Name: Modelowanie toksyczności i neurodegeneracji amyloidu-β42 w mózgu dorosłego danio pręgowanego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-25T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 1 s
Description: Poznaj modelowanie toksyczności amyloidu-β42 w mózgu dorosłego Danio rerio. Ta metoda pozwala badać wpływ toksyczności amyloidu na komórki macierzyste nerwowe i mechanizmy odmładzania w chorobie Alzheimera.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ta praca była wspierana przez DZNE i Stowarzyszenie Helmholtza (VH-NG-1021), CRTD, TU Dresden (FZ-111, 043_261518) i DFG (KI1524/6) (C.K.); oraz przez Stowarzyszenie Leibniza (SAW-2011-IPF-2) i BMBF (BioLithoMorphie 03Z2E512) (Y.Z.). Chcielibyśmy również podziękować Ulrike Hofmann za syntezę peptydów oraz Nandini Asokan, Prayag Murawala i Elly Tanaka za pomoc podczas filmowania zabiegu.

Ten protokół jest standardową procedurą sugerowaną przez wytyczne UE (2010/63) oraz Europejskie Towarzystwo Modeli Ryb w Biologii i Medycynie (EuFishBioMed) w Karlsruhe Insitute of Technology (KIT). Wszystkie opisane poniżej metody zostały zatwierdzone przez komisję etyki (Landesdirektion Dresden; dokument nr TVV-52/2015).
1. Przygotowanie peptydu Aβ42
<ol>
	<li>Zsyntetyzować peptydy (patrz Tabela 1) przy użyciu standardowej chemii 9-fluorenylometoksykarbonylowej (Fmoc) z 2-(1H-benzotriazolo-1-ylem)-1,1,3,3-tetramethyluronoiumhexafluorphosphat (HBTU) jako odczynnikiem sprzęgającym na zautomatyzowanym syntezatorze peptydów w fazie stałej52. Skala syntezy wynosiła 100 μmol.</li>
	<li>Załaduj do automatycznego syntezatora peptydów 500 mg żywicy chronionej Fmoc jako fazę stałą (zdolność ładowania 0,2 mmol/g). Załadować rozpuszczone aminokwasy chronione Fmoc w stężeniu 0,5 M w wymaganej objętości i obliczonej dla odpowiedniego syntezatora. 
	UWAGA: Obliczenia są wykonane tak, aby umożliwić dwukrotne sprzężenie każdego aminokwasu chronionego przez Fmoc z 5-krotnym nadmiarem każdego elementu budulcowego do żywicy47.</li>
	<li>Rozpuścić odczynniki wymagane do syntezy peptydów w dimethlyformamide (DMF). Na przykład należy przygotować aktywator HBTU o stężeniu 0,48 M, 45% v/v N-metylomorfoliny (NMM) (zasada) i 5% v/v bezwodnik octowy (mieszanina zamykająca), aby przykryć nieprzereagowane grupy aminowe.</li>
	<li>Rozszczepić wszystkie peptydy z żywicy, mieszając w sposób ciągły stałe podłoże za pomocą mieszadła w świeżo przygotowanej mieszaninie rozszczepienia składającej się z kwasu trifluorooctowego (TFA): Triizopropylosilian (TIS): woda: Ditiotreitol (DTT) w 90 (v/v): 5 (v/v): 2,5 (v/v): 2,5 (m / v), przez 4 godziny. Użyj 10 ml dla skali syntezy 100 μmol.</li>
	<li>Wytrącić rozszczepiony produkt, dodając mieszaninę rozszczepienia do 100 ml lodowatego eteru dietylowego. Przepuścić przez jednostkę filtracyjną zawierającą filtr z politetrafluoroetylenu (PTFE) o wielkości porów 0,45 μm i przemyć 20 ml lodowatego eteru dietylowego.</li>
	<li>Zebrać przefiltrowany peptyd z bibuły filtracyjnej i rozpuścić 100 mg wytrąconego peptydu w 5 ml destylowanej wody dejonizowanej: acetonitryl w stosunku 1:1.</li>
	<li>Oczyszczać za pomocą wysokociśnieniowej chromatografii cieczowej (HPLC) z odwróconymi fazami na półpreparatywnej HPLC wyposażonej w porowatą kolumnę polistyrenową diwinylobenzenu o wielkości kulki 10 μm.
	<ol>
		<li>Wstępnie podgrzać kolumnę i utrzymywać w temperaturze 50 °C za pomocą urządzenia grzewczego kolumny. Zebrać wszystkie główne frakcje za pomocą automatycznego kolektora frakcji, stosując gradient od 5% do 100% rozpuszczalnika B przez 25 minut przy 4 ml/min. 
		UWAGA: Rozpuszczalnik A to 0,1% TFA w wodzie, a rozpuszczalnik B to 0,1% TFA w acetonitrylu52.</li>
		<li>Monitorować chromatogram przy długości fali 220 nm, zebrać odpowiednie piki i przeprowadzić analizę za pomocą LC-MS.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Potwierdzić czystość za pomocą analitycznej ultrawysokociśnieniowej chromatografii cieczowej (UPLC) z odwróconymi fazami przy długości fali 220 nm, monitorując za pomocą detektora UV, przepuszczając próbkę przez analityczną kolumnę C18 (wielkość kulki 1,7 μm). Potwierdzić produkt peptydowy za pomocą spektrometrii mas. 
	UWAGA: UPLC jest sprzężony ze spektrometrią mas z jonizacją elektrorozpylania (ESI-MS) i tandemowym detektorem kwadrupolowym.</li>
	<li>Liofilizuj odpowiednie frakcje pożądanego peptydu w kolbie okrągłodennej, stosując próżnię 0,052 mbar do puszystego proszku. Podłączyć pompę próżniową do urządzenia zamrażającego utrzymywanego w temperaturze -78 °C. Przechowywać w temperaturze -80 °C, przez czas nieokreślony.</li>
	<li>Użyć liofilizowanego peptydu do przygotowania roztworu podstawowego 1 mM w mieszaninie acetonitrylu: DMF: woda o czystości analitycznej w stosunku 1:1:1 do eksperymentów. Roztwór ten można przechowywać przez co najmniej 6 miesięcy, ponieważ peptydy nie agregują się w tym roztworze.</li>
</ol>
2. Przygotowanie mieszaniny iniekcyjnej
<ol>
	<li>Przygotować sól fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, pH 7,4) do rozcieńczenia liofilizowanych peptydów.</li>
	<li>Rozpuścić peptyd do końcowego stężenia 20 μM w PBS. Przygotuj ten roztwór na świeżo. Dobrze wymieszać i przechowywać na lodzie do momentu wstrzyknięcia. Nie należy przekraczać 30 minut, aby zapobiec agregacji w roztworze.</li>
</ol>
3. Znieczulenie
<ol>
	<li>Przygotować roztwór podstawowy środków znieczulających, 0,1% metanosulfonianu etylu m-aminobenzoesanu (MESAB), w zwykłej wodzie dla ryb z układu krążenia. Przygotować roztwór znieczulający do końcowego stężenia 0,0025% (v/v).</li>
	<li>Wyjmij żądaną liczbę ryb z ich zbiorników do pojemnika transportowego z 5 litrami wody systemowej.</li>
	<li>Napełnij do połowy plastikową szalkę Petriego (90 mm) 40 ml środków znieczulających. Używaj tego naczynia do wstrzykiwań.</li>
	<li>Inkubować ryby w środkach znieczulających, aż ruch operkularny ustanie.</li>
</ol>
4. Mikroiniekcja komorowa mózgu
<ol>
	<li>Przygotowanie aparatu iniekcyjnego
	<ol>
		<li>Przygotować szklane kapilary iniekcyjne za pomocą ściągacza igłowego o następujących parametrach: cykl nagrzewania, 537; cykl ciągnięcia, 250; prędkość, 1,5 s; czas, 80 ms.</li>
		<li>Ustaw ciśnienie w źródle ciśnienia na 25 psi.</li>
		<li>Ustaw parametry mikrowtryskiwacza na następujące: ciśnienie podtrzymania 20 psi; ciśnienie wyrzutu 10 psi; wartość okresu 2,5; wartość bramkowania 100 ms.</li>
		<li>Napełnić szklaną kapilarnę roztworem do wstrzykiwań. Włożyć szklaną kapilę do uchwytu do mikroiniekcji. Ustaw kąt wtrysku na 45°. 
		UWAGA: Bardziej szczegółowe protokoły można znaleźć zgodnie z opisem w references27,46.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umieścić jedną rybę na nowej szalce Petriego wypełnionej roztworem znieczulającym (jak w kroku 3.3).</li>
	<li>Chwyć rybę kleszczami i ustaw się do wstrzyknięcia.</li>
	<li>Za pomocą końcówki igły 30 G należy wykonać szczelinę w czaszce nad powierzchnią nerwu wzrokowego, w miejscu, w którym spotykają się dwie boczne płytki. Nie wkładaj końcówki do tkanki mózgowej, może to spowodować krwawienie i uszkodzenie. Zobacz referencje27,45,46, aby uzyskać więcej informacji.</li>
	<li>Włóż szklaną kapilarnę do szczeliny.
	<ol>
		<li>Używać tylko końcówki igły i nie przebijać czaszki na więcej niż 1 mm. Trzymaj rybę i włóż końcówkę szklanej kapilary przez miejsce nacięcia.</li>
		<li>Ustaw końcówkę szklanej kapilary w kierunku kresomózgowia pod kątem 45°. Wstrzyknąć 1 μl roztworu. Ciecz rozprasza się natychmiast po wstrzyknięciu.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Odzyskiwanie
<ol>
	<li>Umieść rybę z powrotem w pojemniku transportowym, aż wyzdrowieje. Podłącz pojemnik do regularnie krążącej wody dla ryb, aby zapewnić optymalną jakość wody. 
	UWAGA: Rekonwalescencja powinna zwykle trwać 1 minutę. Jeśli trwa to dłużej, ryba musi być trzymana w znieczuleniu przez krótszy czas (musi to być zoptymalizowane przez eksperymentatora).</li>
</ol>
6. Przygotowanie tkanek i ich sekcjonowanie
<ol>
	<li>Odczekaj żądany okres czasu przed złożeniem ryby w ofierze. 
	UWAGA: To zależy od pytania eksperymentalnego. Odkładanie się amyloidu można zauważyć już po 1 dniu od wstrzyknięcia.</li>
	<li>Rybę należy złożyć w ofierze przy użyciu odpowiedniej metody w zależności od przepisów etycznych (np. rybę należy potraktować 0,1 M MESAB).</li>
	<li>Rozetnij czaszkę powyżej tektum wzrokowego za pomocą spiczastego kleszcza po stronie grzbietowej i rozetnij głowę tuż za płetwą piersiową za pomocą skalpela.</li>
	<li>Utrwalić głowice za pomocą 2% paraformaldehydu (PFA) przez noc w temperaturze 4 °C. Użyj 3 ml PFA na głowę w plastikowej tubie z zakręcaną pokrywką. 
	UWAGA: Podczas obchodzenia się z PFA należy nosić odpowiednie środki ochrony osobistej.</li>
	<li>W celu krioprotekcji i odwapnienia umyj głowy trzykrotnie w 0,1 M buforze fosforanowym (pH 7,4), a następnie przenieś je do 20% roztworu sacharozy/20% etylenodiaminotetraoctu (EDTA) i inkubuj przez noc w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Aby zatopić tkankę w żywicy sekcyjnej, zamroź główki w 7,5% roztworze żelatyny/20% sacharozy w plastikowych formach histologicznych na suchym lodzie (około 3-5 minut w celu zamrożenia bloku). Przechowywać próbki w temperaturze -80 °C lub przejść do następnego etapu (kriosekcji).</li>
	<li>Podziel głowy na kriosekcje o grubości 12 μm za pomocą kriostatu zgodnie z opisem28,42. Kriosekcje należy przenieść bezpośrednio na szkiełka podstawowe i przechowywać w temperaturze -20 °C do długotrwałego stosowania.</li>
</ol>
7. Barwienie immunohistochemiczne i mikroskopia
UWAGA: Wykonaj wszystkie etapy inkubacji w wilgotnej komorze. Wszystkie etapy prania trwają 10 minut każdy.
<ol>
	<li>Suszyć sekcje przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Po rozmrożeniu skrawki umyć dwukrotnie w PBS i raz w PBSTx (PBS z 0,03% Triton-X-100).</li>
	<li>Inkubować z przeciwciałem pierwszorzędowym (przeciwciało anty-Aβ42; rozcieńczenie 1:500 w PBSTx) w temperaturze 4 °C przez noc. Następnego dnia przemyć raz w PBS i dwa razy w PBSTx.</li>
	<li>Inkubować skrawki z przeciwciałem drugorzędowym (detekcja sprzężona z fluorescencją, rozcieńczenie 1:500) wraz z DAPI (1 μg/ml) w PBSTx przez 2 godziny w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Umyj trzy razy w PBSTx. Po końcowym umyciu zamontuj szkiełka z szkiełkiem nakrywkowym przy użyciu 100 μL 70% glicerolu.</li>
	<li>Uzyskiwanie obrazów fluorescencyjnych za pomocą mikroskopu konfokalnego (na przykład za pomocą obiektywu 20X PL APO N.A. 0,7 o zakresie wzbudzenia 488 i standardowym filtrze zielonym; <silna klasa="xfig">Rysunek 2)39.</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia

Peptydy amyloidowe mogą być modyfikowane tak, aby zawierały zmiany sekwencji lub różne znaczniki. Na przykład można wygenerować zaszyfrowany peptyd amyloidowy, a peptydy można znakować znacznikami fluorescencyjnymi na N-końcu końca peptydu lub znakować peptydami nośnikowymi39. Podobnie, w tym protokole, peptydem nośnikowym jest peptyd penetrujący komórki TR ze względu na jego skuteczność w transporcie ładunku w głąb tkanki mózgowej39. Dodatkowo nasza metoda pozwala na wstrz...

AD jest przewlekłą postępującą chorobą charakteryzującą się utratą neuronów i synaps w korze mózgowej1,2,3,4,5. Klasycznymi neuropatologicznymi cechami charakterystycznymi AD są odkładanie się peptydów amyloidowych i tworzenie się splątków neurofibrylarnych (NFT)6. Blaszki starcze, znane również jako blaszki amyloidowe, składają się z peptydów β amyloidu (Aβ), które tworzą β-plisowane struktury w miąższu mózgu5. Akumulacja Aβ42 u pacjentów z chorobą Alzheimera odgrywa wczesną i kluczową rolę w postępie choroby. AD uruchamia kaskadę zdarzeń prowadzących do dysfunkcji synaptycznych, upośledzenia plastyczności i utraty neuronów7,8,9,10.
Dorosły mózg danio pręgowanego teleost służy jako doskonały model do badania regulacji plastyczności komórek macierzystych11,12,13,14,15,16,17,18,19,20 i różne choroby ośrodkowego układu nerwowego (OUN), w tym AD21,22,23,24. Dzięki szerokiej gamie dostępnych metod eksperymentalnych19,20,25,26,27,28,29,30,31, badania te mają charakter informacyjny i są wykonalne. Danio pręgowany może uzupełnić CNS13,15,32,33,34,35,36,37,38, częściowo za pomocą programów molekularnych aktywowanych po utracie neuronów19, 39,40,41,42,43,44. W związku z tym stworzenie modelu choroby neurodegeneracyjnej u ryb danio pręgowanego może pomóc w rozwiązaniu nowych problemów dotyczących zdolności regeneracyjnych i biologii komórek macierzystych w mózgach kręgowców.
Ostatnio opracowaliśmy model toksyczności amyloidu w mózgu dorosłego danio pręgowanego, wstrzykując syntetyczne peptydy Aβ42 (Tabela 1)39. To wstrzyknięcie spowodowało fenotypy neurodegeneracji przypominające patologię ludzkiego mózgu (np. śmierć komórki, aktywacja mikrogleju, degeneracja synaps i deficyty pamięci), co wskazuje, że danio pręgowany może być używany do wywoływania neurodegeneracji w mózgu danio pręgowanego, peptydy Aβ42 można wykryć za pomocą barwień immunohistochemicznych, a molekularne mechanizmy regeneracji w OUN dorosłego danio pręgowanego można zidentyfikować39. W tym protokole demonstrujemy wstrzyknięcie syntetycznych peptydów amyloidowych do mózgu danio pręgowanego przy użyciu metody iniekcji komorowej mózgu (CVMI)27,39,45,46 w celu naśladowania osadzania się amyloidu (Rysunek 1). CVMI zapewnia nowatorski sposób dostarczania peptydów, które agregują się po wstrzyknięciu jako struktury β-arkuszowe i wywierają toksyczność. Peptydy są równomiernie rozmieszczone w mózgu, celując w obszar komorowy wzdłuż całej osi ogonowo-ogonowej45. Dodatkowo metoda ta pozwala na analizę morfologicznej i molekularnej odpowiedzi NSPC w mózgu dorosłego danio pręgowanego po inkluzjach amyloidu. Takie badania dostarczą nam informacji na temat skutecznej naprawy mózgu u ssaków. Nasza metoda może być wykorzystana do zrozumienia niezbędnego mechanizmu molekularnego skutecznej reakcji regeneracyjnej po objawach podobnych do choroby Alzheimera w celu wywołania uzupełnienia utraconych neuronów i powrotu do funkcjonowania.

<table><tbody><tr><td>Aminokwasy chronione Fmoc</td><td>IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Niemcy)</td><td></td><td>Aminokwasy na bazie Fmoc do syntezy peptydów w fazie stałej (SPPS)</td></tr><tr><td>N,N,N&prime;,N&prime;-tetrametylo-O-(1H-benzotriazol-1-ylo)uron heksafluorofosforan (HBTU)</td><td>IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Niemcy)</td><td>RL-1030</td><td>Aktywator</td></tr><tr><td>Oxyma</td><td>IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Niemcy)</td><td>RL-1180</td><td>Tłumik racemii</td></tr><tr><td>N,N-diizopropyloetyloamina</td><td>IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Niemcy)</td><td>SOL-003</td><td>Zasada</td></tr><tr><td>dimetyloformamidu</td><td>IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Niemcy)</td><td>SOL-004</td><td>Rozpuszczalnik</td></tr><tr><td>N-metylomorfolina</td><td>Thermo Fisher (Kandel) GmbH, Niemcy</td><td>A12158</td><td></td></tr><tr><td>Hydrat 1-hydroksybenzotriazolu (HOBT)</td><td>Sigma-Aldrich Co. LLC. ( St. Louis, MO, USA)</td><td>157260 ALDRICH</td><td>Aktywator</td></tr><tr><td>Piperydyna</td><td>MERCK KGaA (Darmstadt, Niemcy)</td><td>822299</td><td>Odczynnik deprotekcyjny Fmoc</td></tr><tr><td>Dichlormetan (DCM)</td><td>MERCK KGaA (Darmstadt, Niemcy)</td><td>106050</td><td>Rozpuszczalnik</td></tr><tr><td>Kwas mrówkowy (FA)</td><td>MERCK KGaA (Darmstadt, Niemcy)</td><td>100264</td><td>Składnik buforowy do HPLC</td></tr><tr><td>Kwas trifluorooctowy (TFA)</td><td>MERCK KGaA ( Darmstadt, Niemcy)</td><td>808260</td><td>Odczynnik do mieszaniny do przelewów</td></tr><tr><td>Triizopropylosilan (TIS)</td> <td>MERCK KGaA (Darmstadt, Niemcy)</td> <td>233781 ALDRICH</td><td>Odczynnik do mieszaniny kolców</td></tr><tr><td>Acetonitryl (do UPLC/LCMS)</td><td>Sigma-Aldrich Laborchemikalien GmbH</td><td>34967-1L</td><td>Rozpuszczalnik</td></tr><tr><td>Acetonitryl (do HPLC)</td><td>VWR International Ltd, Anglia</td><td>83639.320</td><td>Rozpuszczalnik</td></tr><tr><td>Dietyllether</td><td>VWR International Ltd, Anglia</td><td>23811.326</td><td>Rozpuszczalnik do wytrącania peptydów</td></tr><tr><td>Ditiotritol (DTT)</td><td>VWR International Ltd, Anglia</td><td>0281-25G</td><td>Odczynnik do mieszaniny kłębów</td></tr><tr><td>TentaGel S RAM Fmoc rink</td><td>żywica amidowa Rapp Polymere GmbH (Tuebingen, Niemcy)</td><td>S30023</td><td>Faza stała do</td></tr><tr><td>syntezy peptydów SPPS Strzykawki 5 ml z dołączonymi filtrami</td><td>Intavis AG (Kolonia, Niemcy)</td><td>34.274</td><td>Rurka reakcyjna do SPPS i do pakowania z filtra</td></tr> z <tr><td>politetrafluoroetylenu (PTFE)</td> w fazie stałej <td>Sartorius Stedtim (Aubagne, Francja)</td><td>11806-50-N</td><td>Filtracja wytrąconych peptydów</td></tr><tr><td>Filtr strzykawkowy z polifluorku winylidenu (PVDF)</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG Karlsruhe</td><td>KC78.1</td><td>Filtracja wstępna do</td></tr><tr><td>syntezatora peptydów</td> HPLC <td>Intavis, Kolonia, Niemcy</td><td>ResPep SL</td><td>Zautomatyzowany syntezator peptydów w fazie stałej</td></tr><tr><td>Water Alliance HPLC</td><td>Waters, Milford Massachusetts, USA</td><td>Waters 2998, Waters e2695</td><td>Półpreparatywna wysokociśnieniowa chromatografia cieczowa z odwróconymi fazami (HPLC)</td></tr><tr><td>PolymerX, wielkość kulek 10&mu; m, 250x10 mm</td><td>Phenomenex Ltd. Niemcy</td><td>00G-4328-N0</td><td>Porowata kolumna HPLC z polistyrenu diwinylobenzenu</td></tr><tr><td>Milli-Q Advantage A10, z filtrem Milli-Q</td><td>EMD Millipore Corporation, Billerica, MA, USA</td><td>LCPAK0001</td><td>System oczyszczania wody</td></tr><tr><td>Jednostka filtracyjna</td><td>Sartorius Stedtim (Aubagne, Francja)</td><td>16307</td><td>Jednostka filtracyjna do wytrącania peptydów</td></tr><tr><td>UPLC Aquity z detektorem</td> <td>UVWaters, Milford, Massachusetts, USA</td><td>M09UPA 664M</td><td>Analityczny ultra HPLC z odwróconą fazą do LC-MS</td></tr><tr><td>ACQUITY UPLC BEH C18, rozmiar koralików 1,7 i mu; m, 50x2.1 mm</td><td>Waters, Milford Massachusetts, Stany Zjednoczone</td><td>186002350</td><td>Kolumna analityczna C18</td></tr><tr><td>ACQUITY TQ Detector</td><td>Waters, Milford Massachusetts, Stany Zjednoczone</td><td>QBB908</td><td>Spektrometria mas z jonizacją elektrorozpylaną (ESI-MS)</td></tr><tr><td>CHRIST ALPHA 2-4 LD plus + vacuubrand RZ6</td><td>Martin Christ Gefriertrocknungsanlagen GmbH, Niemcy</td><td>16706, 101542</td><td>Liofilizator z pompą próżniową</td></tr><tr><td>Czytnik płytek Paradygmat</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MESAB (metanosulfonian etylo-m-aminobenzoesanu)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5040</td><td></td></tr><tr><td>Szalki</td><td>Petriego Sarstedt</td><td>821.472</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami</td><td>Life Technologies, GIBCO</td><td>10010-056</td><td></td></tr><tr><td>Igła</td><td>Becton-Dickinson</td><td>305178</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop preparacyjny</td><td>Olympus, Leica, Zeiss</td><td>różni się w zależności od producenta</td><td></td></tr><tr><td>Pęseta Dumont</td><td>World Precision Instruments</td><td>501985</td><td></td></tr><tr><td>Gillies Kleszcze preparacyjne</td><td>World Precision Instruments 501265</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Szklane kapilary iniekcyjne</td><td>World Precision Instruments</td><td>TWF10</td><td></td></tr><tr><td>PicoNozzle</td><td>World Precision Instruments</td><td>5430-12</td><td></td></tr><tr><td>Pneumatyczny PicoPump</td><td>World Precision Instruments</td><td>SYS-PV820</td><td></td></tr><tr><td>Oświetlacz pierścieniowy; Przewodnik po lampach pierścieniowych</td><td>Parkland Scientific</td><td>ILL-RLG</td><td></td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>Leica</td><td>CM1950</td><td></td></tr></tbody></table>

modelowanie toksyczności i neurodegeneracji amyloidu-β42 w mózgu dorosłego danio pręgowanego

Modeling Amyloid-&#946;42 Toxicity and Neurodegeneration in Adult Zebrafish Brain

Choroba Alzheimera (AD) jest wyniszczającą chorobą neurodegeneracyjną, w której nagromadzenie toksycznych peptydów amyloidu-β42 (Aβ42) prowadzi do degeneracji synaptycznej, stanów zapalnych, śmierci neuronów i deficytów w uczeniu się. Ludzie nie mogą zregenerować utraconych neuronów w przypadku choroby Alzheimera, częściowo z powodu upośledzonej zdolności proliferacyjnej nerwowych komórek macierzystych/progenitorowych (NSPC) i zmniejszonej neurogenezy. Dlatego skuteczne terapie regeneracyjne powinny również zwiększyć proliferację i zdolność neurogenną NSPC. Danio pręgowany (Danio rerio) jest organizmem regeneracyjnym i możemy nauczyć się podstawowych programów molekularnych, za pomocą których możemy zaprojektować podejścia terapeutyczne do walki z AD. Z tego powodu konieczne było wygenerowanie modelu podobnego do AD u danio pręgowanego. Korzystając z naszej metodologii, możemy wprowadzić syntetyczne pochodne peptydu Aβ42 ze zdolnością przenikania do tkanek do mózgu dorosłego danio pręgowanego i przeanalizować patologię choroby i odpowiedź regeneracyjną. Przewagą nad istniejącymi metodami lub modelami zwierzęcymi jest to, że danio pręgowany może nas nauczyć, w jaki sposób mózg kręgowców może się naturalnie regenerować, a tym samym pomóc nam lepiej leczyć ludzkie choroby neurodegeneracyjne poprzez celowanie w endogenne NSPC. W związku z tym model toksyczności amyloidu opracowany w mózgu dorosłego osobnika danio pręgowanego może otworzyć nowe możliwości badań w dziedzinie neuronauki i medycyny klinicznej. Dodatkowo, proste wykonanie tej metody pozwala na opłacalną i wydajną ocenę eksperymentalną. Manuskrypt ten opisuje syntezę i wstrzykiwanie peptydów Aβ42 do mózgu danio pręgowanego.

Do oczyszczania syntetycznego peptydu wykorzystano HPLC, a do charakterystyki oczyszczonych peptydów amyloidu β zastosowano spektrometrię mas. Kolumnę HPLC podgrzano do 50 °C, aby poprawić rozdzielczość peptydów Aβ, a następnie zebrano wszystkie frakcje. W celu zidentyfikowania prawidłowo zsyntetyzowanego peptydu przeprowadzono analizę spektrometrii mas dla wszystkich frakcji. Chromatogram UPLC obrazuje czystość związku. Frakcja HPLC, w której uzyskano jeden pik w UPLC (tzn. praw...

Ten protokół opisuje syntezę, charakterystykę i wstrzykiwanie monomerycznych peptydów amyloidu-β42 do generowania toksyczności amyloidu u dorosłych ryb pręgowanego w celu stworzenia modelu choroby Alzheimera, a następnie analizy histologiczne i wykrywanie agregacji.

Modelowanie toksyczności i neurodegeneracji amyloidu-β42 w mózgu dorosłego danio pręgowanego

Alzheimer's disease (AD) is a debilitating neurodegenerative disease in which accumulation of toxic amyloid-&#946;42 (A&#946;42) peptides leads to ...

Ogólnym celem tej metody jest synteza peptydów beta-amyloidu 42 i ich wstrzyknięcie do mózgu dorosłego danio pręgowanego w celu stworzenia konkretnego modelu dawek amyloidu, jakie występują w chorobie Alzheimera. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na istotne pytania z dziedziny neuronauki, takie jak wpływ toksyczności amyloidu na komórki macierzyste neuronów oraz sposoby wywoływania reakcji odmłodzenia w tak niekorzystnych warunkach. Głównymi zaletami tej techniki są jej powtarzalność oraz fakt, że uzyskiwane fenotypy w dużym stopniu przypominają chorobę Alzheimera w ludzkich mózgach.Zastosowania tej techniki rozciągają się na terapię choroby Alzheimera, ponieważ dostarcza ona naturalnego modelu kręgowca zdolnego do aktywacji komórek macierzystych neuronów w warunkach chorobowych; w związku z tym rybki danio-przełaj mogą wskazać sposób cofania procesów neurodegeneracji. Aby przygotować peptyd amyloidu beta 42, należy załadować do automatycznego syntezatora peptydów 500 mg żywicy chronionej grupą FMOC jako fazę stałą. Następnie należy załadować 0,5 M roztwór aminokwasów chronionych grupą FMOC w objętości obliczonej dla danego syntezatora.Użyj dimetyloformamidu (DMF) do rozpuszczenia

modeling-amyloid-42-toxicity-neurodegeneration-adult-zebrafish

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

W tym filmie zapłodnione zarodki danio pręgowanego są dechorionowane pod mikroskopem stereoskopowym, a następnie poddawane działaniu inhibitora syntezy cholesterolu, co prowadzi do rozwoju pęknięć naczyń krwionośnych i krwotoków mózgowych u larw. Larwy krwotoczne, rozpoznawalne po wyraźnych czerwonych plamach, są następnie oddzielane pod mikroskopem w celu dalszej analizy.

Modelowanie krwotoku wywołanego lekami u larw danio pręgowanego

Ten film demonstruje procedurę wstrzykiwania monomerycznych peptydów amyloidowych do przodomózgowia dorosłego danio pręgowanego w celu wytworzenia toksyczności amyloidu, naśladując uszkodzenia neuronów obserwowane w chorobie Alzheimera.

Ustalenie modelu choroby Alzheimera w mózgu danio pręgowanego poprzez wstrzyknięcie peptydu amyloidowego

Tutaj prezentujemy systematyczne podejście do opracowywania fizjologicznie istotnych, czułych i specyficznych testów in vivo do interpretacji zmienności w ludzkiej patologii. Przejściowa manipulacja genetyczna poprzez mikrowstrzyknięcie WT i zmutowanych ludzkich oligonukleotydów antysensownych mRNA i morfoliny (MO) wykorzystuje podatność rozwijającego się zarodka danio pręgowanego do szybkiego oznaczania mutacji patogennych, zwłaszcza, ale nie wyłącznie, w kontekście zaburzeń rozwojowych...

In vivo (in vivo) Modelowanie chorobliwego genomu ludzkiego przy użyciu Danio rerio

Ukierunkowane manipulacje mające na celu wywołanie ukierunkowanego stresu lub śmierci w poszczególnych komórkach były stosunkowo trudne do osiągnięcia. W tym artykule opisano metodę ablacji w rozdzielczości pojedynczej komórki, polegającą na selektywnym stresowaniu i zabijaniu pojedynczych komórek w hodowli komórkowej i żywych zwierzętach, w oparciu o standardowy konfokalny laser UV.

Wyzwalanie stresu i śmierci komórek za pomocą konwencjonalnej mikroskopii konfokalnej z laserem UV

Ta praca opisuje metody tworzenia modeli ostrej i przewlekłej hiperglikemii u danio pręgowanego. Celem jest zbadanie wpływu hiperglikemii na procesy fizjologiczne, takie jak neurogeneza konstytutywna i wywołana urazem. Praca podkreśla również wykorzystanie danio pręgowanego do śledzenia cząsteczek znakowanych radioaktywnie (tutaj, [18F]-FDG) za pomocą PET/CT.

Ostre i przewlekłe modele hiperglikemii u danio pręgowanego: metoda oceny wpływu hiperglikemii na neurogenezę i biodystrybucję cząsteczek znakowanych radioaktywnie

Prezentujemy komorę behawioralną przeznaczoną do oceny zdolności poznawczych. Przedstawiamy dane pokazujące, że raz zdobyty danio pręgowany pamięta zadanie 8 tygodni później. Pokazujemy również, że zegmunowany z hiperglikemią ma zmienioną wydajność poznawczą, co wskazuje, że ten paradygmat ma zastosowanie w badaniach oceniających funkcje poznawcze i pamięć.

Zadanie behawioralne trójkomorowego wyboru z wykorzystaniem danio pręgowanego jako systemu modelowego

Zmodyfikowaliśmy model spadku masy Marmarou dla dorosłego danio pręgowanego, aby zbadać szeroki zakres patologii po uszkodzeniu mózgu (TBI) i mechanizmy leżące u podstaw późniejszej regeneracji neuronów. Ten model TBI jest skalowalny, indukuje łagodne, umiarkowane lub ciężkie TBI i podsumowuje niejednorodność obrażeń obserwowaną u ludzi.

Skalowalny model do badania skutków obrażeń spowodowanych siłą u dorosłych danio pręgowanych

Uczenie się i pamięć są potężnymi wskaźnikami w badaniu zaburzeń poznawczych wywołanych przez rozwój, chorobę lub środowisko. Większość ocen poznawczych wymaga specjalistycznego sprzętu i dużego zaangażowania czasowego. Jednak test shuttle box jest narzędziem do uczenia się asocjacyjnego, które wykorzystuje konwencjonalne pudełko żelowe do szybkiej i wiarygodnej oceny funkcji poznawczych dorosłych danio pręgowanego.

Test Shuttle Box jako narzędzie asocjacyjnego uczenia się do oceny poznawczej w badaniach nad uczeniem się i pamięcią przy użyciu dorosłych danio pręgowanego

Ten protokół demonstruje mikroiniekcję lipopolisacharydu do obszaru komorowego mózgu w modelu larwalnym danio pręgowanego w celu zbadania wynikowej reakcji neurozapalnej i neurotoksyczności.

Mikroiniekcje lipopolisacharydu do komór mózgowych larwom danio pręgowanego w celu oceny zapalenia nerwów i neurotoksyczności

Celem obecnego protokołu jest nakreślenie kroków niezbędnych do ustanowienia i użycia testu preferencji społecznych dla dorosłych ryb danio pręgowanego i pokazanie, że można go użyć do scharakteryzowania wad społecznych wywołanych etanolem.

Modelowanie płodowych zaburzeń alkoholowych u danio pręgowanego w celu scharakteryzowania wpływu niekorzystnego środowiska embrionalnego na zachowania społeczne dorosłych

Ten protokół zapewnia standaryzowaną, wysokowydajną metodę przesiewowego badania związków z wykorzystaniem in vivo rybek zebrafish w celu ilościowego określenia utraty neuronów dopaminergicznych i deficytów zachowania ruchowego, umożliwiając wydajne przesiewanie związków neuroprotekcyjnych.

In Vivo Fenotypienie neurodegeneracji dopaminergicznej u larw rybki zebra z wykorzystaniem analizy behawioralnej i obrazowania wysoko-zawartościowego

Poznaj modelowanie toksyczności amyloidu-β42 w mózgu dorosłego Danio rerio. Ta metoda pozwala badać wpływ toksyczności amyloidu na komórki macierzyste nerwowe i mechanizmy odmładzania w chorobie Alzheimera.

Modelowanie toksyczności i neurodegeneracji amyloidu-β42 w mózgu dorosłego danio pręgowanego

Przeglądaj więcej filmów