aesar</td><td>L09026</td><td>Odczynnik</td></tr><tr><td>Dichlorometan</td><td>Sigma Aldrich</td><td>320269</td><td>Rozpuszczalnik</td></tr><tr><td>Eter dietylowy&nbsp;</td><td>Emd Millipore</td><td>EX0190</td><td>Rozpuszczalnik</td></tr><tr><td>N,N,N-dimetyloformamid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>270547</td><td>Rozpuszczalnik</td></tr><tr><td>Dulbecco" s zmodyfikowany Eagle średni, DEME&nbsp;</td><td>CORNING Cellgo</td><td>10-013</td><td>Media komórkowe</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Alfa Aesar</td><td>33361</td><td>Rozpuszczalnik</td></tr><tr><td>Formaldehyd&nbsp;</td><td>SIGMA Life Science</td><td>F8775</td><td>Utrwalająca</td></tr><tr><td>płodowa surowica bydlęca, FBS&nbsp;</td><td>HyClone</td><td>SH30071.01</td><td>Media Component</td></tr><tr><td>Bibuła filtracyjna, klasa 415, jakościowa, krepa</td><td>VWR</td><td>28320</td><td>Filtracja</td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G5516</td><td>Węzeł centralny (3-ramienny)</td></tr><tr><td>Diizocyjanian heksametylenu, HDI</td><td>Sigma Aldrich</td><td>52649</td><td>Środek sieciujący</td></tr><tr><td>Chlorek żelaza(III)&nbsp;</td><td>Alfa Aesar</td><td>12357</td><td>Środek trawiący</td></tr><tr><td>Alkohol izopropylowy</td><td>VWR</td><td>BDH1133</td><td>Rozpuszczalnik</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Alfa Aesar</td><td>L13255</td><td>Rozpuszczalnik</td></tr><tr><td>N,N'-dicyclohexylcarbodiimide</td><td>Aldrich</td><td>D80002</td><td>Rozpuszczalnik</td></tr><tr><td>N,N,N-dimetyloformamid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>270547</td><td>Solvent</td></tr><tr><td>Szablon niklowo-metaliczny</td><td>American</td><td>Elements Ni-860</td><td>Szablon piankowy</td></tr><tr><td>Komórki nerwiaka zarodkowego (SH-SY5Y)</td><td></td><td>ATCC CRL-2266</td><td>Linia komórkowa</td></tr><tr><td>Penicylina streptomycyna&nbsp;</td><td>Thermo SCIENTIFIC</td><td>15140122</td><td>Antybiotyki</td></tr><tr><td>Glikol polietylenowy 2000, PEG</td><td>Alfa Aesar</td><td>B22181</td><td>Odczynnik</td></tr><tr><td>Azydek sodu&nbsp;</td><td>VWR</td><td>97064-646</td><td>Odczynnik</td></tr><tr><td>Wodorowęglan sodu</td><td>AMRESCO</td><td>865</td><td>Sól susząca</td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>BDH</td><td>BDH9286</td><td>Sól susząca</td></tr><tr><td>Fosforan sodu dwuzasadowy siedmiowodny</td><td>Fisher Scientific</td><td>S-374</td><td>Sól susząca</td></tr><tr><td>Fosforan sodu jednozasadowy</td><td>jednowodny Sigma Aldrich</td><td>S9638</td><td>Sól susząca</td></tr><tr><td>Siarczan sodu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>239313</td><td>Sól susząca</td></tr><tr><td>Tetrahydrofuran</td><td>Alfa Aesar</td><td>41819</td><td>Rozpuszczalnik</td></tr><tr><td>Tiosiarczan de sodu</td><td>AMRESCO</td><td>393</td><td>Sól susząca</td></tr><tr><td>Cyna(II) 2-etyloheksanian</td><td>Aldrich</td><td>S3252</td><td>Odczynnik</td></tr><tr><td>Toluen</td><td>Alfa Aesar</td><td>22903</td><td>Rozpuszczalnik</td></tr><tr><td>Trietyloamina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>471283</td><td>Odczynnik</td></tr><tr><td>Hyklon trypsyny</td><td></td><td>SH30042.01</td><td>Odłączanie komórek</td></tr><tr><td>Olympus FV1000</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

synteza biokompatybilnych pianek elastomerowych ciekłokrystalicznych jako rusztowań komórkowych do przestrzennych hodowli komórkowych 3d

Synthesis of Biocompatible Liquid Crystal Elastomer Foams as Cell Scaffolds for 3D Spatial Cell Cultures

Tutaj prezentujemy krok po kroku przygotowanie 3D, biodegradowalnego, piankowego rusztowania komórkowego. Rusztowania te zostały przygotowane przez sieciowanie kopolimerów w bloku gwiaździstym zawierających jednostki cholesterolu jako grupy wiszące łańcucha bocznego, w wyniku czego powstały elastomery ciekłokrystaliczne (LCE) smektyczne-A (SmA). Rusztowania przypominające piankę, przygotowane przy użyciu metalowych szablonów, posiadają połączone ze sobą mikrokanały, dzięki czemu nadają się jako rusztowania do hodowli komórkowych 3D. Połączone właściwości regularnej struktury pianki metalowej i elastomeru skutkują uzyskaniem rusztowania komórkowego 3D, które sprzyja nie tylko większej proliferacji komórek w porównaniu z konwencjonalnymi porowatymi foliami szablonowymi, ale także lepszemu zarządzaniu transportem masowym (tj. składnikami odżywczymi, gazami, odpadami itp.). Charakter metalowego szablonu pozwala na łatwą manipulację kształtami pianki (tj. rolkami lub foliami) oraz na przygotowanie rusztowań o różnych rozmiarach porów do różnych badań komórkowych, przy jednoczesnym zachowaniu połączonej porowatej natury szablonu. Proces trawienia nie wpływa na skład chemiczny elastomerów, zachowując ich biokompatybilny i biodegradowalny charakter. Wykazaliśmy, że te smektyczne LCE, gdy są hodowane przez długi czas, umożliwiają badanie klinicznie istotnych i złożonych konstruktów tkankowych, jednocześnie promując wzrost i proliferację komórek.

W niniejszym raporcie przedstawiono metodę przygotowania porowatego trójwymiarowego elastomeru ciekłokrystalicznego (LCE) jako rusztowania do hodowli komórkowej, przy użyciu szablonu z niklu. Uzyskany trójwymiarowy LCE wykazuje złożoną, wzajemnie połączoną sieć kanałów umożliwiającą łatwe przenikanie komórek oraz bardziej odpowiedni transport masy27. Stwierdzono, że komórki są w stanie w pełni przeniknąć przez połączoną sieć kanałów oraz ułożyć się wewnątrz LCE. Wy...

To badanie przedstawia metodologię przygotowania 3D, biodegradowalnych, pianopodobnych rusztowań komórkowych opartych na biokompatybilnych elastomerach ciekłokrystalicznych o łańcuchu bocznym (LCE). Eksperymenty z mikroskopią konfokalną pokazują, że podobne do piany LCE pozwalają na przyłączanie komórek, proliferację i spontaniczne ustawianie mioblastów C2C12.

Synteza biokompatybilnych pianek elastomerowych ciekłokrystalicznych jako rusztowań komórkowych do przestrzennych hodowli komórkowych 3D

Here, we present a step-by-step preparation of a 3D, biodegradable, foam-like cell scaffold. These scaffolds were prepared by cross-linking star block ...

Celem niniejszej procedury jest przygotowanie biodegradowalnych, trójwymiarowych rusztowań komórkowych o strukturze pianki, opartych na biokompatybilnych ciekłokrystalicznych elastomerach z bocznych łańcuchów. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie ciekłych kryształów oraz biomedycynie, takie jak wpływ właściwości ciekłokrystalicznych elastomerów na proliferację i orientację komórek. Główną zaletą tej metody tworzenia trójwymiarowych rusztowań komórkowych jest umożliwienie badania przestrzennych oddziaływań międzykomórkowych, co rzadko jest możliwe w makrośrodowiskach 2D.Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą napotykają trudności podczas testów kompresji dotykowej. Pomysł na tę metodę pojawił się u nas po konieczności wymiany pożywek w setkach szalek Petriego. Zastanawialiśmy się, czy elastomery ciekłokrystaliczne mogłyby wspierać komórki mięśniowe w sieci 3D, aby wyeliminować konieczność stosowania tak wielu szalek Petriego.Wizualna demonstracja tej metody jest kluczowa, ponieważ niektóre etapy wymagają ostrożnego obchodzenia się z odczynnikami chemicznymi. Ponadto formowanie matrycy z pianki metalowej może być wymagające. Najpierw należy napełnić ampułkę o pojemności 20 ml 2% obj. roztworem PFOTES w toluenie.Mieszać roztwór w ampułce przez 24 godziny w celu silanizacji wnętrza ampułki. Przepłukać silanizowaną ampułkę alkoholem izopropylowym i suszyć w temperaturze 140 °C przez 30 minut. Do suchej ampułki wprowadzić 3,64 g destylowanego epsilon-kaprolaktonu, 0,5 g alfa-chloro-epsilon-kaprolaktonu oraz 0,25 mL glicerolu.Mieszaninę wstrząsano w wibratorze wirówkowym (vortex) przez jedną minutę. Następnie do mieszaniny dodano 4,90 g DL-laktydu i przepłukano atmosferę w ampułce azotem przez jedną minutę. Otwór ampułki przykryto folią aluminiową, a mieszaninę ogrzewano w temperaturze 120 °C przez około dwie godziny, aby stopić DL-laktyd.Wymieszaj roztwór w wirówce typu vortex, aby rozbić wszelkie nieprzetopione ciała stałe, a następnie dodaj do ampułki 66 µL 10-2-ethylhexanoate i ponownie wymieszaj w vortexie. Zamknij ampułkę folią aluminiową i podgrzewaj mieszaninę w temperaturze 120 °C przez 10 minut, aby ponownie stopić DL-laktyd. Po ponownym stopieniu DL-laktydu energicznie wymieszaj mieszaninę w vortexie i przepłucz wnętrze ampułki azotem.Zamknąć ampułkę gumowym septem. Przez septum wprowadzić igłę połączoną z linią próżni i uruchomić pompę próżniową. Zewnieć szyjkę ampułki, uważając, aby nie stopić gumowego korka.Po zamknięciu szyjki ogrzewać mieszaninę reakcyjną w temperaturze 140 °C przez 48 godzin. Następnie pozwolić mieszaninie ostygnąć do temperatury pokojowej. Rozbić ampułkę i rozpuścić lepka mieszaninę reakcyjną w 10 ml dichlorometanu.Przenieś mieszaninę do rozdzielacza. Umieść kolbę zawierającą 100 ml metanolu w kąpieli z suchego lodu i acetonu, aby schłodzić metanol do temperatury około -78 °C. Po schłodzeniu metanolu zamocuj rozdzielacz nad kolbą.Dodaj mieszaninę reakcyjną do schłodzonego metanolu w tempie dwóch kropli na sekundę. Zebraną białą zawiesinę odfiltruj na papierze filtracyjnym. Osad susz w suszarce próżniowej w temperaturze od 50 do 60 °C, aby otrzymać produkt trójpodstawiony alpha-chloro SBC.Aby przygotować trójramienny SBC z alfa-cholesterylem, boczny atom chloru zastępuje się azotkiem. Reakcja typu click z 5-heksynoianem cholesterylu prowadzi do uzyskania bocznego cholesterylu jako grupy ciekłokrystalicznej. Aby rozpocząć przygotowanie rusztowania elastomeru ciekłokrystalicznego, połącz 0,75 g trójramiennego SBC z alfa-cholesterylem, 0,25 ml HDI oraz 0,24 ml destylowanego epsilon-kaprolaktonu.Do otrzymanej mieszaniny dodaj 60 µL 10-2-ethylhexanoate i wymieszaj na wortexie. Następnie wytnij fragment pianki niklowej o wymiarach 1 cm na 4 cm. Zwiń piankę niklową w cylinder o średnicy 1 cm i wysokości 1 cm, aby utworzyć matrycę dla rusztowania z pianki z elastomerowego kryształu ciekłego.Umieść matrycę w szklanej fiolce lub obudowie z folii aluminiowej, a następnie wlej mieszaninę elastomeru ciekłokrystalicznego na matrycę, aż zostanie ona całkowicie pokryta. Pozostaw matrycę w mieszaninie elastomeru ciekłokrystalicznego na dwie minuty, a następnie usuń nadmiar za pomocą pipety. Podgrzewaj mieszaninę wraz z matrycą w temperaturze 80 °C przez noc.Następnie zdejmij folię aluminiową lub rozbij szkło. Użyj żyletki, aby usunąć nadmiar ciekłokrystalicznego elastomeru i odsłonić niklową matrycę. Umieść piankę w kolbie i dodaj 70 mililitrów nasyconego wodnego roztworu chlorku żelaza(III).Mieszać piankę w roztworze przez trzy dni w temperaturze pokojowej, aby rozpuścić szablon niklowy. Co 24 godziny mieszać piankę w wodzie dejonizowanej przez 30 minut, a następnie powrócić do mieszania w świeżym roztworze trójchlorowego żelaza. Po drugim dniu mieszania przeprowadzić test sprężystości dotykowej pianki z elastomeru ciekłokrystalicznego.Opór przy ściskaniu dotykowym wskazuje, że szablon niklowy wciąż znajduje się w piance. Po trzecim dniu cały szablon niklowy zostaje usunięty, a powstała pianka wydaje się bardzo miękka i łatwa do pełnego ściśnięcia. Szablon niklowy musi zostać całkowicie usunięty.Ważne jest, aby dokładnie płukać piankę z elastomeru ciekłokrystalicznego w chlorku żelaza, aż stanie się miękka w dotyku podczas wykonania testu kompresji taktylnej. Rusztowanie z pianki z elastomeru ciekłokrystalicznego jest teraz gotowe do charakterystyki i użycia. Po zmiękczeniu pianki z elastomeru ciekłokrystalicznego należy opłukać ją 70% etanolem w celu sterylizacji.Aby rozpocząć procedurę zasiewu, należy ponownie przemyć rusztowania z pianki elastomerowej z ciekłymi kryształami dwukrotnie w 1 ml 70% ethanolu w celu sterylizacji powierzchni elastomeru. Następnie rusztowania należy naświetlić światłem UV przez 10 minut. Rusztowania przemywa się kolejną porcją 1 ml 70% ethanolu.Płukanie rusztowań należy przeprowadzić za pomocą 1 ml sterylnej wody oraz 1 ml soli fizjologicznej w buforze fosforanowym (PBS). Zesterylizowane rusztowania z elastomeru ciekłokrystalicznego należy umieścić w 24-dołkowych płytkach hodowlanych. Następnie należy przygotować i policzyć zawiesinę odpowiednich komórek w odpowiedniej pożywce do wzrostu komórek z dodatkiem penicyliny i streptomycyny.Rozcieńczyć zawiesinę komórkową do stężenia 1,5 × 10⁵ komórek na 100 µl przy użyciu pożywki wzrostowej. Nanieść kroplę rozcieńczonej zawiesiny komórkowej na wierzch każdego rusztowania z elastomeru ciekłokrystalicznego. Inkubować zasiane rusztowania z elastomeru ciekłokrystalicznego w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO2 przez dwie godziny.Do każdego rusztowania należy dodać kolejne 0,5 mililitra pożywki wzrostowej i kontynuować inkubację. Co 48 godzin należy przemyć zasiane rusztowania jednym mililitrem PBS i dodać świeżą pożywkę wzrostową. Inkubację rusztowań kontynuować do momentu, aż komórki będą gotowe do badania mikroskopowego.Te symetryczne LC umożliwiają badanie złożonych konstruktów tkankowych, jednocześnie sprzyjając wzrostowi i proliferacji komórek. Aby zachować żywotność komórek, pianki muszą być sterylizowane, a czystość kultur utrzymywana przez cały czas. W celu przygotowania do mikroskopii, utrwal komórki na rusztowaniach za pomocą roztworu 4% paraformaldehydu w PBS przez 15 minut.Namocz próbki trzykrotnie w 3 ml PBS przez 5 minut. Umieść jedną próbkę rusztowania w probówce Eppendorf. Barw próbkę roztworem 0,1% DAPI w 500 µl PBS przez 10 minut.Próbkę należy dwukrotnie wymoczyć w 1 ml PBS przez pięć minut. Następnie bezzwłocznie należy wykonać obrazowanie próbki za pomocą mikroskopii konfokalnej. Należy zarejestrować serie obrazów (stacki) obejmujące całą próbkę, a następnie przeanalizować dane w programie do przetwarzania obrazów.Trójramienny kopolimer blokowy (SBC) z motywami ciekłokrystalicznymi został odlany na szablonie z pianki niklowej z użyciem HDI jako sieciującego. Szablon niklowy usunięto poprzez trawienie, aby uzyskać piankę z elastomeru ciekłokrystalicznego. W celu monitorowania procesu trawienia okresowo przeprowadzano testy odkształcenia przez ściskanie.Po całkowitym rozpuszczeniu niklu badania odkształcenia ściskaniem wykazały 70% redukcję rozmiaru podczas ściskania. Po zwolnieniu nacisku pianka z elastomeru ciekłokrystalicznego konsekwentnie powracała do swojego pierwotnego rozmiaru i kształtu. Zachowanie to przypisuje się fragmentom ciekłokrystalicznym, ponieważ podobne pianki elastomerowe pozbawione fragmentu cholesterolu epsilon-kaprolaktonu nie odzyskiwały kształtu po ściskaniu.Obrazowanie SCM wewnętrznej morfologii pianki wykazało połączoną sieć pustych rozpórek pianki. Regularna morfologia została przypisana strukturze pianki niklowej, co wskazuje, że wielkość porów i ogólny kształt można kontrolować poprzez wybór odpowiedniej matrycy metalicznej. Piankę zasiano komórkami neuroblastoma, które w ciągu dwóch dni przytwierdziły się do ścian sieci.30 dni po wysiewaniu, mikroskopia konfokalna wykazała, że komórki rozprzestrzeniły się na sieci elastomerze ciekłokrystalicznym i utworzyły wiele warstw rozproszonych w całej piance elastomerowej. Zaobserwowano wydłużenie jąder komórkowych, co korelowało z orientacją komórek. Po opanowaniu techniki, można ją przeprowadzić w ciągu trzech do czterech tygodni, pod warunkiem prawidłowego wykonania.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat projektowania i przygotowywania rusztowań komórkowych z elastomerów ciekłokrystalicznych o określonych rozmiarach porów i morfologii. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest pełne scharakteryzowanie każdego produktu oraz monitorowanie żywotności i proliferacji komórek. Ponadto, właściwa technika barwienia jest istotna dla łatwego pozyskania obrazów z mikroskopii konfokalnej.Po zastosowaniu tej procedury elastomery ciekłokrystaliczne mogą być również poddane działaniu bodźców zewnętrznych, takich jak naprężenia, pola magnetyczne i elektryczne, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące tego, w jaki sposób anizotropowe uporządkowanie cząsteczkowe elastomerów ciekłokrystalicznych wpływa na odpowiedź komórkową. Znaczenie tej techniki znajduje zastosowanie w badaniu procesów chorobowych, ponieważ dostarcza ona platformy do dynamicznego badania wpływu czynników zewnętrznych na symulowaną aktywność choroby oraz następujące po niej procesy naprawcze. Chociaż ta smektyczna pianka z elastomeru ciekłokrystalicznego może dostarczyć wglądu w oddziaływania międzykomórkowe, może ona być również stosowana z innymi materiałami, takimi jak nanostruktury półprzewodnikowe lub metaliczne.Po opracowaniu technika ten utorował drogę badaczom w dziedzinach biomedycznych do projektowania długoterminowych platform eksperymentalnych odzwierciedlających układy żywe.

synthesis-biocompatible-liquid-crystal-elastomer-foams-as-cell

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Niniejsza praca szczegółowo opisuje przygotowanie trójwymiarowych (3D) rusztowań fibrynowych do hodowli i różnicowania pluripotencjalnych komórek macierzystych. Takie rusztowania mogą być wykorzystywane do badania wpływu różnych związków biologicznych na zachowanie komórek macierzystych, a także modyfikowane w celu włączenia systemów dostarczania leków.

Przygotowanie trójwymiarowych rusztowań fibrynowych do zastosowań w hodowli komórek macierzystych

Ten film opisuje metodę syntezy czystych pianek pochodzących z ECM bez potrzeby chemicznego sieciowania. Te pianki pochodzące z ECM znajdują zastosowanie jako zaawansowane modele hodowli komórkowych 3D in vitro lub jako proregeneracyjne biorusztowania.

Wytwarzanie pianki pochodzącej z macierzy zewnątrzkomórkowej poprzez liofilizację: procedura generowania rusztowań biologicznych z ECM tkanek zdecelularyzowanych

Biokompatybilne nanoczujniki zol-żel reagujące na pH mogą być wbudowane w elektrowirowane rusztowania z poli(kwasu mlekowo-ko-glikolowego) (PLGA). Wyprodukowane rusztowania samoraportujące mogą być wykorzystywane do monitorowania warunków mikrośrodowiskowych in situ podczas hodowli komórek na rusztowaniu. Jest to korzystne, ponieważ konstrukt komórkowy 3D może być monitorowany w czasie rzeczywistym bez zakłócania eksperymentu.

Rusztowania samoraportujące do trójwymiarowej hodowli komórkowej

Ten manuskrypt przedstawia szczegółowy protokół wytwarzania powstającej trójwymiarowej platformy hodowli hepatocytów, odwróconego koloidalnego kryształowego rusztowania oraz towarzyszących technik oceny zachowania hepatocytów. Kontrolowane pory o kontrolowanej wielkości, wzajemne połączenia i zdolność do koniugacji białek macierzy zewnątrzkomórkowej z rusztowaniem z poli(glikolu etylenowego) (PEG) zwiększają wydajność komórek Huh-7,5.

Wytwarzanie rusztowania z poli(glikolu etylenowego) z odwróconego koloidalnego kryształu: trójwymiarowa platforma do hodowli komórek do inżynierii tkankowej wątroby

Tkankowa matryca zewnątrzkomórkowa (ECM) jest kluczowym mediatorem funkcji komórki. W artykule opisano metody syntezy czystych pianek i mikronośników pochodzących z ECM, które są stabilne w hodowli bez konieczności sieciowania chemicznego do zastosowań w zaawansowanych modelach hodowli komórkowych 3D in vitro lub jako proregeneracyjne biorusztowania.

Wytwarzanie pianek i mikronośników pochodzących z macierzy zewnątrzkomórkowej jako specyficznych tkankowo platform do hodowli i dostarczania komórek

Tutaj opisujemy łatwe przygotowanie hydrożeli iniekcyjnych na bazie chitozanu przy użyciu dynamicznej chemii iminowej. Przedstawiono metody regulacji wytrzymałości mechanicznej hydrożelu i jego zastosowania w hodowli komórkowej 3D.

Przygotowanie hydrożeli iniekcyjnych na bazie chitozanu i jego zastosowanie w hodowli komórkowej 3D

Tutaj prezentujemy protokół uzyskiwania systemów hodowli 3D w samoorganizujących się rusztowaniach peptydowych, aby promować różnicowanie odróżnicowanych ludzkich chondrocytów stawowych w tkankę podobną do chrząstki.

Hodowla komórek ssaków w trójwymiarowych rusztowaniach peptydowych

Przedstawiono protokół procesu produkcji polimerowych cienkowarstwowych struktur kompozytowych o różnych modułach lub grubościach Younga. Folie są produkowane do zaawansowanych badań nad kulturami komórkowymi lub jako kleje do skóry.

Cienkowarstwowe kompozytowe elastomery krzemowe do hodowli komórkowych i zastosowań skórnych: produkcja i charakterystyka

Mikrożelowe pręty z komplementarnymi grupami reaktywnymi są produkowane za pomocą mikrofluidyki z możliwością łączenia się w roztworze wodnym. Anizometryczne mikrożele zacinają się i łączą w stabilne konstrukcje z większymi porami w porównaniu z systemami sferycznymi. Mikrożele modyfikowane za pomocą GRGDS-PC tworzą makroporowate konstrukcje 3D, które można wykorzystać do hodowli komórkowych.

Połączone makroporowate rusztowania 3D z prętów mikrożelowych

Zoptymalizowaliśmy technikę mikroenkapsulacji jako efektywną platformę 3D do propagacji i różnicowania embrionalnych komórek macierzystych w endodermę oraz neurony dopaminergiczne (DA). Zapewnia ona również możliwość immunoisolacji komórek od gospodarza podczas transplantacji. Platforma ta może zostać dostosowana do innych typów komórek.

Mikrokapsułka alginianowa jako trójwymiarowa platforma do propagacji i różnicowania ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (hESC) w różne linie komórkowe

Poznaj metodę syntezy biokompatybilnych pianek elastomerowych ciekłokrystalicznych jako rusztowań 3D do hodowli komórkowej. Technika umożliwia badanie przestrzennych interakcji międzykomórkowych i proliferacji komórek.

Synteza biokompatybilnych pianek elastomerowych ciekłokrystalicznych jako rusztowań komórkowych do przestrzennych hodowli komórkowych 3D (Wideo) | JoVE Journal

Synteza biokompatybilnych pianek elastomerowych ciekłokrystalicznych jako rusztowań komórkowych do przestrzennych hodowli komórkowych 3D

Przeglądaj więcej filmów