En Face Przygotowanie naczyń krwionośnych myszy

Opisano procedurę przygotowania en face tętnicy szyjnej i aorty myszy. Takie preparaty, po immunofluorescencyjnym wybarwieniu specyficznymi przeciwciałami, umożliwiają badanie lokalizacji białek i identyfikację typów komórek w obrębie całej ściany naczyniowej za pomocą mikroskopii konfokalnej.

Ogólnym celem tej procedury jest przygotowanie mysiej aorty i tętnicy szyjnej do barwienia immunologicznego en face po podwiązaniu lewej tętnicy szyjnej. Metoda ta pozwala nam badać organizację, ekspresję każdego białka oraz możliwy stan komórek antralnych i innych komórek naczyniowych w metodach barwienia immunologicznego. Preparaty en face umożliwiają analizę dużych obszarów w naczyniach krwionośnych w celu oceny regionalnych różnic w ekspresji różnych normalnych i możliwych parametrów komórek.

Procedurę zademonstruje dr Quaico, mikrochirurg z naszej grupy. Zacznij od umieszczenia znieczulonej myszy na desce chirurgicznej w pozycji leżącej. Po potwierdzeniu braku reakcji na przyklejenie palców przyklej przednie łapy do deski w pozycji rozciągniętej na zewnątrz, a obie tylne nogi do prawej strony myszy, aby odsłonić na lewą stronę szyi.

Usuń włosy wokół szyjki macicy i zdezynfekuj odsłoniętą skórę. Przykryj mysz wysterylizowaną serwetą chirurgiczną z otworem nad obszarem operacyjnym i nałóż maść na oczy zwierzęcia. Przesuń mysz pod mikroskopem preparacyjnym i wykonaj brzuszne nacięcie linii środkowej wokół obszaru szyjki macicy.

Zmień położenie gruczołów ślinowych pokrywających naczynia krwionośne po lewej stronie zwierzęcia, aby odsłonić lewą tętnicę szyjną wspólną, która rozdziela się na lewą tętnicę szyjną wewnętrzną i lewą tętnicę szyjną zewnętrzną. Delikatnie usuń tkankę łączną wokół i poniżej lewej tętnicy szyjnej wewnętrznej i za pomocą kleszczy przełóż pod tętnicą 2,5-centymetrowy wstępnie przycięty jedwabny sześcian o długości 2,5 cala, używając drugich kleszczyków, aby przeciągnąć szew mniej więcej w jednej trzeciej jego długości na drugą stronę naczynia. Podwiązywać lewą tętnicę szyjną wewnętrzną.

Następnie usuń tkankę łączną wokół lewej tętnicy szyjnej zewnętrznej, jak właśnie pokazano, i wykonaj podwiązanie proksymalnie do lewej tętnicy tarczycy górnej. Kiedy wszystkie tętnice, z wyjątkiem tętnicy potylicznej, zostaną podwiązane, przywróć gruczoły ślinowe do ich pierwotnych pozycji i nawodnij pole operacyjne dwiema do trzech kroplami soli fizjologicznej. Następnie użyj sześciu szwów vicryl pokrytych O, aby zamknąć skórę i umieść mysz w wstępnie ogrzanej klatce z monitorowaniem aż do pełnego leżenia.

Po zakończeniu eksperymentu zabezpiecz mysz w pozycji leżącej na desce preparacyjnej i użyj nożyczek do tęczówki, aby odsłonić jamę brzuszną z nacięciem w linii środkowej. Przetnij żebra bocznie do mostka, aby odsłonić klatkę piersiową. Następnie naciąć tętnicę udową i wprowadzić igłę o rozmiarze 26 przymocowaną do obfitości grawitacyjnej umieszczonej w wierzchołku lewej komory, aby napełnić układ krążenia roztworem soli fizjologicznej uzupełnionym heparyną.

Kontynuuj obfitowanie, aż sól fizjologiczna wypływająca z nacięcia stanie się czysta. Następnie zmień system profusion z soli fizjologicznej na 4% paraformaldehydu w PBS. Po pięciu minutach przenieś mysz pod mikroskop preparacyjny i użyj nożyczek i kleszczy, aby pobrać aortę oraz lewą i prawą tętnicę szyjną.

Następnie przenieś tkanki na szalkę Petriego PBS i ostrożnie usuń tłuszcz i tkankę łączną, a następnie oddziel i podłużnie rozdziel aortę i tętnice szyjne w celu odsłonięcia śródbłonka. Najważniejszą rzeczą, o której należy pamiętać podczas przygotowywania preparatów naczyń krwionośnych en face, jest to, że komórki śródbłonka łatwo ulegają uszkodzeniu w wyniku nieostrożnego obchodzenia się z nimi. W żadnym momencie nie rozciągaj naczyń, zwłaszcza podczas zbioru i czyszczenia.

Następnie przenieś każde naczynie do indywidualnych studzienek 12-dołkowej płytki zawierającej 0,5 mililitra roztworu przepuszczalnego na studzienkę. Udrażniaj naczynia krwionośne przez 10 minut, kołysząc w temperaturze pokojowej, a następnie krótko myj w PBS. Zablokuj wszelkie niespecyficzne wiązania za pomocą 30-minutowej inkubacji w 10% normalnej surowicy tego samego gatunku, co planowane przeciwciała drugorzędowe w TTBS, z kołysaniem w temperaturze pokojowej.

Następnie oznacz próbki pierwszorzędowymi przeciwciałami będącymi przedmiotem zainteresowania, rozcieńczonymi w TTBS 10% normalną surowicą przez noc z kołysaniem w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnego ranka przepłucz naczynia krwionośne trzema 10-minutowymi płukaniami w TTBS z kołysaniem w temperaturze pokojowej, a następnie inkubacją w odpowiednich przeciwciałach drugorzędowych rozcieńczonych w TTBS i 10% normalnej surowicy i dappy. Umieść próbki z powrotem na wahaczu i pokrywie, aby chronić przed światłem.

Po jednej godzinie w temperaturze pokojowej z kołysaniem należy przemyć próbki trzykrotnie w świeżym TTBS, jak pokazano, a następnie krótko przepłukać w PBS i umieścić jedną kroplę odczynnika zapobiegającego blaknięciu na każde naczynie na indywidualne okulary nakrywkowe o wymiarach 22 na 50 milimetrów. Pod mikroskopem umieść jedno naczynie w każdej kropli odczynnika śródbłonkiem skierowanym w dół i przykryj naczynia jednym szkiełkiem o wymiarach 22 na 75 milimetrów na próbkę. Umieść szkiełka na czystej chusteczce laboratoryjnej i przykryj je dwoma kawałkami chusteczki laboratoryjnej i 3,5 kilograma wagi, aby spłaszczyć naczynia.

Po maksymalnie pięciu minutach usuń ciężarek i wytrzyj nadmiar roztworu z okolic szkiełek nakrywkowych. Następnie nałóż lakier do paznokci na cztery rogi szkiełek nakrywkowych i umieść szkiełka w pudełku na slajdy, szkiełkiem nakrywkowym do góry. Następnego ranka użyj więcej lakieru do paznokci, aby całkowicie uszczelnić szkiełka nakrywkowe i zobrazuj naczynia, gdy tylko lakier do paznokci wyschnie.

Tutaj pokazano typowy obraz immunoflorescencji en face śródbłonka podwójnie wybarwionego kadheryną anty VE i cząsteczką adhezyjną komórek naczyniowych One i ilustrujący pojedynczy przekrój optyczny aorty myszy pobrany w pobliżu ujścia tętnicy międzyżebrowej. Zwróć uwagę na zielone liniowe zabarwienie konturu na złączu adhezyjnym komórek śródbłonka i silną cząsteczkę adhezji komórek naczyniowych, jedno barwienie przy ujściu tętnicy międzyżebrowej, o której wiadomo, że występuje zaburzony przepływ krwi. Na tych obrazach można zaobserwować barwienie en face częściowo podwiązanej lewej tętnicy szyjnej i kontrolnej niepodwiązanej prawej tętnicy dzień po operacji, ze zwiększoną cząsteczką adhezyjną komórek naczyniowych z jednym zabarwieniem widocznym w podwiązanym naczyniu.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wykonać częściowe podwiązanie lewej tętnicy szyjnej i przygotować się en face w naczyniach krwionośnych myszy. Zabierz to ze swoim optykiem do innych małych zwierząt. Stosowanie preparatów en face jest obecnie ograniczone do barwienia immunofluorescencyjnego, ale może być również stosowane z innymi metodami, takimi jak badanie całych obszarów po barwieniu wilgi lub do eksperymentów ex vivo.