Test konkurencji oligopeptydowej do oznaczania miejsca fosforylacji

Ogólnym celem tej procedury jest jednoczesna ocena wielu potencjalnych miejsc fosforylacji i identyfikacja miejsc do późniejszej walidacji przez mutanty miejsc fosforylacji. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania z dziedziny biochemii i biologii komórki dotyczące roli modyfikacji potranslacyjnych w sygnalizacji komórkowej. Technika ta umożliwia łatwe, niedrogie wstępne badania przesiewowe pod kątem miejsc fosforylacji i białka będącego przedmiotem zainteresowania.

Implikacje tej techniki rozszerzyły się na diagnostykę i terapię chorób, w tym stanów zapalnych i raka, ponieważ fosforylacja jest ważnym wydarzeniem biochemicznym w szlakach sygnałowych w chorobach ludzkich. W demonstracji miał pomóc Sol-Bi Shin, doktorant z mojego laboratorium, który podczas wykonywania mutagenezy kierowanej przez miejsce. Najpierw połącz 50 nanogramów plazmy pGEX JST NRF2, 125 nanogramów startera do przodu, 125 nanogramów startera odwrotnego, jeden mikrolitr DNTP wymieszaj 2,5 jednostki polimerazy DNA PFU i 10x bufor reakcyjny na lodzie.

Dodaj sterylną wodę destylowaną, aby zwiększyć objętość do 50 mikrolitrów. Przeprowadzić PCR w celu włączenia zmutowanej nici, a następnie schłodzić próbkę na lodzie przez dwie minuty. Dodać jeden mikrolitr enzymu restrykcyjnego DPNI do schłodzonej próbki.

Wymieszaj próbkę z delikatnym pipetowaniem, a następnie odwiruj próbkę przez jedną minutę w temperaturze 13 000 razy G. Inkubuj próbkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dwie godziny, aby strawić rodzicielskie dwuniciowe DNA. Następnie wrzuć na lód superkompetentne komórki E. coli z mutacjami endA1 i RACA1. Dodać 50 mikrolitrów mieszaniny reakcyjnej do schłodzonych komórek i inkubować na lodzie przez 30 minut.

W międzyczasie podgrzej blok grzewczy do 42 stopni Celsjusza. Po zakończeniu inkubacji podgrzej mieszaninę w temperaturze 42 stopni Celsjusza przez 90 sekund, a następnie schłodzić mieszaninę na lodzie przez dwie minuty. Dodaj podgrzany bulion lizogeniczny do przekształconych komórek.

Inkubować mieszaninę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę, wstrząsając z prędkością 180 obr./min. Następnie rozprowadź komórki na płytkach agarowych z ampicyliną LB i inkubuj płytki przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Przenieś pojedynczą kolonię do pięciu mililitrów bulionu lizogennego z ampicyliną.

Próbki inkubować przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza, wstrząsając z prędkością 180 obr./min. Wyodrębnij próbkę DNA za pomocą standardowego mini zestawu przygotowawczego do analizy sekwencji DNA. Uruchom co najmniej 200 nanogramów konstruktu HDNA w analizatorze DNA, aby zweryfikować zmutowaną sekwencję.

Ekspresja i oczyszczanie zwalidowanego zmutowanego białka NRF2. Określić ilość wytworzonego zmutowanego NRF2 przed przystąpieniem do testu kinazy. Aby rozpocząć test konkurencji peptydów, należy przygotować 5-krotny roztwór buforowy kinazy o stężeniu monofosforanu adenozyny wynoszącym 500 mikromolów.

Następnie rozmrozić zamrożone próbki ludzkiego NRF2 typu dzikiego AMPK i trzech oliogopeptydów naśladujących miejsca fosforylacji AMPK NRF2. Dla każdego peptydu, będąc na lodzie, połącz 0,43 miligrama peptydu z 0,15 mikrograma AMPK, 0,4 mikrograma NRF2 i sześcioma mikrolitrami 5X Kinase Buffer. Dodaj sterylną wodę destylowaną, aby uzyskać końcową objętość 30 mikrolitrów.

Następnie w osłoniętym miejscu ustaw blok grzewczy na 30 stopni Celsjusza. Dodaj jedną mikrokiurę gamma 32P ATP do każdej probówki, dokładnie mieszając każdy roztwór, pipetując w górę iw dół. Mieszaniny reakcyjne inkubować w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez 15 do 30 minut.

Podczas inkubacji przygotuj 7,5% żel STS PAGE. Następnie dodaj trzy mikrolitry buforu do próbki 10X STS do każdej probówki i dokładnie wymieszaj, aby zatrzymać reakcję kinazy. Próbki należy przechowywać w żelu pod napięciem 70 V przez 20 minut, a następnie przy napięciu 140 V przez jedną godzinę.

Po zakończeniu elektroforezy żelowej ostrożnie usuń wysoce radioaktywny żel poniżej niebieskiej linii bromofenolu. Delikatnie przenieś żel z kółka do szklanej tubki. Utrwal żel w roztworze 50% metanolu, 40% wody i 10% kwasu octowego przez 20 minut.

Następnie delikatnie umieść żel na bibule filtracyjnej i przykryj przezroczystą folią. Suszyć żel suszarką próżniową do żelu przez godzinę w temperaturze 80 stopni Celsjusza. Suchy żel należy wystawić na działanie ekranu fosforowego lub kliszy rentgenowskiej odpowiednio przez około 16 godzin przez dwa dni.

Użyj narzędzia Phosphorimager, aby wygenerować plik TIFF lub bitmapowy o wysokiej rozdzielczości ekranu. Aby rozpocząć test aktywności AMPK, należy rozmrozić próbki AMPK oraz zmutowanego i dzikiego typu GST NRF2 na lodzie. Połącz 0,4 mikrograma zmutowanego GST NRF2 z 0,15 mikrograma AMPK i sześcioma mikrolitrami buforu 5X kinazy.

Dodaj sterylną wodę destylowaną, aby zwiększyć objętość do 30 mikrolitrów. Przygotować w ten sposób kolejną mieszaninę reakcyjną z 0,4 mikrograma dzikiego GST NRF2. Dodać jeden mikrokiur gamma 32P ATP do każdej fiolki reakcyjnej.

Kilkakrotnie odpipetować mieszaniny w górę i w dół, a następnie krótko odwirować mieszaniny. Inkubować mieszaniny w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez 30 minut w osłoniętym obszarze, a następnie zakończyć reakcję kinazy trzema mikrolitrami buforu do próbek 10X STS. Uruchom STS PAGE, utrwal żel i wysusz żel w tych samych warunkach, co w konkurencyjnym teście kinazy.

Wystaw żel na ekran fosforowy na noc i zeskanuj ekran za pomocą Phosphorimager. Test AMPK in vitro przeprowadzono w obecności trzech oligopeptydów o reszcie 10 naśladujących miejsca fosforylacji AMPK na ludzkim NRF2. Oligopeptyd naśladujący miejsce seryny 558 stanowił największą konkurencję dla fosforylacji AMPK.

Następnie zsyntetyzowano mutanta NRF2 zastępującego serynę 558 alaniną i oceniono go w teście aktywności in vitro. Zaobserwowano bardzo małą fosforylację AMPK mutanta S558 A, co wskazuje, że AMPK bezpośrednio fosforyluje ludzki NRF2 w serynie 558. Ponieważ peptydy wiążą się konkurencyjnie z białkami, zasada tej metody może być również stosowana do identyfikacji innych posttranslacji i modyfikacji, takich jak acetylizacja i reszty lizyny oraz interakcje białek białkowych.

Nie zapominaj, że praca z izotopem promieniowym może być bardzo niebezpieczna. Przed wykonaniem tej procedury należy już odbyć szkolenie w zakresie bezpieczeństwa izotopów radiowych.