Name: Półautomatyczna analiza morfologii mięśni szkieletowych myszy i składu włókien (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-31T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 36 s
Description: Poznaj półautomatyczną analizę morfologii mięśni szkieletowych myszy z wykorzystaniem immunohistochemii i algorytmów klasyfikacji typów włókien. Ta metoda umożliwia szybką identyfikację typów włókien mięśniowych i przyspiesza badania nad biologią mięśni oraz chorobami mięśniowymi.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Jesteśmy wdzięczni Fundacji Boettchera i Stowarzyszeniu Stwardnienia Zanikowego Bocznego (#17-II-344) za wsparcie tych badań.

Wszystkie procedury z udziałem myszy zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt (Institutional Animal Care and Use Committee) Uniwersytetu Kolorado-Anschutz Medical Campus (91813(05)1D).
1. Dzień 1: Barwienie immunocytochemiczne przeciwciałami pierwotnymi (1°) z blokowaniem albuminą surowiczą bydlęcą (BSA)
<ol>
	<li>Osuszyć na powietrzu mrożone przekroje mięśni kończyn tylnych myszy (np. mięśnia piszczelowego przedniego, mięśnia płaszczowego) zamontowane na szkiełkach do mikroskopu naładowanych elektrostatycznie przez około 30 min11. Obrysować przekroje za pomocą hydrofobowego pisaka PAP tworzącego barierę.</li>
	<li>Nanieść około 250 µL 5% albuminy wołowej w soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (BSA/PBS) na każde szkiełko, aby zablokować nieswoiste wiązanie przeciwciał. Inkubować szkiełka w temperaturze pokojowej przez 1 h.</li>
	<li>Podczas blokowania przygotować rozcieńczenia 1:50 supernatantu przeciwciała pierwszorzędowego w 5% BSA/PBS (wszystkie są to mysie przeciwciała monoklonalne; patrz Tabela 16,12); przygotować 250 µL roztworu na jedno szkiełko. Przechowywać zapasy i rozcieńczenia przeciwciał pierwszorzędowych w lodzie.</li>
</ol>
<img alt="Tabela 1" src="/files/ftp_upload/56024/56024table1.jpg" /> 
Tabela 1: Przeciwciała pierwszorzędowe użyte do rozróżniania izoform MyHC.
<ol start="4">
	<li>Po odessaniu 5% roztworu blokującego BSA/PBS, należy dodać 250 &#181;L z 1&#176; roztwór przeciwciał w odpowiednim rozcieńczeniu na odpowiednie preparaty. Dodać 250 &#181;L 5% BSA/PBS do przeciwciał wtórnych (2&#176;) preparaty kontrolne negatywne z samym przeciwciałem.</li>
	<li>Inkubować w temperaturze 4 &#176;C przez 24–48 h w wilgotnym środowisku. 
	UWAGA: Pszalka Petri przykryta folią aluminiową z wilgotnym papierem filtracyjnym może służyć jako odpowiednia komora inkubacyjna.</li>
</ol>
2. Dzień 2: wtórne barwienie immunofluorescencyjne przeciwciałami fluorescencyjnymi
<ol>
	<li>Odssać roztwór przeciwciała pierwszorzędowego lub kontrolny roztwór 5% BSA/PBS. Przemyć wszystkie preparaty trzy razy przez 10 min w 5% BSA.</li>
	<li>Podczas płukania przygotować rozcieńczenia 1:200 oczyszczonych przeciwciał drugorzędowych sprzężonych z fluorophorem w 5% BSA/PBS (patrz Tabela 2, wszystkie są to przeciwciała kozie anty-mysie). Przygotować 250 µL roztworu na jeden preparat. Przechowywać przeciwciała drugorzędowe sprzężone z fluorophorem w ciemności na lodzie.</li>
</ol>
<img alt="Tabela 2" src="/files/ftp_upload/56024/56024table2.jpg" /> 
Tabela 2: Przeciwciała wtórne sprzężone z fluoroforami użyte do wizualizacji rozpoznawania MyHC przez przeciwciała pierwotne.
<ol start="3">
	<li>Po odessaniu trzeciej aplikacji 5% roztworu blokującego BSA/PBS, nanieś 250 µL rozcieńczonego przeciwciała wtórnego na wszystkie preparaty. Inkubuj przez 90 min w temperaturze pokojowej w ciemnym, wilgotnym środowisku.</li>
	<li>Odessaj roztwór przeciwciał wtórnych. Przemyj wszystkie preparaty trzykrotnie przez 10 min przy użyciu 5% BSA/PBS.</li>
	<li>Opłucz PBS. Susz przez 10 min.</li>
	<li>Przykryj preparat szkiełkiem przykrywkowym, stosując niepermanentne, niskolepkie wodne medium montażowe.</li>
	<li>Po wyschnięciu zabezpiecz krawędzie szkiełka lakierem do paznokci. Wysusz i przechowuj w ciemnej kasetce do preparatów.</li>
</ol>
3. Obrazowanie preparatów przy użyciu mikroskopii epifluorescencyjnej
<ol>
	<li>Oczyścić preparaty za pomocą małej chusteczki laboratoryjnej nasączonej 70% etanolem.</li>
	<li>Wykonać cyfrowe zdjęcia immunobarwionych przekrojów mięśni przy użyciu mikroskopu epifluorescencyjnego wyposażonego w aparat fotograficzny (patrz Tabela materiałów).
	<ol>
		<li>Wybrać obszar o powierzchni około 1 mm2 (obiektyw 10X, 1.4 NA).</li>
		<li>Obserwować fluorescencję przeciwciał wtórnych sprzężonych z Alexa 488 za pomocą filtra długoprzepuszczającego 505 nm. Obserwować fluorescencję generowaną przez wzbudzenie przeciwciał wtórnych sprzężonych z Alexa 594 za pomocą filtra długoprzepuszczającego 595 nm. Zdigitalizować obrazy za pomocą komputera PC z kompatybilnym oprogramowaniem do obrazowania. Do późniejszej analizy dołączyć pasek skali z oprogramowania do obrazowania.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Analiza obrazów za pomocą programu Fiji
Uwaga: Przed przystąpieniem do analizy należy zainstalować program Fiji (dostępny bezpłatnie z National Institutes of Health, Bethesda, MD) poprzez stronę https://imagej.net/Fiji/Downloads. Ponadto makro wykorzystywane w tym procesie znajduje się w Plikach uzupełniających (Supplemental File). Należy umieścić plik makra w łatwo dostępnym katalogu.
<ol>
	<li>Wczytaj obraz w jasnym polu wybranego przekroju w programie Fiji. Przejdź do menu Plugins. &#8594; Segmentacja&#160;&#8594; Segmentacja obrazu za pomocą modułu Trainable Weka Segmentation.</li>
	<li>Aby wyznaczyć obszary komórkowe w preparacie, narysuj linię na włóknie, a następnie kliknij &#34;Dodaj do klasy 1&#34;Następnie należy narysować linię w przestrzeni między włóknami i kliknąć. &#34;Dodaj do klasy 2&#34; w celu oznaczenia domen zewnątrzkomórkowych. Powtórzyć czynność, aż w każdej klasie znajdzie się od 5 do 10 etykiet.
	<ol>
		<li>Kliknij Train Classifier. Na wyświetlonej czerwono-zielonej nakładce, w razie potrzeby, ręcznie dodaj kolejne etykiety (patrz krok 4.2) do błędnie segmentowanych fragmentów obrazu. Powtarzaj czynność do momentu, aż włókna (kolor czerwony) zostaną odpowiednio oddzielone od przestrzeni między włóknami (kolor zielony).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Kliknij &#34;Wyznacz prawdopodobieństwo&#34; i zapisz obraz w nowym, odpowiednio nazwanym folderze.</li>
	<li>Powtórz powyższą procedurę (kroki 4.2 – 4.3), wykorzystując obraz fluorescencyjny wykonany z tego samego pola widzenia. Oznacz włókna poddane immunostynowaniu jako &#34;klasa 1&#34; oraz wszystkie regiony niefluorescencyjne jako &#34;klasa 2&#34;Zapisz otrzymaną mapę prawdopodobieństwa w tym samym folderze, w którym znajduje się przetworzony obraz w jasnym polu.</li>
	<li>Otwórz jedną z wcześniej zapisanych map prawdopodobieństwa w programie Fiji. Narysuj linię prostą na pasku skali dostarczonym przez oprogramowanie do obrazowania. Przejdź do Analyze&#160;&#8594; Ustawienie skali. Zmień parametry (tj., znaną odległość, jednostkę długości) do odpowiednich wartości podanych na pasku skali, a następnie sprawdź &#34;Globalny&#34; ramka w celu standaryzacji skali dla każdego obrazu.</li>
	<li>Przejdź do sekcji Wtyczki&#160;&#8594; Makra&#160;&#8594; Uruchom&#160;&#8594; Tyagi i wsp. fiber_quantification_macro.ijm (patrz na Plik uzupełniający). Natychmiast pojawi się okno nawigacji. Otwórz folder nadrzędny obrazu; pojawi się okno dialogowe. W każdym oknie dialogowym zmień &#34;Wstęp&#34; wartość listy rozwijanej na &#34;Światło.&#34; 
	UWAGA: Folder zostanie teraz uzupełniony obrazami obrysów włókien oraz plikami arkusza kalkulacyjnego z wynikami (najistotniejszymi dla kwantyfikacji morfologii włókien są CSA oraz średnica Fereta; mierzalne parametry można dostosować w Analyze Set Measurements). Dane dotyczące morfologii włókien wygenerowane przez funkcję analizy porów programu Fiji zostaną automatycznie przeniesione do plików arkusza kalkulacyjnego dla obrazów fluorescencyjnych i w polu jasnym.</li>
	<li>Oblicz frakcję włókien wykazujących ekspresję danej izoformy MyHC w polu widzenia, dzieląc liczbę włókien fluorescencyjnych w tym polu przez całkowitą liczbę włókien widocznych na odpowiadającym im obrazie w jasnym polu.</li>
</ol>

<ol><li>Engel, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+essentiality+of+histo-+and+cytochemical+studies+of+skeletal+muscle+in+the+investigation+of+neuromuscular+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neurol%22%5BJournal%5D)">The essentiality of histo- and cytochemical studies of skeletal muscle in the investigation of neuromuscular disease.</a> Neurol. 12, 778-784 (1962).</li>
<li>Dobrowolny, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle+is+a+primary+target+of+SOD1G93A-mediated+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle is a primary target of SOD1G93A-mediated toxicity.</a> Cell Metab. 8, 425-436 (2008).</li>
<li>Sultana, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restricting+calcium+currents+is+required+for+correct+fiber+type+specification+in+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Restricting calcium currents is required for correct fiber type specification in skeletal muscle.</a> Development. 143 (9), 1547-1559 (2016).</li>
<li>Guth, L., Samaha, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Procedure+for+the+histochemical+demonstration+of+actomyosin+ATPase%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Procedure for the histochemical demonstration of actomyosin ATPase.</a> Exp Neurol. 28 (2), 365-367 (1970).</li>
<li>Bloemberg, D., Quadrilatero, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+determination+of+myosin+heavy+chain+expression+in+rat%2C+mouse%2C+and+human+skeletal+muscle+using+multicolor+immunofluorescence+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Rapid determination of myosin heavy chain expression in rat, mouse, and human skeletal muscle using multicolor immunofluorescence analysis.</a> PLoS One. 7 (4), (2012).</li>
<li>Lucas, C. A., Kang, L. H., Hoh, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monospecific+antibodies+against+the+three+mammalian+fast+limb+myosin+heavy+chains%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Monospecific antibodies against the three mammalian fast limb myosin heavy chains.</a> Biochem Biophys Res Commun. 272 (1), 303-308 (2000).</li>
<li>Lee, C. S., et al. <a target="_blank" href="https://skeletalmusclejournal.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13395-014-0027-1">Ca2+ permeation and/or binding to Cav1.1 fine-tunes skeletal muscle Ca2+ signaling to sustain muscle function.</a> Skelet Muscle. 5 (4), (2015).</li>
<li>Sawano, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+one-step+immunostaining+method+to+visualize+rodent+muscle+fiber+type+within+a+single+specimen%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A one-step immunostaining method to visualize rodent muscle fiber type within a single specimen.</a> PLoS One. 11 (11), (2016).</li>
<li>Meunier, B., Picard, B., Astruc, T., Labas, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+image+analysis+tool+for+the+classification+of+muscle+fibre+type+using+immunohistochemical+staining%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Development of image analysis tool for the classification of muscle fibre type using immunohistochemical staining.</a> Histochem Cell Biol. 134 (3), 307-317 (2010).</li>
<li>Kammoun, M., Casser-Malek, I., Meunier, B., Picard, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simplified+immunohistochemical+classification+of+skeletal+muscle+fibres+in+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Histochem%22%5BJournal%5D)">A simplified immunohistochemical classification of skeletal muscle fibres in mouse.</a> Eur J Histochem. 58 (2), 2254(2014).</li>
<li>Kumar, A., Accorsi, A., Rhee, Y., Girgenrath, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Do%27s+and+don%27ts+in+the+preparation+of+muscle+cryosections+for+histological+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Do's and don'ts in the preparation of muscle cryosections for histological analysis.</a> J Vis Exp. (99), (2015).</li>
<li>Schiaffino, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three+myosin+heavy+chain+isoforms+in+type+2+skeletal+muscle+fibres%5BTitle%5D)+AND+%22J+Muscle+Res+Cell+Motil%22%5BJournal%5D)">Three myosin heavy chain isoforms in type 2 skeletal muscle fibres.</a> J Muscle Res Cell Motil. 10 (197), (1989).</li>
<li>Augusto, V., Padovani, C. R., Campos, G. E. R. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/228866300_Skeletal_muscle_fiber_types_in_C57BL6J_mice">Skeletal muscle fiber types in C57Bl6j mice.</a> Braz J Morphol Sci. 21 (2), 89-94 (2004).</li>
<li>Schiaffino, S., Reggiani, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiber+types+in+mammalian+skeletal+muscles%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Fiber types in mammalian skeletal muscles.</a> Physiol Rev. 91 (4), 1447-1531 (2011).</li>
<li>Allen, D. L., Harrison, B. C., Maass, A., Bell, M. L., Byrnes, W. C., Leinwand, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+and+skeletal+muscle+adaptations+to+voluntary+wheel+running+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Physiol%22%5BJournal%5D)">Cardiac and skeletal muscle adaptations to voluntary wheel running in the mouse.</a> J Appl Physiol. 90 (5), 1900-1908 (2001).</li>
</ol>

Autorzy nie mają sprzecznych interesów do ujawnienia.

W tym miejscu przedstawiliśmy przydatne wskazówki dotyczące identyfikacji typów włókien mięśni szkieletowych. W ten sposób opisujemy nowatorski algorytm analizy danych.
Ponieważ nasze wyniki w dużej mierze pokrywają się z poprzednimi raportami 5,8,10 i odzwierciedlają nasze własne ręczne pomiary, algorytm wydaje się być dokładny. Mimo to napotkaliśmy kilka rzadkich pułapek eksperymentalnych, w tym nie...

Od pewnego czasu wiadomo, że mięśnie szkieletowe składają się z pojedynczych włókien wielu typów1. Początkowo scharakteryzowano dwie grupy włókien na podstawie ich właściwości kurczliwych i nazwano je odpowiednio wolnokurczliwymi (typ I) i szybkokurczliwymi (typ II). Kategorie te zostały dodatkowo wyróżnione na podstawie metabolizmu błonnika. Ponieważ włókna typu I są bogate w mitochondria i zależne od metabolizmu oksydacyjnego, zostały one wyjaśnione przez silnie dodatnie barwienie dinukleotydu dinukleotydu nikotynamidoadeninowego i reduktazy tetrazolowej (NADH-TR) 2 lub dehydrogenazy bursztynianowej (SDH)3 barwienie. W przeciwieństwie do tego, włókna typu II wykazywały mniejsze i zmienne stopnie diaforazy NADH-TR lub barwienia SDH i zostały podzielone na dwie podgrupy szybkokurczliwe (typ IIA i typ IIB) nieco prymitywnie oparte na ich względnych zdolnościach oksydacyjnych. Te różnice między włóknami zostały skuteczniej uwidocznione przez barwienie miozyną-ATPazą, gdzie włókna typu I barwią się na ciemno po wstępnej inkubacji przy pH 4,0, a włókna typu IIB absorbują osad po wstępnej inkubacji przy pH 10,0 z włóknami typu IIA barwiącymi się pośrednio4.
Ostatnio immunohistochemiczne barwienie izoform ciężkiego łańcucha miozyny (MyHC) okazało się lepszym dyskryminatorem typu włókna5. Włókna typu I, typu IIA i typu IIB można precyzyjnie zidentyfikować na podstawie ich profilu MyHC. Ponadto zidentyfikowano inny szybkokurczliwy typ włókien metabolicznie pośrednich, typ IIX6. Potwierdzono również włókna hybrydowe wyrażające więcej niż jeden MyHC5,7,8. Wiadomo, że niektóre gatunki, takie jak kot i pawian, nie wyrażają MyHCs6. Chociaż barwienie immunologiczne MyHC jest obecnie najnowocześniejszą oceną składu mięśni, analiza danych uzyskanych za pomocą tej techniki jest kłopotliwa i czasochłonna bez automatycznej pomocy. W tym celu opracowano kilka półautomatycznych metod analizy tych danych5,9,10. W tym miejscu przedstawiamy stosunkowo standardowy protokół immunohistochemicznej identyfikacji typu włókien mięśniowych5,7,8,10, wraz z nowatorskim półautomatycznym algorytmem, który przyspiesza analizę typu włókna i morfologii włókien z dokładnością.

<table><tbody><tr><td>Surowica bydlęca Albumina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9418-100G</td><td>5% w PBS</td></tr><tr><td>Hydrofobowa bariera Pap Pen</td><td>Scientific Device Laboratory</td><td>9804-02</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka mikroskopowe</td><td>Globe Scientific</td><td>1358W</td><td></td></tr><tr><td>Szkło nakrywkowe</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-E</td><td></td></tr><tr><td>Immumount</td><td>Thermo Scientific</td><td>9990402</td><td></td></tr><tr><td>Lakier do paznokci</td><td>L'Oreal</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nikon Eclipse TE-200 Odwrócona fluorescencja i mikroskop</td><td></td> jasnego pola <td>wycofany z produkcji</td><td></td></tr><tr><td>Rozwiązania do obrazowania SPOT RT/KE RT</td><td></td><td>940</td><td></td></tr><tr><td>Dell Optiplex</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BA-F8 Badania rozwojowe przeciwciał pierwotnych</td><td>Bank Hybridoma na Uniwersytecie Iowa</td><td></td><td>mysz monoklonalna IgG2b; 1:50</td></tr><tr><td>SC-71 Badania rozwojowe przeciwciał pierwotnych</td><td>Bank Hybridoma na Uniwersytecie Iowa</td><td></td><td>mysz monklonalna IgG1; 1:50</td></tr><tr><td>BF-F3 Badania rozwoju przeciwciał pierwotnych</td><td>Bank Hybridoma na Uniwersytecie Iowa</td><td></td><td>mysz monoklonalna IgGM; 1:50</td></tr><tr><td>6H1 Badania rozwoju przeciwciał pierwotnych</td><td>Bank Hybridoma na Uniwersytecie Iowa</td><td></td><td>mysz monoklonalna IgGM; 1:50</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 anty-IgG2b</td><td>Invitrogen</td><td>A21145</td><td>kozi anty-mysz; 1:200</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 anty-IgG1</td><td>Invitrogen</td><td>A21121</td><td>kozia anty-mysz; 1:200</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 anty-IgGM</td><td>Invitrogen</td><td>A21044</td><td>kozia anty-mysz; 1:200</td></tr><tr><td>PAŹ</td><td>Sakura Finetek</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>izopentan</td><td>Fisher Scientific</td><td>O3551-4</td><td>chłodny z azotem ligowym</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Fisher Bioodczynniki</td><td>BP665-1</td><td>10x, rozcieńczony do 1x</td></tr><tr><td>chusteczki Kim</td><td>Kimberly-Clark</td><td>06-666A</td><td></td></tr></tbody></table>

półautomatyczna analiza morfologii mięśni szkieletowych myszy i składu włókien

Semi-automated Analysis of Mouse Skeletal Muscle Morphology and Fiber-type Composition

Przez lata różnice między typami włókien mięśni szkieletowych były najlepiej widoczne za pomocą barwienia miozyną-ATPazą. Ostatnio barwienie immunohistochemiczne izoform łańcucha ciężkiego miozyny (MyHC) okazało się dokładniejszym dyskryminatorem typu włókna. Włókna typu I, typu IIA, typu IIX i typu IIB mogą być teraz identyfikowane z precyzją na podstawie ich profilu MyHC; Jednak ręczna analiza tych danych może być powolna i wręcz żmudna. W związku z tym szybka, dokładna ocena składu i morfologii rodzaju włókien jest bardzo pożądanym narzędziem. W tym miejscu przedstawiamy protokół najnowocześniejszego barwienia immunohistochemicznego MyHCs w zamrożonych skrawkach uzyskanych z mięśni kończyn tylnych myszy w połączeniu z nowatorskim półautomatycznym algorytmem, który przyspiesza analizę rodzaju włókien i morfologii włókien. Zgodnie z oczekiwaniami, mięsień płaszczkowaty wykazywał zabarwienie dla włókien typu I i typu IIA, ale nie dla włókien typu IIX lub typu IIB. Z drugiej strony, mięsień piszczelowy przedni składał się głównie z włókien typu IIX i typu IIB, niewielkiej frakcji włókien typu IIA i niewielkiej ilości włókien typu I lub nie ma ich wcale. Wykorzystano kilka transformacji obrazu do wygenerowania map prawdopodobieństwa w celu pomiaru różnych aspektów morfologii włókien (tj. pola przekroju poprzecznego (CSA), maksymalnej i minimalnej średnicy Fereta). Wartości uzyskane dla tych parametrów zostały następnie porównane z wartościami uzyskanymi ręcznie. Nie zaobserwowano istotnych różnic pomiędzy którymkolwiek z trybów analizy w odniesieniu do CSA, maksymalnej lub minimalnej średnicy Fereta (wszystkie p > 0,05), co wskazuje na dokładność naszej metody. W związku z tym nasz protokół analizy barwienia immunologicznego może być zastosowany do badania wpływu na skład mięśni w wielu modelach starzenia się i miopatii.

Mięśnie kończyn tylnych (tzn. mięsień piszczelowy przedni, mięsień płoneczny) wypreparowane z samca myszy C57BL/6 o nieznanym wieku zamrożono błyskawicznie poprzez zanurzenie plastikowej formy zawierającej mięsień w związku OCT w izopentanie chłodzonym ciekłym azotem. Następnie, przy użyciu kriotomu, wykonano seryjne cięcia o grubości 8-10 µm w temperaturze -20 °C i przeniesiono je na różne naładowane pozytywnie szkiełka przedmiotowe12.
<p class="jove_...

Immunohistochemiczne barwienie izoform łańcucha ciężkiego miozyny stało się najnowocześniejszym dyskryminatorem włókien mięśni szkieletowych typu (tj. typu I, typu IIA, typu IIX, typu IIB). W tym miejscu przedstawiamy protokół barwienia wraz z nowatorskim półautomatycznym algorytmem, który ułatwia szybką ocenę rodzaju włókien i morfologii włókien.

Półautomatyczna analiza morfologii mięśni szkieletowych myszy i składu włókien

For years, distinctions between skeletal muscle fiber types were best visualized by myosin-ATPase staining. More recently, immunohistochemical staining of ...

Ogólnym celem niniejszego protokołu jest wykorzystanie nowoczesnej immunohistochemii do dokładnej i szybkiej identyfikacji typów włókien mięśni szkieletowych. Metoda ta może pomóc w uzyskaniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie biologii mięśni, takie jak to, czy zmiany typu włókien są wywołane utratą funkcjonalnych białek. Chociaż metoda ta może dostarczyć cennych informacji w wielu modelach chorób mięśni, może być ona również stosowana w układach takich jak modele knock-in i knock-out, aby ukazać szerszy wpływ pojedynczej cząsteczki na podstawowe funkcje mięśni.Na początek należy wysuszyć na powietrzu zamrożone przekroje mięśni myszy na naładowanych szkiełkach przez około pół godziny. Po wysuszeniu należy obrysować przekroje na każdym szkiełku za pomocą hydrofobowego pisaka PAP. Następnie, aby zablokować nieswoiste wiązanie przeciwciał, należy nanieść około 250 µL 5% BSA w PBS wewnątrz wyznaczonych granic i inkubować szkiełka w temperaturze pokojowej przez godzinę.W międzyczasie przygotować rozcieńczenie przeciwciała pierwszorzędowego w stosunku 1:50 w PBS z 5% BSA. Przygotować około 250 µL na każdy preparat i przechowywać rozcieńczenie przeciwciał w lodzie. Po zakończeniu blokowania odessać roztwór blokujący z preparatów i dodać aliquoty rozcieńczenia przeciwciał po 250 µL.W celu uzyskania kontroli negatywnej należy zastosować 5% BSA w PBS bez przeciwciała pierwszorzędowego. Następnie do szalki Petriego należy włożyć zwilżony papier filtracyjny i przykryć ją folią aluminiową, tworząc komorę inkubacyjną. Następnie preparaty na szkiełkach należy inkubować w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 24 do 48 godzin w tej komorze lub w podobnym środowisku o takiej samej wilgotności.Po inkubacji z przeciwciałem pierwszorzędowym odessać roztwór z preparatów i trzykrotnie je wypłukać. Podczas każdego płukania nanosić około 250 µL 5% BSA w PBS przez około 10 minut. W trakcie płukania preparatów przygotować rozcieńczenia 1:200 oczyszczonych przeciwciał wtórnych sprzężonych z fluorophorem.Przygotować co najmniej 250 µL roztworu na jeden preparat; roztwór należy przechowywać w ciemności i w lodzie. Po trzecim przemyciu dodać 250 µL rozcieńczenia przeciwciała wtórnego na preparaty. Następnie inkubować preparaty przez 90 minut w temperaturze pokojowej, w ciemnym i wilgotnym środowisku.Po inkubacji odessać roztwór przeciwciał i trzykrotnie przemyć preparaty w sposób opisany wcześniej. Po usunięciu nadmiaru przeciwciał wtórnych opłukać preparaty buforem PBS i pozostawić do wyschnięcia na powietrzu przez 10 minut. Na koniec zamontować preparaty, używając nietrwałego, wodnego medium montażowego o niskiej lepkości.Po wyschnięciu medium uszczelnij krawędzie szkiełka nakrywkowego lakierem do paznokci i przełóż preparaty do nieprzezroczystego pudełka do przechowywania. Przed obrazowaniem preparatu oczyść szkiełko nakrywkowe 70% etanolem. Następnie wykonaj zdjęcia cyfrowe przy użyciu mikroskopu epifluorescencyjnego.Przy małym powiększeniu wybierz obszar zainteresowania o powierzchni jednego milimetra kwadratowego. Aby zobrazować przeciwciała sprzężone z Alexa 488, należy użyć filtra długoprzepustowego 505 nm. Aby zobrazować przeciwciała sprzężone z Alexa 594, należy użyć filtra długoprzepustowego 595 nm.Po odpowiednim ustawieniu filtrów rozpocznij gromadzenie obrazów cyfrowych. Należy pamiętać o uwzględnieniu paska skali do późniejszej analizy. W celu przeprowadzenia analizy zainstaluj program Fiji przy użyciu makra dostarczonego wraz z niniejszą publikacją.Przechowuj plik makra w łatwo dostępnym katalogu. Następnie wczytaj obraz w jasnym polu wybranego przekroju i przejdź do opcji Trainable Weka Segmentation. Aby wyznaczyć obszary komórkowe przekroju, narysuj linię na włóknie i kliknij Add to class 1.Następnie, aby zaznaczyć domeny pozakomórkowe, narysuj linię w przestrzeni między włóknami i kliknij „dodaj do klasy drugiej”. Powtarzaj ten proces, aż zdefiniowane zostanie od 5 do 10 etykiet dla każdej klasy. Zaznaczenie granic śródmiąższowych może być trudne.Użycie funkcji powiększania pozwala na dokładniejsze wyznaczenie tych granic. Następnie należy wybrać opcję trenowania klasyfikatora. Na wyświetlonej czerwono-zielonej nakładce należy ręcznie dodać dodatkowe etykiety do wszystkich części obrazu, które zostały błędnie wysegmentowane przez proces automatyczny.Powtarzaj tę czynność do momentu, aż włókna zaznaczone na czerwono zostaną odpowiednio oddzielone od przestrzeni pomiędzy nimi zaznaczonych na zielono. Następnie kliknij „get probability” i zapisz obraz w nowym folderze plików. Teraz powtórz cały proces, wykorzystując obraz fluorescencyjny wykonany z tego samego pola widzenia.Oznacz włókna poddane immunostynowaniu jako klasę pierwszą, a wszystkie regiony niefluorescencyjne jako klasę drugą. Na koniec zapisz powstałą mapę prawdopodobieństwa w tym samym folderze, w którym zapisano przetworzony obraz w polu jasnym. Teraz otwórz w programie Fiji jedną z wcześniej zapisanych map prawdopodobieństwa.Narysuj linię prostą na pasku skali dostarczonym przez oprogramowanie do obrazowania. Wybierz opcję ustawienia skali i wprowadź odpowiednie wartości na podstawie paska skali. Następnie aktywuj opcję globalną, aby ustandaryzować skalę dla każdego obrazu.Następnie uruchom makro Tyagi do kwantyfikacji włókien, po czym pojawi się panel nawigacyjny. Potem otwórz folder nadrzędny obrazów. W powiązanym oknie dialogowym zmień wartość z listy rozwijanej tła na light.Funkcję ustawień pomiarów można wykorzystać do zdefiniowania parametrów, które należy zmierzyć. CSA oraz średnica stóp są najważniejszymi pomiarami w celu określenia morfologii włókien. Po uruchomieniu makra folder zostanie uzupełniony obrazami konturów włókien oraz arkuszami kalkulacyjnymi z pomiarami wykonanymi przez funkcję analizy.Mięśnie piszczelowe przednie oraz płaszczowate zostały przeanalizowane przy użyciu opisanych metod, ponieważ składają się głównie z włókien szybkokurczliwych lub wolnokurczliwych. Za pomocą specyficznych przeciwciał zidentyfikowano kilka różnych ciężkich łańcuchów miozyny. Znaczna część włókien mięśnia płaszczowatego wykazywała ekspresję ciężkich łańcuchów miozyny typu 1 i typu 2A, a spora część pozostałych włókien była pozytywna pod kątem typu 2X. W przeciwieństwie do tego, niemal nie stwierdzono obecności włókien typu 2B.Dla porównania, barwione mięśnie piszczelowe przednie składały się głównie z włókien z ciężkimi łańcuchami miozyny typu dwa B i dwa X, z mniejszym udziałem włókien wykazujących ekspresję łańcuchów typu dwa A i praktycznie całkowitym brakiem włókien wykazujących ekspresję łańcuchów typu jeden. Analiza morfometryczna mięśnia piszczelowego przedniego poddanego badaniu z użyciem przeciwciał SC-71 skierowanych przeciwko ciężkiemu łańcuchowi miozyny typu dwa A dostarczyła kilku transformacji obrazu wykorzystanych do stworzenia map prawdopodobieństwa. Dzięki tej prostej zautomatyzowanej analizie dane okazały się w pełni porównywalne z danymi uzyskanymi za pomocą znacznie bardziej żmudnych obliczeń ręcznych.Łącznie analiza dostarczyła danych z około 6 000 poszczególnych włókien. Wysoka przepustowość danych znacznie ułatwiła przeprowadzenie analizy statystycznej. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak przeprowadzić immunobarwienie przekrojów mięśni oraz jak wykorzystać dostarczone oprogramowanie półautomatyczne w celu usprawnienia analizy typu i składu włókien mięśniowych.Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, że mięśnie mogą być niejednorodne regionalnie i że w celu rzetelnej oceny typu i składu włókien mięśniowych konieczna jest analiza wielu pól mięśniowych. W połączeniu z tą procedurą można zastosować inne metody, takie jak barwienie trichromowe, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, np. czy włóknienie rozwija się równolegle ze zmianami w składzie typów włókien.

semi-automated-analysis-mouse-skeletal-muscle-morphology-fiber-type

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Aby ocenić efekty in vivo interwencji terapeutycznych w chorobach mięśni, konieczne są metody ilościowego pomiaru generowanej siły oraz podatności na zmęczenie w leczonych mięśniach. Szczegółowo opisujemy podejście do oceny właściwości miomechanicznych w wyizolowanym mięśniu kończyny tylnej myszy. Analiza ta stanowi solidną metodę ilościowego określania wpływu modyfikacji genetycznej na funkcję mięśni, a także porównywania terapii w modelach mysich chorób mięśni.

Analiza miomechaniczna wyizolowanego mięśnia szkieletowego

Danio pręgowany to nowy system do modelowania zaburzeń mięśni szkieletowych u ludzi.  Opisujemy szybką i skuteczną metodę izolowania włókien mięśniowych mięśni szkieletowych od embrionalnego i larwalnego danio pręgowanego.  Metoda ta pozwala uzyskać preparat z włókien mięśniowych o dużej gęstości, odpowiedni do badania morfologii pojedynczych włókien mięśni szkieletowych, lokalizacji subkomórkowej białek i fizjologii mięśni.

Analiza embrionalnych i larwalnych włókien mięśniowych szkieletu danio pręgowanego z preparatów zdysocjowanych

Tutaj prezentujemy protokół do szybkich analiz włókien mięśniowych, który pozwala na poprawę jakości barwienia, a tym samym na automatyczne pozyskiwanie i kwantyfikację populacji włókien za pomocą swobodnie dostępnego oprogramowania ImageJ.

Szybki zautomatyzowany protokół analizy populacji włókien mięśniowych w przekrojach poprzecznych mięśni szczurów przy użyciu immunohistochemii łańcuchów ciężkich miozyny

Zdolność do dokładnego wykrywania komponentów połączenia nerwowo-mięśniowego jest kluczowa w ocenie zmian w jego architekturze spowodowanych procesami patologicznymi lub rozwojowymi. Poniżej przedstawiamy pełny opis prostej metody uzyskiwania wysokiej jakości obrazów całych połączeń nerwowo-mięśniowych, które można wykorzystać do wykonywania pomiarów ilościowych.

Rozwarstwienie pojedynczych włókien mięśni szkieletowych do analiz immunofluorescencyjnych i morfometrycznych połączeń nerwowo-mięśniowych w całości

Coraz więcej dowodów wskazuje, że nadmierna infiltracja lipidów wewnątrz mięśni szkieletowych prowadzi do lipotoksyczności i cukrzycy. Tutaj przedstawiamy kompletny protokół, w tym przetwarzanie tkanek, barwienie za pomocą Bodipy, akwizycję obrazu i analizę, w celu ilościowego określenia wielkości, gęstości i subkomórkowego rozkładu kropelek lipidów w sposób specyficzny dla rodzaju włókna.

Analiza zawartości kropelek lipidów w mięśniach szkieletowych pod kątem rodzaju włókien i subkomórek

Ten protokół demonstruje izolację pojedynczego włókna z liofilizowanych ludzkich mięśni szkieletowych i klasyfikację typów włókien według izoformy ciężkiego łańcucha miozyny (MHC) przy użyciu techniki kropkowania. Zidentyfikowane próbki włókien MHC I i II mogą być następnie dalej analizowane pod kątem specyficznych dla rodzaju błonnika różnic w ekspresji białek przy użyciu western blotting.

Identyfikacja rodzaju włókien ludzkich mięśni szkieletowych

Opisujemy protokół uzyskiwania enzymatycznie zdysocjowanych włókien o różnych długościach i typach z sześciu mięśni dorosłych myszy: trzy z nich już opisane (zginacz palca krótkiego, prostownik palca długiego, płaszczkowaty) i trzy z nich pomyślnie zdysocjowane po raz pierwszy (prostownik palucha długiego, mięsień długi długi, peroneus digiti quarti).

Nienaruszone krótkie, pośrednie i długie włókna mięśni szkieletowych uzyskane w wyniku enzymatycznej dysocjacji sześciu mięśni kończyn tylnych myszy: poza zginaczem digitorum brevis

Tutaj opisujemy kompleksową metodę pomiaru mitochondrialnej fosforylacji oksydacyjnej w świeżych, przepuszczalnych włóknach mięśni szkieletowych z mięśni ludzkich lub myszy. Metoda ta pozwala na ilościowe określenie oddychania mitochondriów w czasie rzeczywistym oraz ocenę preferencji paliwowych i elastyczności metabolicznej przy jednoczesnym zachowaniu istniejących sieci mitochondrialnych i integralności błony.

Pomiar oddychania mitochondrialnego we włóknach mięśni szkieletowych ludzi i myszy za pomocą respirometrii o wysokiej rozdzielczości

Miejscowe wstrzyknięcia barwnika mitochondrialnego oznacza końcowe mitochondria komórek Schwanna in vivo do mikroskopii konfokalnej. Ta metoda wykorzystuje dowód koncepcji wykazany w tkance mięśniowej szkieletowej myszy ze zdrową lub chorą tkanką mięśniową, aby zapewnić wysoką rozdzielczość wizualizacji mitochondriów.

Metody in situ ilościowej oceny morfologii mitochondriów w mięśniach i komórkach Schwanna końcowych myszy

Prosty zestaw metod izolacji i identyfikacji najliczniej występujących białek ekspresjonowanych w mięśniach szkieletowych. Na żelu dwuwymiarowym z 10 mg mięśnia można wyróżnić około 800 plamek, co umożliwia określenie specyficznej dla płci ekspresji białek. Metody te dają porównywalne wyniki w większości tkanek.

Dymorfizm płciowy mięśni szkieletowych w ujęciu proteomicznym

Poznaj półautomatyczną analizę morfologii mięśni szkieletowych myszy z wykorzystaniem immunohistochemii i algorytmów klasyfikacji typów włókien. Ta metoda umożliwia szybką identyfikację typów włókien mięśniowych i przyspiesza badania nad biologią mięśni oraz chorobami mięśniowymi.

Półautomatyczna analiza morfologii mięśni szkieletowych myszy i składu włókien

Przeglądaj więcej filmów