Name: Model odwróconego serca do zbierania śródmiąższowego przesięku z izolowanego serca szczura (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 59 s
Description: Poznaj metodę zbierania śródmiąższowego przesięku z izolowanego serca szczura przy użyciu odwróconego modelu Langendorffa. Technika ta umożliwia badanie sygnalizacji parakrynnej i dynamiki płynu międzykomórkowego w fizjologii serca.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie zostało sfinansowane przez NSFC 81570244, FoKo 23/2013 i SFB 1116/B01 oraz przez Instytut Badań Sercowo-Naczyniowych w Düsseldorfie (CARID).

Wszystkie eksperymenty zostały zatwierdzone przez lokalną agencję regulacyjną (LANUV z Nadrenii Północnej-Westfalii, Niemcy) i zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi dotyczącymi stosowania na zwierzętach. Zwierzęta były karmione standardową dietą karmową i otrzymywały wodę z kranu ad libitum. Cały sprzęt i substancje chemiczne niezbędne na każdym etapie eksperymentu są dostępne w Tabeli Materiałów.
1. Przygotowanie lateksowej czapki i balonu dokomorowego
<ol>
	<li>Wykonaj aluminiową formę za pomocą frezarki, która pasuje do średniej wielkości serca szczura (masa ciała 300-350 g). Wypoleruj formę bardzo drobnym (10/0) papierem ściernym. 
	UWAGA: Szczegółowe metryki formy są pokazane w Rysunek 1A.</li>
	<li>Przymocuj pionowo szyjkę aluminiowej formy do frezarki, aby przygotować nasadkę lateksową. 
	UWAGA: Frezarka powoduje powolne obracanie się formy. Alternatywnie można zastosować silnik elektryczny.</li>
	<li>Wlej 20 ml płynnego lateksu (zakupionego w handlu, patrz Tabela materiałów) do szklanej zlewki o pojemności 50 ml.</li>
	<li>Opuść formę, aż cały korpus formy zostanie zanurzony w roztworze lateksu.</li>
	<li>Powoli podnoś formę (5 cm/min) podczas obracania.</li>
	<li>Obracaj formę przez dodatkowe 15 minut, aż lateks na powierzchni formy zestali się.</li>
	<li>Dodaj około 1 g talku na powierzchnię formy (już pokrytą cienką folią lateksową), aby zapobiec uszkodzeniom podczas odłączania.</li>
	<li>Delikatnie oderwij palcami już wysuszoną lateksową nasadkę od powierzchni formy; lateksowa nasadka jest teraz gotowa do użycia (<silna klasa="xfig">Rysunek 1B).</li>
	<li>Podłącz wylot nasadki lateksowej do 15-centymetrowej rurki silikonowej (ID = 0,2 mm), używanej później do zbierania CT.</li>
	<li>Napełnij komorowy balon lateksowy wodą i mocno przymocuj go do metalowej kaniuli w kształcie litery L połączonej ze strzykawką wypełnioną wodą o pojemności 1 ml (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1C). 
	UWAGA: Zostanie to wykorzystane do zapewnienia pionowego ułożenia serca (patrz poniżej).</li>
	<li>Upewnij się, że balon jest szczelny, wykonując kilka testów opróżniania/pompowania za pomocą dołączonej strzykawki o pojemności 1 ml.</li>
	<li>Podłącz kaniulę, za pomocą trójdrożnego ogranicznika, do przetwornika ciśnienia, aby w przyszłości zmierzyć ciśnienie wytworzone w dokomorowej (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1C).</li>
</ol>
2. Przygotowanie buforu Krebsa-Henseleita (KHB) i systemu perfuzji Langendorffa
<ol>
	<li>Skonfiguruj system perfuzyjny Langendorffa w trybie stałego przepływu (napędzanego przez pompę rolkową) lub stałego ciśnienia (generowanego przez ciśnienie statyczne w szklanej kolumnie). 
	UWAGA: Szczegóły dotyczące preparatu serca Langendorffa zostały opisane wcześniej12.</li>
	<li>Przygotować 2 l zmodyfikowanego KHB (w mM: 116,02 NaCl, 4,63 KCl, 1,10 MgSO,4·7H2O, 1,21K2HPO4, 2,52 CaCl2·2H2O, 24,88 NaHCO3, 8,30 D-glukozy i 2,0 pirogronianu sodu).
	<ol>
		<li>Zważyć wszystkie substancje chemiczne z wyjątkiem CaCl2 i rozpuścić je w 1,8 l podwójnie destylowanej wody w kolbie o pojemności 2 l.</li>
		<li>Pęcherzykować podłoże karbogenem (95% O2/5% CO2) przez co najmniej 5 minut w celu zrównoważenia (pH: 7.4) przy mieszaniu magnetycznym.</li>
		<li>Dodać 0,74 g CaCl 2,2H2O i zwiększyćcałkowitą objętość do 2 l wodą podwójnie destylowaną.</li>
		<li>Kontynuuj mieszanie i bulgotanie pożywki z karbogenem przez dodatkowe 5 minut.</li>
		<li>Przefiltruj KHB przez filtr 0,2 μm, aby wyeliminować małe cząsteczki, które mogą utrudniać mikrokrążenie serca.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie systemu perfuzyjnego Langendorffa.
	<ol>
		<li>Umieścić przefiltrowany KHB we wstępnie podgrzanej łaźni wodnej (38 °C); nadal bulgotać karbogenem, aby wytworzyć ciśnienie 100 cmH2O wewnątrz zbiornika KHB.</li>
		<li>Podłączyć zbiornik do szklanej kolumny, aby ustalić ciśnienie hydrostatyczne 100 cmH2O dla perfuzji Langendorffa z KHB; kontynuować bulgotanie KHB wewnątrz kolumny za pomocą karbogenu.</li>
		<li>Dostosuj temperaturę systemu grzewczego tak, aby temperatura na wylocie kaniuli aortalnej wynosiła 37 °C.</li>
		<li>Upewnij się, że system przewodów jest wolny od pęcherzyków powietrza.</li>
		<li>Natleniaj KHB karbogenem przez dodatkowe 5 minut, aż PO2 w KHB osiągnie 500-600 mmHg (mierzone przez analizator gazometrii krwi).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ustaw system perfuzyjny tak, aby działał przy stałym ciśnieniu 100 cmH2O lub przy stałym przepływie około 10-20 ml/min za pomocą ręcznego przełączania. Alternatywnie użyj wymiennego sterownika pompy CPK, aby natychmiast przełączyć się w tryb perfuzji.</li>
</ol>
3. Izolacja i kaniulacja serca
UWAGA: Samce szczurów rasy Wistar o masie ciała 300-350 g zostały użyte tak, aby rozmiary serc odpowiadały prefabrykowanej lateksowej czapce. Szczury przeszły podwiązanie lewej tętnicy zstępującej (LAD) przez 50 minut, a następnie reperfuzję lub były operowane pozorowano. Szczegóły dotyczące metodologii indukcji zawału mięśnia sercowego (MI) zostały podane w innym miejscu13. Eksperymenty z odwróconym sercem u zwierząt z zawałem przeprowadzono 5 dni po operacji.
<ol>
	<li>Znieczulenie szczurów za pomocą parownika izofluranu (2% V/V) podłączonego do komory przetrzymywania zwierząt (20 l).</li>
	<li>Przenieś szczury na stół operacyjny (bez kontrolowanej temperatury) po osiągnięciu głębokiego znieczulenia.</li>
	<li>Podnieś skórę i mięśnie tuż pod mostkiem za pomocą kleszczy i przetnij dolny brzeg żeber ciężkimi nożyczkami.</li>
	<li>Za pomocą cienkich nożyczek wykonaj małe nacięcie w przeponie, na brzegu żebra. Przetnij żebra doogonowo, aby utworzyć klapę całej brzusznej ściany klatki piersiowej.</li>
	<li>Delikatnie chwyć serce kciukiem oraz palcem wskazującym i środkowym i powoli unieś je do góry, aby naczynia sercowe uległy lekkiemu rozciągnięciu.</li>
	<li>Wytnij serce, aż aorta zostanie całkowicie odsłonięta.</li>
	<li>Umieścić serce w zlewce o pojemności 100 ml zawierającej 50 ml lodowatego KHB (4 °C) i przenieść je do aparatu perfuzyjnego.</li>
	<li>Natychmiast zamontuj serce przez aortę na kapiącej kaniuli i mocno zaciśnij je szwem (4-0). Unikaj przedostawania się pęcherzyków powietrza do serca.</li>
	<li>Stosować stałe ciśnienie perfuzji (100 cmH2O). Alternatywnie można zastosować pełne natężenie przepływu (zaczynając od 20 ml/min). 
	Uwaga: Czas od otwarcia klatki piersiowej do podłączenia serca do kaniuli perfuzyjnej powinien zająć około 3 minut w rękach doświadczonego operatora.</li>
</ol>
4. Model odwróconego serca
<ol>
	<li>Delikatnie obracaj kaniulę aortalną, aż tylna ściana serca znajdzie się w widoku en face.</li>
	<li>Usuń tkankę łączną nożyczkami, aby odsłonić otwór lewego przedsionka, przygotowując go do kaniulacji śródkomorowej.</li>
	<li>Wprowadzić opróżniony balon lateksowy przymocowany do sztywnego cewnika przez lewy przedsionek do lewej komory.</li>
	<li>Napompuj balon, aż wypełni całą jamę komorową (objętość do napompowania jest wstępnie zaznaczona na strzykawce).</li>
	<li>Odwróć serce, aż znajdzie się do góry nogami, podtrzymując je cewnikiem balonowym dokomorowym.</li>
	<li>Jak pokazano w Rysunek 1C, mechanicznie ustabilizuj odwrócone serce w pozycji pionowej za pomocą balonu dokomorowego ze sztywnym metalowym cewnikiem.</li>
	<li>Dostosuj pozycję serca, aby uniknąć nadmiernego skręcenia korzenia aorty.</li>
	<li>Dostosuj ciśnienie rozkurczowe do 3-5 mmHg (mierzone przez balon wewnątrzkomorowy; patrz <silna klasa="xfig">Rysunek 1C).</li>
	<li>Obserwuj powierzchnię nasierdzia serca i upewnij się, że tworzą się małe kropelki.</li>
	<li>Umieść lateksową nasadkę na powierzchni serca, delikatnie dociskając ją palcami, aby pokryła całe serce.</li>
	<li>Upewnij się, że lateksowa nasadka zakrywa większość powierzchni komory.</li>
	<li>Usuń pęcherzyki powietrza, jeśli występują, z wnętrza nasadki i rurki, delikatnie zasysając strzykawką o pojemności 1 ml.</li>
	<li>Wyreguluj dystalny otwór rurki przepuszczającej tomografię komputerową na 10 cm poniżej poziomego poziomu serca. 
	UWAGA: Ta procedura zapewnia lekkie zasysanie przez ujemne ciśnienie hydrostatyczne.</li>
	<li>Zbierz krople CT w probówce o pojemności 1,5 ml umieszczonej w lodzie zmieszanym 1:1 z NaCl. Zbierz około 0,15-1,5 ml CT. 
	UWAGA: Mieszanina lodu i NaCl stabilizuje temperaturę w probówce zbiorczej poniżej zera (około -4 °C). 
	UWAGA: Czas pobierania próbek zależy od celu eksperymentu. Natężenie przepływu w tomografii komputerowej wynosi około 27 ± 20 μl/min u zwierząt operowanych pozorowo (n = 3) i 100 ± 47 μl/min u zwierząt podwiązanych wieńcowo (n = 11).</li>
	<li>Zważ i zamroź próbki CT w ciekłym azocie i przechowuj je w temperaturze -80 °C do późniejszych pomiarów.</li>
</ol>
5. Analiza CT
<ol>
	<li>Do analizy metabolitów należy używać płynu CT, w zależności od zagadnienia naukowego. 
	UWAGA: Dane pokazane w Rysunek 2 i <silna klasa="xfig">Rysunek 3 zostały zebrane z perfuzji o stałym ciśnieniu (100 cmH2O), a około 0,15-1,5 ml płynu CT pobrano w ciągu 10 minut. Ten czas i objętość były wystarczające do przeprowadzenia proteomiki (minimum: 50 μL; <silna klasa="xfig">Rysunek 2)14 i HPLC (minimum: 20 μL; <silna klasa="xfig">Rysunek 3)15 analiza różnych puryn.</li>
</ol>

<ol><li>Henkel, D. M., Redfield, M. M., Weston, S. A., Gerber, Y., Roger, V. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Death+in+heart+failure%3A+a+community+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Heart+Fail%22%5BJournal%5D)">Death in heart failure: a community perspective.</a> Circ Heart Fail. 1 (2), 91-97 (2008).</li>
<li>Limana, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myocardial+infarction+induces+embryonic+reprogramming+of+epicardial+c-kit%28%2B%29+cells%3A+role+of+the+pericardial+fluid%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Cell+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Myocardial infarction induces embryonic reprogramming of epicardial c-kit(+) cells: role of the pericardial fluid.</a> J Mol Cell Cardiol. 48 (4), 609-618 (2010).</li>
<li>Brunner, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+tissue+endothelin-1+levels+under+basal%2C+stimulated%2C+and+ischemic+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cardiovasc+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Cardiac tissue endothelin-1 levels under basal, stimulated, and ischemic conditions.</a> J Cardiovasc Pharmacol. 26, Suppl 3. S44-S46 (1995).</li>
<li>de Lannoy, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Renin-angiotensin+system+components+in+the+interstitial+fluid+of+the+isolated+perfused+rat+heart.+Local+production+of+angiotensin+I%5BTitle%5D)+AND+%22Hypertension%22%5BJournal%5D)">Renin-angiotensin system components in the interstitial fluid of the isolated perfused rat heart. Local production of angiotensin I.</a> Hypertension. 29 (6), 1240-1251 (1997).</li>
<li>Strupp, M., Kammermeier, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interstitial+Lactate+And+Glucose-Concentrations+Of+the+Isolated-Perfused+Rat-Heart+before%2C+during+And+after+Anoxia%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Arch%22%5BJournal%5D)">Interstitial Lactate And Glucose-Concentrations Of the Isolated-Perfused Rat-Heart before, during And after Anoxia.</a> Pflugers Arch. 423 (3-4), 232-237 (1993).</li>
<li>Wienen, W., Jungling, E., Kammermeier, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzyme-Release+into+the+Interstitial+Space+of+the+Isolated+Rat-Heart+Induced+by+Changes+in+Contractile+Performance%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc+Res%22%5BJournal%5D)">Enzyme-Release into the Interstitial Space of the Isolated Rat-Heart Induced by Changes in Contractile Performance.</a> Cardiovasc Res. 28 (8), 1292-1298 (1994).</li>
<li>De Deckere, E. A., Ten Hoor,, P, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modified+Langendorff+technique+for+metabolic+investigations%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Arch%22%5BJournal%5D)">A modified Langendorff technique for metabolic investigations.</a> Pflugers Arch. 370 (1), 103-105 (1977).</li>
<li>Tschubar, F., Rose, H., Kammermeier, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fatty+acid+transfer+across+the+myocardial+capillary+wall%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Cell+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Fatty acid transfer across the myocardial capillary wall.</a> J Mol Cell Cardiol. 25 (4), 355-366 (1993).</li>
<li>Wienen, W., Kammermeier, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intra-+and+extracellular+markers+in+interstitial+transudate+of+perfused+rat+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Intra- and extracellular markers in interstitial transudate of perfused rat hearts.</a> Am J Physiol. 254 (4 Pt 2), H785-H794 (1988).</li>
<li>Sasse, A., Ding, Z. P., Wallich, M., Godecke, A., Schrader, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+transfer+of+adenovirus+is+augmented+by+nitric+oxide+in+the+rat+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Heart+Circ+Physiol%22%5BJournal%5D)">Vascular transfer of adenovirus is augmented by nitric oxide in the rat heart.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 287 (3), H1362-H1368 (2004).</li>
<li>Gnecchi, M., Zhang, Z., Ni, A., Dzau, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paracrine+mechanisms+in+adult+stem+cell+signaling+and+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Paracrine mechanisms in adult stem cell signaling and therapy.</a> Circ Res. 103 (11), 1204-1219 (2008).</li>
<li>Herr, D. J., Aune, S. E., Menick, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+and+Assessment+of+Ischemia-reperfusion+Injury+in+Langendorff-perfused+Rat+Hearts%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Induction and Assessment of Ischemia-reperfusion Injury in Langendorff-perfused Rat Hearts.</a> J Vis Exp. (101), e52908(2015).</li>
<li>Ding, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epicardium-Derived+Cells+Formed+After+Myocardial+Injury+Display+Phagocytic+Activity+Permitting+In+Vivo+Labeling+and+Tracking%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Epicardium-Derived Cells Formed After Myocardial Injury Display Phagocytic Activity Permitting In Vivo Labeling and Tracking.</a> Stem Cells Transl Med. 5 (5), 639-650 (2016).</li>
<li>Hartwig, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secretome+profiling+of+primary+human+skeletal+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Secretome profiling of primary human skeletal muscle cells.</a> Biochim Biophys Acta. 1844 (5), 1011-1017 (2014).</li>
<li>Smolenski, R. T., Lachno, D. R., Ledingham, S. J. M., Yacoub, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+sixteen+nucleotides%2C+nucleosides+and+bases+using+high-performance+liquid+chromatography+and+its+application+to+the+study+of+purine+metabolism+in+hearts+for+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chromatogr%22%5BJournal%5D)">Determination of sixteen nucleotides, nucleosides and bases using high-performance liquid chromatography and its application to the study of purine metabolism in hearts for transplantation.</a> J Chromatogr. 527 (2), 414-420 (1990).</li>
<li>Decking, U. K., Juengling, E., Kammermeier, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interstitial+transudate+concentration+of+adenosine+and+inosine+in+rat+and+guinea+pig+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Interstitial transudate concentration of adenosine and inosine in rat and guinea pig hearts.</a> Am J Physiol. 254 (6 Pt 2), H1125-H1132 (1988).</li>
<li>Heller, L. J., Mohrman, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estimates+of+interstitial+adenosine+from+surface+exudates+of+isolated+rat+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Cell+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Estimates of interstitial adenosine from surface exudates of isolated rat hearts.</a> J Mol Cell Cardiol. 20 (6), 509-523 (1988).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Model odwróconego serca opiera się na dobrze znanej technice perfuzji serca Langendorffa12 i jest wykonywany po prostu poprzez odwrócenie serca do pozycji odwróconej i utrzymanie tej pozycji za pomocą sztywnego wewnątrzkomorowego cewnika balonowego. W ten sposób przesięk śródmiąższowy serca może być fizycznie oddzielony od perfuzatu z żył wieńcowych, kapiącego grawitacyjnie z podstawy serca9. Tomografia komputerowa może być pobierana w sposób ciągły za pomocą cienkiej i ela...

Niewydolność serca (HF) jest główną przyczyną zgonów ludzi na całym świecie1. Niewydolność serca często występuje z powodu zapalenia mięśnia sercowego, niedokrwiennych uszkodzeń mięśnia sercowego i przebudowy lewej komory, co prowadzi do postępującego pogorszenia funkcji skurczowej serca i jakości życia pacjentów. Chociaż postępy w kardiologii i kardiochirurgii znacznie obniżyły śmiertelność z powodu niewydolności serca, służą one jedynie jako przejściowe "opóźniacze" nieuchronnie postępującego procesu chorobowego, który niesie ze sobą znaczną zachorowalność. W związku z tym obecny brak skutecznego leczenia podkreśla potrzebę zidentyfikowania nowych celów molekularnych, które mogą zapobiec lub nawet odwrócić niewydolność serca. Obejmuje to zmiany w macierzy zewnątrzkomórkowej, niekontrolowaną odpowiedź immunologiczną serca oraz interakcje między komórkami sercowymi i niesercowymi2.
Ważne jest, aby uznać, że mikrośrodowisko, na które narażone są komórki serca, bezpośrednio kształtuje odpowiedź immunologiczną i regeneracyjną uszkodzonego serca. W izolowanym, perfundowanym solą fizjologiczną sercu, CT jest generowany na powierzchni serca w postaci małych kropelek, które pochodzą z przestrzeni płynu śródmiąższowego (tj. mikrośrodowiska), zarówno w warunkach fizjologicznych, jak i patofizjologicznych3,4,5. Dlatego analiza CT (tj. płynu śródmiąższowego) może pomóc w identyfikacji czynników, które regulują metabolizm serca i funkcję skurczu6 lub wpływają na funkcje komórek odpornościowych po migracji do uszkodzonego serca. Potencjalnie może to doprowadzić do opracowania nowych strategii terapeutycznych w leczeniu niewydolności serca.
Zbieranie CT z mysich serc jest technicznie trudne. W przypadku zwykłych serc z perfuzją Langendorffa wyłączne pobranie tomografii komputerowej jest trudne, ponieważ mieszanina tomografii komputerowej z perfuzatem ścieku z żył wieńcowych w nieprzewidywalny sposób rozrzedza wszelkie stężenie metabolitów/enzymów uwalnianych z przestrzeni śródmiąższowej. Jedną z możliwych strategii przezwyciężenia tego ograniczenia jest wykluczenie ścieków żylnych poprzez kaniulację płuc i jednoczesne podwiązanie żyły płucnej7. Jednak metoda ta napotyka trudności związane z kaniulacją i podwiązaniem tętnicy płucnej i żyły, powodując potencjalny wyciek ścieków żylnych do przesięku serca. Koncepcja użycia modelu odwróconego serca została po raz pierwszy wprowadzona przez grupę Kammermeiera, który odwrócił izolowane, perfundowane serce do pozycji odwróconej do góry nogami i umieścił cienką lateksową nasadkę na powierzchni nasierdzia, aby w sposób ciągły pobierać próbki CT bez zanieczyszczenia ścieków żylnych8,9. Za pomocą tej procedury wykazano, że CT zapewnia bardzo czuły pomiar metabolitów uwalnianych z serca9, kapilarnego transferu kwasów tłuszczowych 8 i cząstek wirusa10.
Ostatnio czynniki parakrynne, które mogą regulować miejscową odpowiedź immunologiczną i nasilać angiogenezę serca11 zostały powiązane z korzystnymi efektami terapii opartej na komórkach macierzystych w chorobach serca. Analiza tomografii komputerowej w odwróconym sercu może pomóc w chemicznej identyfikacji tych indywidualnych czynników parakrynnych. Ponadto tomografia komputerowa może pomóc w identyfikacji czynników zaangażowanych w aktywację in vivo komórek odpornościowych w sercu.
Szczegółowy opis pobierania tomografii komputerowej z powierzchni serca, zamieszczony tutaj, jest eksperymentalnie przydatny dla badaczy badających wzajemne oddziaływanie komórek odpornościowych, fibroblastów, komórek śródbłonka i kardiomiocytów w odniesieniu do ogólnej funkcji serca. Jak wspomniano powyżej, płyn śródmiąższowy przenosi informacje do komunikacji międzykomórkowej w sercu, które można wygodnie ocenić za pomocą zbioru tomografii komputerowej. Szczegółowy opis techniczny, w tym protokół wideo przedstawiający sposób pobierania tomografii komputerowej z odwróconego serca, powinien ułatwić zastosowanie tej unikalnej techniki w przyszłości.

<table><tbody><tr><td>Rozwiązanie lateksowe</td><td>ProChemie</td><td>Z-Latex LA-TZ</td><td>http://kautschukgesellschaft.de/%E2%80%A8z-latex-la-tz</td></tr><tr><td>Forma aluminiowa</td><td>Domowa robota-model</td><td></td> <td>odwróconego serca</td></tr><tr><td>Piekarniki uniwersalne</td><td>Memmert</td><td>UNB 400</td><td>Model odwróconego serca</td></tr><tr><td>Balon lateksowy</td><td>Hugo Sachs</td><td>Rozmiar 4</td><td>Model odwróconego serca</td></tr><tr><td>Frezarka</td><td>Proxxon</td><td>MF70</td><td>Odwrócony model serca</td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Sigma</td><td>SZBD0810V</td><td>Chemikalia</td></tr><tr><td>Wodorowęglan sodu</td><td>Roth</td><td>68852</td><td>Chemikalia</td></tr><tr><td>Chlorek potasu</td><td>Merck</td><td>49361</td><td>Chemikalia</td></tr><tr><td>Siarczan magnezu siedmiowodny</td><td>Merck</td><td>58861</td><td>Chemikalia</td></tr><tr><td>Diwodorofosforan potasu</td><td>Merck</td><td>48731</td><td>Chemikalia</td></tr><tr><td>D(+)-glukoza bezwodna</td><td>Merck</td><td>83371</td><td>Chemikalia</td></tr><tr><td>Chlorek wapnia dwuwodny</td><td>Fluka</td><td>21097</td><td>Waga chemiczna</td></tr><tr><td></td><td>VWR</td><td>SE 1202</td><td>Chemikalia do ważenia</td></tr><tr><td>Podwójnie destylowana woda</td><td></td> <td>Chemikalia rozpuszczające</td><td>młyny</td></tr> <tr><td>Medyczny przetwornik ciśnienia</td> <td>Gold-Langendorff</td><td></td><td> aparatura</td></tr><tr><td>Medyczna sonda przepływu</td><td>Transonic</td><td>3PXN</td><td>Aparat Langendorffa</td></tr><tr><td>Ogrzewanie Kąpiel cyrkulacyjna</td><td>Haake&nbsp;</td><td>B3 ; DC1</td><td>Aparat Langendorffa</td></tr><tr><td>Rurki laboratoryjne i próżniowe</td><td>Tygon</td><td>R-3603</td><td>Aparat Langendorffa</td></tr><tr><td>Przepływomierze do badań na zwierzętach</td><td>Aparatura Transonic</td><td>T206</td><td>Langendorffa</td></tr><tr><td>Urządzenie do akwizycji danych PowerLab Wykres</td><td>przyrządów AD</td><td>7.1</td><td>Aparat Langendorffa</td></tr><tr><td>Oprogramowanie do akwizycji danych LabChart</td><td>Wykres AD Instruments</td><td>7.1</td><td>Aparat Langendorffa</td></tr><tr><td>Pompa perystaltyczna</td><td>Glison</td><td>MINIPULS 3</td><td>Aparat Langendorffa</td></tr><tr><td>Szklana kolumna wodna</td><td>domowej roboty</td><td></td> <td>- aparat Langendorffa</td></tr><tr><td>Środek ochronny do kąpieli wodnej</td><td>VWR</td><td>462-7000</td><td>Aparat Langendorffa</td></tr><tr><td>Sterylne filtry jednorazowe (0,2 i mikro; m)</td> <td>Thermo Scientific</td><td>595-4520</td><td>Aparat Langendorffa</td></tr><tr><td>Analizatory parametrów krytycznych</td><td>Radiometer</td><td>ABL90 FLEX PLUS</td><td>Analizator gazów</td></tr><tr><td>70% etanolu</td><td>VWR</td><td>UN1170</td><td>Węże do czyszczenia&nbsp;</td></tr><tr><td>100% etanol</td><td>Merck</td><td>64-17-5</td><td>Rurki do czyszczenia</td></tr><tr><td>Wistar Rats</td><td>Janvier-Animals</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Nożyczki ze stali nierdzewnej</td><td>AESCULAP</td><td>BC702R</td><td>Instrumenty chirurgiczne</td></tr><tr><td>Nożyczki ze stali nierdzewnej</td><td>AESCULAP</td><td>BC257R</td><td>Instrumenty chirurgiczne</td></tr><tr><td>Duże kleszcze</td><td>AESCULAP</td> <td>-</td> <td>Narzędzia chirurgiczne</td></tr><tr><td>8 m / m Kleszcze ze stali nierdzewnej</td><td>FST</td><td>11052-10</td><td>Instrumenty chirurgiczne</td></tr><tr><td>bardzo cienki (10/0) papier ścierny</td><td>3M</td><td>051111-11694</td><td>Odwrócony model serca</td></tr></tbody></table>

model odwróconego serca do zbierania śródmiąższowego przesięku z izolowanego serca szczura

The Inverted Heart Model for Interstitial Transudate Collection from the Isolated Rat Heart

Obecny protokół opisuje unikalne podejście, które umożliwia pobranie przesięku serca (CT) z izolowanego, perfuzowanego solą fizjologiczną serca szczura. Po izolacji i wstecznej perfuzji serca zgodnie z techniką Langendorffa, serce jest odwracane do pozycji odwróconej i jest mechanicznie stabilizowane przez cewnik balonowy wprowadzany do lewej komory. Następnie na powierzchnię nasierdzia nakłada się cienką lateksową nasadkę – wcześniej odlewaną tak, aby pasowała do średniej wielkości serca szczura. Wylot nasadki lateksowej jest połączony z silikonową rurką, z dystalnym otworem 10 cm poniżej podstawowego poziomu serca, powodując lekkie ssanie. Tomografia komputerowa wytwarzana w sposób ciągły na powierzchni nasierdzia jest gromadzona w fiolkach chłodzonych lodem w celu dalszej analizy. Szybkość tworzenia TK wahała się od 17 do 147 μl/min (n = 14) w sercach kontrolnych i zawałowych, co stanowi 0,1-1% perfuzatu ścieku z żył wieńcowych. Analiza proteomiczna i wysokosprawna chromatografia cieczowa (HPLC) wykazały, że pobrana tomografia komputerowa zawiera szerokie spektrum białek i metabolitów purynergicznych.

Model odwróconego serca umożliwia gromadzenie wysięku śródmiąższowego z mięśnia sercowego w izolowanym, retroperfundowanym sercu szczura (Rysunek 1A-C). Przy perfuzji pod stałym ciśnieniem 100 cmH2O szybkość tworzenia się płynu śródmiąższowego wynosiła od 17 do 147 µL/min, co stanowiło 0,1-1% odpływu z żył wieńcowych w izolowanym sercu.
Zawartość białek w CT, zmierzona za...

Ten protokół opisuje metodę pobierania płynu śródmiąższowego serca z izolowanego, perfundowanego serca szczura. Aby fizycznie oddzielić przesięk śródmiąższowy od perfuzatu z żył wieńcowych, perfundowane serce Langendorffa jest odwracane, a przesięk (płyn śródmiąższowy) utworzony na powierzchni serca jest zbierany za pomocą miękkiej nasadki lateksowej.

Model odwróconego serca do zbierania śródmiąższowego przesięku z izolowanego serca szczura

The present protocol describes a unique approach that enables the collection of cardiac transudate (CT) from the isolated, saline-perfused rat heart. ...

Ogólnym celem tego modelu odwróconego serca jest pobranie przesięku śródmiąższowego z izolowanego serca szczura. W bijącym sercu poszczególne komórki serca wydzielają czynniki parakrynne do otaczającej je przestrzeni płynu śródmiąższowego. Jest to istotne, ponieważ przestrzeń płynu śródmiąższowego przenosi informacje służące do komunikacji między komórkami serca.Jest to szczególnie istotne w warunkach stanu zapalnego i regeneracji zawałowatego mięśnia sercowego. W tym filmie moi współpracownicy, dr Ding i Tan, zaprezentują techniki, których używamy w naszym laboratorium do pobierania płynu śródmiąższowego z powierzchni izolowanego, perfundowanego serca szczura. Aby wykonać lateksową osłonę lub nasadkę na serce, należy użyć aluminiowej formy odpowiadającej średniej wielkości serca szczura, która została wypolerowana superdrobnoziarnistym papierem ściernym.Zamocuj pionowo szyjkę formy do frezarki i rozpocznij powolną rotację formy. Następnie wlej 20 ml ciekłego lateksu do zlewki szklanej o pojemności 50 ml i opuść obracającą się formę do lateksu, aż zostanie całkowicie zanurzona. Następnie powoli ją wyjmij i kontynuuj obracanie formy przez kolejne 15 minut, aż lateks stężeje.Obracanie jest niezbędne do przygotowania tej masy oraz równomiernego rozprowadzenia warstwy ciekłego lateksu na powierzchni formy. Należy więc upewnić się, że forma obraca się podczas podnoszenia jej z lateksu. Po wyschnięciu lateksu należy pokryć go pudrem talkowym, aby zapobiec jego uszkodzeniu.Zatrzymaj obrót, a następnie delikatnie odłącz formę od urządzenia. Ostrożnie wyjmij lateks z formy. Teraz przymocuj 25 centymetr rurki silikonowej do wylotu w lateksowej nasadce.Tę probówkę wykorzystuje się do zbierania przeżyskotkowego wysięku sercowego (interstitial cardiac transudate), czyli CT. Następnie mocno przymocuj balonik komorowy w rozmiarze dla szczura do metalowej kaniuli w kształcie litery L, połączonej z jednofunkcyjną strzykawką wypełnioną wodą. Napełnij balonik komorowy w rozmiarze dla szczura wodą. Upewnij się, że balonik jest szczelny, pompując i wypuszczając z niego powietrze kilkakrotnie za pomocą strzykawki.Następnie należy połączyć kaniulę z przetwornikiem ciśnienia za pomocą trójdrożnego kurka. Na koniec należy zaznaczyć na strzykawce poziom, przy którym balon wypełni jamę komory w celu pomiaru ciśnienia wewnątrzkomorowego. Przed przystąpieniem do preparowania serca należy przygotować system perfuzji Langendorffa zgodnie z protokołem tekstowym.Następnie, po pełnym znieczuleniu samca szczura Wistar o masie od 300 do 350 g, przenieś go na stół operacyjny w temperaturze pokojowej. Przy odpowiednim doświadczeniu następne kroki prowadzące do kanulacji serca powinny zająć około trzech minut. Za pomocą pęsety unieś skórę i mięśnie tuż poniżej mostka, a następnie przetnij tkanki wzdłuż dolnej krawędzi żeber, używając ciężkich nożyc.Następnie za pomocą precyzyjnych nożyczek wykonaj niewielkie nacięcie przepony na brzegu żebra. Dalej, przetnij żebra w kierunku ogonowym, aby utworzyć płat obejmujący całą brzuszną ścianę klatki piersiowej. Teraz delikatnie chwyć serce i powoli je unoś, aż naczynia krwionośne serca zaczną się napinać.Następnie wyciąć serce, aż aorta zostanie całkowicie odsłonięta, i przenieść je do zlewki o pojemności 100 ml zawierającej 50 ml lodowatego roztworu KHB. Teraz bezzwłocznie przenieść serce do aparatury perfuzyjnej i zamocować aortę na kaniuli kroplującej. Mocno zabezpieczyć ją szwem 4-0, aby do serca nie dostawały się pęcherzyki powietrza.Następnie zastosuj stałe ciśnienie perfuzji lub przepływ perfuzyjny. Aby przygotować układ z odwróconym sercem, najpierw delikatnie obróć kaniulę aortalną, aż ściana tylna serca znajdzie się na wprost. Następnie odetnij tkankę łączną, aby odsłonić otwór do lewego przedsionka.Następnie delikatnie chwyć serce i odwróć je do góry nogami. Zamocuj serce na przygotowanym balonie komorowym, gdy ten jest spłaszczony, i wprowadź go do lewej komory. Serce zostaje teraz mechanicznie ustabilizowane w pozycji pionowej, z wykorzystaniem zestawu cewnika z balonem jako podpory.Napompuj balon, aż wypełni on całą jamę komory, przesuwając tłok do znaku napełnienia. Unieruchom serce w taki sposób, aby naprężenie u nasady aorty było minimalne. Ta część procedury wymaga wprawy.Teraz należy obserwować manometr na balonie i ustawić ciśnienie rozkurczowe na wartość od 3 do 5 mmHg. Jeśli ciśnienie zostało ustawione prawidłowo, na epikardium powinny pojawić się małe kropelki. Następnie należy delikatnie naciągnąć lateksową nasadkę na serce.Należy pokryć nawet najbardziej komorową powierzchnię. Przed kontynuacją należy sprawdzić, czy wewnątrz nakładki nie ma pęcherzyków powietrza. Aby usunąć pęcherzyki powietrza, należy zastosować delikatne ssanie za pomocą strzykawki.Następnie umieść koniec rurki odpływowej 10 cm poniżej serca. Zbierz skapującą krew tkankową (CT) do probówki o pojemności 1,5 ml i utrzymuj temperaturę probówki poniżej 4 °C, umieszczając ją w mieszaninie lodu i chlorku sodu w stosunku 1:1. Zbierz od 0,15 do 1,5 ml CT, a następnie zważ próbkę i zamroź ją gwałtownie w ciekłym azocie.Przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu przetworzenia. Podczas retroperfuzji modelu serca w odwróconym układzie przy stałym ciśnieniu 100 cm H₂O, można było zebrać od 1/10 do 1% odpływu z żył wieńcowych. Zawartość białka w CT zmierzono za pomocą testu BCA, a jej średnia wartość wyniosła 1,1 mg/mL.Prosta elektroforeza żelowa ujawniła szerokie spektrum białek. Próbki prawidłowe porównano z próbkami z serc poddanych 50-minutowej reperfuzji po niedokrwieniu, stosując metodę 2D DIGE. Stwierdzono zwiększoną ekspresję kilku białek w CT serc niedokrwiennych.Przeprowadzono analizę proteomiczną białek o zwiększonej ekspresji. Dużym zainteresowaniem cieszyły się również puryny. Puryny są kluczowymi cząsteczkami sygnałowymi, które regulują odpowiedź immunologiczną serca, napięcie naczyniowe oraz funkcję serca, szczególnie po urazie niedokrwiennym.Analiza HPLC CT wykazała podwyższone stężenia wielu puryn w uszkodzonych sercach. Podczas przeprowadzania tej procedury należy pamiętać, że model translokacji serca utworzony w izolowanym sercu nie będzie w pełni odzwierciedlał rzeczywistego składu warunków in vivo.

the-inverted-heart-model-for-interstitial-transudate-collection-from

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Ten film opisuje technikę perfuzji skierowanej do przodu izolowanego serca myszy, podczas której perfuzat jest wstrzykiwany przez lewą komorę, a ostatecznie przenika cały mięsień sercowy. Metoda ta może być wykorzystana do izolowania kardiomiocytów od modeli mysich i generowania pozbawionych komórek serc do dalszych zastosowań.

Model perfuzji antegrade: technika ex vivo perfuzji izolowanego serca myszy

Większość badań z udziałem aparatu Langendorffa wykorzystuje małe modele zwierzęce ze względu na zwiększoną złożoność systemów dla większych ssaków. Opisujemy system Langendorffa dla dużych modeli zwierzęcych, który pozwala na zastosowanie go u różnych gatunków, w tym ludzi, i stosunkowo łatwe pozyskiwanie danych.

Izolowany działający system serca dla dużych modeli zwierzęcych

Izolowane serce szczura jest trwałym modelem uszkodzenia reperfuzyjnego niedokrwiennego. W tym miejscu opisujemy proces pobierania bijącego serca od szczura poprzez kaniulację aorty in situ, perfuzję Langendorffa serca, symulowane uszkodzenie niedokrwienno-reperfuzyjne i barwienie zawału, aby potwierdzić zakres urazu niedokrwiennego.

Indukcja i ocena uszkodzenia niedokrwienno-reperfuzyjnego w sercach szczurów z perfuzją Langendorffa

Izolowane modele pracującego serca mogą być używane do pomiaru wpływu warunków obciążenia, tętna i leków na wydajność mięśnia sercowego i zużycie tlenu. Opisano metody przygotowania modelu pracy lewego serca gryzonia, który pozwala na badanie wydolności skurczowej i rozkurczowej oraz zużycia tlenu w różnych warunkach.

Model pracującego serca gryzoni do badania wydajności mięśnia sercowego i zużycia tlenu

Tutaj opisujemy zoptymalizowaną, opartą na Langendorffie procedurę izolacji jednokomórkowych kardiomiocytów przedsionkowych z szczurzego modelu niewydolności serca związanej z zespołem metabolicznym z zachowaną frakcją wyrzutową. Ręczna regulacja ciśnienia śródświetlnego w jamach serca jest wdrażana w celu uzyskania funkcjonalnie nienaruszonych miocytów odpowiednich do badań pobudzenia, skurczu i sprzężenia.

Izolacja kardiomiocytów przedsionkowych od szczurzego modelu niewydolności serca związanej z zespołem metabolicznym z zachowaną frakcją wyrzutową

Opisujemy model heterotopowego przeszczepu serca w jamie brzusznej u szczurów, sugerując modyfikacje obecnych strategii, które prowadzą do uproszczonego podejścia chirurgicznego. Dodatkowo opisujemy nowatorski model odrzucania przeszczepu poprzez wstrzyknięcie do ucha ważnych komórek mięśnia sercowego, co pozwala na dalsze analizy immunologiczne przeszczepu u szczurów.

Model immunologiczny do heterotopowego przeszczepu komórek serca i mięśnia sercowego u szczurów

Przedstawiamy protokół izolacji komórek śródbłonka wsierdzia i naczyń wieńcowych z serc szczurów poprzez sekwencyjne trawienie tkanek w buforze trawiennym, pobieranie komórek z powtarzających się cykli wirowania i oczyszczanie komórek za pomocą mikrogranulek anty-szczurzych CD31.

Izolacja komórek śródbłonka wsierdzia i naczyń wieńcowych z wolnej ściany komory serca szczura

Tutaj prezentujemy protokół oceny heterotopowo wszczepionego serca po normotermicznym zachowaniu ex situ w modelu szczurzym.

Szczurzy model normomicznego heterotopowego przeszczepu serca z perfuzją ex-situ

Ten protokół przedstawia model długotrwałego migotania komór w sercach szczurów, wywołanego ciągłą stymulacją prądem przemiennym o niskim napięciu. Model ten ma wysoki wskaźnik sukcesu, jest stabilny, niezawodny i powtarzalny, ma niewielki wpływ na czynność serca i powoduje tylko łagodne uszkodzenie mięśnia sercowego.

Model długotrwałego migotania komór w izolowanych sercach szczurów

Opisujemy protokół ex vivo izolowanego działania na szczurzym sercu, aby przetestować strategie zachowania serca dawcy. W artykule opisano protokół stosowania w statycznym przechowywaniu serc dawców gryzoni w chłodniach; Jednak protokół może być również stosowany w przypadku serc dawców uzyskanych po dawstwie po śmierci krążeniowej i śmierci mózgu.

Wykorzystanie izolowanego modelu pracującego serca szczura do testowania strategii zachowania serca dawcy

Poznaj metodę zbierania śródmiąższowego przesięku z izolowanego serca szczura przy użyciu odwróconego modelu Langendorffa. Technika ta umożliwia badanie sygnalizacji parakrynnej i dynamiki płynu międzykomórkowego w fizjologii serca.

Model odwróconego serca do zbierania śródmiąższowego przesięku z izolowanego serca szczura

Przeglądaj więcej filmów