Name: Obrazowanie morfologii włośnika siewek rzodkiewnika w dwuwarstwowej platformie mikroprzepływowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 23 s
Description: Poznaj metodę mikroprzepływową do hodowli siewek Arabidopsis thaliana z wysokorozdzielczym obrazowaniem morfologii korzeni. Platforma PDMS umożliwia kontrolowane badanie reakcji korzeni na czynniki fizyczne i chemiczne.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ten manuskrypt został napisany przez UT-Battelle, LLC na podstawie umowy nr. DE-AC05-00OR22725 z Departamentem Energii Stanów Zjednoczonych. Rząd Stanów Zjednoczonych zachowuje, a wydawca, przyjmując artykuł do publikacji, przyjmuje do wiadomości, że Rząd Stanów Zjednoczonych zachowuje niewyłączną, opłaconą, nieodwołalną, ogólnoświatową licencję na publikację lub powielanie opublikowanej formy tego rękopisu lub zezwalanie na to innym osobom dla celów Rządu Stanów Zjednoczonych. Departament Energii zapewni publiczny dostęp do tych wyników badań sponsorowanych przez rząd federalny zgodnie z Planem Publicznego Dostępu DOE (http://energy.gov/downloads/doe-public-access-plan).
Ta praca była częściowo wspierana przez Program Nauk o Genomice, Departament Energii Stanów Zjednoczonych, Biuro Nauki, Badań Biologicznych i Środowiskowych, jako część Obszaru Naukowego Interfejsów Mikroorganizmów Roślinnych (http://pmi.ornl.gov). Produkcja platform mikroprzepływowych została przeprowadzona w Laboratorium Badawczym Nanofabrykacji w Centrum Nauk o Materiałach Nanofazowych, które jest obiektem użytkownika Biura Nauki DOE. JAA jest wspierany przez stypendium naukowe dla absolwentów NSF DGE -1452154

1. Dwuwarstwowa produkcja platformy
<ol>
	<li>Wytwarzanie wielowarstwowych wzorców
	<ol>
		<li>Fotorezyst ujemny na bazie żywicy epoksydowej (~63,45% ciał stałych, 1,250 cSt) zgodnie ze specyfikacją producenta (2,000 obr./min przez 45 s) na płytce krzemowej o średnicy 4 cali, aby uzyskać pożądaną wysokość 20 μm dla pierwszej warstwy projektowej.</li>
		<li>Miękkie pieczenie wafli powlekanych przez 4 minuty w temperaturze 95 °C. Pozostaw wafel do ostygnięcia na 5 minut. Wystaw wafel na działanie światła UV przez 15 s (~150 mJ/cm2 przy 365 nm) przez fotomaskę w nakładce kontaktowej UV, aby określić geometrię dolnej warstwy.</li>
		<li>Po ekspozycji piecz wafel przez 5 minut w temperaturze 95 °C. Bez wywoływania, włóż płytkę z powrotem do powlekarki wirowej i odwiruj na drugiej warstwie ujemnego fotorezystu na bazie żywicy epoksydowej (~76,75% ciał stałych, 80 000 cSt) przy 3,000 obr./min, aby uzyskać wysokość drugiej warstwy 150 - 200 μm.</li>
		<li>Pozostaw wafel na 5 minut do odpoczynku przed przeniesieniem na płytę grzejną o temperaturze 95 °C na 45 minut. Po upieczeniu na płycie grzejnej wyjmij wafel i pozwól rezystowowi ostygnąć i stwardnieć w temperaturze pokojowej przez kolejne 5 minut na płaskiej, równej powierzchni. Wyrównaj i naświetl wafel na fotomasce drugiej warstwy przez 30 s w nakładce kontaktowej UV (dawka około 300 mJ/cm2).</li>
		<li>Wykonaj pieczenie poekspozycyjne, umieszczając wafel na płycie grzejnej na 15 minut w temperaturze 95 °C, a następnie pozwól wafli ostygnąć na płaskiej, równej powierzchni przez 5 minut przed wywołaniem.</li>
		<li>Obie warstwy oporowe należy opracować jednocześnie, umieszczając wafel w plastikowym naczyniu i zanurzając go w odpowiednim wywoływaczu (patrz Tabela materiałów). Od czasu do czasu delikatnie kołysz naczyniem, aby umyć świeży wywoływacz na wafli.</li>
		<li>Po 17 minutach opłucz wafel izopropanolem (IPA). Jeśli pojawi się biały film, kontynuuj iterację między płukaniem płytki za pomocą wywoływacza i IPA, aż film zniknie. Wysuszyć wzorzystą płytkę krzemową azotem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Miękka litografia polidimetylosiloksanu
	<ol>
		<li>Wystaw płytkę krzemową na działanie plazmy powietrznej przez 30 sekund w myjce plazmowej ustawionej na wysoki poziom (patrz tabela materiałów) w celu oczyszczenia. Sylanizować wafel za pomocą trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluoro-n-oktylo)silanu w okapie chemicznym na płycie grzejnej poniżej temperatury zapłonu silanu (85 °C) przez 2 godziny.</li>
		<li>Wlej 10:1 polidimetylosiloksanu (PDMS) do utwardzacza na płytkę silikonową. Odgazować zmieszany PDMS w komorze próżniowej, a następnie utwardzić polimer w piecu o temperaturze 70 °C przez 1 godzinę lub do momentu całkowitego utwardzenia PDMS.</li>
		<li>Za pomocą skalpela pokrój urządzenia PDMS i oderwij je od płytki krzemowej. Użyj stempla do biopsji o średnicy 1,5 mm, aby utworzyć wloty nasion i zaprawiania, przebijając wlot nasion pod kątem 45°, aby pobudzić wzrost korzeni do głównego kanału.</li>
		<li>Użyj przezroczystej taśmy klejącej, aby usunąć zanieczyszczenia z urządzenia PDMS i umieść urządzenie stroną do dołu na szklanym szkiełku nakrywkowym. Autoklaw zmontowanych urządzeń.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Urządzenia do sadzenia
<ol>
	<li>Przygotowanie nasion Arabidopsis thaliana 
	<ol>
		<li>Nasiona A. thaliana należy sterylizować powierzchniowo w probówce do mikrofuge roztworem 30% dostępnego w handlu wybielacza rozcieńczonego w wodzie dejonizowanej i 0,1% detergentu Triton X przez 7 min. Umyj nasiona 4 razy sterylną wodą.</li>
		<li>Rozwarstwić nasiona, przechowując rurkę do mikrofuge w lodówce przez noc lub do tygodnia w temperaturze 4 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie urządzenia
	<ol>
		<li>Umieść wysterylizowane urządzenia w próżniowej komorze odgazowywania, aby usunąć powietrze z przepuszczalnego dla gazu PDMS i kanałów płynnych, aby ułatwić napełnianie.</li>
		<li>Wyjmij urządzenia z komory próżniowej i natychmiast zanurz je na szalce Petriego wypełnionej płynnymi pożywkami roślinnymi o stężeniu 1/4 o pH 5,7.</li>
		<li>Za pomocą pipety przeciągnij płyn przez wloty, aby napełnić urządzenie. Upewnij się, że w kanałach nie pozostały pęcherzyki powietrza podczas oględzin.</li>
		<li>Przenieś poszczególne urządzenia na nowe suche szalki Petriego. Wlej lub pipetuj gorący agar wokół urządzenia, aż poziom agaru prawie zrówna się z górną częścią urządzenia PDMS. Pozwól agarowi zastygnąć. 
		UWAGA: Urządzenia są teraz gotowe do sadzenia nasion lub mogą być przechowywane w temperaturze 4 °C do czasu, gdy będą potrzebne.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Sadzenie nasion w urządzeniach
	<ol>
		<li>W sterylnym środowisku przenieś jedno wysterylizowane nasiono do wlotu każdego urządzenia za pomocą małej pipety.</li>
		<li>Przykryj szalkę Petriego folią woskową (patrz Tabela Materiałów) i umieść w komorze wzrostu lub parapecie o temperaturze pokojowej w jasnym/ciemnym cyklu. Ustaw szalkę Petriego tak, aby urządzenia były pionowe, a grawitacja zachęci korzenie do wzrostu przez kanał.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Leczenie
<ol>
	<li>Zabiegi eksperymentalne
	<ol>
		<li>W pożądanym momencie rozwoju sadzonki dodaj eksperymentalny zabieg do sadzonki, dodając przepisaną ilość nawozu do każdego z 8 bocznych portów za pomocą pipety.</li>
		<li>Ponownie zamknij szalkę Petriego i wróć do komory wzrostowej lub parapetu.</li>
		<li>Kontynuuj obrazowanie próbek w żądanym czasie, aby uchwycić poszczególne punkty czasowe lub rozpocząć obrazowanie poklatkowe.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Obrazowanie optyczne
<ol>
	<li>Obrazowanie o niższej rozdzielczości (4 - 20X)
	<ol>
		<li>Umieść całą szalkę Petriego zawierającą urządzenie i sadzonkę pod mikroskopem odwróconego jasnego pola w celu obrazowania w jasnym polu o niższej rozdzielczości (4 - 20X) lub kontrastu różnicowego (DIC). Zoptymalizuj warunki oświetleniowe, aby wyjaśnić interesujące Cię cechy morfologiczne, dostosowując czasy ekspozycji, jasność lampy, przysłonę i polaryzację światła. Skieruj scenę do żądanego obszaru korzenia i skup się na interesującym cię korzeniu lub włośniku.</li>
		<li>Uzyskaj pojedynczy punkt czasowy lub serię obrazów w czasie. Aby zobrazować wzrost włośników, wyobraź sobie rosnące włośniki raz na minutę. Aby zobrazować wzrost głównego korzenia, uzyskuj jeden obraz co 30 minut. Po zakończeniu obrazowania umieścić szalkę Petriego i sadzonki z powrotem w komorze wzrostowej lub parapecie w pozycji pionowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Obrazowanie o wyższej rozdzielczości (20 - 63x)
	<ol>
		<li>Gdy sadzonka wyrośnie przez pożądany czas, użyj kleszczy, aby usunąć szkiełko nakrywkowe i urządzenie z agaru. Oczyść spód szkiełka nakrywkowego za pomocą chusteczki laboratoryjnej zwilżonej etanolem.</li>
		<li>Nałóż zalecany środek zanurzeniowy na obiektyw zgodnie z sugestią producenta soczewek mikroskopu. Umieść szkiełko nakrywkowe na stoliku mikroskopu i podnieś stolik, aby zetknął się z mediami zanurzeniowymi na obiektywie. Zoptymalizuj warunki oświetleniowe, dostosowując czasy naświetlania, jasność lampy, przysłonę i polaryzację światła. Przesuń scenę do żądanego obszaru i skup się na interesujących Cię włosach korzeniowych. 
		UWAGA: DIC jest potrzebny do wizualizacji strumieni cytoplazmatycznych, a markery fluorescencyjne są potrzebne do wizualizacji ruchu organelli.</li>
		<li>Aby określić ilościowo wzrost włośników w czasie, uzyskaj jeden obraz na minutę. Aby zobrazować ruch organelli, zminimalizuj czas ekspozycji na fluorescencję, zachowując jednocześnie możliwy do zidentyfikowania sygnał fluorescencyjny z organelli. Rób zdjęcia organelli tak szybko, jak pozwala na to czas ekspozycji. W przypadku dłuższego obrazowania poklatkowego należy użyć inkubatora do obrazowania żywych komórek, aby utrzymać temperaturę i wilgotność otoczenia. 
		UWAGA: Obiektyw olejowy 63X jest zalecany do obrazowania organelli owłosików.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Obrazowanie nieoptyczne
<ol>
	<li>Przygotowanie urządzenia
	<ol>
		<li>Gdy sadzonka wyrośnie na żądany czas, wyjmij urządzenie i szkiełko nakrywkowe z szalki Petriego.</li>
		<li>Odwróć urządzenie do góry nogami i delikatnie oderwij szkiełko nakrywkowe, aby korzeń pozostał w kanale PDMS.</li>
		<li>Przystąp do używania urządzenia PDMS jako podłoża dla korzenia w wyższej rozdzielczości siły atomowej lub skaningowej mikroskopii elektronowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Skaningowa mikroskopia elektronowa
	<ol>
		<li>Umieść cienką (~20 nm) warstwę chromu na korzeniu i otaczającym PDMS za pomocą komory parowania wiązką elektronów z podwójnym pistoletem.</li>
		<li>Przenieś korzeń i urządzenie PDMS do komory skaningowego mikroskopu elektronowego. 
		UWAGA: Warunki obrazowania, tj. napięcie, prąd i odległość robocza będą musiały zostać zoptymalizowane, aby osiągnąć pożądaną rozdzielczość dla danego zastosowania.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Mikroskopia sił atomowych (AFM)
	<ol>
		<li>Zamontuj urządzenie PDMS stroną główną do góry na uchwycie na próbki AFM. Aby zwiększyć kontrast w aparacie i łatwiej odróżnić korzeń od PDMS, przed zamontowaniem urządzenia na uchwycie na próbkę AFM umieść urządzenie PDMS na płaskim podłożu odbijającym światło (takim jak mika pokryta złotem).</li>
		<li>Zamocuj nasadkę do studni z płynem na górze urządzenia PDMS i napełnij ją wodą, aby utrzymać nawodnienie korzeni podczas obrazowania.</li>
		<li>Załaduj uchwyt próbki do AFM. Dostosuj regulator z do grubości urządzenia PDMS i skieruj wspornik do obszaru zainteresowania na korzeniu, korzystając z kamery do prowadzenia.</li>
		<li>Wyrównaj laser z końcówką wspornika. Aby uzyskać najlepsze wyniki obrazowania w trybie kontaktowym, należy użyć wsporników o stałych sprężystości 0,01 lub 0,03 N/m, aby wywierać minimalną siłę na wierzeń podczas skanowania.</li>
		<li>Powoli opuść mechanizm skanujący, aż wspornik po prostu zetknie się z próbką. Dostosuj rozmiar skanowania dla żądanego regionu i wybierz prędkość skanowania 1 linia/s z 256 punktami napięcia na linię. Pobierz skan.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Pritchard, S. G. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/profile/Seth_Pritchard/publication/229773581_Soil_organisms_and_global_climate_change/links/53ee8d000cf26b9b7dccbff1.pdf">Soil organisms and global climate change.</a> Plant Pathol. 60 (1), 82-99 (2011).</li>
<li>Norby, R. J., Ledford, J., Reilly, C. D., Miller, N. E., O'Neill, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fine-root+production+dominates+response+of+a+deciduous+forest+to+atmospheric+CO2+enrichment%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natll.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Fine-root production dominates response of a deciduous forest to atmospheric CO2 enrichment.</a> Proc. Natll. Acad. Sci. USA. 101 (26), 9689-9693 (2004).</li>
<li>McCormack, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redefining+fine+roots+improves+understanding+of+below-ground+contributions+to+terrestrial+biosphere+processes%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytol%22%5BJournal%5D)">Redefining fine roots improves understanding of below-ground contributions to terrestrial biosphere processes.</a> New Phytol. 207 (3), 505-518 (2015).</li>
<li>Mangano, S., Juarez, S. P. D., Estevez, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ROS+regulation+of+polar-growth+in+plant+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">ROS regulation of polar-growth in plant cells.</a> Plant Physiol. 171 (3), 1593-1605 (2016).</li>
<li>Ketelaar, T., Emons, A. M. The Actin Cytoskeleton in Root Hairs: A Cell Elongation Device. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/chapter/10.1007%2F978-3-540-79405-9_8">Root Hairs</a>. , 211-232 (2009).</li>
<li>Grossmann, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RootChip%3A+an+integrated+microfluidic+chip+for+plant+science%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">The RootChip: an integrated microfluidic chip for plant science.</a> Plant Cell. 23 (12), 4234-4240 (2011).</li>
<li>Grossmann, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-lapse+fluorescence+imaging+of+Arabidopsis+root+growth+with+rapid+manipulation+of+the+root+environment+using+the+RootChip%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Time-lapse fluorescence imaging of Arabidopsis root growth with rapid manipulation of the root environment using the RootChip.</a> J. Vis. Exp. (65), (2012).</li>
<li>Jiang, H., Xu, Z., Aluru, M. R., Dong, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+chip+for+high-throughput+phenotyping+of+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Plant chip for high-throughput phenotyping of Arabidopsis.</a> Lab Chip. 14 (7), 1281(2014).</li>
<li>Busch, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfluidic+device+and+computational+platform+for+high-throughput+live+imaging+of+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">A microfluidic device and computational platform for high-throughput live imaging of gene expression.</a> Nat. Methods. 9 (11), (2012).</li>
<li>Meier, M., Lucchettta, E., Ismagilov, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+Stimulation+of+the+Arabidopsis+thaliana+Root+using+Multi-Laminar+Flow+on+a+Microfluidic+Chip%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Chemical Stimulation of the Arabidopsis thaliana Root using Multi-Laminar Flow on a Microfluidic Chip.</a> Lab Chip. 10 (16), 2147-2153 (2010).</li>
<li>Ozoe, K., Hida, H., Kanno, I., Higashiyama, T., Notaguchi, M. <a target="_blank" href="http://ieeexplore.ieee.org/document/7051054/">Early characterization method of plant root adaptability to soil environments.</a> Proc. of 28th IEEE Interntl. Conf. Micro. Electro Mech. Syst. , (2015).</li>
<li>Sanati Nezhad, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+platforms+for+plant+cells+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+chip%22%5BJournal%5D)">Microfluidic platforms for plant cells studies.</a> Lab on a chip. , 3262-3274 (2014).</li>
<li>Parashar, A., Pandey, S. <a target="_blank" href="http://aip.scitation.org/doi/abs/10.1063/1.3604788">Plant-in-chip: Microfluidic system for studying root growth and pathogenic interactions in Arabidopsis.</a> App. Phys. Lett. 98 (26), 2009-2012 (2011).</li>
<li>Rigas, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Root+gravitropism+and+root+hair+development+constitute+coupled+developmental+responses+regulated+by+auxin+homeostasis+in+the+Arabidopsis+root+apex%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytolol%22%5BJournal%5D)">Root gravitropism and root hair development constitute coupled developmental responses regulated by auxin homeostasis in the Arabidopsis root apex.</a> New Phytolol. 197 (4), 1130-1141 (2013).</li>
<li>Bengough, A. G., McKenzie, B. M., Hallett, P. D., Valentine, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Root+elongation%2C+water+stress%2C+and+mechanical+impedance%3A+A+review+of+limiting+stresses+and+beneficial+root+tip+traits%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Bot%22%5BJournal%5D)">Root elongation, water stress, and mechanical impedance: A review of limiting stresses and beneficial root tip traits.</a> J. Exp. Bot. 62 (1), 59-68 (2011).</li>
<li>Sia, S. K., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+devices+fabricated+in+poly%28dimethylsiloxane%29+for+biological+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophor%22%5BJournal%5D)">Microfluidic devices fabricated in poly(dimethylsiloxane) for biological studies.</a> Electrophor. 24 (21), 3563-3576 (2003).</li>
<li>Millet, L. J., Stewart, M. E., Sweedler, J. V., Nuzzo, R. G., Gillette, M. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+devices+for+culturing+primary+mammalian+neurons+at+low+densities%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+chip%22%5BJournal%5D)">Microfluidic devices for culturing primary mammalian neurons at low densities.</a> Lab chip. 7 (8), 987-994 (2007).</li>
<li>Nelson, B. K., Cai, X., Nebenführ, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multicolored+set+of+in+vivo+organelle+markers+for+co-localization+studies+in+Arabidopsis+and+other+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">A multicolored set of in vivo organelle markers for co-localization studies in Arabidopsis and other plants.</a> Plant J. 51 (6), 1126-1136 (2007).</li>
<li>Talbot, M. J., White, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+surface+and+cell+outline+imaging+in+plant+tissues+using+the+backscattered+electron+detector+in+a+variable+pressure+scanning+electron+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Methods%22%5BJournal%5D)">Cell surface and cell outline imaging in plant tissues using the backscattered electron detector in a variable pressure scanning electron microscope.</a> Plant Methods. 9 (1), 40(2013).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Opisana w tym artykule metoda tworzenia platformy typu plant-on-a-chip jest wyjątkowa, ponieważ dwuwarstwowa konstrukcja ogranicza włośniki do jednej płaszczyzny obrazowania, a platforma może zostać zdekonstruowana i wykorzystana jako podłoże do obrazowania nieoptycznego o wysokiej rozdzielczości. Korzystanie z obrazowania nieoptycznego o wysokiej rozdzielczości może dostarczyć cennych informacji o tkance roślinnej, których nie można uzyskać za pomocą samego obrazowania optycznego. Na przykład obrazowanie AFM może zapewn...

Drobne cechy korzeni zwiększają zapotrzebowanie rośliny na wodę i składniki odżywcze, odkrywając nowe przestrzenie glebowe i zwiększając całkowitą powierzchnię korzeni. Rotacja tych drobnych cech korzeniowych odgrywa główną rolę w stymulowaniu podziemnego łańcucha pokarmowego1 i oczekuje się, że liczba drobnych korzeni u niektórych gatunków roślin podwoi się pod wpływem podwyższonego stężenia dwutlenku węgla w atmosferze2. Drobne korzenie są ogólnie definiowane jako te o średnicy mniejszej niż 2 mm, chociaż nowe definicje opowiadają się za charakteryzowaniem drobnych korzeni według ich funkcji3. Podobnie jak wiele drobnych korzeni, włośniki pełnią funkcję pobierania i wchłaniania, ale zajmują znacznie mniejszą przestrzeń o średnicach rzędu mikronów. Ze względu na ich niewielkie rozmiary, włośniki są trudne do zobrazowania in situ i często są pomijane jako część ogólnej architektury korzeni w eksperymentach i modelach na skalę terenową.
Badania ex włosów korzeniowych terra, takie jak z sadzonek wyhodowanych na płytkach agarowych, dostarczyły społeczności naukowej cennych informacji na temat wzrostu i transportu komórek4,5. Podczas gdy płytki agarowe umożliwiają obrazowanie systemów korzeniowych w sposób nieniszczący i w czasie rzeczywistym, nie zapewniają one wysokiej kontroli środowiska w przypadku dodawania eksperymentalnych zabiegów, takich jak składniki odżywcze, hormony roślinne lub bakterie. Pojawiającym się rozwiązaniem ułatwiającym obrazowanie w wysokiej rozdzielczości przy jednoczesnym zapewnieniu dynamicznej kontroli środowiska stało się pojawienie się platform mikroprzepływowych do badań roślin. Platformy te umożliwiły nieniszczący wzrost i wizualizację kilku gatunków roślin w celu uzyskania fenotypowania o wysokiej przepustowości6,7,8,9, izolowane zabiegi chemiczne10, pomiary siły11,12, oraz dodawanie mikroorganizmów13. Projekty platform mikroprzepływowych skupiły się na wykorzystaniu pojedynczych warstw fluidycznych w otwartej przestrzeni, w których korzenie mogą się rozprzestrzeniać, umożliwiając włośnikom włośników do i z dala od ogniska optycznego podczas wzrostu lub zabiegu.
Tutaj prezentujemy procedurę rozwoju dwuwarstwowej platformy mikroprzepływowej przy użyciu metod fotograficznych i miękkiej litografii, która opiera się na poprzednich projektach typu roślina na chipie, ograniczając włośniki sadzonek do tej samej płaszczyzny obrazowania co główny korzeń. Dzięki temu możemy śledzić rozwój włośników w czasie rzeczywistym, w wysokiej rozdzielczości i przez cały proces eksperymentalnego leczenia. Nasze metody hodowli pozwalają siewkom Arabidopsis thaliana kiełkować z nasion na platformie i hodować je przez okres do tygodnia w uwodnionym i sterylnym środowisku, które nie wymaga użycia pomp strzykawkowych. Po zakończeniu eksperymentu z obrazowaniem poklatkowym prezentowaną tutaj platformę można otworzyć bez naruszania położenia drobniejszych cech korzenia. Pozwala to na zastosowanie innych metod obrazowania o wysokiej rozdzielczości. W tym miejscu przedstawiamy reprezentatywne wyniki do kwantyfikacji i wizualizacji morfologii włośnika na tej platformie za pomocą technik optycznej, skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM) i mikroskopii sił atomowych (AFM).

<table><tbody><tr><td>Materiały WRS wafla krzemowego</td><td></td><td>100mm średnica, 500-550um grubość, Prime, 10-20 rezystywność, N/Phos< 100></td><td></td></tr><tr><td>Quintel Contact Aligner</td><td>Neutronix Quintel Corp</td><td>NXQ 7500 Mask Aligner</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop fluorescencyjny</td><td>Nikon</td><td>Eclipse Ti-U</td><td></td></tr><tr><td>tkanka laboratoryjna</td><td>Kimberly Clark</td><td>Kimwipe KIMTECH SCIENCE Marka, 34155</td><td></td></tr><tr><td>Negatywny fotorezystor Epoksydowy</td><td>mikrochemik</td><td>SU-8 Seria</td><td></td>2000s</tr><tr><td>Wywoływanik</td> <td>fotorezystu</td><td>Wywoływacz</td><td></td>Microchem Su-8</tr><tr><td>trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluoro-oktylo)silan</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td>zastosowanie w okapie chemicznym</td></tr><tr><td>Środek do czyszczenia plazmą powietrzną</td><td>Harrick Plasma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PDMS</td><td>Dow Corning</td><td>Sylgard 184 Utwardzacz</td> PDMS na bazie <td></td>elastomeru silikonowego</tr><tr><td></td><td>Dow Corning</td><td>Sylgard 184 Utwardzacz</td><td></td></tr> <tr><td>z elastomeru silikonowegoEksykator</td><td>Bel-Art</td><td>F42010-000</td><td></td></tr><tr><td>Skalpel</td> Nóż <td></td><td></td><td>X-acto</td></tr><tr><td>Dziurkacz do biopsji</td><td>Ted Pella</td><td>15110-15</td><td></td></tr><tr><td>Taśma klejąca</td><td>Zszywki</td><td>Niewidoczna taśma Rurka</td><td></td></tr><tr><td>do mikrofugi</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triton X</td><td>J.T.Baker XI98-07</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wybielacz</td><td>Chlorox</td><td>skoncentrowane</td><td></td></tr><tr><td>podłoża roślinne</td><td>Fitotechnologia Laboratoria</td><td>M524</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Teknova</td><td>A7777</td><td></td></tr><tr>Mikroskop <td>parafilmowy</td><td></td><td></td><td>z filmem woskowym</td></tr> Mikroskop sił atomowych <tr><td></td><td>Olympus</td><td>IX51</td><td></td></tr><tr><td>Keysight</td><td>Technologies</td><td>5500 PicoPlus AFM</td><td></td></tr><tr><td>szalka Petriego</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Skaningowy mikroskop elektronowy</td><td>JEOL</td><td>7400</td><td></td></tr><tr><td>Podwójny pistolet Parownik wiązki elektronów</td><td>Termionika</td><td>Niestandardowy system parowania z podwójnym pistoletem elektronowym</td><td></td></tr></tbody></table>

obrazowanie morfologii włośnika siewek rzodkiewnika w dwuwarstwowej platformie mikroprzepływowej

Imaging the Root Hair Morphology of Arabidopsis Seedlings in a Two-layer Microfluidic Platform

Włoski zwiększają powierzchnię korzeni, co zapewnia lepsze pobieranie wody i wchłanianie składników odżywczych przez roślinę. Ponieważ są one niewielkich rozmiarów i często zasłonięte przez ich naturalne środowisko, morfologia i funkcja włośników są trudne do zbadania i często wykluczane z badań nad roślinami. W ostatnich latach platformy mikroprzepływowe umożliwiły wizualizację systemów korzeniowych w wysokiej rozdzielczości bez naruszania ich podczas transferu do systemu obrazowania. Przedstawiona tutaj platforma mikroprzepływowa opiera się na wcześniejszych badaniach typu plant-on-a-chip, zawierając dwuwarstwowe urządzenie do ograniczania głównego korzenia Arabidopsis thaliana do tej samej płaszczyzny optycznej co włośniki. Taka konstrukcja umożliwia ilościowe określenie włośników na poziomie komórkowym i organelli, a także zapobiega dryfowaniu osi z podczas dodawania eksperymentalnych zabiegów. Opisujemy, jak przechowywać urządzenia w zamkniętym i nawodnionym środowisku, bez konieczności stosowania pomp fluidycznych, przy jednoczesnym zachowaniu środowiska gnotobiotycznego dla sadzonki. Po eksperymencie obrazowania optycznego urządzenie może zostać zdemontowane i wykorzystane jako podłoże do siły atomowej lub skaningowej mikroskopii elektronowej, zachowując nienaruszone drobne struktury korzeniowe.

Opisane tutaj dwuwarstwowe urządzenia mikroprzepływowe z PDMS posiadają kanał o wysokości 200 µm dla głównego korzenia Arabidopsis oraz komorę o wysokości 20 µm do ograniczania bocznie rosnących włośników korzeniowych (Rysunek 1A). Konstrukcja ta może być stosowana dla gatunków roślin o średnicy korzenia zbliżonej do Arabidopsis thaliana i może być łatwo zmodyfikowana, aby dostosować ją do gatunków o innych rozmiarach. Projekt zawie...

Ten artykuł pokazuje, jak hodować siewki Arabidopsis thaliana w dwuwarstwowej platformie mikroprzepływowej, która ogranicza główny korzeń i włośniki do jednej płaszczyzny optycznej. Platforma ta może być wykorzystywana do obrazowania optycznego w czasie rzeczywistym drobnej morfologii korzeni, a także do obrazowania w wysokiej rozdzielczości za pomocą innych środków.

Obrazowanie morfologii włośnika siewek rzodkiewnika w dwuwarstwowej platformie mikroprzepływowej

Root hairs increase root surface area for better water uptake and nutrient absorption by the plant. Because they are small in size and often obscured by ...

Ogólnym celem tej mikrofluidycznej metody hodowli z odstępami jest uprawa roślin bezpośrednio z nasion w ustrukturyzowanym środowisku, które może być również wykorzystywane do kontrolowanego traktowania i obrazowania korzeni siewek z wysoką rozdzielczością. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu biologii roślin, takie jak sposób, w jaki wzrost korzeni roślin reaguje na sygnały fizyczne i chemiczne w wielu skalach długości. Główną zaletą tej platformy jest to, że korzenie są ograniczone do jednej płaszczyzny, co umożliwia ich traktowanie i obrazowanie bez utraty ostrości optycznej.W dzisiejszych pracach pomóc mi będzie dr Sahar Hasim, profesor adiunkt na University of Tennessee. Na początek należy wylać PDMS i czynnik sieciujący w stosunku 10:1 na wstępnie przygotowany i selenizowany wzorzec krzemowy. Odgazuj PDMS w komorze próżniowej, a następnie utwardź polimer w piecu w temperaturze 70 °C przez jedną godzinę.Następnie za pomocą skalpela wyciąć urządzenia z PDMS i oddzielić je od formy matki. Następnie użyć wycinaka do biopsji o średnicy 1,5 mm, aby przebić wlot dla nasion pod kątem 45 stopni, co ma stymulować wzrost korzeni do głównego kanału. Ten sam wycinak należy wykorzystać do udrożnienia wlotów dla czynników traktujących.Użyj taśmy klejącej, aby usunąć wszelkie zanieczyszczenia z urządzenia, a następnie połóż je stroną projektu do dołu na szkiełku podstawowym. Po złożeniu wysterylizuj urządzenia w autoklawie. Umieść nasiona Arabidopsis thaliana w probówce do mikrocentryfugi i dodaj mieszaninę wybielacza i detergentu, aby wysterylizować nasiona.Następnie nasiona należy przemyć czterokrotnie sterylną wodą. W kolejnym kroku nasiona należy stratyfikować, przechowując je przez noc w probówce do wirówki w lodówce lub przechowywać do jednego tygodnia w temperaturze 4 °C. Przed użyciem sterylnych urządzeń należy umieścić je w komorze do odpowietrzania próżniowego, aby usunąć powietrze z przepuszczalnego dla gazów PDMS oraz kanałów płynowych.Poprawi to późniejsze napełnianie urządzeń. Wyjmij urządzenia z komory próżniowej i natychmiast zanurz je w szalce Petri wypełnionej podłożem roślinnym o jedną czwartą standardowego stężenia, przy pH 5,7. Za pomocą pipety zaciągnij ciecz przez wloty, aby napełnić urządzenie.Przed przeniesieniem do oddzielnych, świeżych i suchych szalek Petri, należy sprawdzić wizualnie, czy w kanałach nie pozostały pęcherzyki powietrza. Następnie wlej gorący agar wokół urządzenia, aż poziom agaru będzie niemal zrównany z górną krawędzią urządzenia. W środowisku sterylnym, za pomocą małej pipety, przenieś jedno wysterylizowane nasiono do wlotu każdego urządzenia.Następnie przykryj każdą szalkę Petriego folią woskową i umieść je w komorze wzrostowej z cyklem dobowym (światło/ciemność) w temperaturze pokojowej. Ustaw szalki Petriego w komorze wzrostowej w temperaturze pokojowej pionowo, aby grawitacja stymulowała wzrost korzeni przez kanał. W wyznaczonym czasie, zależnie od stopnia rozwoju siewek, za pomocą pipety dodaj określoną ilość preparatu badawczego do każdego z ośmiu bocznych portów w urządzeniach.Po zakończeniu szczelnie zamknij szalki Petriego folią woskową. Następnie umieść je z powrotem w komorze inkubacyjnej. Ustaw powiększenie mikroskopu odwróconego w kontraście jasnego pola w zakresie od 4x do 20x.Umieść całą szalkę Petriego zawierającą urządzenie i siewkę pod mikroskopem w celu obrazowania w jasnym polu lub w kontraście interferencyjnym (DIC). Zoptymalizuj warunki oświetlenia, regulując czasy ekspozycji, jasność lampy, aperturę oraz polaryzację światła, aby uwidocznić interesujące cechy morfologiczne. Następnie przesuń stolik do pożądanego obszaru korzenia i ustaw ostrość na wybrany korzeń lub włośnik korzeniowy.Należy wykonać pojedyncze ujęcie lub serię obrazów w czasie, aby zwizualizować wzrost włośników korzeniowych. W przypadku serii czasowej obrazy rosnących włośników należy rejestrować raz na minutę. Aby zwizualizować wzrost korzenia głównego, należy wykonać jeden obraz co 30 minut.Po zakończeniu należy przenieść szalkę Petriego wraz z siewkami z powrotem do komory wzrostowej, ustawiając je w pozycji pionowej. Po tym, jak siewka wzrośnie przez pożądany czas, należy za pomocą pęsety usunąć szkiełko nakrywkowe oraz urządzenie z agaru. Następnie należy zwilżyć chusteczkę laboratoryjną etanolem i oczyścić nią spód szkiełka nakrywkowego.Nanieś odpowiedni olej na obiektyw imersyjny 63x i umieść szkiełko nakrywkowe na stoliku mikroskopu. Następnie podnieś stolik, aż zetknie się on z medium imersyjnym na obiektywie. Zoptymalizuj warunki oświetlenia, regulując czas ekspozycji, jasność lampy, aperturę oraz polaryzację światła.Następnie przesuń stoлик do pożądanego obszaru korzenia i ustaw ostrość na interesujące nas włośniki korzeniowe. Aby ilościowo określić wzrost włośników korzeniowych w czasie, skonfiguruj oprogramowanie tak, aby rejestrowało jeden obraz na minutę w wybranym miejscu. W celu wizualizacji autofluorescencji roślin lub markerów fluorescencyjnych zminimalizuj czas ekspozycji na fluorescencję, zachowując jednocześnie możliwy do zidentyfikowania sygnał fluorescencyjny.Należy pozyskać obrazy organelli tak szybko, jak pozwoli na to czas ekspozycji. Po tym, jak siewka urosła przez pożądany czas, należy wyjąć urządzenie oraz szkiełko nakrywkowe z szalki Petriego. Następnie należy obrócić urządzenie do góry dnem i delikatnie oddzielić szkiełko nakrywkowe w taki sposób, aby korzeń pozostał w kanale PDMS.Umieść urządzenie z PDMS na płaskim, refleksyjnym podłożu, na przykład pokrytym cienką warstwą złota, a następnie zamocuj urządzenie w uchwycie na próbki AFM, stroną z korzeniem do góry. Po zamocowaniu na górze urządzenia z PDMS przystawki w postaci studzienki z cieczą, napełnij ją wodą, aby utrzymać nawilżenie korzeni podczas obrazowania. Po załadowaniu próbki do AFM dostosuj kontrolę osi z do grubości urządzenia z PDMS i przesuń wspornik (cantilever) do obszaru korzenia będącego przedmiotem zainteresowania.Kierując się obrazem z kamery, wyrównaj laser z końcówką wspornika i zastosuj obrazowanie w trybie kontaktowym, aby podczas skanowania wywierać minimalną siłę na korzeń. Powoli opuszczaj mechanizm skanujący, aż wspornik będzie stykał się z próbką. Następnie dostosuj rozmiar skanowania dla wybranego obszaru i wybierz prędkość skanowania wynoszącą jedna linia na sekundę przy 256 punktach napięcia na linię.Na koniec wykonaj skan. Opisane tutaj dwuwarstwowe urządzenia mikroprzepływowe z PDMS posiadają kanał środkowy o wysokości 200 µm dla głównego korzenia Arabidopsis oraz dwie boczne komory o wysokości 20 µm, które ograniczają rozrost bocznych włośników korzeniowych. Zapewnia to, że włośniki korzeniowe znajdują się w tej samej płaszczyźnie obrazowania co główny korzeń.W ramach platformy mikrofluidycznej można dokonać ilościowej oceny włośników korzeniowych na poziomie komórkowym, pod kątem ich długości, gęstości oraz kąta wzrostu względem korzenia. Jedną z największych zalet zastosowania platformy mikrofluidycznej jest możliwość jednorodnego dodawania precyzyjnych stężeń substancji chemicznych do organizmów. Poniżej przedstawiono obraz siewki przed i po dodaniu fluorescencyjnych karboksylowanych kuleczek polistyrenowych.Zastosowanie tej obróbki abiotycznej nie zaburzyło orientacji ogniska optycznego włosków korzeniowych siewek. Dzięki zastosowaniu markerów fluorescencyjnych można zaobserwować streaming cytoplazmatyczny w włosku korzeniowym. Ruch tych trzech organelli przedstawiono na tym wykresie rozkładu skumulowanego.Oprócz obrazowania optycznego, platforma ta umożliwia również obrazowanie AFM i SEM dzięki możliwości jej demontażu bez naruszania korzenia. Po wykonaniu tej procedury można zastosować inne metody, w tym obrazowanie chemiczne, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak wygląd profilu chemicznego wokół korzenia.

imaging-root-hair-morphology-arabidopsis-seedlings-two-layer

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Opisujemy zastosowanie perfluorodekaliny jako infiltracyjnego medium montażowego. Jest to prosta metoda poprawiająca głębokość obrazowania w tkance liścia Arabidopsis thaliana przy minimalnym wpływie fizjologicznym.

Prosta metoda obrazowania liści Arabidopsis z wykorzystaniem perfluorodekaliny jako infiltrującego medium obrazującego

Niniejszy artykuł przedstawia protokół hodowli siewek Arabidopsis w RootChip, mikrofluidycznej platformie obrazowania, która łączy zautomatyzowaną kontrolę warunków wzrostu z mikroskopijnym monitorowaniem korzeni oraz pomiarem wewnątrzkomórkowych poziomów metabolitów w oparciu o technikę FRET.

Obrazowanie fluorescencyjne w czasie rzeczywistym wzrostu korzeni Arabidopsis z szybką manipulacją środowiskiem korzenia przy użyciu urządzenia RootChip

Opisujemy protokół z wykorzystaniem szkiełek z komorami oraz pośrodków do unieruchamiania liści zasadniczych roślin w celu obrazowania konfokalnego epidermy przez kilka dni rozwoju, co pozwala na dokumentowanie różnicowania szparek. Białka znakowane fluoroforami mogą być śledzone dynamicznie poprzez analizę ich ekspresji i lokalizacji subkomórkowej, co zwiększa zrozumienie ich potencjalnych ról podczas podziału komórek i różnicowania typów komórek.

Długoterminowe obrazowanie poklatkowe wysokiej rozdzielczości konfokalne epidermy zawilżnych liści przeciwstawnych Arabidopsis podczas kiełkowania

Ten protokół opisuje proces szybkiego zbierania obrazów sadzonek rzodkiewnika reagujących na bodziec grawitacyjny za pomocą dostępnych na rynku skanerów płaskich.  Metoda ta pozwala na niedrogie, wysokonakładowe przechwytywanie obrazów o wysokiej rozdzielczości, które można poddać dalszym algorytmom analizy.

Używanie skanerów płaskich do zbierania poklatkowych obrazów o wysokiej rozdzielczości odpowiedzi grawitropowej korzenia rzodkiewnika

Ca2+ reguluje różnorodne procesy biologiczne w roślinach. W tym miejscu przedstawiamy podejścia do monitorowania przestrzennych i czasowych sygnałów Ca2 + wywołanych stresem abiotycznym w komórkach i tkankach rzodkiewnika przy użyciu genetycznie kodowanych wskaźników Ca2 + Aequorin lub Case12.

Pomiar przestrzennych i czasowych sygnałów Ca2+ u rzodkiewnika

Ten protokół pokazuje metodę przygotowania próbek roślinnych do mikroskopii świetlnej. Konfiguracja charakteryzuje się zamontowaniem rośliny pionowo na powierzchni żelu i pozwoleniem jej rosnąć w kontrolowanych jasnych warunkach. Pozwala to na długotrwałą obserwację rozwoju organów roślinnych w znormalizowanych warunkach.

Mikroskopia fluorescencyjna arkusza świetlnego korzeni roślin rosnących na powierzchni żelu

Obrazowanie konfokalne na żywo dostarcza biologom potężnego narzędzia do badania rozwoju. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół obrazowania konfokalnego na żywo rozwijających się kwiatów rzodkiewnika.

Obrazowanie konfokalne na żywo rozwijających się kwiatów rzodkiewnika

Przedstawiona tutaj jest prosta technika konfokalnego obrazowania poklatkowego o wysokiej rozdzielczości rozwoju korzeni i hipokotylu przez okres do 3 dni przy użyciu obiektywów o dużej aperturze numerycznej i perfluorodekaliny jako medium immersyjnego.

Prosta komora do długoterminowego obrazowania konfokalnego rozwoju korzeni i hipokotylu

Opisujemy metodę badania zdolności komórek roślinnych rosnących na wierzchołkach, w tym łagiewek pyłkowych, włośników i protonematy mchu, do wydłużania się przez ekstremalnie wąskie szczeliny (~1 μm) w urządzeniu mikroprzepływowym.

Opracowanie urządzeń mikroprzepływowych do badania zdolności wydłużania komórek roślinnych rosnących wierzchołkowo w ekstremalnie małych przestrzeniach

Tutaj dostarczamy chip mikroprzepływowy i automatycznie sterowany, wysoce wydajny system mikroprzepływowy krążenia, który podsumowuje początkowe mikrośrodowisko neowaskularyzacji, umożliwiając stymulację komórek śródbłonka (EC) przez wysokie naprężenie ścinające światło, fizjologiczny poziom przepływu przezśródbłonkowego i rozkład różnych czynników wzrostu śródbłonka naczyniowego (VEGF) jednocześnie.

Model mikroprzepływowy naśladujący początkowe zdarzenie neowaskularyzacji

Protokół wgłębień mikroskopii sił atomowych oferuje możliwość przeanalizowania roli fizycznych właściwości ściany komórkowej konkretnej komórki tkanki lub organu podczas normalnego lub ograniczonego wzrostu (tj. przy niedoborze wody).

Mikroskopia sił atomowych w celu zbadania właściwości fizycznych komórek naskórka żywych korzeni rzodkiewnika

Poznaj metodę mikroprzepływową do hodowli siewek Arabidopsis thaliana z wysokorozdzielczym obrazowaniem morfologii korzeni. Platforma PDMS umożliwia kontrolowane badanie reakcji korzeni na czynniki fizyczne i chemiczne.

Obrazowanie morfologii włośnika siewek rzodkiewnika w dwuwarstwowej platformie mikroprzepływowej

Przeglądaj więcej filmów