Profilowanie wyrażeń za pomocą mikrotablic

Mikromacierze DNA są szeroko stosowanymi narzędziami do jednoczesnego pomiaru ekspresji wielu różnych genów. Składają się one z tysięcy sond – z których każda reprezentuje inny gen – unieruchomionych na "chipach" lub szkiełkach i opierają się na komplementarnej hybrydyzacji w celu oceny ekspresji genów w różnych warunkach biologicznych.

W tym filmie omówione zostaną podstawowe zasady technologii mikromacierzy, protokół profilowania ekspresji genów za pomocą mikromacierzy oraz niektóre aktualne zastosowania.

Zacznijmy od omówienia zasad profilowania ekspresji genów i technologii mikromacierzy.

Jedną z najwcześniejszych metod opracowanych do oceny ekspresji genów w próbkach biologicznych jest Northern blotting, który polega na "sondowaniu" określonych cząsteczek RNA unieruchomionych na błonach. "Swobodnie pływające" sondy rozpoznają komplementarne sekwencje RNA w próbce i są zwykle znakowane cząsteczkami radioaktywnymi lub fluorescencyjnymi, aby można je było zwizualizować.

Postępy w mikrowytwarzaniu, sekwencjonowaniu genomu i innych technologiach doprowadziły do opracowania biochipa z mikromacierzami. Podobnie jak plamy północne, mikromacierze opierają się na zasadzie komplementarnego wiązania między sekwencjami kwasów nukleinowych sondy i próbki. Jednak w przeciwieństwie do Northern, w mikromacierzach to sondy oligonukleotydowe są unieruchomione na szkiełku podstawowym lub chipie. "Swobodnie pływające" próbki są generowane z RNA wyizolowanego z komórek lub organizmów będących przedmiotem zainteresowania, który jest odwrotnie transkrybowany do komplementarnego lub "c"-DNA. Można to albo bezpośrednio znakować cząsteczkami fluorescencyjnymi, albo ich ilości mogą być dalej wzmacniane przez transkrypcję in vitro do cRNA. Próbka jest następnie hybrydyzowana z chipem. Ponieważ sondy na mikromacierzach zaprojektowanych do różnych zastosowań mogą być albo "zmysłowe", co oznacza, że ich sekwencje są w tym samym kierunku, co ekspresja RNA organizmu, lub "antysensowne", naukowcy muszą upewnić się, że kierunkowość nici próbki jest komplementarna do kierunkowości sond.

"Surowe" dane dotyczące intensywności fluorescencji dla każdej specyficznej dla genu kropki na chipie można następnie określić ilościowo i przetworzyć. Dane można poddać dalszym testom statystycznym, takim jak test t Studenta, w celu określenia, czy sygnały fluorescencyjne - a tym samym poziomy ekspresji - dla genu będącego przedmiotem zainteresowania różnią się znacząco między dwoma typami komórek lub warunkami eksperymentalnymi.

Naukowcy mogą również wykorzystać te dane do "grupowania" lub grupowania genów w oparciu o podobne wzorce ekspresji. Na przykład, porównując wzorce ekspresji między dwiema populacjami komórek, można stwierdzić, że niektóre geny wykazują zmiany ekspresji o mniej więcej równoważne wartości w tym samym kierunku, a zatem zostaną zgrupowane razem. Naukowcy mogą zobrazować te relacje na diagramie drzew lub "dendrogramie", gdzie wysokość i układ "gałęzi" wskazują, jak podobne - lub różne - są wzorce ekspresji genów. Ten rodzaj analizy może dostarczyć informacji na temat sieci genów, ponieważ "zgrupowane" geny mogą uczestniczyć w tych samych szlakach biologicznych.

Teraz, gdy omówiliśmy zasady metodologii mikromacierzy, przyjrzyjmy się typowemu eksperymentowi z mikromacierzami.

Aby zapewnić jakość wyizolowanego RNA, miejsca pracy i sprzęt powinny być traktowane substancjami chemicznymi, które dezaktywują RNazy - enzymy, które w przeciwnym razie zniszczyłyby RNA. RNA jest następnie izolowane z próbek będących przedmiotem zainteresowania i oczyszczane, a jego stężenie i integralność są określane za pomocą spektrofotometrii.

Ta próbka RNA jest przekształcana w cDNA, a następnie w cRNA. Następnie próbka jest znakowana cząsteczkami fluorescencyjnymi i rozdrobniona, a jej jakość i ilość mogą być ponownie sprawdzone, w którym to czasie można również ocenić zakres znakowania fluorescencyjnego.

Znakowane cRNA jest następnie mieszane z "roztworem hybrydyzacyjnym" przed załadowaniem do mikromacierzy. Aby ułatwić udaną hybrydyzację, na chipie umieszcza się "mieszalnik", który tworzy "komory hybrydyzacyjne". Mieszanka hybrydyzacyjna jest następnie powoli dodawana do tablicy. Należy zachować ostrożność, aby uniknąć pęcherzyków powietrza, ponieważ mogą one zakłócać wiązanie próbki z określonymi obszarami mikromacierzy i powodować fałszywie ujemny sygnał. Po dodaniu próbki wióry są inkubowane w odpowiedniej temperaturze przez okres do 24 godzin.

Po hybrydyzacji mieszalnik wyjmuje się z chipa, niezwiązaną próbkę zmywa się, a matrycę dokładnie suszy się przez odwirowanie w specjalistycznej wirówce z suwakiem. Wysuszony chip jest wkładany do skanera mikromatrycowego, a maszyna jest regulowana tak, aby najjaśniejsze sygnały obserwowane na chipie nie były przesycone. Następnie mikromacierz jest skanowana i tworzony jest obraz całego chipa.

Po zeskanowaniu chipa plik obrazu jest ładowany do oprogramowania do ekstrakcji danych i oceniany pod kątem wszelkich nieprawidłowości sygnału. Dane wyodrębnione z obrazu mikromacierzy są poddawane szeregowi manipulacji statystycznych, w tym transformacji log₂, która pozwala badaczom numerycznie przedstawić dane pod względem wzrostów lub spadków ekspresji genów; a także normalizacja, która odpowiada za różnice w sygnale między układami mikromacierzy. Tak przetworzone dane mogą być następnie dalej analizowane.

Teraz, gdy pokazaliśmy, jak odbywa się profilowanie wyrażeń za pomocą mikrotablic, przyjrzyjmy się, jak mikrotablice mogą być używane w określonych eksperymentach.

Naukowcy często wykorzystują mikromacierze do oceny, jak zmienia się ekspresja genów w trakcie procesu biologicznego, takiego jak różnicowanie komórek. W tym miejscu naukowcy ocenili poziomy mikroRNA, które są małymi 22-nukleotydowymi RNA zaangażowanymi w precyzyjne dostrajanie ekspresji genów, w trzech typach komórek ludzkich reprezentujących różne etapy rozwoju siatkówki. Porównując ekspresję mikroRNA między tymi komórkami, naukowcy byli w stanie zidentyfikować geny potencjalnie zaangażowane w różnicowanie i rozwój tkanki siatkówki.

Mikromacierze mogą być również wykorzystywane do oceny różnic w ekspresji między różnymi typami komórek lub tkanek. W tym eksperymencie ustalono model zespołu stresu pourazowego (PTSD) u gryzoni, wystawiając szczury na wstrząsy elektryczne. Neurony pobrano z różnych regionów mózgu i wyizolowano RNA. Mikromacierze wykorzystano następnie do identyfikacji zróżnicowanej ekspresji genów związanych z mitochondriami w tych neuronach, dostarczając informacji na temat złożonych mechanizmów molekularnych stojących za PTSD.

Naukowcy stosują również mikromacierze w badaniach nad rakiem w nadziei, że uda się zidentyfikować nowe biomarkery choroby. W wyniku infekcji wirusami w trakcie naszej ewolucji, ludzkie genomy zawierają sekwencje genetyczne wirusów określane jako "endogenne retrowirusy" lub ERV, z których niektóre są nadal aktywnie wyrażane. W tym przypadku ekspresję ERV w tkankach nowotworowych i prawidłowych prostaty porównano za pomocą mikromacierzy. Metoda ta pozwoliła naukowcom wskazać kilka ERV, które były regulowane w górę w raku prostaty, co czyni je potencjalnymi biomarkerami, które można wykorzystać do diagnozowania choroby.

Właśnie obejrzałeś film JoVE na temat profilowania ekspresji genów za pomocą mikromacierzy. W tym filmie omówiono podstawowe zasady technologii mikromacierzy, protokół profilowania wyrażeń oraz zastosowania tej techniki. Jak zawsze, dziękujemy za oglądanie!