Name: Test konkurencji oligopeptydowej do oznaczania miejsca fosforylacji (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: Poznaj test konkurencji oligopeptydowej do identyfikacji miejsc fosforylacji w białkach. Ta metoda biochemiczna umożliwia ekonomiczne wstępne badanie modyfikacji potranslacyjnych w sygnalizacji komórkowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez grant Narodowej Fundacji Badawczej Korei finansowany przez rząd koreański (MSIP) (nr 2015R1A2A1A10052663 i nr 2014M1A3A3A02034698).

1. Bezpieczeństwo
UWAGA: Ten protokół używa [γ-32P]-ATP do oceny aktywności AMPK. Fosfor-32 jest izotopem promieniotwórczym, w dużej mierze emitującym promieniowanie beta. Ponieważ rozmiar cząsteczki beta jest niezwykle mały, może ona łatwo przenikać przez ubranie i skórę. Zarówno zewnętrzne, jak i wewnętrzne narażenie na promieniowanie beta może być szkodliwe dla zdrowia ludzkiego, w tym powodując oparzenia skóry i uszkodzenia tkanek.
<ol>
	<li>Wykonaj wszystkie czynności, które wymagają użycia [γ-32P]-ATP, stosując odpowiednią ochronę, taką jak ekranowanie akrylowe.</li>
	<li>Upewnij się, że cały personel jest wyposażony w elektroniczne dozymetry osobiste (EPD) do monitorowania stopnia narażenia na szkodliwe promieniowanie podczas wszystkich zabiegów.</li>
	<li>Z promieniowaniem typu open source należy radzić sobie tylko po odpowiednim przeszkoleniu i uzyskaniu zgody organów regulacyjnych. 
	UWAGA: Tutaj wszystkie eksperymenty zostały przeprowadzone po ukończeniu szkolenia na temat wykorzystania promieniowania open-source na Uniwersytecie Narodowym w Seulu i uzyskaniu zgody rządu koreańskiego (nssc.go.kr/nssc/en).</li>
	<li>Utylizuj odpady radioaktywne zgodnie z lokalnymi przepisami. 
	UWAGA: W tym przypadku przestrzegano wytycznych Instytutu Ochrony Środowiska i Bezpieczeństwa Uniwersytetu Narodowego w Seulu. Poniżej znajduje się lista organów regulacyjnych w Stanach Zjednoczonych i krajach europejskich: Stany Zjednoczone Ameryki, Amerykańska Komisja Dozoru Jądrowego (http://www.nrc.gov/); Zjednoczone Królestwo, Urząd ds. Bezpieczeństwa i Higieny Pracy (HSE) (http://www.hse.gov.uk); Francja, Autorité de sûreté nucléaire (https://www.asn.fr/); oraz Niemcy, Federalne Ministerstwo Środowiska, Ochrony Przyrody, Bezpieczeństwa Budowlanego i Jądrowego (BMU) (http://www.bmu.de).</li>
</ol>
2. Konkurencyjny test kinazy in vitro
<ol>
	<li>Budowa konkurencyjnych peptydów
	<ol>
		<li>Określ motyw konsensusu fosforylowany przez AMPK. 
		UWAGA: AMPK rozpoznaje motyw konsensusu, Φ-[X,β]-X-X-Ser/Thr-X-X-X-Φ. W sekwencji konsensusu Φ reprezentuje aminokwasy hydrofobowe (tj. walinę [V], leucynę [L], metioninę [M] i izoleucynę [I]), a β reprezentuje aminokwasy zasadowe (tj. lizynę [K], argininę [R] i histydynę [H])1.</li>
		<li>Wybrać reszty seryny lub treoniny z sekwencji docelowych zgodnie z powyższym motywem konsensusu. Użyj trzech przypuszczalnych miejsc ludzkiego Nrf2 (#1, 148-157 składającego się z Ser153; #2, 330-339 składającego się z Ser335; i #3, 553-562 składającego się z Ser558)8.</li>
		<li>Komercyjnie syntetyzować peptydy 10-resztowe, które naśladują domniemane miejsca. Otrzymaj zsyntetyzowany produkt w postaci liofilizowanego proszku o czystości większej niż 98% dla każdego peptydu.</li>
		<li>Rozpuścić peptydy za pomocą buforu kinazy, aby osiągnąć stężenie 71,667 g/l. Jeśli peptyd nie jest rozpuszczalny w buforze kinazy, należy go rozpuścić w 20% DMSO. Jeśli pozostaje nierozpuszczalny, peptyd naśladujący przypuszczalne miejsce może zostać rozszerzony w celu zwiększenia rozpuszczalności.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<ol start="2">
	<li>Konkurencyjny test kinazy AMPK in vitro
	<ol>
		<li>Przygotować 5× bufor kinazy w następujący sposób: 100 mM HEPES, pH 7,4; 25 mM MgCl2; 5 mM EGTA; 5 mM DTT; 125 mM β-glicerofosforan (inhibitor fosfatazy seryny/treoniny); 5 mM Na3VO4 (inhibitor fosfatazy tyrozynowej); 0,5% (v/v) zestaw koktajli inhibitorów proteazy III, 1 mM zimne ATP; i 500 μM AMP. 
		UWAGA: AMP jest niezbędnym składnikiem bufora kinazy do badania aktywności AMPK. Bufor może być używany do pomiaru aktywności zarówno kinaz serynowo-treoninowych, jak i kinaz tyrozynowych.</li>
		<li>Rozmrozić następujące rekombinowane białka i syntetyczne peptydy na lodzie: AMPK; Nrf2; oraz oligopeptydy #1, #2 i #3.</li>
		<li>Przygotuj bufor reakcyjny na lodzie: 0,15 μg AMPK, 0,4 μg Nrf2 (~4 pmol), 0,43 mg oligopeptydu (~300 nmol) i 6 μl buforu kinazy 5×. Doprowadzić końcową objętość do 30 μl sterylną wodą destylowaną (DW). 
		UWAGA: Dodanie [γ-32P]-ATP po przygotowaniu buforu reakcyjnego może zmniejszyć sygnał radioaktywny w wyniku autofosforylacji kinazy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Uruchamianie reagentów 
	UWAGA: Wszystkie poniższe procesy muszą być wykonywane pod ochroną za pomocą akrylowej osłony, stojaka lub bloku, a także odpowiednich środków ochrony osobistej.
	<ol>
		<li>Ustaw bloki grzewcze na 30 °C przed rozpoczęciem eksperymentu.</li>
		<li>Dodać 1 μl [γ-32P]-ATP (1 μCi) do probówek reakcyjnych na lodzie. Wymieszać bufor reakcyjny, kilkakrotnie pipetując w górę i w dół. 
		UWAGA: Radioaktywność 32P ma krótki okres półtrwania wynoszący około 14 dni9. Dostosuj objętość, biorąc pod uwagę okres półtrwania (np. po miesiącu od produkcji [γ-32 P]-ATP dodaj 4 μL [γ-32P]-ATP, aby uzyskać 1 μCi).</li>
		<li>Inkubować próbkę w bloku grzewczym w temperaturze 30 °C przez 15-30 minut. Na tym etapie należy przygotować 7,5% żele do elektroforezy w żelu dodecylosiarczanu sodu i poliakryloamidu (SDS-PAGE). Dostosuj zawartość procentową żelu w zależności od wielkości białka docelowego.</li>
		<li>Zatrzymaj reakcję kinazy, dodając 3 μl 10× buforu próbki SDS (10% (v/v) glicerol, 20% (w/v) SDS, 15,42% (w/v) ditiotreitol, 90% (v/v) 0,5 M Tris-HCl (pH 6,8) i 0,02% (w/v) błękitu bromofenolowego). Wymieszać bufor reakcyjny, kilkakrotnie pipetując w górę i w dół.</li>
		<li>Próbki należy uruchomić w 7,5% żelu SDS-PAGE przy napięciu 70 V przez 20 minut i w sposób ciągły pod napięciem 140 V przez 1 godzinę 
		UWAGA: Niebieska linia bromofenolu na końcu żelu zawiera bardzo wysokie sygnały radioaktywne. Zaleca się usunięcie żelu poniżej niebieskiej linii przed przejściem do następnego kroku w celu zmniejszenia sygnałów tła.</li>
		<li>Po SDS-PAGE delikatnie usuń żel z kółka. Umieść żel w szklanej tubce, aby wykonać następny krok.</li>
		<li>Utrwalić żel buforem utrwalającym przez 20 minut (50% metanolu i 10% lodowatego kwasu octowego).</li>
		<li>Delikatnie przenieś żel na bibułę filtracyjną i przykryj go przezroczystym opakowaniem. Należy pamiętać, że na tym etapie żel może zostać łatwo rozerwany. Suszyć żel w suszarce próżniowej do żelu w temperaturze 80 °C przez 1 godzinę.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>wizualizacja
	<ol>
		<li>Żel należy wystawić na działanie ekranu luminoforowego lub kliszy rentgenowskiej przez noc (zwykle przez około 16 godzin). 
		UWAGA: Ekran luminoforowy może być ponownie użyty po wystawieniu na działanie bardzo jasnego światła. W przypadku użycia kliszy rentgenowskiej należy naświetlić żel przez dwa dni. Filmy rentgenowskie mają niższą czułość niż ekrany fosforowe.</li>
		<li>Zeskanuj ekran luminoforowy za pomocą imagera luminoforowego. Wyeksportuj obraz jako plik TIFF lub bitmapowy o wysokiej rozdzielczości.</li>
		<li>Po wizualizacji przenieś żel do szklanego lub plastikowego pojemnika w celu barwienia Coomassie na błękit brylantowy (CBB).</li>
		<li>Umyj żel za pomocą DW. Wyrzuć DW i zabarwij żel odczynnikiem barwiącym przez 1 godzinę.</li>
		<li>Wyrzuć odczynnik i odbarwiaj żel za pomocą DW przez 1 godzinę lub przez noc. Umieść żel między przezroczystymi foliami z tworzywa sztucznego (lub ich odpowiednikiem), aby zeskanować za pomocą skanera biurowego.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Test kinazy in vitro z użyciem mutanta specyficznego dla danego miejsca
<ol>
	<li>Mutageneza ukierunkowana na miejsce pGEX-NRF2
	<ol>
		<li>Wzór podkładu mutagencyjnego 
		UWAGA: Zaprojektowanie odpowiednich starterów mutagennych ma kluczowe znaczenie dla pomyślnego wyniku mutagenezy. Poniżej przedstawiono kilka zagadnień dotyczących projektowania starterów mutagennych. Utwórz starter składający się z 25 do 45 zasad, z pożądaną mutacją w środku startera. Podkład powinien mieć 40-60% zawartości GC i kończyć się jedną lub kilkoma zasadami G lub C. Upewnij się, że Tm startera jest równe 78 °C lub więcej zgodnie ze wzorem [Tm = 81,5 + 0,41 (% GC) - (675 / długość zasad) - % niedopasowania]. 
		UWAGA: Oczyść starter, ponieważ jego czystość jest ważna dla wydajności mutacji. Istnieje kilka stron internetowych poświęconych projektowaniu starterów mutagennych.
		<ol>
			<li>Otwórz program do projektowania podkładów dla "projektowania starterów do mutagenezy ukierunkowanej na miejsce" (http://www.genomics.agilent.com/primerDesignProgram.jsp).</li>
			<li>Wklej ludzką sekwencję DNA Nrf2 (nr dostępu. NM_006164.4) i wybierz przycisk "prześlij przetłumaczone".</li>
			<li>Wybierz resztę seryny 558 z translowanej sekwencji aminokwasów, która ma zostać zmieniona na alaninę. Używając startera mutagennego, zastąp kodon seryną od agc do gcc, alaniną.</li>
			<li>Weź pod uwagę długość podkładu, Tm i zawartość GC. 
			UWAGA: Starter mutagenny został ostatecznie zaprojektowany jako 5'-ctactgaaaaaacaactc gccaccttatatctcgaag-3'.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Reakcja syntezy zmutowanej nici z wykorzystaniem reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR)
		<ol>
			<li>Przygotować mieszaninę reakcyjną PCR na lodzie: 10× bufor reakcyjny, 50 ng pGEX-GST-Nrf2, 125 ng startera do przodu, 125 ng startera odwrotnego, 1 μl mieszaniny dNTP (po 10 mM), polimeraza DNA 2,5 U Pfu i sterylny DW do 50 μL.</li>
			<li>Uruchom PCR do syntezy nici z mutacją pGEX-GST-Nrf2 z następującym programem cyklicznym: 1 cykl w temperaturze 95 °C przez 30 s; 18 cykli w temperaturze 95 °C przez 30 s, w temperaturze 55 °C przez 1 minutę i w temperaturze 68 °C przez 90 s; oraz 1 cykl w temperaturze 68 °C przez 5 min. 
			UWAGA: W zależności od długości plazmidu parametry cyklu mogą ulec zmianie.</li>
			<li>Umieść go na lodzie na 2 minuty, aby schłodzić reagenty do następnego kroku. Alternatywnie przechowuj je przez noc w temperaturze 4 °C.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Trawienie DPN I i selekcja zmutowanego plazmidu
		<ol>
			<li>Dodać 1 μl enzymu restrykcyjnego Dpn I (10 U/μL) do każdego z reagentów po schłodzeniu. Dokładnie i delikatnie wymieszać za pomocą pipetowania i odwirowywania przez 1 minutę.</li>
			<li>Inkubować w temperaturze 37 °C przez 2 godziny w celu wytrawienia rodzicielskiego dwuniciowego DNA pGEX-GST-Nrf2.</li>
			<li>Delikatnie rozmrozić α superkompetentne komórki DH5 na lodzie.</li>
			<li>Dodać 50 μl reagenta do 150 μl wstępnie schłodzonego DH5 α nadkompetentnych komórek i inkubować na lodzie przez co najmniej 30 minut.</li>
			<li>Przenieś rurki do bloku grzewczego nagrzanego do 42 °C i pozostaw je na 90 sekund. Umieść je na lodzie na 2 minuty.</li>
			<li>Dodać wstępnie podgrzany bulion lizogeniczny (LB) do przekształconych komórek α DH5 i inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę z wytrząsaniem przy 180 obr./min.</li>
			<li>Przekształcone komórki rozprowadzić na płytkach agarowych LB-ampicyliny i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C. 
			UWAGA: Ampicylina jest używana do selekcji, ponieważ plazmid GEX-GST-Nrf2 ma marker oporności na ampicylinę. Należy stosować odpowiednie antybiotyki, w zależności od markera oporności mutagenizowanego plazmidu.</li>
			<li>Wybrać pojedynczą kolonię z płytki, przenieść ją do 5 ml LB-ampicyliny i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem przy 180 obr./min. W celu weryfikacji sekwencji mutagennej należy ocenić co najmniej trzy kolonie.</li>
			<li>Ekstrahuj DNA za pomocą zestawu do miniprzygotowania DNA do analizy sekwencji DNA; postępuj zgodnie z protokołem producenta.</li>
			<li>Zweryfikuj mutagenne sekwencje DNA za pomocą automatycznego analizatora sekwencji DNA zgodnie z protokołem producenta. Użyć co najmniej 200 ng konstruktu DNA do weryfikacji zmutowanych sekwencji.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Oczyszczanie rekombinowanego białka GST-Nrf2
	<ol>
		<li>Ekspresja mutagennego białka fuzyjnego GST-Nrf2 w Escherichia coli
		<ol>
			<li>Przekształć mutagenny plazmid pGEX-GST-Nrf2 w komórki BL21. Zaszczepić pojedynczą rodzinę w 25 ml bulionu LB zawierającego ampicylinę (100 μg/ml) i inkubować w temperaturze 37 °C na rotatorze przez noc.</li>
			<li>Zaszczepić wyhodowane komórki w 100 ml bulionu LB zawierającego ampicylinę (100 μg/ml) w stosunku rozcieńczenia 1:100.</li>
			<li>Inkubować w temperaturze 37 °C na rotatorze do momentu, gdy absorbancja przy 600 nm osiągnie około 0,4-0,8 (około 4 h).</li>
			<li>Dodać 100 μl 1 M IPTG do 100 ml hodowanych komórek, aby przygotować końcowe stężenie 1 mM IPTG.</li>
			<li>Inkubować komórki w temperaturze 30 °C na rotatorze przez 6 godzin lub przez noc w celu ekspresji białka.</li>
			<li>Odwirować komórki przy 5,000 x g przez 20 minut i ponownie zawiesić granulki komórek z 1 ml bakteryjnego buforu do lizy (25 mM HEPES, 5 mM EDTA, 2 mM DTT, 0,1% CHAPS, 1 μg/ml pepstatyny, 0,5 μg/ml leupeptyny i 1 mM PMSF) na lodzie.</li>
			<li>Lizuj granulki ogniw za pomocą homogenizatora ultradźwiękowego w odstępach 2-sekundowych przez 2 minuty przy 50% maksymalnej mocy wyjściowej.</li>
			<li>Odwirować komórki w temperaturze 12 000 × g przez 15 minut w temperaturze 4 °C i zebrać supernatant.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Oczyszczanie rekombinowanego białka GST-Nrf2
		<ol>
			<li>Przygotuj 200 μl 50% (v/v) kulek glutationowo-agarozowych i przemyj 1 ml PBS (pH 7,3; 140 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4 i 1,8 mM KH2PO4). Zebrać kulki przez odwirowanie w stężeniu 500 × g przez 1 minutę. Powtórz krok prania trzy razy.</li>
			<li>Dodać lizat komórkowy do przygotowanych 200 μl 50% (v/v) kulek glutationowo-agarozowych i inkubować w temperaturze 4 °C na rotatorze typu end-to-end przez 2 godziny.</li>
			<li>Zebrać kulki glutationowo-agarozowe połączone z białkiem GST-Nrf2 przez odwirowanie przy 500 x g przez 1 min. Usunąć supernatant za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml z igłą 31 G.</li>
			<li>Umyj koraliki 1 ml PBS (pH 7,3), jak w kroku 1.</li>
			<li>Dodać 500 μl buforu elucyjnego (50 mM Tris-HCl i 10 mM zredukowanego glutationu, pH 8,0) do kulek glutationowo-agarozowych połączonych z GST-Nrf2. Inkubować w temperaturze 4 °C na rotatorze typu end-of-end przez 30 min.</li>
			<li>Wirować przy 500 x g przez 1 minutę i zebrać supernatant.</li>
			<li>Ponownie dodać 300 μl buforu elucyjnego do kulek i powtórzyć kroki 3.2.2.5-3.2.2.6 dwukrotnie.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Potwierdzenie oczyszczonego białka GST-NRF2
		<ol>
			<li>Przygotować 5 μl próbki do wizualizacji ilości białka z 0,5 μg standardowego białka BSA.</li>
			<li>Próbki należy umieścić w 7,5% żelu SDS-PAGE pod napięciem 70 V przez 20 minut, a następnie przy napięciu 140 V przez 60 minut.</li>
			<li>Zabarwić żel 0,1% roztworem barwiącym CBB (0,1 g CBB R250, 40 ml 99% metanolu, 10 ml lodowatego kwasu octowego i 50 ml destylowanegoH2O) przez 2 godziny i odbarwić (30 ml metanolu, 10 ml lodowatego kwasu octowego i 60 ml destylowanegoH2O), aż pasma będą wyraźnie widoczne.</li>
			<li>Umieść odbarwiony żel na bibule filtracyjnej i przykryj przezroczystym opakowaniem. Suszyć żel w suszarce próżniowej do żelu w temperaturze 80 °C przez 1 godzinę.</li>
			<li>Określić ilość zmutowanego białka GST-Nrf2 za pomocą densytometrii do testu kinazy AMPK in vitro.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Test aktywności in vitro AMPK z mutantem specyficznym dla danego miejsca 
	UWAGA: Test kinazy AMPK in vitro przeprowadza się zgodnie z krokami 2.2-2.4, przy użyciu 0,4 μg oczyszczonego GST-Nrf2 typu dzikiego lub mutanta GST-Nrf2-S558A bez inhibitorów peptydów. Postępuj zgodnie ze wszystkimi wskazówkami dotyczącymi bezpieczeństwa radiacyjnego opisanymi w kroku 1.
	<ol>
		<li>Przygotować bufor reakcyjny na lodzie z 0,15 μg AMPK, 0,4 μg zmutowanego lub dzikiego typu GST-Nrf2 i 6 μl buforu 5 kinaz. Napełnij do 30 μl sterylnym DW.</li>
		<li>Dodać 1 μL [γ-32P]-ATP (1 μCi/μL) do probówek reakcyjnych na lodzie. Wymieszać bufor reakcyjny, kilkakrotnie pipetując w górę i w dół, a następnie odwirować.</li>
		<li>Próbki inkubować w bloku grzewczym w temperaturze 30 °C przez 30 minut.</li>
		<li>Zatrzymaj reakcję kinazy, dodając 3 μl 10× buforu próbki SDS.</li>
		<li>Stosować w żelu 7,5% SDS-PAGE przy napięciu 70 V przez 20 minut, a następnie przy napięciu 140 V przez 1 godzinę.</li>
		<li>Utrwalić żel buforem utrwalającym przez 20 minut, przesunąć go na bibułę filtracyjną i przykryć żel przezroczystym opakowaniem.</li>
		<li>Wysuszyć żel w suszarce próżniowej do żelu w temperaturze 80 °C przez 1 godzinę, a następnie wystawić go na noc na ekran fosforowy lub film rentgenowski.</li>
		<li>Zeskanuj ekran luminoforowy za pomocą imagera luminoforowego i przenieś żel do szklanej probówki w celu barwienia CBB po wizualizacji zgodnie z krokiem 2.4.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Hardie, D. G., Schaffer, B. E., Brunet, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AMPK%3A+An+energy-sensing+pathway+with+multiple+inputs+and+outputs%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">AMPK: An energy-sensing pathway with multiple inputs and outputs.</a> Trends Cell Biol. 26, 190-201 (2016).</li>
<li>Gwinn, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AMPK+phosphorylation+of+raptor+mediates+a+metabolic+checkpoint%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">AMPK phosphorylation of raptor mediates a metabolic checkpoint.</a> Mol Cell. 30, 214-226 (2008).</li>
<li>Huang, H. C., Nguyen, T., Pickett, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphorylation+of+Nrf2+at+Ser-40+by+protein+kinase+C+regulates+antioxidant+response+element-mediated+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Phosphorylation of Nrf2 at Ser-40 by protein kinase C regulates antioxidant response element-mediated transcription.</a> J Biol Chem. 277, 42769-42774 (2002).</li>
<li>Niture, S. K., Jain, A. K., Jaiswal, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antioxidant-induced+modification+of+INrf2+cysteine+151+and+PKC-delta-mediated+phosphorylation+of+Nrf2+serine+40+are+both+required+for+stabilization+and+nuclear+translocation+of+Nrf2+and+increased+drug+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Antioxidant-induced modification of INrf2 cysteine 151 and PKC-delta-mediated phosphorylation of Nrf2 serine 40 are both required for stabilization and nuclear translocation of Nrf2 and increased drug resistance.</a> J Cell Sci. 122, 4452-4464 (2009).</li>
<li>Jain, A. K., Jaiswal, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GSK-3beta+acts+upstream+of+Fyn+kinase+in+regulation+of+nuclear+export+and+degradation+of+NF-E2+related+factor+2%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">GSK-3beta acts upstream of Fyn kinase in regulation of nuclear export and degradation of NF-E2 related factor 2.</a> J Biol Chem. 282, 16502-16510 (2007).</li>
<li>Steen, H., Jebanathirajah, J. A., Rush, J., Morrice, N., Kirschner, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphorylation+analysis+by+mass+spectrometry%3A+myths%2C+facts%2C+and+the+consequences+for+qualitative+and+quantitative+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Phosphorylation analysis by mass spectrometry: myths, facts, and the consequences for qualitative and quantitative measurements.</a> Mol Cell Proteomics. 5, 172-181 (2006).</li>
<li>Dephoure, N., Gould, K. L., Gygi, S. P., Kellogg, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+and+analysis+of+phosphorylation+sites%3A+a+quick+guide+for+cell+biologists%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Mapping and analysis of phosphorylation sites: a quick guide for cell biologists.</a> Mol Biol Cell. 24, 535-542 (2013).</li>
<li>Joo, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AMPK+facilitates+nuclear+accumulation+of+Nrf2+by+phosphorylating+at+Serine+550%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">AMPK facilitates nuclear accumulation of Nrf2 by phosphorylating at Serine 550.</a> Mol Cell Biol. 36, 1931-1942 (2016).</li>
<li>Sinclair, W. K., Holloway, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Half-lives+of+some+radioactive+isotopes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Half-lives of some radioactive isotopes.</a> Nature. 167 (4244), 365(1951).</li>
<li>Chang, B. Y., Chiang, M., Cartwright, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+interaction+of+Src+and+RACK1+is+enhanced+by+activation+of+protein+kinase+C+and+tyrosine+phosphorylation+of+RACK1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The interaction of Src and RACK1 is enhanced by activation of protein kinase C and tyrosine phosphorylation of RACK1.</a> J Biol Chem. 276, 20346-20356 (2001).</li>
<li>Smith, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RACK1+interacts+with+filamin-A+to+regulate+plasma+membrane+levels+of+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">RACK1 interacts with filamin-A to regulate plasma membrane levels of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 305 (1), C111-C120 (2013).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Jako prosty i wygodny sposób oceny autentyczności przewidywanych miejsc fosforylacji, w których pośredniczy AMPK, opisujemy tutaj test kinazy in vitro, który można wykorzystać do odkrycia określonego miejsca fosforylacji przy użyciu konkurencyjnych peptydów i zweryfikowania go za pomocą mutanta specyficznego dla miejsca. Reprezentatywne dane uzyskane z konkurencyjnego testu aktywności AMPK in vitro odpowiadały wynikom testu z użyciem zmutowanego białka skierowanego do miejsca, co wskazuje, że test konku...

Fosforylacja białek w określonej reszcie odgrywa znaczącą rolę w szerokim zakresie procesów komórkowych. W związku z tym zrozumienie sieci sygnalizacyjnych wymaga identyfikacji określonych miejsc fosforylacji. Ponadto miejsce fosforylacji określa wpływ na funkcję białka, ponieważ poszczególne domeny w białku mają różne struktury i funkcje. Aktywność czynnika jądrowego erytroidalnego 2 związanego z czynnikiem 2 (Nrf2), kluczowego przeciwutleniającego czynnika transkrypcyjnego, jest dwukierunkowo regulowana przez fosforylację w różnych miejscach. Nasze badania koncentrowały się na kinazach, które katalizują fosforylację Nrf2. Reakcja stresowa Nrf2 na prowokację oksydacyjną zachodzi szybko, głównie poprzez fosforylację seryny 40 i za pośrednictwem kinazy białkowej C (PKC)-δ, która aktywuje Nrf23,4. I odwrotnie, Fyn katalizuje hamującą fosforylację Nrf2 w tyrozynie 568 w celu ścisłej kontroli aktywności5.
Najczęstszą metodą używaną do wykrywania miejsc fosforylacji jest chromatografia cieczowa/analiza spektrometrii mas (LC/MS). W ten sposób można szybko i bardzo czuło wygenerować dane mapowania miejsc fosforylacji; Ma jednak kilka ograniczeń technicznych, często generując sygnały fałszywie ujemne. Słabe pokrycie sekwencji często występuje w analizie LC/MS. Aby zidentyfikować miejsca fosforylacji, wymagane są informacje na temat maksymalnego pokrycia aminokwasami białka6. Proteoliza białka będącego przedmiotem zainteresowania kilkoma proteazami na etapie trawienia może być pomocna w poprawie pokrycia sekwencji. Kolejną przeszkodą w identyfikacji reszt fosforylacji jest łatwa utrata kwasu fosforowego, która jest często obserwowana w przypadku peptydów fosforylowanych seryną i treoniną6,7. Nietrwałe ugrupowania fosforanowe są często uwalniane z fosfopeptydów podczas procesu fragmentacji7. Drugą opcją przy poszukiwaniu miejsc fosforylacji jest użycie metody mikromacierzy peptydowej. Możliwe jest badanie przesiewowe miejsc docelowych kinazy za pomocą chipa mikromacierzy zawierającego fragmenty peptydów pochodzące z białka będącego przedmiotem zainteresowania. Jednak ze względu na wymagania sprzętowe do produkcji i wykrywania chipa mikromacierzy, metoda mikromacierzy peptydowej jest uważana za czasochłonną i kosztowną.
Aby przezwyciężyć te wyzwania, można zastosować test kinazy konkurującej z oligopeptydami in vitro dla kinazy białkowej o znanych motywach rozpoznawania. Jeśli zostanie ustalony motyw rozpoznawania konsensusu kinazy, można przewidzieć przypuszczalne miejsca fosforylacji potencjalnego substratu i potwierdzić autentyczność tych miejsc. Najbardziej przekonującą metodą tej procedury jest wykazanie zniesienia fosforylacji w zmutowanym białku, w którym przewidywana reszta jest podstawiona niefosforylującym aminokwasem (tj. seryną lub treoniną do alaniny; tyrozyny do fenyloalaniny). Jednak produkcja i izolacja zmutowanych białek jest czasochłonna. Jako alternatywa na początkowym etapie badań, konkurencyjny test kinazy peptydowej jest prosty i wygodny. W tym miejscu opisujemy protokół testu konkurencji peptydów in vitro oraz walidacji miejsca fosforylacji.

<table><tbody><tr><td>HEPES</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td><td>15630</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>208337</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>D9779</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-glicerofosforan</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>G9422</td><td></td></tr><tr><td>Na3VO4</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>450243</td><td></td></tr><tr><td>Koktajl inhibitorów proteazy</td><td>Calbiochem, Nottingham, Wielka Brytania</td><td>539134</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>A2383</td><td></td></tr><tr><td>AMP</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>A1752</td><td></td></tr><tr><td>AMPK</td><td>Upstate Biotechnology, Jezioro Placid, NY</td><td>14-840</td><td></td></tr><tr><td>Nrf2 (WT)</td><td>Abnova, Tajpej, Tajwan</td><td>H00004780-P01</td><td></td></tr><tr><td>[&gamma;-32P]-ATP</td><td>PerkinElmer Life and Analytical Sciences, Waltham, MA</td><td>NEG502A</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik do barwienia EZblue</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>G1041</td><td></td></tr><tr><td>Pfu turbo polimeraza DNA</td><td>Agilent Technologies, Santa Clara, Kalifornia</td><td>600250</td><td></td></tr><tr><td>mieszanka dNTP</td><td>Agilent Technologies, Santa Clara, CA</td><td>200415-51</td><td>Unikaj wielokrotnego cyklu rozmrażania i zamrażania</td></tr><tr><td>DpnI</td><td>New England Biolabs, Ipswich, MA</td><td>R0176S</td><td></td></tr><tr><td>LB bulion</td><td>Duchefa Biochemie BV, Haarlem, Holandia</td><td>L1704</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Affymetrix, Santa Clara, CA</td><td>11259</td><td></td></tr><tr><td>Agaroza LE</td><td>iNtRON Biotechnology, Sungnam, Korea Południowa</td><td>32034</td><td></td></tr><tr><td>HiYield Plus Gel/PCR DNA Mini Kit</td><td>Real Biotech Corporation, Tajpej, Tajwan</td><td>QDF100</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie Brilliant Blue R-250</td><td>Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA</td><td>161-0400</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej</td><td>Bovogen Biologicals, Wiktoria, Australia</td><td>BSA100</td><td></td></tr><tr><td>Sepharose glutationu 4B</td><td>GE Opieka zdrowotna, Marlborough, MA</td><td>17-0756-01</td><td></td></tr><tr><td>Kwas octowy lodowaty</td><td>Duksan czyste chemikalia, Ansan, Korea</td><td></td><td></td>Południowa</tr><tr><td>Alkohol metylowy &nbsp; &nbsp;</td><td>Daejung Chemikalia & Metals, Siheung, Korea Południowa</td><td>5558-4410</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">[nagłówek]</td></tr><tr><td>Tajfun FLA 7000</td><td>GE Healthcare, Marlborough, MA</td><td>28-9558-09</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw SDS-PAGE</td><td>Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA</td><td>1658001FC</td><td></td></tr><tr><td>Pompa próżniowa</td><td>Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA</td><td>165-178</td><td></td></tr><tr><td>Suszarka do żelu</td><td>Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA</td><td>165-1746</td><td></td></tr><tr><td>Tańczący shaker</td><td>FINEPCR, Seul, Korea</td><td>CR300</td><td>Maszyna jest potrzebna do prania</td></tr><tr><td>krokowego Maszyna do PCR</td><td>Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA</td><td>T100</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator/wytrząsarki</td><td>N-BIOTEK, GyeongGi-Do, Korea</td><td>NB-205L</td><td></td></tr><tr><td>Mikrowirówki</td><td>LABOGENE, Seul, Korea</td><td>1730R</td><td></td></tr><tr><td>Kolumny</td> <td>chromatograficzneLaboratoria Bio-Rad, Hercules, CA</td><td>732-1010</td><td></td></tr></tbody></table>

test konkurencji oligopeptydowej do oznaczania miejsca fosforylacji

Oligopeptide Competition Assay for Phosphorylation Site Determination

Fosforylacja białek w określonych miejscach determinuje jego konformację i interakcję z innymi cząsteczkami. W ten sposób fosforylacja białek wpływa na funkcje biologiczne i charakterystykę komórki. Obecnie najpowszechniejszą metodą wykrywania miejsc fosforylacji jest chromatografia cieczowa/analiza spektrometrii mas (LC/MS), która jest szybką i czułą metodą. Jednak stosunkowo labilne ugrupowania fosforanowe są często uwalniane z fosfopeptydów na etapie fragmentacji, co często daje sygnały fałszywie ujemne. W takich przypadkach tradycyjny test kinazy in vitro z użyciem mutantów skierowanych na miejsce byłby dokładniejszy, ale ta metoda jest pracochłonna i czasochłonna. Dlatego korzystna może być alternatywna metoda wykorzystująca konkurencję peptydów. Ustalono motyw rozpoznawania konsensusu kinazy białkowej aktywowanej monofosforanem adenozyny (AMPK) 1 i został zweryfikowany za pomocą pozycyjnego skanowania biblioteki peptydów2. W ten sposób miejsca fosforylacji AMPK dla nowego substratu można było przewidzieć i potwierdzić za pomocą testów konkurencji peptydów. W tym raporcie opisujemy szczegółowe etapy i procedury testu kinazy konkurującej z oligopeptydami in vitro, ilustrując fosforylację czynnika 2 związanego z erytroidem 2 (Nrf2) za pośrednictwem AMPK. Aby uwierzytelnić miejsce fosforylacji, przeprowadziliśmy sekwencyjny test kinazy in vitro przy użyciu mutanta specyficznego dla miejsca. Ogólnie rzecz biorąc, test konkurencji peptydów zapewnia metodę badania przesiewowego wielu potencjalnych miejsc fosforylacji i identyfikacji miejsc do walidacji przez mutanty miejsca fosforylacji.

Rycina 1 oraz Rycina 2 przedstawiają wyniki powtórzonych eksperymentów opisanych w poprzednim artykule8. Zsyntetyzowano trzy różne 10-resztkowe oligopeptydy naśladujące domniemane miejsca docelowe AMPK (#1, 148-157 zawierający Ser153; #2, 330-339 zawierający Ser335; oraz #3, 553-562 zawierający Ser558), które wykorzystano jako konkurenty w teście kinazy in vitro. Fosforylacja Nrf2 przez AMPK była ...

Testy konkurencji peptydowej są szeroko stosowane w różnych eksperymentach molekularnych i immunologicznych. W artykule opisano szczegółową metodę testu kinazy konkurującej z oligopeptydami in vitro i związane z nią procedury walidacyjne, które mogą być przydatne do znalezienia określonych miejsc fosforylacji.

Test konkurencji oligopeptydowej do oznaczania miejsca fosforylacji

Protein phosphorylation at specific sites determines its conformation and interaction with other molecules. Thus, protein phosphorylation affects ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest jednoczesna ocena wielu potencjalnych miejsc fosforylacji oraz identyfikacja miejsc do późniejszej walidacji za pomocą mutantów miejsc fosforylacji. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu biochemii i biologii komórki dotyczące roli modyfikacji potranslacyjnych w sygnalizacji komórkowej. Technika ta umożliwia łatwe i niskokosztowe wstępne przesiewanie miejsc fosforylacji w białku będącym przedmiotem zainteresowania.Zastosowanie tej techniki rozszerzyło się na diagnostykę i terapię chorób, w tym stanów zapalnych oraz nowotworów, ponieważ fosforylacja jest istotnym zdarzeniem biochemicznym w szlakach sygnalizacyjnych w chorobach ludzkich. W demonstracji pomoże Sol-Bi Shin, studentka studiów doktoranckich z mojego laboratorium, wykonując mutogenezę ukierunkowaną. Najpierw połączyć na lodzie 50 nanogramów plazmidu pGEX JST NRF2, 125 nanogramów startera forward, 125 nanogramów startera reverse, 1 µL mieszaniny dNTP, 2,5 jednostek polimerazy DNA PFU oraz bufor reakcyjny 10x.Dodać sterylną wodę destylowaną, aby zwiększyć objętość do 50 µL. Przeprowadzić reakcję PCR w celu wprowadzenia nici zmutowanej, a następnie s

oligopeptide-competition-assay-for-phosphorylation-site-determination

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Ten film demonstruje czułą technikę fosforylacji białek za pomocą testu ściągania pojedynczej cząsteczki. Funkcjonalizacja glikolu polietylenowego-biotyny i zastosowanie znakowanych przeciwciał zwiększa wykrywalność fosforylowanej tyrozyny ze swoistością.

Test jednocząsteczkowy pull-down do analizy fosforylacji białek: wysokoprzepustowa technika ilościowego określania fosforylacji białek w lizacie komórkowym

Opisujemy tutaj protokół oczyszczania i charakterystyki kompleksów białek roślinnych. Pokazujemy to, immunoprecypitując pojedyncze białko w kompleksie, dzięki czemu możemy zidentyfikować jego modyfikacje potranslacyjne i oddziałujących partnerów.

Identyfikacja modyfikacji potranslacyjnych kompleksów białek roślinnych

Fosforylacja białek jest główną cechą tego, jak komórki interpretują i reagują na informacje w swoim środowisku zewnątrzkomórkowym. W tym miejscu przedstawiamy wysokoprzepustowy protokół badań przesiewowych wykorzystujący kinazy oczyszczone z komórek ssaków w celu szybkiej identyfikacji kinaz, które fosforylują substrat (substraty) będący przedmiotem zainteresowania.

Identyfikacja par kinaza-substrat za pomocą wysokoprzepustowych badań przesiewowych

Ten protokół porównuje względne pokrewieństwo partnerów wiążących dla GTPaz rodziny Rho, w tym Rac1. In vivo białka wiążące Rac1 konkurują o pojedynczy interfejs wiążący, którego konformacja jest podyktowana przez związany nukleotyd. Nukleotyd jest zarówno ważny, jak i trudny do kontrolowania eksperymentalnie ze względu na wysoką szybkość hydrolizy.

Porównanie powinowactwa białek wiążących GTPazę przy użyciu testów konkurencji

Kinaza zależna od cykliny 1 (Cdk1) jest aktywowana w fazie G2 cyklu komórkowego i reguluje wiele szlaków komórkowych. W tym miejscu przedstawiamy protokół testu kinazy in vitro z Cdk1, który umożliwia identyfikację miejsc fosforylacji specyficznych dla Cdk1 w celu ustalenia celów komórkowych tej ważnej kinazy.

Identyfikacja miejsc fosforylacji specyficznych dla kinazy 1 zależnej od cykliny za pomocą testu kinazy in vitro

Tutaj prezentujemy protokół koimmunoprecypitacji i test aktywności enzymatycznej na koraliku, aby jednocześnie badać udział specyficznych domen białkowych receptorów błony komórkowej zarówno w rekrutacji enzymów, jak i ich aktywności.

Test koimmunoprecypitacji do badania funkcjonalnych interakcji między receptorami i enzymami

Scharakteryzowaliśmy nowe białko kinazy za pomocą solidnych podejść biochemicznych: analiza Western Blot z dedykowanym specyficznym przeciwciałem na różnych liniach komórkowych i tkankach, interakcje za pomocą eksperymentów z koimmunoprecypitacją, aktywność kinazy wykryta przez Western Blot przy użyciu przeciwciała specyficznego dla fosfy oraz znakowanie γ[32P] ATP.

Charakterystyka na poziomie molekularnym przy użyciu solidnych podejść biochemicznych nowego białka kinazy

Ten protokół opisuje nieradioaktywny test do pomiaru aktywności kinaz polinukleotydowych (PNK) na małych substratach DNA i RNA.

Test nieradioaktywny do pomiaru fosforylacji polinukleotydów małych substratów nukleotydowych

Obecny protokół opisuje przygotowanie próbki i analizę danych w celu ilościowego określenia fosforylacji białek za pomocą ulepszonego testu ściągania pojedynczych cząsteczek (SiMPull).

Zoptymalizowany test typu pull-down dla pojedynczych cząsteczek do ilościowego oznaczania fosforylacji białek

Tutaj wprowadzamy protokół do używania substratów z powierzchni drożdży do testów modyfikacji enzymatycznej. Platformę zademonstrowano, wykorzystując analizę aktywności defosforylacji fosfatazy tyrozynowej SHP-2 w stosunku do jednego z jej substratów jako reprezentatywny test modyfikacji enzymatycznej.

Modyfikacja enzymatyczna i cytometria przepływowa oceny białek powierzchniowych drożdży

Poznaj test konkurencji oligopeptydowej do identyfikacji miejsc fosforylacji w białkach. Ta metoda biochemiczna umożliwia ekonomiczne wstępne badanie modyfikacji potranslacyjnych w sygnalizacji komórkowej.

Test konkurencji oligopeptydowej do oznaczania miejsca fosforylacji

Przeglądaj więcej filmów