Model hodowli komórkowej tętnic opornych

Ogólnym celem tej techniki jest hodowla komórek śródbłonka i mięśni gładkich razem in vitro w celu stworzenia połączeń mięśniowo-śródbłonkowych, które występują w tętnicach oporowych o małej średnicy. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie układu sercowo-naczyniowego, takie jak lokalizacja białek i aktywacja kaskad sygnałowych w ścianie tętnicy. Główną zaletą tej techniki jest to, że można specyficznie wyizolować frakcje połączenia mięśniowo-śródbłonkowego ze śródbłonka i mięśni gładkich, co jest niemożliwe do zrobienia przy użyciu prawdziwej tętnicy.

Wizualna demonstracja zatapiania parafiny jest szczególnie ważna, ponieważ etapy zatapiania mogą być trudne do nauczenia się bez zobaczenia procesu. Rozpocznij budowę kokultury komórek naczyniowych lub VCCC, spryskając 150-milimetrowe szalki Petriego i pokrywki środkiem dezynfekującym, a następnie przecierając ręcznikiem papierowym lub niestrzępiącymi się chusteczkami. Następnie spryskaj szalki Petriego 70% etanolem i umieść je w okapie do wyschnięcia na powietrzu.

Otwórz płytkę wkładów filtracyjnych w sterylnych warunkach. Pokryj dolną stronę filtrów roztworem fiberaktyny, pipetując do jednego mililitra roztworu fiberaktyny przez boczne szczeliny do dolnej części płytki. Upewnij się, że dolna połowa filtra jest zakryta i pozostaw wkłady w okapie, zachowując pokrywę płyty.

Po 30 minutach leczenia roztworem fiberaction, odkurz nadmiar roztworu, nie naruszając wkładów filtracyjnych. Następnie odwróć płytkę, umieszczając filtry w dolnej połowie czystej szalki Petriego. Trypsynizuj kolbę o powierzchni 225 centymetrów kwadratowych komórek mięśni gładkich trzema mililitrami wstępnie podgrzanego roztworu trypsyny EDTA.

Gdy komórki oderwą się, dodaj dziewięć mililitrów pożywki SMC, aby zneutralizować trypsynę. Przełóż do stożkowej rurki i dobrze wymieszaj. Następnie odpipetuj 10 mikrolitrów na hemocytometr, aby określić liczbę komórek.

Po wykonaniu zliczania komórek ostrożnie umieść 750 mikrolitrów zawiesiny komórkowej zawierającej około 75 000 komórek mięśni gładkich na dolnej stronie każdego filtra. Inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc. Drugiego dnia napełnij każdą studzienkę czystej płytki sześciodołkowej dwoma mililitrami świeżego, wstępnie podgrzanego podłoża SMC.

Wyjmij pożywkę z wkładu przez odsysanie i przenieś ją na płytkę sześciodołkową z podłożem SMC. Dodaj jeden mililitr 0,5% roztworu żelatyny wołowej do górnej części wkładek i umieść w temperaturze 37 stopni Celsjusza na co najmniej 30 minut. Trypsynizować kolbę komórek śródbłonka o powierzchni 225 centymetrów kwadratowych trzema mililitrami wstępnie podgrzanego roztworu trypsyny EDTA.

Z delikatnym stuknięciem kolby, aby podnieść komórki z płytki. Po ponownym zawieszeniu komórek w pożywce EC i wykonaniu zliczenia komórek, należy usunąć żelatynę z filtra. Następnie umieść 360 000 EC w objętości jednego mililitra na górnej stronie każdego wkładu filtracyjnego.

Pozwól komórkom inkubować bez przeszkód w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 24 godziny. Frakcjonowanie należy rozpocząć od odessania pożywki z jednej sześciodołkowej płytki z wkładkami do hodowli komórkowych, a następnie przetransportować do chłodni na lodzie. W komorze chłodniczej odpipetować 10 mikrolitrów PBS na stronę SMC wkładów.

Użyj podnośnika ogniw, aby zeskrobać SMC. Następnie przenieś komórki ze skrobaka na oznakowaną szalkę Petriego zawierającą bufor do lizy. Gdy skrobak do komórek dotknie buforu do lizy, nie pozwól, aby dotknął wkładu filtra, dopóki nie zostanie całkowicie wytarty i wysuszony na ręcznikach papierowych.

Powtórz złomowanie filtra SMC jeszcze raz lub dwa razy, aby całkowicie usunąć pozostałe resztki ogniw SMC. Następnie odpipetować 10 mikrolitrów PBS na stronę komórek śródbłonka filtra wkładowego. Zeskrob komórki na odpowiednio oznakowaną szalkę Petriego buforu do lizy, jak właśnie pokazano.

Zebrać zawiesinę komórkową z filtra po stronie EC za pomocą pipety i przenieść na odpowiednio oznakowaną szalkę Petriego. Bądź bardzo dokładny w usuwaniu komórek z obu stron filtrów, aby zapewnić minimalne zanieczyszczenie komórek we frakcji połączenia mięśniowo-śródbłonkowego. Następnie ostrożnie użyj skalpela, aby wyciąć filtry z plastikowej wkładki.

Zrób to, odcinając od 70 do 80% z tworzywa sztucznego i używając kleszczy, aby całkowicie ściągnąć filtr z plastikowej struktury wkładu. Skieruj każdy filtr do oznakowanej stożkowej rurki o pojemności 50 mililitrów zawierającej bufor do lizy. Upewnij się, że filtry są zanurzone w buforze i pozostają mokre.

Po pobraniu wszystkich komórek z filtrów, wiruj 50-mililitrową probówkę MEJ na pełnej mocy przez 15 sekund lub do momentu, gdy dobrze się wymieszają. Wyjmij filtry ze stożka MEJ za pomocą kleszczyków, przeciągając je wzdłuż bocznych ścianek probówki, aby pozostawić maksymalną ilość białek i płynów w probówce. Po wyjęciu wszystkich filtrów ze stożkowej rurki MEJ wykonaj szybkie wirowanie w wirówce, aby wyciągnąć całą ciecz i białka na dno probówki.

Po odwirowaniu przenieść zawartość probówki MEJ oraz szalek Petriego SMC i EC do oddzielnych mniejszych probówek wirówkowych. Następnie odwirować probówki o sile blisko 16 000 x G przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Usunąć supernatanty.

Następnie otrzymuj lizy komórek pod kątem zawartości białka za pomocą testu bicynkonowego. W piątym dniu inkubacji VCCC dodać 4% PFA do każdej studzienki zawierającej przepłukany wkład filtracyjny i inkubować przez noc, wstrząsając w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po około 24 godzinach przenieś wkładki do 70% etanolu na co najmniej 24 godziny.

Przetwarzaj filtry przez długi czas na automatycznym procesorze tkanek. Po zakończeniu pracy wyjmij filtr z kasety za pomocą kleszczy, aby przytrzymać filtr za krawędź, a następnie przetnij filtr na pół nożyczkami. Połóż każdą z dwóch połówek na zimnym talerzu i napełnij formę do zatapiania płynną parafiną.

Bardzo krótko przyłóż wypełnioną formę do zatapiania do zimnej płyty, a następnie zanurz każdą połówkę filtra w formie do zatapiania ściętą stroną do dołu, aby upewnić się, że filtr jest podzielony od środka. Użyj kleszczyków, aby przytrzymać filtr na miejscu, aby zapobiec wpadaniu połówek na siebie, dopóki parafina nie ostygnie na tyle, aby mogły stać samodzielnie. Następnie przenieś formę do zatapiania na zimną płytę, aż do całkowitego zestalenia.

Osadź i podziel filtrowaną wkładkę na sekcje w orientacji pionowej. Po przecięciu VCCC można wybarwić immunologicznie w celu immunofluorescencji poprzecznej. Ten obraz z mikroskopu elektronowego immunotransmisji pokazuje tętnicę myszy z ekspresją alfa globiny w MEJ oznaczoną złotymi koralikami, które pojawiają się jako czarne kropki.

Ten western blot pokazuje, że jedna ekspresja inhibitora aktywatora plazminogenu jest wzbogacona we frakcję MEJ w porównaniu z frakcjami EC lub SMC. Plastikowe EC oznacza EC wyhodowane na plastikowym naczyniu, które nie tworzą MEJ. Barwienie immunologiczne ujawnia ścisłą kompartmentalizację modelu VCCC.

Receptor adrenergiczny alfa-1 jest widoczny tylko w warstwie komórek mięśni gładkich, receptor bradykininy jest widoczny tylko w warstwie komórek śródbłonka. Barwienie aktyną F występuje w obu typach komórek w MEJ in vitro, jak wskazuje biała strzałka. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, aby wszystko było sterylne do czasu zbiorów, ostrożnie pokryć komórki płytkami i dokładnie zeskrobać filtry.

Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak western blotting lub immunofluorescencja, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak lokalizacja białka, poziomy ekspresji lub aktywacja.