Sekwencja RNA

Sekwencjonowanie RNA lub sekwencjonowanie RNA to technika, która może dostarczyć informacji na temat sekwencji i ilości każdego wyrażonego RNA, znanego jako "transkryptom" w populacji komórek. W przeciwieństwie do innych metod profilowania ekspresji, takich jak mikromacierze, które obejmują sondowanie znanych sekwencji RNA, sekwencja RNA może profilować ekspresję genów z organizmów o niezsekwencjonowanych genomach. Dodatkowo, sekwencja RNA może dokładnie mierzyć większy zakres poziomów ekspresji transkryptu niż mikromacierze, zwłaszcza na bardzo niskich lub bardzo wysokich poziomach.

W tym filmie omówione zostaną zasady sekwencjonowania RNA, protokołu służącego do przygotowywania biblioteki sekwencjonowania RNA i analizowania danych, a także niektóre zastosowania tej techniki.

Najpierw przyjrzyjmy się kilku zasadom stojącym za sekwencją RNA. Sekwencjonowanie transkryptomu wymaga wyizolowania populacji transkryptów, których poziomy mają być mierzone. Większość RNA w komórkach to rybosomalny RNA lub rRNA, centralny składnik maszynerii produkcji białek w komórce. Aby ułatwić odzyskiwanie innych typów transkryptów, rRNA jest zwykle usuwane przed sekwencjonowaniem poprzez hybrydyzację próbki z komplementarnymi oligonukleotydami przyłączonymi do kulek magnetycznych i użycie magnesu do oddzielenia rRNA od reszty próbki.

Alternatywnie można wybrać określoną populację RNA do sekwencjonowania. Na przykład kodujące białka informacyjne RNA lub mRNA mogą być wychwytywane za pomocą "oligo-dT" - krótkich odcinków nukleotydów deoksy-T, które wiążą się z sekwencją zasad A znaną jako ogon poli-A na końcu tych transkryptów. Zanieczyszczające rRNA jest następnie usuwane. MikroRNA, które są 22-nukleotydowymi regulatorowymi RNA, mogą być selektywnie izolowane do sekwencjonowania w oparciu o ich rozmiar. Ponieważ RNA jest z natury podatne na degradację, jest najpierw odwrotnie transkrybowane do dwuniciowego DNA.

Sekwencje oligonukleotydowe znane jako adaptory są następnie ligowane do fragmentów DNA. Adaptery zawierają stałe regiony, które służą jako miejsca wiązania starterów do późniejszej amplifikacji PCR, a te są zwykle asymetryczne, dzięki czemu zachowana jest "nicość" matrycy. Adaptery zawierają również unikalne sekwencje, znane jako "kody kreskowe", które identyfikują wszystkie fragmenty pochodzące z pojedynczej próbki. Biblioteka jest następnie amplifikowana przez PCR.

Chip sekwencjonujący, na którym znajdują się oligonukleotydy komplementarne do adapterów, służy do unieruchamiania próbki bibliotecznej, która jest rozcieńczana tak, że cząsteczki DNA wyżarzają się na chipie przy niskiej gęstości. DNA jest amplifikowane na chipie w procesie zwanym "amplifikacją mostka" w celu utworzenia "klastrów klonalnych". Krótkie fragmenty, każdy o długości 30-150 zasad, są następnie syntetyzowane z jednego lub obu końców tych matryc DNA, generując setki milionów produktów znanych jako odczyty sekwencjonowania.

Wyniki sekwencjonowania są następnie analizowane pod kątem jakości, a dane są przetwarzane. Analiza sekwencji może ujawnić szeroką gamę informacji, w tym różnice w poziomach ekspresji RNA między próbkami a nieznanymi wcześniej transkryptami lub formami transkryptów.

Teraz, gdy już wiemy, jak działa sekwencja RNA, przejdźmy przez protokół przygotowania biblioteki sekwencjonowania RNA i analizy danych sekwencji. RNA jest najpierw pozyskiwane z interesującej nas próbki, a jego jakość jest sprawdzana za pomocą elektroforezy, na przykład za pomocą urządzenia mikroprzepływowego zwanego bioanalizatorem. RNA musi być wysokiej jakości, aby uzyskać dokładne wyniki sekwencjonowania. Aby zapewnić brak zanieczyszczenia DNA, RT-PCR dla wyrażonego genu przeprowadza się z odwrotną transkryptazą lub bez niej. Nie powinno być żadnych produktów w przypadku braku odwrotnej transkryptazy.

Aby wybrać poli-A RNA, próbki są wiązane z sondami oligo-dT przymocowanymi do kulek magnetycznych. Wyselekcjonowane RNA jest fragmentowane na 200 fragmentów nukleotydowych w wysokiej temperaturze w obecności jonów magnezu, co zmniejsza odchylenia zależne od długości w kolejnych reakcjach i analizach. Fragmenty są następnie przekształcane w dwuniciowe DNA, a adaptory są ligowane. Biblioteka jest amplifikowana metodą PCR, a jej jakość jest sprawdzana na bioanalizatorze i poprzez wykonanie qPCR. Wyniki bioanalizatora powinny ujawnić szczyt produktów o wielkości oczekiwanej na podstawie średniego rozmiaru fragmentu i długości adapterów.

Biblioteki z różnych próbek, zawierające różne adaptery z kodami kreskowymi, mogą być mieszane ze sobą, wraz z próbką referencyjnego DNA dodawaną w niskim stężeniu jako kontrola jakości dla kolejnych etapów procesu, takich jak generowanie klastrów klonalnych i reakcje sekwencjonowania. Mieszaninę dodaje się do chipa sekwencjonującego i ładuje do maszyny.

Podczas reakcji sekwencjonowania monitorowana jest gęstość klastrów DNA: nie może być zbyt wysoka, co może prowadzić do zanieczyszczenia krzyżowego, ani zbyt niska, co może prowadzić do niewystarczających danych. Jakość sekwencjonowania jest określana przez wynik Q, który wskazuje na prawdopodobieństwo zidentyfikowania nieprawidłowej zasady. Wyniki Q dla większości baz powinny być większe niż 30, co odpowiada szansie mniejszej niż 1 na 1000 na nieprawidłowy odczyt. Odzyskiwanie referencyjnych sekwencji DNA w oczekiwanym tempie wskazuje, że wszystkie sekwencje biblioteczne są równomiernie reprezentowane.

Odczyty wygenerowane przez sekwencjonowanie są następnie nakładane na siebie, aby wywnioskować RNA, które zostało zsekwencjonowane. W przypadku organizmów, dla których dostępne są informacje o genomie, odczyty można dostosować do genomu referencyjnego. Liczba odczytów na transkrypt jest zliczana w celu zmierzenia obfitości każdego RNA.

Po zobaczeniu, jak działa sekwencja RNA, przyjrzyjmy się niektórym sposobom, w jakie jest ona wykorzystywana.

Sekwencjonowanie transkryptomu może zidentyfikować geny, które ulegają zróżnicowanej ekspresji w różnych warunkach. Na przykład w tym eksperymencie porównano transkryptomy larw komarów wytwarzanych w różnych warunkach wzrostu. Mimo że ten konkretny gatunek komara przenoszącego choroby nie ma zsekwencjonowanego genomu, naukowcy byli w stanie porównać uzyskane informacje transkryptomiczne z innymi zsekwencjonowanymi gatunkami i zidentyfikować geny o zwiększonym lub obniżonym poziomie ekspresji.

Sekwencja RNA może być również stosowana w "masowo równoległych testach reporterowych" do badania mechanizmów regulacji genów. Odbywa się to poprzez transfekcję komórek ssaków za pomocą biblioteki tysięcy plazmidów, z których każdy zawiera zmutowany wariant miejsca regulatorowego genu "napędzającego" transkrypcję sekwencji reporterowej, która jest sprzężona z unikalnymi znacznikami. Po izolacji RNA i sekwencjonowaniu wysokoprzepustowym, poziomy każdego znacznika są oceniane w celu oceny ekspresji reporterowej z każdego konstruktu, co daje wgląd w funkcjonalne znaczenie nukleotydów zmutowanych w każdym wariancie miejsca regulatorowego.

Wreszcie, sekwencjonowanie RNA można dostosować do badania interakcji RNA-białko, w szczególności do identyfikacji transkryptów, z którymi wiąże się białko będące przedmiotem zainteresowania. Białko jest immunoprecypitowane przeciwciałami, a związane RNA są definiowane przez sekwencjonowanie. Jeśli kompleksy RNA-białko są usieciowane na początku, analiza sekwencjonowania może zmapować miejsce usieciowania i zidentyfikować miejsce wiązania białka w RNA aż do poziomu nukleotydów.

Właśnie obejrzałeś film JoVE na temat sekwencji RNA. W tym filmie widzieliśmy, jak próbki RNA są przekształcane w biblioteki, sekwencjonowane, a wynikowe dane analizowane, a także rodzaje informacji, które może dostarczyć analiza sekwencjonowania. Dzięki swojej czułości, potencjałowi do wykorzystania w każdym organizmie i obniżonym kosztom sekwencjonowania, sekwencjonowanie RNA jest coraz częściej wykorzystywane w wielu obszarach badań genetycznych i zapewni wgląd w wiele pytań dotyczących funkcji i rozwoju komórek. Dzięki za oglądanie!