3: Analiza metylacji DNA

Metylacja DNA to chemiczna modyfikacja DNA, która wpływa na ekspresję genów w różnych kontekstach komórkowych. Wielu badaczy interesuje się mechanizmem i funkcjami tego procesu, ponieważ nieprawidłowa metylacja DNA jest związana z chorobami takimi jak rak.

W tym filmie omówimy zasady metylacji DNA i metody jej wykrywania. Następnie przyjrzymy się ogólnemu protokołowi jednej z tych metod, analizie wodorosiarczynu, oraz niektórym zastosowaniom tej techniki.

Najpierw przyjrzyjmy się, czym jest metylacja DNA i jak można ją wykryć.

Podczas tego procesu biochemicznego komórka dodaje znacznik chemiczny znany jako grupa metylowa do zasad cytozyny w swoim DNA. Większość metylowanych cytozyn występuje obok zasad guaninowych w tej samej nici DNA, a te sąsiednie nukleotydy - i wiązanie fosfodiestrowe, które je łączy - są określane jako "CpG". Chociaż większość kręgowców CpG jest metylowana, te, które nie są metylowane, mają tendencję do występowania blisko siebie na "wyspach" CpG w pobliżu promotorów aktywnie eksprymowanych genów. i różne inne regulacyjne elementy sekwencji.

To, w jaki sposób zmiany w metylacji DNA przyczyniają się do regulacji genów, jest nadal przedmiotem intensywnych badań. Metylacja wysp CpG wydaje się być ważna dla stabilnego, długoterminowego wyciszania genów obserwowanego w procesach epigenetycznych, takich jak imprinting genomowy, który jest specyficzną dla rodzica pochodzenia ekspresją niektórych genów, a także inaktywacja chromosomu X, czyli wyciszenie jednego z dwóch chromosomów X w każdej komórce samicy ssaków. Wykazano również, że tłumienie krytycznych genów spowodowane nieprawidłową metylacją wysp CpG przyczynia się do niekontrolowanego wzrostu komórek, co może prowadzić do raka. Mechanistycznie metylacja DNA może przyczyniać się do wyciszania genów, zapobiegając asocjacji czynników transkrypcyjnych z promotorami lub rekrutując białka, które modyfikują histony i przekształcają chromatynę w stan niepermisywny transkrypcyjnie.

Istnieje kilka metod wykrywania stanu metylacji DNA.

Jedna z technik, test HELP, obejmuje dwie endonukleazy restrykcyjne zwane HpaII i MspI, które odpowiednio rozszczepiają tylko niemetylowane lub zarówno metylowane, jak i niemetylowane sekwencje CCGG. Porównując wzorce trawienia wytwarzane przez te dwa enzymy, można wywnioskować stan metylacji DNA.

Inna metoda, zwana immunoprecypitacją metylowanego DNA lub "MeDIP", wykorzystuje przeciwciała, które wiążą się z metylowanymi cytozynami w celu wzbogacenia o metylowane sekwencje DNA.

Wreszcie, analiza wodorosiarczynowa służy do odróżnienia cytozyny metylowanej od niemetylowanej w DNA, przeprowadzając reakcję chemiczną, która przekształca niemetylowaną cytozynę w uracyl. Po tej konwersji DNA poddane działaniu wodorosiarczynu można poddać PCR, zsekwencjonować i porównać z genomem referencyjnym. Cytozyny niemetylowane to te, które są obecne w referencji, ale zastąpione tyminami po analizie wodorosiarczynów i PCR. Poddając DNA poddane działaniu wodorosiarczynu spektrometrii mas, naukowcy mogą również stworzyć "epigramy metylacji", które liniowo reprezentują różne CpG w genomie i przedstawiają stopień metylacji w każdym z nich. Takie epigramy są szczególnie przydatne, jeśli naukowcy chcą porównać wzorce metylacji między różnymi typami komórek.

Przyjrzyjmy się teraz dogłębnie protokołowi analizy wodorosiarczynu.

Na początek wodorotlenek sodu dodaje się do preparatów genomowego DNA, które następnie inkubuje się w temperaturze 95°C. Powoduje to denaturację DNA i sprawia, że jego zasady stają się dostępne dla kolejnych reakcji chemicznych. Pirosiarczyn sodu jest następnie wprowadzany do zdenaturowanej mieszaniny DNA i zachodzą dwa etapy reakcji chemicznej. Podczas pierwszego etapu, sulfonacji, grupa siarczynowa jest dodawana do niemetylowanej cytozyny w celu wytworzenia sulfonianu cytozyny. Następnie, podczas deaminacji hydrolowej, grupa aminowa jest usuwana z sulfonianu cytozyny w celu wytworzenia sulfonianu uracylu.

Aby ułatwić te pierwsze etapy reakcji chemicznej, preparat DNA jest pokryty olejem mineralnym, który zapobiega parowaniu i pomaga utrzymać stężenie pirosiarczynu sodu. Reakcja jest następnie inkubowana w temperaturze 55°C w ciemności. Na tym etapie do mieszaniny dodaje się również środek zapobiegający utlenianiu, taki jak chinol.

Aby zebrać zmodyfikowane DNA zawierające sulfonian uracylu i brak oleju mineralnego, mieszaninę odwirowuje się i odzyskuje najniższą warstwę cieczy. DNA w tym roztworze jest następnie oczyszczane.

Następnie wodorotlenek sodu dodaje się do mieszaniny DNA, którą następnie inkubuje się w temperaturze 37°C. Odbywa się to w celu wywołania odsulfonowania, które - jak można się domyślić - usuwa grupę siarczynową z sulfonianu uracylu, tworząc uracyl i kończąc reakcję chemiczną.

Na koniec mieszaninę neutralizuje się dodatkiem octanu amonu, a DNA zbiera się przez wytrącanie etanolu. Po oczyszczeniu DNA przekształconego w wodorosiarczyn poddaje się go PCR i sekwencjonowaniu.

Teraz, gdy omówiliśmy podstawową technikę analizy wodorosiarczynów, przyjrzyjmy się niektórym zastosowaniom eksperymentalnym.

Niektórzy badacze wykorzystują analizę wodorosiarczynów do zbadania imprintingu genomowego. W tym przypadku naukowcy skrzyżowali dwa szczepy Arabidopsis z różnicami genetycznymi, aby można było odróżnić DNA matki i ojca. Następnie porównano wzorce metylacji w powstałych zarodkach i związanym z nimi bielmie, czyli tkance podtrzymującej zarodek. Korzystając z tej metody, naukowcy odkryli, że CpG w matczynym allelu genu kodującego białko, MEA, mają tendencję do metylacji w zarodkach, ale nie metylują się w bielmie, co wskazuje na wdrukowanie specyficzne dla tkanki.

Inni badacze wykorzystują tę technikę, aby zrozumieć, w jaki sposób czynniki środowiskowe lub społeczne mogą zmieniać wzorce metylacji. Tutaj młode myszy zostały oddzielone od matek w celu wywołania stresu, a następnie ich tkanki mózgowe zostały odizolowane. Po zsekwencjonowaniu DNA poddanego działaniu wodorosiarczynu naukowcy ustalili, że wzorce metylacji w genie kodującym hormony, AVP, zmieniły się w określonym regionie mózgu u "oddzielonych" szczeniąt, co sugeruje możliwy mechanizm molekularny dla długoterminowych skutków biologicznych doświadczeń we wczesnym okresie życia.

Wreszcie, wielu badaczy stara się zoptymalizować analizę wodorosiarczynów, aby ułatwić porównanie wzorców metylacji między indywidualnymi, unikalnymi komórkami. W tym przypadku naukowcy zmodyfikowali metodę analizy wodorosiarczynu tak, aby wszystkie etapy zostały wykonane na pojedynczych oocytach myszy osadzonych w agarozie, co pomogło uchronić się przed utratą DNA. Korzystając z tej metody, naukowcy byli w stanie łatwo zidentyfikować próbki pojedynczych oocytów, które zostały zanieczyszczone innymi komórkami, szukając tych, które dawały wiele wzorców metylacji.

Właśnie obejrzałeś film JoVE na temat analiz wrażliwych na metylację. Tutaj omówiliśmy rolę, jaką metylacja DNA odgrywa w regulacji genów, metody, których naukowcy używają do identyfikacji metylowanych regionów w genomie, uogólniony protokół analizy wodorosiarczynów i wreszcie niektóre zastosowania tej techniki. Jak zawsze, dziękujemy za oglądanie!