Synteza biokompatybilnych pianek elastomerowych ciekłokrystalicznych jako rusztowań komórkowych do przestrzennych hodowli komórkowych 3D

Celem zabiegu jest przygotowanie biodegradowalnych, trójwymiarowych rusztowań komórkowych przypominających piankę na bazie biokompatybilnych elastomerów ciekłokrystalicznych o łańcuchu bocznym. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie ciekłokrystalicznej i biomedycznej, takie jak wpływ właściwości elastomeru ciekłokrystalicznego na proliferację i wyrównanie komórek. Główną zaletą tej metody dwuwymiarowych rusztowań komórkowych jest to, że pozwala ona na badanie przestrzennych interakcji komórka-komórka, co jest rzadko możliwe w makrośrodowiskach 2D.

Ogólnie rzecz biorąc, ci, którzy są nowicjuszami w tej metodzie, będą zmagać się z testami kompresji dotykowej. Po raz pierwszy wpadliśmy na pomysł tej metody po tym, jak musieliśmy zmienić pożywkę w setkach szalek Petriego. Zastanawialiśmy się, czy elastomery ciekłokrystaliczne mogą wspierać komórki mięśniowe w sieci 3D, aby wyeliminować użycie tak wielu szalek Petriego.

Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ niektóre kroki wymagają starannej manipulacji chemikaliami. Co więcej, kształtowanie szablonu z pianki metalowej może być trudne. Najpierw napełnij 20-mililitrową ampułkę 2% objętościowo roztworem PFOTES w toluenie.

Mieszaj roztwór w ampułce przez 24 godziny, aby sylianizować wnętrze ampułki. Opłucz silanizowaną ampułkę alkoholem izopropylowym i susz ją w temperaturze 140 stopni Celsjusza przez 30 minut. Umieść 3,64 grama destylowanego epsilon-kaprolaktonu, 0,5 grama alfa-chloro-epsilon-kaprolaktonu i 0,25 mililitra glicerolu w suchej ampułce.

Mieszaj mieszaninę przez minutę. Następnie dodaj 4,90 grama DL-laktydu do mieszaniny i przedmuchuj atmosferę ampułki gazowym azotem przez jedną minutę. Przykryj otwór ampułki folią aluminiową i podgrzewaj mieszaninę w temperaturze 120 stopni Celsjusza przez około dwie godziny, aby stopić DL-laktyd.

Zwiruj mieszaninę, aby rozbić wszelkie niestopione ciała stałe, a następnie dodaj 66 mikrolitrów 10-2-etyloheksanianu do ampułki i ponownie wiruj. Zamknij ampułkę folią aluminiową i podgrzewaj mieszaninę w temperaturze 120 stopni Celsjusza przez 10 minut, aby ponownie stopić DL-laktyd. Gdy DL-laktyd ponownie się stopi, energicznie zmieszaj mieszaninę i oczyść atmosferę ampułki gazowym azotem.

Uszczelnij ampułkę gumową przegrodą. Włóż igłę podłączoną do przewodu podciśnieniowego przez przegrodę i uruchom próżnię. Uszczelnij płomieniowo szyjkę ampułki, uważając, aby nie stopić gumowego korka.

Po uszczelnieniu szyjki podgrzej mieszaninę reakcyjną w temperaturze 140 stopni Celsjusza przez 48 godzin. Następnie pozwól mieszaninie ostygnąć do temperatury pokojowej. Rozbić ampułkę i rozpuścić lepką mieszaninę reakcyjną w 10 mililitrach dichlorometanu.

Przenieść mieszaninę do rozdzielacza. Umieścić kolbę zawierającą 100 mililitrów metanolu w kąpieli suchego lodu i acetonu, aby schłodzić metanol do około minus 78 stopni Celsjusza. Gdy metanol ostygnie, zabezpieczyć rozdzielacz separatora nad kolbą.

Dodaj mieszaninę reakcyjną do zimnego metanolu w ilości dwóch kropli na sekundę. Zebrać powstały biały osad na bibule filtracyjnej. Wysuszyć osad w piecu próżniowym w temperaturze od 50 do 60 stopni Celsjusza, aby otrzymać trójramienny produkt alfa-chloro SBC.

Aby przygotować trójramienny SBC alfa cholesteryl, atom chloru wisiorka jest zastępowany azydkiem. W wyniku reakcji klikania z 5-heksynoinianem cholesterolu powstaje wiszący cholesterol jako ugrupowanie ciekłokrystaliczne. Aby rozpocząć przygotowanie rusztowania z elastomeru ciekłokrystalicznego, połącz 0,75 grama trójramiennego SBC alfa-cholesterylu z 0,25 mililitra HDI i 0,24 mililitra destylowanego epsilonu-kaprolaktonu.

Dodaj do tego 60 mikrolitrów 10-2-etyloheksanianu i zwiruj mieszaninę. Następnie wytnij kawałek pianki niklowej o wymiarach jeden centymetr na cztery centymetry. Zwiń piankę niklową w cylinder o średnicy jednego centymetra i wysokości jednego centymetra, aby utworzyć szablon dla rusztowania z pianki elastomerowej ciekłokrystalicznej.

Umieścić szablon w szklanej fiolce lub obudowie z folii aluminiowej i wlać mieszaninę elastomeru ciekłokrystalicznego na szablon, aż zostanie całkowicie pokryty. Pozostaw szablon w mieszaninie elastomerów ciekłokrystalicznych na dwie minuty, a następnie usuń nadmiar pipetą. Podgrzej mieszaninę i szablon w temperaturze 80 stopni Celsjusza przez noc.

Następnie oderwij folię aluminiową lub rozbij szkło. Użyj żyletki, aby usunąć nadmiar elastomeru ciekłokrystalicznego, aby odsłonić niklowo-metalowy szablon. Umieścić pianę w kolbie i dodać 70 mililitrów nasyconego wodnego roztworu chlorku żelaza i trój.

Mieszaj pianę w roztworze przez trzy dni w temperaturze pokojowej, aby rozpuścić niklową matrycę. Co 24 godziny mieszaj piankę w wodzie dejonizowanej przez 30 minut, a następnie wznów mieszanie ze świeżym roztworem chlorku i trzech żelaza. Po drugim dniu mieszania należy przeprowadzić dotykową próbę ściskania pianki z elastomeru ciekłokrystalicznego.

Odporność na ucisk dotykowy wskazuje, że niklowy szablon jest nadal obecny w piance. Po trzecim dniu cały szablon niklu został usunięty, a powstała piana wydaje się bardzo miękka i łatwa do pełnego skompresowania. Szablon niklu musi zostać całkowicie wyeliminowany.

Ważne jest, aby dokładnie spłukać piankę z elastomeru ciekłokrystalicznego w chlorku żelaza, aż stanie się miękka w dotyku po wykonaniu dotykowego testu ściskania. Rusztowanie z pianki ciekłokrystalicznej z elastomeru jest teraz gotowe do scharakteryzowania i użycia. Gdy pianka z elastomeru ciekłokrystalicznego będzie miękka, spłucz ją 70% etanolem, aby ją wysterylizować.

Aby rozpocząć procedurę wysiewu, należy ponownie umyć rusztowania z pianki z elastomeru ciekłokrystalicznego dwukrotnie w jednym mililitrze 70% etanolu w celu wysterylizowania powierzchni elastomerowych. Następnie należy naświetlać rusztowania światłem UV przez 10 minut. Umyj rusztowania kolejną porcją jednego mililitra 70% etanolu.

Opłucz rusztowania po jednym mililitrze sterylnej wody i soli fizjologicznej buforowanej fosforanami. Załaduj wysterylizowane rusztowania z elastomeru ciekłokrystalicznego do 24-dołkowych płytek hodowlanych. Przygotować i policzyć zawiesinę komórek będących przedmiotem zainteresowania w odpowiedniej pożywce do wzrostu komórek z penicyliną i streptomycyną.

Rozcieńczyć zawiesinę komórek 1,5 razy 10 do piątych komórek na 100 mikrolitrów za pomocą pożywki wzrostowej. Umieść kroplę rozcieńczonej zawiesiny komórek na wierzchu każdego rusztowania z elastomeru ciekłokrystalicznego. Inkubować rusztowania z elastomeru ciekłokrystalicznego w temperaturze 37 stopni Celsjusza w atmosferze 5% CO2 przez dwie godziny.

Dodaj kolejne 0,5 mililitra pożywki wzrostowej do każdego rusztowania i kontynuuj inkubację. Co 48 godzin myj rusztowania z nasionami jednym mililitrem PBS i dodaj świeże podłoże wzrostowe. Kontynuuj inkubację rusztowań, aż komórki będą gotowe do mikroskopii.

Te smetyczne LC umożliwiają badanie złożonych konstruktów tkankowych, jednocześnie promując wzrost i proliferację komórek. Aby utrzymać żywotność komórek, pianki muszą być sterylizowane, a czystość kultur utrzymywana przez cały czas. Aby przygotować się do mikroskopii, przymocuj komórki do rusztowań roztworem 4% paraformaldehydu w PBS przez 15 minut.

Namocz próbki trzykrotnie w trzech mililitrach PBS przez pięć minut. Umieść jedną próbkę rusztowania w probówce Eppendorfa. Wybarwić próbkę roztworem 0,1% DAPI w 500 mikrolitrach PBS przez 10 minut.

Namocz próbkę dwukrotnie w jednym mililitrze PBS przez pięć minut. A następnie natychmiast zobrazuj próbkę za pomocą mikroskopii konfokalnej. Zdobądź stosy obrazów obejmujące próbkę i przeanalizuj dane w programie do przetwarzania obrazów.

Trójramienny SBC z ugrupowaniami ciekłokrystalicznymi został odlany na matrycy z pianki niklowej z HDI jako środkiem sieciującym. Szablon niklu usunięto przez trawienie w celu uzyskania ciekłokrystalicznej pianki elastomerowej. Okresowo przeprowadzano testy deformacji przy ściskaniu w celu monitorowania procesu trawienia.

Gdy nikiel został całkowicie rozpuszczony, test odkształcenia przy ściskaniu wykazał 70% zmniejszenie rozmiaru po ściśnięciu. Po zwolnieniu kompresji ciekłokrystaliczna pianka elastomerowa konsekwentnie odzyskiwała swój pierwotny rozmiar i kształt. Zachowanie to przypisuje się ugrupowaniom ciekłokrystalicznym, ponieważ podobne pianki elastomerowe pozbawione ugrupowania cholesterolu epsilon-kaprolakton nie odzyskały się po ściskaniu.

SCM wewnętrznej morfologii piany wykazał wzajemnie połączoną sieć pustych rozpórek piankowych. Regularna morfologia została przypisana strukturze pianki niklowej, co wskazuje, że wielkość porów i ogólny kształt można kontrolować poprzez wybór odpowiedniego metalowego szablonu. Piana została wysiana komórkami nerwiaka zarodkowego, które przyczepiły się do ścian sieci w ciągu dwóch dni.

30 dni po wysiewie mikroskopia konfokalna ujawniła, że komórki rozciągały się nad siecią elastomerów ciekłokrystalicznych i tworzyły wiele warstw rozproszonych w piance elastomerowej. Zaobserwowano wydłużenie jąder komórkowych, które było skorelowane z wyrównaniem komórek. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu trzech do czterech tygodni, jeśli zostanie wykonana prawidłowo.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak projektować i przygotowywać rusztowania komórkowe z elastomeru ciekłokrystalicznego o określonych rozmiarach porów i morfologii. Podczas próby tej procedury ważne jest, aby w pełni scharakteryzować każdy produkt oraz monitorować żywotność i ekspansję komórek. Ponadto ważna jest właściwa technika barwienia, aby łatwo uzyskać obrazy z mikroskopii konfokalnej.

Po tej procedurze elastomery ciekłokrystaliczne mogą być również wystawione na bodźce zewnętrzne, takie jak stres lub pola magnetyczne i elektryczne, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące tego, jak anizotropowe uporządkowanie molekularne elastomerów ciekłokrystalicznych wpływa na odpowiedź komórkową. Implikacje tej techniki odnoszą się do badania procesów chorobowych, ponieważ zapewnia ona platformę do dynamicznego badania wpływu czynników zewnętrznych na symulowaną aktywność choroby i późniejsze procesy naprawcze. Chociaż ta smektyczna pianka z elastomeru ciekłokrystalicznego może zapewnić wgląd w interakcje komórka-komórka, może być również stosowana z innymi materiałami, takimi jak półprzewodniki lub nanostruktury metalowe.

Po jej opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom z dziedzin biomedycznych do projektowania długoterminowych platform eksperymentalnych odzwierciedlających żywe systemy.