Name: Mysie plastry serca o krótkiej osi do badań elektrofizjologicznych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 51 s
Description: Poznaj metodę przygotowania żywych płatów komorowych myszy do badań elektrofizjologicznych. Technika umożliwia rejestrację potencjałów czynnościowych i badanie integracji komórek sercowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy za wsparcie udzielone przez warsztaty i obiekt dla zwierząt Instytutu Neurofizjologii. Prace te były wspierane przez Walter und Marga Boll-Stiftung, Köln Fortune i Deutsche Stiftung für Herzforschung.

Obchodzenie się ze zwierzętami musi być zgodne z wytycznymi lokalnego komitetu ds. dobrostanu zwierząt oraz z Dyrektywą Parlamentu Europejskiego 2010/63/UE.
1. Przygotuj rozwiązania
<ol>
	<li>Przygotować roztwór Tyrode'a bez Ca2+ (skład w mM): NaCl 136, KCl 5,4, NaH2PO4 0,33, MgCl2 1, glukoza 10, HEPES 5, monoksymus 2,3-butanodionu (BDM) 30. Doprowadzić pH do 7,4 za pomocą NaOH w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przygotować roztwór Tyrode'a z Ca2+ (skład w mM): NaCl 136, KCl 5,4, NaH2PO4 0,33, MgCl2 1, glukoza 10, HEPES 5, BDM 30, CaCl2 0,9. Doprowadzić pH do 7,4 za pomocą NaOH w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przygotuj 4% niskotopliwej agarozy: Umieść 0,6 g niskotopliwej agarozy w 15 ml roztworu Tyrode'a bez Ca2+. Podgrzej mieszaninę w kuchence mikrofalowej dwa razy z mocą 750 W przez 10-15 s, aż agaroza się rozpuści. Utrzymywać roztwór w stałej temperaturze 37 °C i ciągle mieszać.</li>
	<li>Przechowywać Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) bez surowicy w temperaturze 37 °C bąbelkowanej karbogenem (5% CO2, 95% O2 ).</li>
</ol>
2. Przygotuj mikrotom
<ol>
	<li>Włączyć mikrotom.</li>
	<li>Napełnij zewnętrzną komorę mikrotomu lodem.</li>
	<li>Napełnij wewnętrzną komorę mikrotomu lodowatym roztworem Tyrode bez Ca2+ i stale natleniaj roztwór 100%O2.</li>
	<li>Umieść stalowe ostrze w uchwycie ostrza mikrotomu.</li>
</ol>
3. Izolacja serca myszy
<ol>
	<li>Wstrzyknąć podskórnie 2 500 j. heparyny. Odczekaj 15 min.</li>
	<li>Złóż zwierzę w ofierze przez zwichnięcie szyjki macicy.</li>
	<li>Otwórz klatkę piersiową przez sternotomię.</li>
	<li>Ostrożnie wypreparuj osierdzie za pomocą małych nożyczek i kleszczy #5.</li>
	<li>Wprowadź kaniulę do aorty wstępującej i perfuzjuj tętnice wieńcowe in situ lodowatym roztworem Tyrode'a bez Ca2+, aż pozostała krew zostanie usunięta.</li>
	<li>Delikatnie wyciąć serce kleszczami i nożyczkami i przenieść serce w lodowatym roztworze Tyrode'a bez Ca2+.</li>
	<li>Oddziel przedsionki od komór skalpelem lub nożyczkami.</li>
</ol>
4. Osadzanie komór w 4% niskotopliwej agarozie
<ol>
	<li>Umieść komory z wierzchołkiem skierowanym do góry w formie agarozowej (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1). Umieść szpilkę na środku formy w lewej komorze komory.</li>
	<li>Napełnij formę 4% niskotopliwą agarozą w temperaturze 37 °C, aż serce zostanie całkowicie pokryte.</li>
	<li>Umieść foremkę na lodzie, aby szybciej stwardnieć agarozy, zapobiegając unoszeniu się tkanki.</li>
	<li>Usuń blok agarozy zawierający komory z formy za pomocą skalpela.</li>
	<li>Odwróć blok do góry nogami i wypełnij komory komorowe oraz szczelinę z tyłu bloku agarozy, która jest pozostawiona przez szpilkę linienia, 4% niskotopliwej agarozy za pomocą strzykawki z igłą 20 G.</li>
	<li>Przytnij blok agarozy skalpelem, aby uzyskać płaskie dno bloku i pionową pozycję wierzchołka serca.</li>
</ol>
5. Cięcie tkanki komorowej
<ol>
	<li>Przymocuj blok do uchwytu próbki mikrotomu za pomocą kropli kleju cyjanoakrylowego. Skieruj wierzchołek serca do góry.</li>
	<li>Umieść uchwyt na próbkę w wewnętrznej komorze na próbki mikrotomu, która jest wypełniona lodowatym tylodym bez Ca2+. Całkowicie przykryj blok agarozy roztworem Tyrode.</li>
	<li>Przygotuj plastry o krótkiej osi o grubości 150-400 μm, w zależności od dalszego zastosowania (dla nagrań ostrych elektrod 150-200 μm), utrzymuj częstotliwość drgań ostrza na poziomie 60-70 Hz i przesuwaj ostrze do przodu tak wolno, jak to możliwe.</li>
	<li>Za pomocą cienkiego pędzla ostrożnie usuń pozostałą agarozę z plastrów.</li>
	<li>Delikatnie przenieś plastry pipetą Pasteura do roztworu Tyrode'a z 0,9 mM Ca2+ napowietrzonego 100%O2 i przechowuj je przez co najmniej 30 minut na lodzie, aby odzyskać siły po procedurze krojenia.</li>
	<li>Następnie trzymaj plastry przez 30 minut w DMEM w temperaturze 37 °C, napowietrzone karbogenem, aby wypłukać BDM przed dalszym użyciem.</li>
</ol>
6. Przygotowanie zestawu elektrod Sharp
<ol>
	<li>W celu podgrzania włącz wszystkie urządzenia elektryczne na 30 minut przed rozpoczęciem nagrywania.</li>
	<li>Umieść 3 cm naczynie do hodowli komórkowych na płycie grzewczej umieszczonej na odwróconym mikroskopie.</li>
	<li>Umieść wykonaną na zamówienie elektrodę pierścieniową (<klasa silna = "xfig" > Rysunek 2) w naczyniu i podłącz przewody uziemiające przedwzmacniacza i elektrody stymulującej.</li>
	<li>Podłącz elastyczne rurki systemu perfuzyjnego do naczynia.</li>
	<li>Napełnij zbiornik systemu perfuzyjnego DMEM, napowietrzonym karbogenem.</li>
	<li>Włącz pompę perfuzyjną i ustaw szybkość perfuzji na 2-3 ml/min.</li>
	<li>Dostosuj temperaturę DMEM w naczyniu do 37 °C, regulując grzałkę przepływową i płytę grzewczą.</li>
</ol>
7. Nagrania potencjału działania
<ol>
	<li>Umieść plasterek komorowy w naczyniu wypełnionym DMEM.</li>
	<li>Sprawdź integralność strukturalną i żywotność (w oparciu o funkcję skurczową) tkanki za pomocą odwróconego mikroskopu.</li>
	<li>Napełnij szklaną elektrodę nagrywającą 3 M KCL.</li>
	<li>Napełnij elektrodę stymulacyjną DMEM.</li>
	<li>Umieść elektrodę rejestrującą i elektrodę stymulacyjną na uchwytach elektrod.</li>
	<li>Ostrożnie umieść elektrodę stymulającą na plastrze i włącz stymulator elektryczny. Zacznij od częstotliwości stymulacji 1-2 Hz.</li>
	<li>Przesunąć elektrodę rejestrującą z mikromanipulatorem nad zamierzoną pozycję nagrywania.</li>
	<li>Powoli opuść elektrodę rejestrującą, aż końcówka dotknie tkanki.</li>
	<li>Zastosuj krótki prostokątny impuls elektryczny przez elektrodę rejestrującą, aby przeniknąć przez błonę komórkową.</li>
	<li>Ostrożnie zmień położenie elektrody rejestrującej, aż zapewniony zostanie stabilny sygnał.</li>
	<li>Rozpocznij rejestrację potencjałów czynnościowych.</li>
</ol>

<ol><li>Yamamoto, C., McIlwain, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrical+activities+in+thin+sections+from+the+mammalian+brain+maintained+in+chemically-defined+media+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Electrical activities in thin sections from the mammalian brain maintained in chemically-defined media in vitro.</a> J Neurochem. 13, 1333-1343 (1966).</li>
<li>Colbert, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+cortical+brain+slices+for+electrophysiological+recording%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Preparation of cortical brain slices for electrophysiological recording.</a> Methods Mol Biol. 337, 117-125 (2006).</li>
<li>Ad Graaf, I., Groothuis, G. M., Olinga, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precision-cut+tissue+slices+as+a+tool+to+predict+metabolism+of+novel+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin+Drug+Metab+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Precision-cut tissue slices as a tool to predict metabolism of novel drugs.</a> Expert Opin Drug Metab Toxicol. 3, 879-898 (2007).</li>
<li>Kim, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiopulmonary+toxicity+of+peat+wildfire+particulate+matter+and+the+predictive+utility+of+precision+cut+lung+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Part+Fibre+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Cardiopulmonary toxicity of peat wildfire particulate matter and the predictive utility of precision cut lung slices.</a> Part Fibre Toxicol. 11, 29(2014).</li>
<li>Nembo, E. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+chronotropic+effects+of+Erythrina+senegalensis+DC+%28Fabaceae%29+aqueous+extract+on+mouse+heart+slice+and+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Ethnopharmacol%22%5BJournal%5D)">In vitro chronotropic effects of Erythrina senegalensis DC (Fabaceae) aqueous extract on mouse heart slice and pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> J Ethnopharmacol. 165, 163-172 (2015).</li>
<li>Wang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+tissue+slices%3A+preparation%2C+handling%2C+and+successful+optical+mapping%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Heart+Circ+Physiol%22%5BJournal%5D)">Cardiac tissue slices: preparation, handling, and successful optical mapping.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 308, H1112-H1125 (2015).</li>
<li>Bussek, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+slices+from+adult+mammalian+hearts+as+a+model+for+pharmacological+drug+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Physiol+Biochem%22%5BJournal%5D)">Tissue slices from adult mammalian hearts as a model for pharmacological drug testing.</a> Cell Physiol Biochem. 24, 527-536 (2009).</li>
<li>Burnashev, N. A., Edwards, F. A., Verkhratsky, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patch-clamp+recordings+on+rat+cardiac+muscle+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Arch%22%5BJournal%5D)">Patch-clamp recordings on rat cardiac muscle slices.</a> Pflugers Arch. 417, 123-125 (1990).</li>
<li>Pillekamp, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+and+characterization+of+a+mouse+embryonic+heart+slice+preparation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Physiol+Biochem%22%5BJournal%5D)">Establishment and characterization of a mouse embryonic heart slice preparation.</a> Cell Physiol Biochem. 16, 127-132 (2005).</li>
<li>Pillekamp, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neonatal+murine+heart+slices.+A+robust+model+to+study+ventricular+isometric+contractions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Physiol+Biochem%22%5BJournal%5D)">Neonatal murine heart slices. A robust model to study ventricular isometric contractions.</a> Cell Physiol Biochem. 20, 837-846 (2007).</li>
<li>Halbach, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ventricular+slices+of+adult+mouse+hearts--a+new+multicellular+in+vitro+model+for+electrophysiological+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Physiol+Biochem%22%5BJournal%5D)">Ventricular slices of adult mouse hearts--a new multicellular in vitro model for electrophysiological studies.</a> Cell Physiol Biochem. 18, 1-8 (2006).</li>
<li>Halbach, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophysiological+maturation+and+integration+of+murine+fetal+cardiomyocytes+after+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Electrophysiological maturation and integration of murine fetal cardiomyocytes after transplantation.</a> Circ. Res. 101, 484-492 (2007).</li>
<li>Halbach, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-course+of+the+electrophysiological+maturation+and+integration+of+transplanted+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Cell+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Time-course of the electrophysiological maturation and integration of transplanted cardiomyocytes.</a> J. Mol. Cell Cardiol. 53, 401-408 (2012).</li>
<li>Halbach, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+persistence+and+electrical+integration+of+transplanted+fetal+cardiomyocytes+from+different+developmental+stages%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Cell persistence and electrical integration of transplanted fetal cardiomyocytes from different developmental stages.</a> Int. J. Cardiol. 171, e122-e124 (2014).</li>
<li>Halbach, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophysiological+integration+and+action+potential+properties+of+transplanted+cardiomyocytes+derived+from+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc.+Res%22%5BJournal%5D)">Electrophysiological integration and action potential properties of transplanted cardiomyocytes derived from induced pluripotent stem cells.</a> Cardiovasc. Res. 100, 432-440 (2013).</li>
<li>Verrecchia, F., Herve, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversible+blockade+of+gap+junctional+communication+by+2%2C3-butanedione+monoxime+in+rat+cardiac+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Reversible blockade of gap junctional communication by 2,3-butanedione monoxime in rat cardiac myocytes.</a> Am J Physiol. 272, C875-C885 (1997).</li>
<li>Watanabe, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibitory+effect+of+2%2C3-butanedione+monoxime+%28BDM%29+on+Na%28%2B%29%2FCa%282%2B%29+exchange+current+in+guinea-pig+cardiac+ventricular+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Inhibitory effect of 2,3-butanedione monoxime (BDM) on Na(+)/Ca(2+) exchange current in guinea-pig cardiac ventricular myocytes.</a> Br J Pharmacol. 132, 1317-1325 (2001).</li>
<li>Fleischmann, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+subunit+composition+of+the+G+protein-activated+inward-rectifier+potassium+channel+during+cardiac+development%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Differential subunit composition of the G protein-activated inward-rectifier potassium channel during cardiac development.</a> J Clin Invest. 114, 994-1001 (2004).</li>
<li>Peinkofer, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+Early+Embryonic+to+Adult+Stage%3A+Comparative+Study+of+Action+Potentials+of+Native+and+Pluripotent+Stem+Cell-Derived+Cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">From Early Embryonic to Adult Stage: Comparative Study of Action Potentials of Native and Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes.</a> Stem Cells Dev. 25, 1397-1406 (2016).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do zadeklarowania.

Wycinki komorowe umożliwiają badania elektrofizjologiczne, farmakologiczne i mechaniczne z zachowaną strukturą tkanek podobną do in vivo i bezpośrednim dostępem technologii pomiarowej do wszystkich obszarów serca. Właściwości fizjologicznego potencjału czynnościowego wykazano w wycinkach embrionalnych, noworodkowych i dorosłych 9,10,11. Żywotność plastrów, z wyjątkiem warstw powierzchniowych bezpośrednio uszkodzonych w ...

Cienkie plasterki tkanki były często używane w naukach podstawowych, odkąd Yamamot i Mcllwain wykazali w 1966 roku, że aktywność elektryczna wycinków mózgu jest utrzymywana in vitro1. Od tego czasu przeprowadzono badania elektrofizjologiczne i farmakologiczne na wycinkach mózgu 2, wątroby 3, płuc 4 i tkanki mięśnia sercowego 5,6,7. Pierwsze nagrania patch-clamp w warstwach komorowych z noworodków szczurzych serc zostały opisane w 1990 roku 8, ale technika ta na jakiś czas popadła w zapomnienie. Ponad dekadę później nasza grupa opracowała nową metodę przygotowania mysich embrionów 9, noworodków 10 i dorosłych 11 plastrów serca. Te żywotne wycinki tkanek mogą być wykorzystywane do ostrych eksperymentów (dorosłe plastry można hodować przez kilka godzin) lub krótkoterminowych eksperymentów hodowlanych (plastry embrionalne i noworodkowe można hodować przez kilka dni). Warstwy wykazują in vivo cechy elektrofizjologiczne podobne do cech i jednorodny rozrzut wzbudzenia, oceniany za pomocą potencjału czynnościowego elektrody ostrej i zapisów matrycy mikroelektrod 11. Ze względu na swoją "dwuwymiarową" morfologię umożliwiają bezpośredni dostęp elektrod rejestrujących do wszystkich obszarów komory, co czyni je interesującym narzędziem do badań elektrofizjologicznych i stwarza nowe możliwości eksperymentalne w porównaniu z całym sercem perfundowanym metodą Langendorffa. Odpowiedź lekowa wycinków na blokery kanałów jonowych, takie jak werapamil (bloker kanału Ca2+ typu L), lidokaina (bloker kanału Na+), 4-aminopirydyna (nieselektywny bloker kanału K + zależny od napięcia) i linopirydyna (bloker kanału K + KCNQ) 9,11 odpowiadały znanemu wpływowi na zdysocjowane kardiomiocyty. Pomiary siły izometrycznej wykazały dodatnią zależność częstotliwości siły i silnie sugerowały nienaruszoną funkcję kurczliwości 10. Wyniki te wykazały, że mysie plastry komorowe nadają się jako model tkankowy in vitro do badań fizjologicznych i farmakologicznych. Co więcej, komorowe wycinki serc biorców w połączeniu z ostrymi zapisami elektrod okazały się bardzo pomocnym narzędziem do scharakteryzowania integracji elektrycznej i mechanicznej, a także dojrzewania przeszczepionego płodu xref"12,13,14 i kardiomiocytów pochodzących z komórek macierzystych 15.
Podsumowując, wycinki komorowe są cennym i dobrze ugruntowanym modelem tkanki wielokomórkowej i powinny być uważane za komplementarne do zdysocjowanych kardiomiocytów i serc perfundowanych Langendorffem w badaniach sercowo-naczyniowych, z główną zaletą dostarczania struktury tkankowej podobnej do in vivo (w przeciwieństwie do komórek zdysocjowanych), jak również bezpośredniego dostępu do technologii pomiarowych, takich jak zapisy z ostrymi elektrodami, do wszystkich obszarów serca (w przeciwieństwie do całego serca przygotowania).

<table><tbody><tr><td>Leica VT 1000s</td><td>Leica Microsystems, Wetzlar, Niemcy</td><td></td><td>Mikrotom z wibrującym ostrzem.</td></tr><tr><td>Ostrza ze stali nierdzewnej</td><td>Campden Instruments, Loughborough, Anglia</td><td>7550-1-SS</td><td></td></tr><tr><td>Pipety Pasteura</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louise, USA</td><td>Z627992</td><td></td></tr><tr><td>Drobna szczotka, np. rozmiar 6 (4/32")</td><td>VWR, International, Radnor, USA</td><td>149-2125</td><td></td></tr><tr><td>Stół przygotowawczy</td><td></td><td></td><td>własnej produkcji</td></tr><tr><td>Wylinka do osadzania komór w agaroza</td><td></td><td></td><td>własnej roboty</td></tr><tr><td>1 ml strzykawka</td><td>Becton, Dickinson; Franklin Lakes, Stany Zjednoczone</td><td>300013</td><td></td></tr><tr><td>Igły 27 G x 3/4''</td><td>Braun, Melsungen, Niemcy</td><td>4657705</td><td></td></tr><tr><td>Igły 20 G 11/2''</td><td>4657519</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Małe nożyczki</td><td>WPI, Sarasota, USA</td><td>Pęseta 501263</td><td></td></tr><tr><td>#5, końcówka 0,1 x 0,06 mm</td><td>WPI, Sarasota, USA</td><td>500342</td><td></td></tr><tr><td>Tlen gazowy (klasa medyczna O2)</td><td>Linde, Monachium, Niemcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gaz karbogeniczny (95 % O2, 5 % CO2)</td><td>Linde, Monachium, Niemcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louise, USA</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louise, Stany</td><td>Zjednoczone 746436</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louise, Stany</td><td>Zjednoczone 746495</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louise, Stany Zjednoczone</td><td>NIST200B</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louise, USA</td><td>51558</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louise, USA</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>D(+)-Glukoza</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louise, USA</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louise, Stany Zjednoczone</td><td>M7506</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louise, Stany Zjednoczone</td><td>S8045</td><td></td></tr><tr><td>Klej cyjanoakrylowy</td><td>Henkel, D&uuml; sseldorf, Niemcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Niskotopliwa agaroza</td><td>Roth, Karlsruhe, Niemcy</td><td>6351.2</td><td></td></tr><tr><td>Heparyno-sod-25000 I.E./5 ml</td><td>Ratiopharm, Ulm, Niemcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), o wysokiej zawartości glukozy, GlutaMAX</td><td>ThermoScientific, Waltham, USA</td><td>10566016</td><td></td></tr><tr><td>SEC-10LX Wzmacniacz</td><td>npi electronic GmbH, Tamm, Niemcy</td><td>SEC-10LX</td><td></td></tr><tr><td>EPC 9</td><td>HEKA Elektronik GmbH, Lambrecht, Niemcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zeiss Axiovert 200</td><td>Zeiss, Oberkochen, Niemcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikromanipulator o małym powiększeniu</td><td>Narashige, Tokio, Japonia</td><td>Nm-3</td><td></td></tr><tr><td>Trójosiowy mikromanipulator o dużym powiększeniu</td><td>Narashige, Tokio, Japonia</td><td>MHW-3</td><td></td></tr><tr><td>Pompa</td> <td>perfuzyjna perystaltycznaMulti Channel Systems, Reutlingen, Niemcy</td><td>PPS2</td><td></td></tr><tr><td>2-kanałowy regulator temperatury</td><td>Multi Channel Systems, Reutlingen, Niemcy</td><td>TCO02</td><td></td></tr><tr><td>Kwadratowy stymulator impulsów</td><td>Natus Europe GmbH, Planegg, Niemcy</td><td>Trawa SD9</td><td></td></tr><tr><td>Kapilary szklane</td><td>WPI, Sarasota, USA</td><td>1B150F-1</td><td></td></tr></tbody></table>

mysie plastry serca o krótkiej osi do badań elektrofizjologicznych

Murine Short Axis Ventricular Heart Slices for Electrophysiological Studies

Mysie kardiomiocyty były szeroko wykorzystywane do badań in vitro fizjologii serca i nowych strategii terapeutycznych. Jednak wielokomórkowe preparaty zdysocjowanych kardiomiocytów nie są reprezentatywne dla złożonej struktury in vivo kardiomiocytów, niemiocytów i macierzy zewnątrzkomórkowej, która wpływa zarówno na właściwości mechaniczne, jak i elektrofizjologiczne serca. W tym miejscu opisujemy technikę przygotowania żywotnych wycinków komorowych serc dorosłych myszy o zachowanej strukturze tkankowej podobnej do in vivo i wykazujemy ich przydatność do zapisów elektrofizjologicznych. Po wycięciu serca komory są oddzielane od przedsionków, perfundowane roztworem wolnym od Ca2+ zawierającym monoksym 2,3-butanodionu i zatopione w 4% niskotopliwym bloku agarozowym. Blok umieszcza się na mikrotomie z wibrującym ostrzem, a plastry tkanki o grubości 150-400 μm przygotowuje się, utrzymując częstotliwość drgań ostrza na poziomie 60-70 Hz i przesuwając ostrze do przodu tak wolno, jak to możliwe. Grubość plastrów zależy od dalszej aplikacji. Plastry są przechowywane w lodowatym roztworze Tyrode'a z 0,9 mM Ca2+ i monoksymem 2,3-butanodionu (BDM) przez 30 minut. Następnie plastry przenosi się do DMEM o temperaturze 37 °C na 30 minut w celu wypłukania BDM. Plastry mogą być używane do badań elektrofizjologicznych z ostrymi elektrodami lub układami mikroelektrod, do pomiarów siły w celu analizy funkcji skurczu lub do zbadania interakcji przeszczepionych kardiomiocytów pochodzących z komórek macierzystych a tkanką gospodarza. W celu uzyskania ostrych zapisów elektrodowych plaster umieszcza się w 3-centymetrowym naczyniu do hodowli komórkowej na płycie grzewczej odwróconego mikroskopu. Wycinek jest stymulowany elektrodą jednobiegunową, a wewnątrzkomórkowe potencjały czynnościowe kardiomiocytów w obrębie wycinka są rejestrowane za pomocą ostrej elektrody szklanej.

Zawał mięśnia sercowego prowadzi do niemal nieodwracalnej utraty kardiomiocytów. Terapia zastępcza komórek z wykorzystaniem kardiomiocytów pochodzących z komórek macierzystych w celu egzogennej regeneracji serca jest obiecującym podejściem terapeutycznym. Integracja elektryczna i dojrzewanie przeszczepionych komórek są kluczowe dla bezpieczeństwa i skuteczności terapii zastępczej komórek.
Aby ocenić integrację i dojrzewanie, prz...

Tutaj opisujemy przygotowanie żywotnych wycinków komorowych od dorosłych myszy i ich wykorzystanie do rejestracji potencjału czynnościowego elektrod ostrych. Te wielokomórkowe preparaty zapewniają zachowaną in vivo strukturę tkankową, co czyni je cennym modelem do badań elektrofizjologicznych i farmakologicznych in vitro.

Mysie plastry serca o krótkiej osi do badań elektrofizjologicznych

Murine cardiomyocytes have been extensively used for in vitro studies of cardiac physiology and new therapeutic strategies. However, multicellular ...

Ogólnym celem tej techniki jest uzyskanie żywotnych plastrów komór serca, które nadają się do rejestracji elektrofizjologicznych. Metoda ta może pomóc w uzyskaniu odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu elektrofizjologii serca na poziomie tkankowym, takie jak kwestie integracji elektrycznej przeszczepionych kardiomiocytów czy działanie leków kardioaktywnych. Główną zaletą tej techniki jest to, że żywotne plastry tkanki komorowej mają zachowaną strukturę tkankową zbliżoną do warunków in vivo, co umożliwia bezpośrednie pomiary we wszystkich obszarach serca.Choć metoda ta pozwala na uzyskanie wglądu w elektrofizjologię serca myszy, można ją zastosować również u innych zwierząt, takich jak króliki lub świnki morskie. Aby rozpocząć tę procedurę, należy najpierw przetrzeć skórę zwierzęcia 70%ethanol. Po otwarciu klatki piersiowej należy ostrożnie rozciąć osierdzie serca, używając małych nożyczek i pęsety.Wprowadź kaniulę do lewej komory i przeprowadź perfuzję serca in situ lodowatym roztworem Tyrode’a bez wapnia, aż do usunięcia pozostałej krwi. Następnie ostrożnie wyciśnij serce i przenieś je do lodowatego roztworu Tyrode’a bez wapnia. Oddziel przedsionki od komór za pomocą skalpela lub nożyczek.Następnie należy umieścić komory w formie agarozowej tak, aby wierzchołek był skierowany ku górze. Następnie należy umieścić szpilkę w środku formy, w jamie lewej komory. Napełnić formę 4% agarozą niskotopliwą o temperaturze 37 stopni Celsjusza, aż serce zostanie całkowicie przykryte.Następnie umieść formę na lodzie, aby przyspieszyć twardnienie agarozy i zapobiec wypłynięciu tkanki. Po jednej minucie wyjmij z formy skalpelem blok agarozy zawierający komory mózgu. Następnie odwróć blok do góry dnem i za pomocą strzykawki wypełnij komory oraz szczelinę na tylnej stronie bloku agarozy 4% agarozą niskotopliwą.Następnie przytnąć blok agarowy skalpelem, aby uzyskać płaską podstawę i ustawić wierzchołek serca w pozycji pionowej. W tej procedurze przymocować blok do uchwytu na preparat mikrotomu za pomocą kropli kleju cyjanoakrylowego, tak aby wierzchołek serca był skierowany do góry. Następnie umieścić uchwyt na preparat w wewnętrznej komorze mikrotomu wypełnionej lodowatym roztworem Tyrode'a bez wapnia.Należy upewnić się, że blok agarozy jest całkowicie zakryty roztworem Tyrodea. Przygotować skrawki o grubości od 150 do 400 µm, w zależności od dalszego zastosowania. Częstotliwość drgań ostrza należy utrzymać na poziomie 60 do 70 Hz, przesuwając ostrze do przodu tak powoli, jak to możliwe.Następnie za pomocą cienkiego pędzla ostrożnie usuń pozostały agaroz z plastrów. Potem delikatnie przenieś plastry pipetą Pasteura do roztworu Tyrode’a z 0.9 mM wapnia, napowietrzonego 100% tlenem. Przechowuj je przez co najmniej 30 minut w lodzie, aby regenerowały się po procedurze krojenia.Umieszczenie plastrów na siatce pomaga utrzymać ich płaskość. Następnie, używając papieru filtracyjnego i drugiej siatki, przenieś plastry do pożywki DMEM w temperaturze 37 °C, napowietrzonej karbogenem, aby wypłukać BDM przed dalszym użyciem. W celu wstępnego podgrzania włącz wszystkie urządzenia elektryczne na 30 minut przed rozpoczęciem pomiarów.Umieść trzycentymetrową szalkę do hodowli komórkową z płytą grzewczą na mikroskopie odwróconym. Następnie umieść w szalce wykonowaną na zamówienie elektrodę pierścieniową i podłącz przewody uziemiające przedwzmacniacza oraz elektrody stymulującej. Po tym połączenie elastyczne rurki systemu perfuzyjnego z szalką.Napełnij zbiornik systemu perfuzyjnego medium DMEM i napowietrz go karbogenem. Następnie włącz pompę perfuzyjną i ustaw szybkość perfuzji na 2-3 ml/min. Dostosuj temperaturę DMEM w szalce do 37 °C, regulując grzałkę przepływową oraz płytę grzewczą.Teraz należy umieścić przekrój komory w naczyniu wypełnionym DMEM. Za pomocą mikroskopu odwróconego należy sprawdzić integralność strukturalną i żywotność tkanki. Następnie należy napełnić szklaną elektrodę rejestrującą trzymolowym chlorkiem potasu, a elektrodę stymulującą DMEM.Następnie należy umieścić elektrodę rejestrującą oraz elektrodę stymulującą w uchwytach elektrod. Po tym czasie należy ostrożnie położyć elektrodę stymulującą na skrawku. Włączyć stymulator elektryczny i rozpocząć od częstotliwości stymulacji od jednego do dwóch Hertz.Następnie, za pomocą mikromanipulatora przemieść elektrodę rejestrującą do zamierzonej pozycji pomiarowej. Powoli opuszczaj elektrodę rejestrującą, aż jej końcówka dotknie tkanki. Gdy rejestracja wykaże kontakt, przyłóż przez elektrodę rejestrującą krótki prostokątny impuls elektryczny, aby przebić błonę komórkową.Następnie ostrożnie zmień położenie elektrody rejestrującej, aż do uzyskania stabilnego sygnału. Po tym etapie rozpocznij rejestrację potencjałów czynnościowych. Aby ocenić integrację i dojrzewanie, kardiomiocyty pochodzące z iPSCM wykazujące ekspresję eGFP zostały przeszczepione do zdrowych serc dorosłych myszy.Przedstawiony tutaj jest przekrój komory serca zawierający przeszczepione iPSCM, który został punktowo stymulowany za pomocą elektrody jedbiegunowej umieszczonej w tkance gospodarza. Potencjały czynnościowe wewnątrzkomórkowe rejestrowano za pomocą ostrych szklanych mikroelektrod wypełnionych trzymolowym chlorkiem potasu w eGFP-dodatnich przeszczepionych iPSCM oraz w sąsiedniej tkance gospodarza w obrębie przekrojów. Poniżej znajdują się zapisy potencjałów czynnościowych w zdrowej tkance gospodarza oraz w przeszczepionych iPSCM.Przekrój był stymulowany ogniskowo za pomocą elektrody stymulującej umieszczonej w tkance gospodarza, z częstotliwością około 2 Hz i 5 Hz. Po opanowaniu tej techniki procedura ta może zostać wykonana w ciągu jednej do dwóch godzin, pod warunkiem jej prawidłowego przeprowadzenia. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby zachować jak najmniejszą prędkość posuwu noża mikrotomu.Po wykonaniu tej procedury można zastosować inne metody, takie jak pomiary wstępne, w celu udzielenia odpowiedzi na dodatkowe pytania. Po opracowaniu technika ta otworzyła badaczom w dziedzinie terapii komórkowej drogę do analizy integracji elektrycznej oraz dojrzewania przeszczepionych kardiomiocytów w sercach biorców. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś mieć dobrą wiedzę na temat przygotowania żywych skrawków krótkiej osi komory z wykorzystaniem mikrotomu z wibrującym ostrzem.Przekroje te są szczególnie odpowiednie do rejestracji elektrofizjologicznych przy użyciu szklanych mikroelektrod.

murine-short-axis-ventricular-heart-slices-for-electrophysiological

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Wysokoczęstotliwościowe ultradźwięki Dopplera to nowatorska technologia służąca do oceny regionalnej funkcji mięśnia sercowego. Niniejsza praca przedstawia pierwsze dowody wykazujące przydatność tej wszechstronnej platformy obrazowania do wielokrotnego pomiaru odkształcenia mięśnia sercowego, dp/dt oraz niedomykalności zastawki mitralnej w modelu niedokrwienia i reperfuzji (IR) serca mysiego.

Wysokoczęstotliwościowa echokardiografia o wysokiej rozdzielczości: pierwsze dowody na nieinwazyjny, powtarzalny pomiar odkształcenia mięśnia sercowego, kurczliwości i niedomykalności zastawki mitralnej w modelu niedokrwienia i reperfuzji serca myszy

Uraz chirurgiczny wywołuje odpowiedź zapalną. Wiadomo, że cytokiny i ligandy endogenne modulują wielkość zawału mięśnia sercowego po niedokrwieniu i reperfuzji. Przedstawiamy zmodyfikowany model niedokrwienia i reperfuzji u myszy z zamkniętą klatką piersiową, wykorzystujący obciążniki wiszące w celu zminimalizowania efektów torakotomii.

Mysi model zamkniętoklatkowy niedokrwienia i reperfuzji mięśnia sercowego

Ten film demonstruje procedurę opartą na wibratomie do generowania żywotnych, ultracienkich odcinków serca świni. Przygotowane wycinki tkanek mogą być hodowane i wykorzystywane jako systemy modelowe do badań farmakologicznych.

Wytwarzanie plastrów komór świń: technika oparta na wibratomie do przygotowywania ultracienkich plastrów tkanki serca świni

Pokazujemy, jak przygotować ukośne wycinki rdzenia kręgowego u młodych myszy. Preparat ten pozwala na stymulację korzeni brzusznych.

Przygotowanie skośnych wycinków rdzenia kręgowego do stymulacji korzeni brzusznych

Opracowaliśmy poziome przygotowanie siatkówki dorosłego ssaka z płaszczyzną przekroju równoległą do powierzchni siatkówki. Pola dendrytyczne neuronów siatkówki o orientacji niepromieniowej nie zostały obcięte, co pozwoliło na badanie przetwarzania sygnału za pomocą patch-clamp i technik obrazowania.

Przygotowanie poziomych wycinków siatkówki dorosłej myszy do badań elektrofizjologicznych

Ten protokół opisuje procedurę cięcia i hodowli ludzkich wycinków serca do przedklinicznych testów leków oraz szczegółowo opisuje użycie mapowania optycznego do jednoczesnego rejestrowania napięcia transbłonowego i wewnątrzkomórkowych sygnałów wapnia z tych wycinków.

Przedkliniczna ocena elektrofizjologii serca za pomocą optycznego mapowania dwunapięciowego i wapniowego ludzkich organotypowych wycinków serca

Ten protokół opisuje, jak kroić i hodować tkankę serca w warunkach fizjologicznych przez 6 dni. Ten system hodowli może być wykorzystany jako platforma do testowania skuteczności nowatorskich metod leczenia niewydolności serca, a także jako wiarygodne testowanie ostrej kardiotoksyczności w modelu 3D serca.

Krojenie i hodowla serc wieprzowych w warunkach fizjologicznych

Prezentowany jest protokół izolacji ludzkich i zwierzęcych kardiomiocytów komorowych z wyciętych wibratomem plastrów mięśnia sercowego. Wysoką wydajność komórek tolerujących wapń (do 200 komórek/mg) można uzyskać z niewielkich ilości tkanek (&lt;50 mg). Protokół ma zastosowanie do mięśnia sercowego narażonego na zimne niedokrwienie przez okres do 36 godzin.

Izolacja ludzkich kardiomiocytów komorowych z plastrów mięśnia sercowego wycinanych wibratomem

Modele mysie pozwalają badać kluczowe mechanizmy arytmogenezy. W tym celu niezbędne są wysokiej jakości kardiomiocyty do wykonywania pomiarów typu patch-clamp. W tym miejscu opisano metodę izolacji mysich miocytów przedsionków i komór za pomocą wstecznej perfuzji Langendorffa opartej na enzymach, która umożliwia jednoczesne pomiary stanów przejściowych wapnia i prądu wapniowego typu L.

Izolacja wysokiej jakości mysich miocytów przedsionkowych i komorowych do jednoczesnych pomiarów stanów nieustalonych Ca2+ i prądu wapniowego typu L

Ze względu na skomplikowaną anatomię, konsekwentnie powtarzalny protokół sekcji i pobierania próbek sercowych może być trudny do wdrożenia. W niniejszym manuskrypcji przedstawiono kluczowe elementy niektórych standardowych protokołów rozwarstwiania serca, podkreślając zarówno ogólne podejścia do badania, jak i miejsca pobierania próbek powszechnie stosowane w badaniu histopatologicznym.

Techniki preparacji i histologiczne pobieranie próbek serca w dużych modelach zwierzęcych pod kątem chorób sercowo-naczyniowych

Przedstawiamy protokół do hodowli ex vivo ludzkiej tkanki mięśnia sercowego komorowego. Pozwala na szczegółową analizę siły skurczu i kinetyki, a także zastosowanie obciążenia wstępnego i następczego w celu dokładniejszego naśladowania środowiska fizjologicznego in vivo.

Przygotowanie ludzkiej tkanki mięśnia sercowego do długotrwałej hodowli

Poznaj metodę przygotowania żywych płatów komorowych myszy do badań elektrofizjologicznych. Technika umożliwia rejestrację potencjałów czynnościowych i badanie integracji komórek sercowych.

Mysie plastry serca o krótkiej osi do badań elektrofizjologicznych

Przeglądaj więcej filmów