Test konkurencji oligopeptydowej do oznaczania miejsca fosforylacji

Ogólnym celem niniejszej procedury jest jednoczesna ocena wielu potencjalnych miejsc fosforylacji oraz identyfikacja miejsc do późniejszej walidacji za pomocą mutantów miejsc fosforylacji. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu biochemii i biologii komórki dotyczące roli modyfikacji potranslacyjnych w sygnalizacji komórkowej. Technika ta umożliwia łatwe i niskokosztowe wstępne przesiewanie miejsc fosforylacji w białku będącym przedmiotem zainteresowania.

Zastosowanie tej techniki rozszerzyło się na diagnostykę i terapię chorób, w tym stanów zapalnych oraz nowotworów, ponieważ fosforylacja jest istotnym zdarzeniem biochemicznym w szlakach sygnalizacyjnych w chorobach ludzkich. W demonstracji pomoże Sol-Bi Shin, studentka studiów doktoranckich z mojego laboratorium, wykonując mutogenezę ukierunkowaną. Najpierw połączyć na lodzie 50 nanogramów plazmidu pGEX JST NRF2, 125 nanogramów startera forward, 125 nanogramów startera reverse, 1 µL mieszaniny dNTP, 2,5 jednostek polimerazy DNA PFU oraz bufor reakcyjny 10x.

Dodać sterylną wodę destylowaną, aby zwiększyć objętość do 50 µL. Przeprowadzić reakcję PCR w celu wprowadzenia nici zmutowanej, a następnie schłodzić próbkę na lodzie przez dwie minuty. Do schłodzonej próbki dodać 1 µL enzymu restrykcyjnego DPNI.

Wymieszaj próbkę za pomocą delikatnego pipetowania, a następnie odwiruj ją w wirówce przez jedną minutę przy 13 000 ×g. Inkubuj próbkę w temperaturze 37 °C przez dwie godziny w celu strawienia rodzimego dwuniciowego DNA. Następnie przygotuj na lodzie superkompetentne komórki E.coli z mutacjami endA1 i RACA1. Dodaj 50 µl mieszaniny reakcyjnej do schłodzonych komórek i inkubuj na lodzie przez 30 minut.

W międzyczasie podgrzej blok grzejny do 42 °C. Po zakończeniu inkubacji podgrzewaj mieszaninę w temperaturze 42 °C przez 90 sekund, a następnie schładzaj ją na lodzie przez dwie minuty. Do przekształconych komórek dodaj uprzednio ogrzany bulion Lysogeny broth.

Inkubować mieszaninę w temperaturze 37 °C przez jedną godzinę, wytrząsając z prędkością 180 RPM. Następnie wysiać komórki na płytki z agarem LB z ampicyliną i inkubować płytki przez noc w temperaturze 37 °C. Przenieść pojedynczą kolonię do 5 ml bulionu Lysogeny z ampicyliną.

Inkubować próbki przez noc w temperaturze 37 °C przy wytrząsaniu z prędkością 180 RPM. Wyekstrahować DNA z próbki, używając standardowego zestawu do mini-preparatyki w celu analizy sekwencji DNA. Nałożyć co najmniej 200 ng konstruktu HDNA na analizator DNA, aby zweryfikować sekwencję mutanta.

Wyraź i oczyść zwalidowane białko zmutowane NRF2. Przed przystąpieniem do testu kinazy określ ilość otrzymanego zmutowanego NRF2. Aby rozpocząć test konkurencji peptydowej, przygotuj 5-krotny roztwór buforu kinazy z stężeniem adenozynomonofosforanu wynoszącym 500 µM.

Następnie rozmrozić zamrożone próbki AMPK typu dzikiego, ludzkiego NRF2 oraz trzech oligopeptydów naśladujących miejsca fosforylacji NRF2 przez AMPK. Dla każdego peptydy, zachowując niską temperaturę na lodzie, połączyć 0,43 mg peptydy z 0,15 µg AMPK, 0,4 µg NRF2 oraz sześcioma µL 5X Kinase Buffer. Dodać sterylną wodę destylowaną, aby uzyskać końcową objętość 30 µL.

Następnie w osłoniętym obszarze ustaw blok grzejny na 30 °C. Do każdej probówki dodaj jedną mikrokuri $\gamma ^{32} \text{P ATP}$, dokładnie mieszając każdy roztwór poprzez pipetowanie w górę i w dół. Inkubuj mieszaniny reakcyjne w temperaturze 30 °C przez 15 do 30 minut.

Podczas inkubacji należy przygotować żel do elektroforezy PAGE z 7,5% STS. Następnie do każdej probówki dodaje się 3 µL 10-krotnego buforu do próbek STS i miesza dokładnie, aby zatrzymać reakcję kinazy. Próbki poddaje się elektroforezie w żelu przy napięciu 70 V przez 20 minut, a następnie przy 140 V przez jedną godzinę.

Po zakończeniu elektroforezy w żelu ostrożnie usuń silnie radioaktywny żel poniżej linii błękitu bromofenolowego. Delikatnie przenieś żel z formy do szklanej probówki. Utrwal żel w roztworze 50% methanol, 40% water i 10% acetic acid przez 20 minut.

Następnie ostrożnie należy umieścić żel na papierze filtracyjnym i przykryć go przezroczystą folią. Żel należy wysuszyć w próżniowej suszarce do żeli przez jedną godzinę w temperaturze 80 degree Celsius. Wysuszony żel należy naświetlać odpowiednio na ekranie fosforowym przez około 16 godzin lub na filmie rentgenowskim przez dwa dni.

Użyj fosforimageru do wygenerowania pliku TIFF lub Bitmapy skanu w wysokiej rozdzielczości. Aby rozpocząć test aktywności AMPK, rozmroź na lodzie próbki AMPK oraz mutanty i typy dzikie GST NRF2. Połącz 0,4 µg mutantu GST NRF2 z 0,15 µg AMPK oraz sześcioma µL 5X buforu kinazowego.

Dodać sterylną wodę destylowaną, aby doprowadzić objętość do 30 µL. W ten sam sposób przygotować kolejną mieszaninę reakcyjną z 0,4 µg GST NRF2 typu dzikiego. Do każdej fiolki z reakcją dodać 1 µCi ATP znakowanego 32P gamma.

Wymieszaj zawiesiny, pipetując je kilka razy w górę i w dół, a następnie krótko odwiruj próbki w wirówce. Inkubuj mieszaniny w temperaturze 30 °C przez 30 minut w osłoniętym obszarze, a następnie przerwij reakcję kinazy, dodając 3 µL 10X buforu do próbek STS. Przeprowadź elektroforezę STS PAGE, utrwal żel i wysusz go, stosując te same warunki, co w konkurencyjnym teście kinazy.

Naświetlaj żel na ekranie fosforowym przez noc, a następnie przeskanuj ekran za pomocą urządzenia Phosphorimager. Przeprowadzono test AMPK in vitro w obecności trzech oligopeptydów składających się z 10 reszt, naśladujących miejsca fosforylacji AMPK w ludzkim białku NRF2. Oligopeptyd naśladujący miejsce seryny 558 wykazał najsilniejszą konkurencję w procesie fosforylacji AMPK.

Następnie zsyntetyzowano mutant NRF2, w którym seryna 558 została zastąpiona alaniną, i poddano go ocenie w teście aktywności in vitro. Zaobserwowano bardzo słabą fosforylację mutanta S558 A przez AMPK, co wskazuje, że AMPK bezpośrednio fosforyluje ludzki NRF2 w pozycji seryny 558. Ponieważ peptydy wiążą się z białkami konkurencyjnie, zasadę tej metody można zastosować również do identyfikacji innych modyfikacji potranslacyjnych, takich jak acetylacja reszt lizyny, a także oddziaływań białko-białko.

Należy pamiętać, że praca z izotopami promieniotwórczymi może być niezwykle niebezpieczna. Przed przystąpieniem do tej procedury należy przejść szkolenie z zakresu bezpieczeństwa pracy z izotopami promieniotwórczymi.