Name: Przejściowo transgenizowany model myszy IL-8 do długoterminowego monitorowania in vivo reakcji zapalnych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-07T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 16 s
Description: Poznaj metodę obrazowania bioluminescencyjnego do monitorowania zapalenia płuc u myszy z wykorzystaniem konstruktu reporterowego lucyferazy. Technika umożliwia nieinwazyjną, wielokrotną ocenę tych samych zwierząt przez dwa miesiące.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Projekt Włoskiej Fundacji Mukowiscydozy FFC#18/2013, FFC#29/2015 oraz przez Włoską Ligę Mukowiscydozy poprzez Oddział Veneto — Associazione Veneta Lotta contro la Fibrosi Cistica Onlus.

Wszystkie opisane eksperymenty na zwierzętach zostały zatwierdzone przez wewnętrzną komisję ds. dobrostanu zwierząt w Międzywydziałowym Centrum Służby Badań Eksperymentalnych na Uniwersytecie w Veronie i są zgodne z Dyrektywą Europejską 2010/63 UE, włoskim dekretem D.Lgs 26/2014 oraz zrewidowanym opracowaniem „Guide for the Care and Use of Laboratory Animals”, Washington, D.C.: National Academy Press, 1996. Niniejszy protokół oraz przeprowadzone eksperymenty zostały zatwierdzone przez National Institutes of Health (n 273/15). Zwierzęta miały swobodny dostęp do standardowej karmy dla gryzoni oraz zmiękczonej wody z kranu i przed rozpoczęciem jakiegokolwiek leczenia były aklimatyzowane przez co najmniej 5 dni do warunków lokalnego animalarium (temperatura w pomieszczeniu: 20 - 24 °C; wilgotność względna: 40 - 70%; cykl światło-ciemność: 12 h).
1. Dostarczanie genów in vivo
<ol>
	<li>Do przygotowania kompleksów odczynnika do dostarczania in vivo/kwasów nukleinowych należy użyć komory z laminarnym przepływem powietrza.</li>
	<li>Należy określić protokół i parametry eksperymentalne zgodnie z instrukcją producenta dotyczącą zastosowań in vivo.
	<ol>
		<li>Należy zastosować całkowitą objętość iniekcji wynoszącą 200 µL kompleksów na mysz.</li>
		<li>Należy zacząć od 40 µg DNA zawieszonego w wodzie wolnej od endotoksyn; zakres optymalizacji może wynieść do 60 µg. 
		UWAGA: Zgodnie z instrukcją producenta końcowe stężenie kwasu nukleinowego w objętości iniekcji nie może przekraczać 0,5 µg/µL.</li>
		<li>Należy zastosować stosunek N/P od 6 do 8 (0,12 - 0,16 µL odczynnika do dostarczania na µg kwasu nukleinowego). Należy obliczyć odpowiednią objętość odczynnika do dostarczania. 
		UWAGA: Kompleksy powinny być kationowe, aby zapewnić skuteczne wnikanie do komórek. Stosunek N/P definiuje się jako liczbę reszt azotowych (N) w odczynniku do dostarczania in vivo na grupę fosforanową (P) kwasu nukleinowego i stanowi on miarę równowagi jonowej w obrębie kompleksów.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Należy rozcieńczyć obliczoną ilość (patrz krok 1.2.1) kwasu nukleinowego w 5% glukozie (stężenie końcowe), używając roztworu stokowego 10% glukozy (załączonego) oraz wody sterylnej. Należy upewnić się, że objętość rozcieńczenia stanowi połowę końcowej objętości iniekcji. Całość należy delikatnie wymieszać w wstrząsaciu typu vortex lub poprzez pipetowanie w górę i w dół.</li>
	<li>Należy rozcieńczyć obliczoną ilość (patrz krok 1.2.3) odczynnika do dostarczania do połowy objętości iniekcji w 5% glukozie (stężenie końcowe), używając roztworu stokowego 10% glukozy (załączonego) oraz wody sterylnej. Próbkę należy delikatnie wymieszać w wstrząsacu typu vortex, a następnie wirować przy 13,000 x g przez 15 s.</li>
	<li>Powyższe rozcieńczone odczynniki do dostarczania należy dodać do rozcieńczonego kwasu nukleinowego w jednej porcji. Należy je wymieszać za pomocą delikatnego wstrząsania w vortexie, a następnie wirować przy 13,000 x g przez 15 s.</li>
	<li>Mieszaninę z kroku 1.5 należy inkubować przez 15 min w temperaturze pokojowej. 
	UWAGA: Od tego momentu kompleksy są stabilne przez 4 h w temperaturze pokojowej oraz do 7 dni podczas przechowywania w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Iniekcje do żyły ogonowej należy wykonywać przy użyciu kompleksów wyrównanych do temperatury pokojowej. Ogon myszy należy umieścić w ciepłej wodzie (50 - 53 °C) na 30 s, aby umożliwić rozszerzenie żyły.
	<ol>
		<li>Myszy należy umieścić w urządzeniu stabilizującym. Igłę o rozmiarze od 27 do 30G należy wprowadzić do żyły ogonowej pod kątem 20 - 30° i powoli wstrzyknąć 200 µL. Po zakończeniu należy wyjąć igłę i ucisnąć miejsce iniekcji. 
		UWAGA: Lekkie wybrzuszenie ogona podczas iniekcji świadczy o nieprawidłowym ustawieniu igły. W takim przypadku należy wyjąć igłę i powtórzyć proces bliżej nasady ogona względem poprzedniego miejsca.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ekspresję genów należy zwizualizować, wykonując obrazowanie BLI in vivo (patrz krok 2) w 24. i 48. godzinie po iniekcji dożylnej.</li>
</ol>
2. BLI in vivo
UWAGA: Wcześniej należy przygotować świeży roztwór zapasowy D-lucyferyny o stężeniu 15 mg/mL w DPBS, wysterylizować go za pomocą jednostki filtrującej 0,22-µm i przechowywać w temperaturze -20 °C.
<ol>
	<li>Umieść myszy w przezroczystej pleksiglasowej komorze anestezjologicznej. Upewnij się, że komora z izofluranem jest pełna. Przed rozpoczęciem anestezji zwierząt upewnij się, że przełączniki pompy (po lewej) i komory (po prawej) są włączone. Ustaw pokrętło izofluranu na 2,5% podczas indukcji i na 2% podczas podtrzymywania znieczulenia. Zwierzęta wewnątrz komory IVIS są utrzymywane w anestezji izofluranem w stężeniu 2,5% podczas akwizycji obrazów.</li>
	<li>Po pełnym znieczuleniu myszy, wstrzyknij dojamieniowo 10 mL/kg masy ciała roztworu D-lucyferyny na 15 min przed obrazowaniem. 
	UWAGA: Należy przeprowadzić badanie kinetyczne D-lucyferyny, aby określić czas wystąpienia szczytu sygnału po podaniu D-lucyferyny.</li>
	<li>Otwórz system obrazowania in vivo i przygotuj komorę obrazującą, wyścielając ją arkuszem czarnego brystolu (utylizować po zakończeniu). Umieść stożki nosowe w sposób zapewniający prawidłową anestezję (stosuj jeden stożek na mysz). 
	UWAGA: Rura doprowadzająca środek znieczulający do urządzenia jest rozdzielona tak, aby to samo stężenie anestetyku docierało do kolektorów anestezjologicznych znajdujących się wewnątrz systemu obrazowania.</li>
	<li>Przenieś myszy (do 5 osobników) z pudełka do stożków nosowych przymocowanych do kolektora w systemie obrazowania i zamknij drzwiczki. Akwizycja obrazu trwa 5 min.</li>
	<li>Wykonaj BLI przy użyciu oprogramowania producenta w następujący sposób:
	<ol>
		<li>Uruchom oprogramowanie. W panelu sterowania akwizycją systemu obrazowania in vivo zaznacz pole Luminescent. Potwierdź, że ustawienie filtra wzbudzenia (Excitation Filter) to Block, a ustawienie filtra emisji (Emission Filter) to Open.</li>
		<li>Kliknij strzałki: dla trybu obrazowania luminescencyjnego (Luminescent Imaging Mode) wybierz czas ekspozycji 5 min, Binning 8 oraz F/Stop 1; dla trybu obrazowania fotograficznego (Photograph Imaging Mode) wybierz Binning 4 oraz F/stop 8.</li>
		<li>Z listy rozwijanej Pola Widzenia (Field of View) wybierz D, 19 cm oraz wysokość obiektu (Subject Height) 1,5 cm. Po przygotowaniu do wykonania obrazu kliknij Acquire.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po zakończeniu akwizycji obrazów umieść myszy z powrotem w klatkach.</li>
	<li>Ilościowo określ fotony emitowane z określonych obszarów za pomocą oprogramowania producenta:
	<ol>
		<li>Kliknij ROI Tools na palecie narzędzi. W ROI Tools wybierz Measurement ROI z listy rozwijanej Typ (Type).</li>
		<li>Kliknij ikonę kwadratu i narysuj kwadratowy obszar ROI o odpowiednich wymiarach, obejmujący klatkę piersiową jednego zwierzęcia. Skopiuj i wklej ROI dla każdego zwierzęcia, aby uzyskać obszary o tych samych wymiarach. W panelu ROI Tools kliknij Measure ROI, aby uzyskać pomiary całkowitej intensywności w obszarach ROI.</li>
		<li>Przejrzyj dane pomiarowe ROI (ROI Measurements) dla wszystkich obszarów utworzonych na obrazach lub w sekwencjach podczas sesji (jeden ROI w jednym wierszu). Kliknij Export i wybierz folder, w którym plik zostanie zapisany.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Wywołanie stanu zapalnego u myszy za pomocą bodźców pro zapalnych
UWAGA: Przed stymulacją myszy bodźcami prozapalnymi należy sprawdzić poziom aktywacji bazowej za pomocą BLI in vivo (patrz krok 2). Między dostarczeniem genu in vivo a stymulacją myszy musi upłynąć co najmniej 7 dni, aby łagodny i przejściowy stan zapalny ustąpił.
<ol>
	<li>Przygotuj sprzęt do instylacji dotchawiczej (patrz Rycina 1 i Rycina 2).
	<ol>
		<li>Podłącz jednorazowe strzykawki 5 ml ze sprężyną (C, E), strzykawkę 100 µL (B) oraz jednorazowy manometr (D) do kurka trójdrożnego (A). Umieść system na wsporniku (H). Umieść system na wsporniku (H).</li>
		<li>Podłącz mikroprzewód medyczny PE190 (F) do jednorazowego manometru (D) oraz do adaptera typu pen century (G).</li>
		<li>Napełnij strzykawkę 5 mL ilością 800 µL powietrza i przekręć kurek trójdrożny. 
		UWAGA: Napełnij rurkę nadsączem z hodowli Pseudomonas aeruginosa, aspirując 50 µl do strzykawki 100 µl.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="Zestaw instrumentów chirurgicznych do procesu interwencji z użyciem mikroprzewodów medycznych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55499/55499fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Schematyczny przedstawienie pojedynczego elementu urządzenia wewnątrztachealnego. 
(A) kurek trójdrożny, (B) strzykawka Hamiltona 100-µL, (C) jednorazowa strzykawka 5-mL, (D) jednorazowy manometr, (E) jednorazowa strzykawka 5-mL ze sprężyną, (F) mikroprzewód medyczny PE190, (G) Pen Century oraz (H) podpora. <a href="http://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/55499/55499fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Konfiguracja systemu filtracji in vitro do oczyszczania białek; zaznaczono połączenia strzykawki, zacisk oraz filtr." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55499/55499fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Przedstawienie zmontowanego urządzenia dotrachealnego. 
Oznaczenia są takie same jak na Rycini 1. <a href="http://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/55499/55499fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<ol start="2">
	<li>Zanurz myszy w komorze z waporyzatorem izofluranu ustawionym na 2,5% izofluranu w mieszaninie z tlenem w celu znieczulenia.</li>
	<li>Monitoruj zwierzę przez 3 - 5 min, aby ocenić działanie środka znieczulającego. 
	UWAGA: Aby potwierdzić pełne znieczulenie myszy, uważnie monitoruj następujące objawy: spowolnienie częstotliwości oddechów, brak wyciągania przednich kończyn podczas podnoszenia za kark oraz brak reakcji na stymulację kończyn tylnych. Jeśli kryteria te nie zostaną spełnione, odczekaj kilka dodatkowych minut i sprawdź je ponownie przed przejściem do następnego kroku.</li>
	<li>Umieść znieczuloną mysz na pleksiglasowej platformie do intubacji, zawieszając ją za siekacze umieszczone na drucie.</li>
	<li>Włącz laryngoskop lewą ręką (w przypadku badaczy praworęcznych) i chwyć pęsetę z tępymi końcami. Używając końcówki laryngoskopu i pęsety, delikatnie rozewrzyj pysk.</li>
	<li>Wyciągnij język i odsuń go na bok za pomocą pęsety. Poprowadź ostrze laryngoskopu w stronę tylnej części jamy ustnej. Delikatnie dociskaj laryngoskop pod kątem 90°, aż do momentu, gdy ujrzysz otwór krtani. Przytrzymaj laryngoskop w tej pozycji.</li>
	<li>Drugą ręką weź rurkę podającą połączoną z końcem rurki PE i wprowadź ją do tchawicy. Obróć zawór trójdrożny, aby podać inokulum. Jak najszybciej wyciągnij rurkę z tchawicy. Trzymaj mysz w pozycji pionowej przez kilka sekund, aby umożliwić wniknięcie inokulum do płuc. 
	UWAGA: Myszy uduszą się i zginą, jeśli tchawica zostanie zablokowana na zbyt długo.</li>
	<li>Zdejmij mysz z platformy. Czas wybudzania może różnić się w zależności od szczepu; uważnie monitoruj mysz, upewniając się, że zwierzę w pełni odzyska przytomność w ciągu 30 min po zabiegu.</li>
	<li>Wstrzyknij dootrzewnowo 150 mg/kg D-lucyferyny i obrazuj płuca za pomocą systemu obrazowania in vivo 4, 24 i 48 h po intratrachealnej instylacji bodźców. Ilościowo określ liczbę fotonów emitowanych z określonych obszarów, korzystając z oprogramowania producenta.</li>
</ol>

<ol><li>Barnes, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+approaches+to+asthma-chronic+obstructive+pulmonary+disease+overlap+syndromes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Allergy+Clin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Therapeutic approaches to asthma-chronic obstructive pulmonary disease overlap syndromes.</a> J Allergy Clin Immunol. 136 (3), 531-545 (2015).</li>
<li>Cohen-Cymberknoh, M., Kerem, E., Ferkol, T., Elizur, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Airway+inflammation+in+cystic+fibrosis%3A+molecular+mechanisms+and+clinical+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Thorax%22%5BJournal%5D)">Airway inflammation in cystic fibrosis: molecular mechanisms and clinical implications.</a> Thorax. 68 (12), 1157-1162 (2013).</li>
<li>Dhooghe, B., Noel, S., Huaux, F., Leal, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lung+inflammation+in+cystic+fibrosis%3A+pathogenesis+and+novel+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Biochem%22%5BJournal%5D)">Lung inflammation in cystic fibrosis: pathogenesis and novel therapies.</a> Clin Biochem. 47 (7-8), 539-546 (2014).</li>
<li>Durham, A. L., Caramori, G., Chung, K. F., Adcock, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+anti-inflammatory+therapeutics+in+asthma+and+chronic+obstructive+lung+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Transl+Res%22%5BJournal%5D)">Targeted anti-inflammatory therapeutics in asthma and chronic obstructive lung disease.</a> Transl Res. 167 (1), 192-203 (2015).</li>
<li>Sagel, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninvasive+biomarkers+of+airway+inflammation+in+cystic+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Pulm+Med%22%5BJournal%5D)">Noninvasive biomarkers of airway inflammation in cystic fibrosis.</a> Curr Opin Pulm Med. 9 (6), 516-521 (2003).</li>
<li>Starkey, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+models+of+infectious+exacerbations+of+airway+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Murine models of infectious exacerbations of airway inflammation.</a> Curr Opin Pharmacol. 13 (3), 337-344 (2013).</li>
<li>Cacalano, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+and+B+cell+expansion+in+mice+that+lack+the+murine+IL-8+receptor+homolog%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neutrophil and B cell expansion in mice that lack the murine IL-8 receptor homolog.</a> Science. 265 (5172), 682-684 (1994).</li>
<li>Simonet, W. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+impaired+neutrophil+migration+in+mice+overexpressing+human+interleukin-8%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Long-term impaired neutrophil migration in mice overexpressing human interleukin-8.</a> J Clin Invest. 94 (3), 1310-1319 (1994).</li>
<li>Stellari, F. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+transiently+transgenized+mice+with+a+bovine+interleukin+8+%28CXCL8%29+promoter%2Fluciferase+reporter+construct%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of transiently transgenized mice with a bovine interleukin 8 (CXCL8) promoter/luciferase reporter construct.</a> PLoS One. 7 (6), e39716(2012).</li>
<li>Stellari, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+the+lung+inflammatory+response+to+Pseudomonas+aeruginosa+and+its+modulation+by+azithromycin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of the lung inflammatory response to Pseudomonas aeruginosa and its modulation by azithromycin.</a> J Transl Med. 13, 251(2015).</li>
<li>Stellari, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+monitoring+of+lung+inflammation+in+CFTR-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">In vivo monitoring of lung inflammation in CFTR-deficient mice.</a> J Transl Med. 14 (1), 226(2016).</li>
<li>De Simone, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host+genetic+background+influences+the+response+to+the+opportunistic+Pseudomonas+aeruginosa+infection+altering+cell-mediated+immunity+and+bacterial+replication%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Host genetic background influences the response to the opportunistic Pseudomonas aeruginosa infection altering cell-mediated immunity and bacterial replication.</a> PLoS One. 9 (9), e106873(2014).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W poprzedniej pracy11 pokazano kontrast między markerami BLI i BAL zależnymi od bIL-8-Luc. Opierał się on na zróżnicowanym stopniu wrażliwości w obrębie szczepów myszy12. Z tego powodu pierwsze zastosowanie modelu bIL-8-Luc do innego szczepu myszy wymaga wstępnego zbadania odpowiedzi zapalnej, zarówno pod kątem BLI, jak i bardziej standaryzowanych markerów stanu zapalnego.
Transfekcja myszy powoduje łagodne zapalenie płuc i aktywację bIL-8-Luc, k...

Przewlekłe choroby płuc, takie jak astma, przewlekła obturacyjna choroba płuc (POChP), mukowiscydoza (CF) i rozstrzenie oskrzeli, charakteryzują się zapaleniem dróg oddechowych. Zapalenie dróg oddechowych charakteryzuje się obrzękiem, naciekiem komórkowym, aktywacją limfocytów T i komórek tucznych, zwiększonym wydzielaniem dróg oddechowych i nadmiernym odkładaniem się kolagenu. Mukowiscydoza jest chorobą wieloukładową, a jej główną przyczyną śmiertelności i zachorowalności jest zakażenie bakteryjne płuc z narastającym zaostrzeniem choroby płuc. Pogorszenie czynności płuc zapowiada znacznie gorszy wynik1,2,3,4.
Stan zapalny dróg oddechowych jest zazwyczaj obserwowany poprzez ocenę markerów immunologicznych rekrutowanych podczas procesu zapalnego w materiale pochodzącym z dolnych i górnych dróg oddechowych, takich jak plwocina, która daje zmienne wyniki. Wykonywane są również bronchoskopie5. Modele mysie są cennymi narzędziami do badania patogenezy i ewolucji chorób charakteryzujących się zapaleniem dróg oddechowych, dla których nie zidentyfikowano jeszcze skutecznych metod leczenia lub lekarstw. Modele zwierzęce infekcji płuc i stanu zapalnego zostały wykorzystane do badania astmy i interakcji gospodarz-patogen, w tym roli substancji chemicznych, które symulują warunki ludzkie (np. narażenie na dym papierosowy, LPS, elastazę, albuminę jaja kurzego, poli I:C itp., a także kombinacje powyższych)6. Pomiar parametrów związanych ze stanem zapalnym wymaga poświęcenia zwierząt, ponieważ do pomiaru takich czynników, jak obciążenie bakteryjne, cytokiny w płucach i pobrany płyn z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego (BAL) wymagane są podejścia inwazyjne. Często wymagane są również badania histologiczne. Możliwość uzyskania informacji na temat kinetyki odpowiedzi zapalnej wymaga wykorzystania wielu myszy. Dlatego technika, która pozwoliłaby na uzyskanie takich informacji bez konieczności poświęcania zwierząt, jest cenna z technicznego, etycznego, ekonomicznego i operacyjnego punktu widzenia.
IL-8 odgrywa kluczową rolę w procesie zapalenia, rekrutując leukocyty do tkanki objętej stanem zapalnym. Stanowi odczyt molekularny do badania aktywacji szlaku zapalnego. MIP-2 i KC mogą być funkcjonalnymi homologami ludzkiej IL-8 u myszy. Myszy wyrażają tylko jeden potencjalny receptor IL-8, homolog ludzkiego CXCR27,8, ale są zdolne do modulowania heterologicznego promotora genu IL-8, który napędza gen reporterowy. Mysi model zapalenia płuc został niedawno opracowany po obserwacji, że bydlęcy konstrukt promotora IL-8 / reportera lucyferazy może być transaktywowany u myszy. Ta funkcja pozwala na wykorzystanie obrazowania bioluminescencyjnego (BLI) do monitorowania reakcji zapalnej u żywych zwierząt9.
Ten model został dostosowany do badania stanu zapalnego wywołanego przez egzoprodukty bakteryjne (np. LPS lub produkty uwalniane przez szczepy bakteryjne) lub TNFalpha10,11. Proces odkrywania leków koncentruje się na rozwoju i optymalizacji starych i nowych cząsteczek przeciwzapalnych, które mogą leczyć choroby płuc, takie jak mukowiscydoza, astma i POChP. Te nowe jednostki chemiczne muszą być szybko i wygodnie testowane na modelach zwierzęcych, które można powiązać z określonymi fenotypami klinicznymi, aby ułatwić projektowanie inteligentnych badań klinicznych.

<table><tbody><tr><td>System tomografii fluorescencyjnej FMT 2500</td><td>Perkin Elmer Inc.</td><td>Eksperymentalny Builder</td><td></td></tr><tr><td>IVIS Lumina serie II Przedkliniczny In Vivo; System obrazowania</td><td>Perkin Elmer Inc.</td><td>Eksperymentalny konstruktor</td><td></td></tr><tr><td>MMPsense 750 FAST</td><td>Perkin Elmer Inc.</td><td>NEV10001EX</td><td>Chronić przed światłem, przechowuj sondę w temperaturze 4 & stopni; C</td></tr><tr><td>Samica wsobna BalbC</td><td>Harlan Laboratories Włochy</td><td></td><td>Przed użyciem zwierzęta aklimatyzowano przez co najmniej 5 dni do lokalnych warunków wiwarium</td></tr><tr><td>plazmid bIL-8-Luc</td><td>Wydział Nauk Medycznych i Weterynaryjnych, Uniwersytet w Parmie, Włochy</td><td></td><td>Przechowuj plazmid w temperaturze -20 &stopni; C</td></tr><tr><td>pGL3basic vector</td><td>Promega</td><td>E1751</td><td>Przechowuj wektor w temperaturze -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Odczynnik do transfekcji DNA JetPEI</td><td>Transfekcja Polyplus transfekcja</td><td>201B-001G</td><td>Mieszanina DNA i JetPEI została opracowana z końcowym stosunkiem N/P 7</td></tr><tr><td>sól potasowa D-lucyferyny 1 g</td><td>Perkin Elmer Inc.</td><td>122796</td><td>Chronić przed światłem, przechowywać w temperaturze -20 stopni; C</td></tr><tr><td>Oprogramowanie Living Image</td><td>Caliper Nauki przyrodnicze,</td> <td>Eksperymentalny budowniczy</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>ESTEVE spa</td><td>571329.8</td><td>Nie wdychać</td></tr><tr><td>zestawu do oznaczania cytokin Bio-Plex</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>M60-009RDPD</td><td>Przechowuj nieotwarty zestaw w temperaturze 4 & stopni; C</td></tr><tr><td>Automatyczny licznik komórek</td><td>Dasit XT 1800J</td><td>Eksperymentalny budowniczy</td><td></td></tr><tr><td>Model Penn-century DP-4M Insulatator suchej energii</td><td>Penn-century</td><td>DPM-EXT</td><td></td></tr><tr><td>System znieczulenia gazowego XGI-8</td><td>Perkin Elmer Inc.</td><td>Experimental Builder</td><td></td></tr><tr><td>PE190 mikro rurki medyczne</td><td>2instrumenty biologiczne snc</td><td>BB31695-PE/8</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka bez igły 5 ml</td><td>Terumo</td><td>SS*05SE1</td><td>Wytnij deski tłoka nożyczkami</td></tr><tr><td>Hamilton 0,10 mL (model 1710)</td><td>Gazoszczelny</td><td>81022</td><td></td></tr><tr><td>Discofix 3-drożny kran</td><td>Braun</td><td>4095111</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka z igłą 1 mL</td><td>roztwór</td><td>3,071,260,300,320</td><td>Stosować bez igły</td></tr><tr><td>Plastikowe rurki do karmienia 18ga x 50 mm</td><td>2instrumenty biologiczne snc</td><td>FTP-18-50</td><td>Ukośnie odciąć końcówkę&nbsp;</td></tr></tbody></table>

przejściowo transgenizowany model myszy il-8 do długoterminowego monitorowania in vivo reakcji zapalnych

An IL-8 Transiently Transgenized Mouse Model for the In Vivo Long-term Monitoring of Inflammatory Responses

Zapalenie dróg oddechowych jest często związane z infekcjami bakteryjnymi i stanowi główny czynnik determinujący chorobę płuc. Określenie in vivo zdolności prozapalnych różnych czynników jest trudne i wymaga procedur terminalnych, takich jak płukanie oskrzelowo-pęcherzykowe i usunięcie płuc do analizy in situ, co wyklucza wizualizację podłużną u tej samej myszy. W tym przypadku zapalenie płuc jest wywoływane poprzez dotchawicze wkraplanie supernatantu kultury Pseudomonas aeruginosa (SN) u przejściowo transgenizowanych myszy z ekspresją genu reporterowego lucyferazy pod kontrolą heterologicznego promotora bydlęcego IL-8. Ekspresja lucyferazy w płucach jest monitorowana za pomocą analizy obrazu bioluminescencyjnego in vivo (BLI) w okresie od 2,5 do 48 godzin po wkropleniu. Procedurę można powtarzać wielokrotnie w ciągu 2-3 miesięcy, co pozwala na ocenę reakcji zapalnej u tych samych myszy bez konieczności przerywania ciąży zwierząt. Takie podejście pozwala na monitorowanie czynników pro- i przeciwzapalnych działających w płucach w czasie rzeczywistym i wydaje się odpowiednie do badań funkcjonalnych i farmakologicznych.

Przejściowy transgeniczny model mysi bIL-8-Luc został wykorzystany do monitorowania in vivo stanu zapalnego płuc u myszy poddanych działaniu stężonego supernatantu bakteryjnego (30x) zawierającego wydzielane czynniki wirulencji. Indukowana odpowiedź zapalna była wykrywalna za pomocą obrazowania in vivo jako wzrost sygnału BLI. Aktywność prozapalna była wyraźnie widoczna 2,5 h po instylacji, choć sygnał BLI osiągnął najwyższy szczyt między 5 a 24 h i był nadal wykrywalny ...

Opisana tutaj metoda pozwala na wizualizację zależnej od promotora IL-8 aktywacji stanu zapalnego w płucach myszy za pomocą nieinwazyjnego obrazowania bioluminescencyjnego (BLI). To samo zwierzę może być poddawane BLI wielokrotnie przez okres do dwóch miesięcy od momentu dostarczenia konstruktu reporterowego lucyferazy.

Przejściowo transgenizowany model myszy IL-8 do długoterminowego monitorowania in vivo reakcji zapalnych

Airway inflammation is often associated with bacterial infections and represents a major determinant of lung disease. The in vivo determination of the ...

Ogólnym celem tej procedury jest monitorowanie w czasie rzeczywistym stanu zapalnego płuc u myszy po nieinwazyjnej ekspozycji na bodziec prozapalny, taki jak nadsącz z hodowli bakteryjnej. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na konkretne pytania dotyczące oddziaływań między gospodarzem a patogenem, na przykład w kwestii tego, które produkty bakteryjne odpowiadają za choroby zakaźne dróg oddechowych. Głównymi zaletami tej techniki są jej nieinwazyjny charakter oraz możliwość wielokrotnego monitorowania tych samych zwierząt w określonym czasie.Wizualna prezentacja tej metody jest istotna, ponieważ kroki instalacyjne są trudne do opanowania wyłącznie na podstawie tekstu. Procedurę zademonstrują Francesca Ruscitti, Angela Sandri oraz Federico Boschi, wszyscy będący zewnętrznymi współpracownikami mojej grupy badawczej. W przypadku dostarczania genów in vivo, najpierw ogrzej kompleks kwasów nukleinowych do temperatury pokojowej.Następnie ogrzewaj ogon zwierzęcia doświadczalnego w wodzie o temperaturze od 50 do 53 °C przez 30 sekund. Po rozszerzeniu żył ogonowych umieść mysz w odpowiednim urządzeniu ograniczającym i wprowadź igłę o rozmiarze od 27 do 30 G do rozszerzonej żyły ogonowej pod kątem od 20 do 30 stopni, aby wstrzyknąć 200 µL kompleksu. Po podaniu całej objętości wyjmij igłę i uciśnij miejsce wstrzyknięcia.Od dwudziestu czterech do 48 godzin później, na 15 minut przed obrazowaniem bioluminescencyjnym, wstrzyknij doprzewnowiecznie 10 ml/kg świeżo przygotowanej D-lucyferyny maksymalnie pięciu w pełni znieczulonych zwierzętom, którym podano kompleks. Otwórz system obrazowania in vivo, włóż do komory obrazowania arkusz czarnego brystolu, a następnie umieść myszy w komorze. Uruchom oprogramowanie systemu obrazowania in vivo i zainicjuj system.Zaznacz pole przy opcji luminescent i potwierdź, że filtr wzbudzenia jest ustawiony na block (blokada), a filtr emisji na open (otwarty). Dla trybu obrazowania luminescencyjnego wybierz czas naświetlania pięć minut, binning wynoszący osiem oraz wartość F/Stop równą jeden. Dla trybu obrazowania fotograficznego wybierz binning wynoszący cztery oraz wartość F/Stop równą osiem.W menu pola widzenia wybierz pole widzenia D o obszarze 19 na 19 centymetrów i wysokości obiektu 1,5 centymetra. Po ustawieniu wszystkich parametrów kliknij Acquire, aby wykonać obrazowanie zwierząt. Po uzyskaniu obrazu należy przenieść zwierzęta z powrotem do klatek i monitorować je aż do pełnego powrotu do stanu spoczynkowego.Aby ilościowo określić liczbę fotonów emitowanych z konkretnych obszarów zainteresowania, otwórz oprogramowanie systemu obrazowania i wybierz narzędzie obszaru zainteresowania (region of interest). W menu typu wybierz Pomiar obszaru zainteresowania i za pomocą narzędzia kwadratu narysuj kwadratowy obszar zainteresowania wokół klatki piersiowej jednego zwierzęcia. Skopiuj i wklej ten obszar zainteresowania na każde z pozostałych zwierząt, aby wygenerować obszary zainteresowania o tych samych wymiarach, a następnie kliknij Pomiar obszaru zainteresowania, aby zmierzyć całkowitą intensywność wszystkich obszarów zainteresowania.Następnie kliknij Export i wybierz folder, w którym zostaną zapisane dane pomiarowe obszarów zainteresowania. Co najmniej siedem dni po wprowadzeniu genu in vivo, połącz strzykawki o pojemności 5 ml z a amortyzatorem sprężynowym, strzykawkę Hamiltona o pojemności 100 µL oraz jednorazowy przejściowy element mocujący z trójdrogowym kurkiem. Połącz fragment mikro rurki medycznej PE 190 z jednorazowym elementem mocującym oraz z igłą pen sentry.Napełnij strzykawkę pięciomilimetrową 800 µl powietrza. Przekręć kurek stopowy i pobierz supernatant z probówki, napełniając strzykawkę 100 µl, a następnie umieść znieczoloną mysz doświadczalną na pleksiglasowej platformie do intubacji i unieruchom zwierzę za siekacze. Włącz laryngoskop niedominującą ręką, a w drugiej użyj pęsety tępokrawędziowej oraz końcówki laryngoskopu, aby delikatnie rozewrzeć pysk.Za pomocą pęsety odsunąć język na bok i skierować ostrze laryngoskopu w stronę tylnej części jamy ustnej. Bardzo delikatnie nacisnąć laryngoskop pod kątem 90 stopni w dół, aż do momentu, gdy otwór tchawicy stanie się widoczny. Drugą ręką wprowadzić rurkę dozującą połączoną z końcem cewki PE do tchawicy i przekręcić zawór trójdrożny, aby podać inokulum Pseudomonas aeruginosa, a następnie szybko usunąć rurkę, gdy tylko cała dawka inokulum zostanie dostarczona.Trzymaj mysz w pozycji pionowej przez kilka sekund, aby umożliwić wchłonięcie inokulum do płuc. Na koniec wstrzyknij dojamieniowo 150 milligrams per kilogram D-Luciferin zainokulowanym zwierzętom i wykonaj obrazowanie płuc w systemie obrazowania in vivo po 4, 24 i 48 godzinach od intratrachealnej instalacji stymulacji, a następnie przeprowadź kwantyfikację fotonów, zgodnie z wcześniejszą demonstracją. W tym przypadku obrazowanie bioluminescencyjne zostało wykorzystane do monitorowania w czasie rzeczywistym in vivo stanu zapalnego płuc u przejściowo transgenicznych myszy BALB/c z białkiem bovine interleukin-8 luciferase, poddanych działaniu skoncentrowanego supernatantu bakteryjnego zawierającego wydzielone czynniki wirulencji, zgodnie z wcześniejszą demonstracją.Wywołaną odpowiedź zapalną wykryto jako wzrost sygnału bioluminescencyjnego już 2,5 godziny po implantacji, przy czym emisja fotonów osiągnęła szczyt między 5 a 24 godzinami i pozostawała wykrywalna przez co najmniej 48 godzin po stymulacji. Po przeprowadzeniu tej procedury można zastosować inne metody, takie jak płukanie oskrzelowo-pęcherzykowe, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące liczby i rodzajów komórek odpornościowych powstałych w wyniku terapii. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć dobrą wiedzę na temat tego, jak wywoływać zapalenie płuc u myszy i monitorować je in vivo przy użyciu obrazowania bioluminescencyjnego.

an-il-8-transiently-transgenized-mouse-model-for-vivo-long-term

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Opisujemy metodę wielokrotnej wizualizacji mikrogleju mysiego oraz monocytów krążących in vivo w czasie liczonym w godzinach, dniach lub tygodniach, z wykorzystaniem transkranialnej mikroskopii dwufotonowej. Demonstrujemy sposób przygotowania okna z cienkiej czaszki, które umożliwia przerywaną obserwację spoczywającego mikrogleju, który może zostać aktywowany poprzez sąsiednią stereotaktyczną iniekcję białka regulatorowego Tat wirusa HIV-1.

Technika cienkiej okienkowej czaszki do przewlekłego obrazowania dwufotonowego in vivo mikrogleju mysiego w modelach neurozapalenia

W niniejszej pracy opracowujemy narzędzia niezbędne do obrazowania żywych komórek ex vivo w celu śledzenia podziałów pojedynczych komórek w neuroepitelium myszy w stadium...

Ex vivo obrazowanie na żywo podziałów pojedynczych komórek w neuroepitelium myszy

Modele zwierzęce okazały się nieocenionymi narzędziami w definiowaniu mechanizmów specyficznych dla gospodarza i patogenu, które przyczyniają się do rozwoju przewlekłego stanu zapalnego. W tym miejscu opisujemy mysi model zakażenia jamy ustnej ludzkim patogenem Porphyromonas gingivalis i szczegółowo opisujemy metodologie oceny postępu stanu zapalnego w miejscach miejscowych i ogólnoustrojowych.

Mysi model przewlekłego stanu zapalnego wywołanego przez patogeny w miejscach lokalnych i ogólnoustrojowych

Dwie metody oparte na cytometrii przepływowej - test in vitro na bazie limfocytów T i wewnątrzkomórkowe barwienie cytokin zostały wykorzystane do zmierzenia zdolności komórek dendrytycznych do prezentacji antygenu i odpowiedzi limfocytów T specyficznych dla antygenu na infekcję mutantem wirusa Zachodniego Nilu u myszy.

In vitro Analiza komórkowej odpowiedzi immunologicznej za pośrednictwem Myd88 na zakażenie zmutowanym szczepem wirusa Zachodniego Nilu

Istnieje ogólny brak wiedzy na temat działania szczepionek. W tym miejscu proponujemy połączone zastosowanie genetyki odwrotnej i chimerycznych myszy szpiku kostnego w celu uzyskania wglądu we wczesną odpowiedź immunologiczną gospodarza na szczepionki, ze szczególnym uwzględnieniem komórek dendrytycznych i odporności limfocytów T.

Donosowe podawanie rekombinowanych szczepionek przeciw grypie w chimerycznych modelach mysich w celu zbadania odporności błony śluzowej

Mechanizmy rządzące ruchliwością śródmiąższową komórek T efektorowych CD4 w miejscach zapalenia są stosunkowo nieznane. Przedstawiamy nieinwazyjne podejście do wizualizacji i manipulacji limfocytami T CD4 przygotowanymi in vitro w zapalnej skórze właściwej ucha, co pozwala na badanie dynamicznego zachowania tych komórek in situ.

Obrazowanie migracji śródmiąższowej komórek T CD4 w stanie zapalnym skóry właściwej

Opisujemy tutaj transgeniczny model myszy reporterowej do wizualizacji komórek wytwarzających IL-22 wewnątrz różnych tkanek myszy. Ta metoda może być wykorzystana do śledzenia lokalizacji innych cytokin lub białek wydzielniczych u myszy.

Wizualizacja limfocytów z ekspresją IL-22 przy użyciu myszy reporterowych

Pokazujemy technikę obrazowania in vivo na żywo bioluminescencji i bliskiej podczerwieni zapalenia nerwu wzrokowego i zapalenia mózgu w eksperymentalnym modelu autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia (EAE) dla stwardnienia rozsianego u myszy SJL/J.

Bioluminescencja i obrazowanie w bliskiej podczerwieni zapalenia nerwu wzrokowego i zapalenia mózgu w modelu EAE stwardnienia rozsianego u myszy

Prezentowana tutaj jest wielofotonowa mikroskopijna platforma do obrazowania powierzchni oka myszy na żywo. Fluorescencyjna mysz transgeniczna umożliwia wizualizację jąder komórkowych, błon komórkowych, włókien nerwowych i naczyń włosowatych na powierzchni oka. Nieliniowe sygnały generujące drugą harmoniczną pochodzące ze struktur kolagenowych zapewniają obrazowanie bez znaczników dla architektur zrębowych.

Niestandardowa platforma mikroskopii wielofotonowej do obrazowania na żywo rogówki i spojówki myszy

W tym raporcie prezentujemy protokół, który pozwala badaczowi na wygenerowanie mysiego modelu wewnątrzgałkowego zapalenia błony naczyniowej oka. Ten uznany model, częściej określany jako eksperymentalne autoimmunologiczne zapalenie błony naczyniowej oka (EAU), obejmuje wiele aspektów chorób u ludzi. W tym miejscu opiszemy, jak indukować i monitorować postęp choroby za pomocą kilku odczytów.

Eksperymentalne autoimmunologiczne zapalenie błony naczyniowej oka: wewnątrzgałkowy model zapalny myszy

Zapalenie powierzchni oka uszkadza tkanki powierzchni oka i zagraża funkcjom życiowym oka. Niniejszy protokół opisuje metodę wywoływania zapalenia oka i zbierania uszkodzonych tkanek w mysim modelu dysfunkcji gruczołów Meiboma (MGD).

Indukcja stanu zapalnego powierzchni oka i gromadzenie zajętych tkanek

Poznaj metodę obrazowania bioluminescencyjnego do monitorowania zapalenia płuc u myszy z wykorzystaniem konstruktu reporterowego lucyferazy. Technika umożliwia nieinwazyjną, wielokrotną ocenę tych samych zwierząt przez dwa miesiące.

Przejściowo transgenizowany model myszy IL-8 do długoterminowego monitorowania in vivo reakcji zapalnych

Przeglądaj więcej filmów