Analiza kinematyczna chodu w płaszczyźnie strzałkowej u myszy C57BL/6 poddanych eksperymentalnemu autoimmunologicznemu zapaleniu mózgu i rdzenia wywołanemu MOG35-55

Ogólnym celem tej procedury jest pomiar funkcjonalnych zaburzeń motorycznych w eksperymentalnym autoimmunologicznym zapaleniu mózgu i rdzenia kręgowym lub EAE, stwardnieniu rozsianym w modelu myszy przy użyciu kinematycznej analizy chodu. Zastosowanie kinematycznej analizy chodu do zachowań związanych z chodzeniem myszy zostało już wcześniej ustalone i opisane przez innych. Deficyty neurologiczne w EAE wynikają z zapalenia neuronów i sporadycznej utraty istoty białej w całym rdzeniu kręgowym i móżdżku.

Tradycyjnie, stabilność motoryczna u myszy EAE była oceniana za pomocą systemów punktacji klinicznej, w których myszom przypisuje się wynik kliniczny na podstawie wrażenia obserwatora na temat nasilenia deficytów motorycznych. Dane z wyników klinicznych są porządkowe i nie korelują dobrze z histopatologią rdzenia kręgowego. Niedawno wykazano, że analiza kinematyczna chodu jest lepszym behawioralnym korelatem utraty istoty białej niż wyniki kliniczne, a także zapewnia obiektywny opis deficytów chodzenia u myszy EAE.

Technika ta polega na umieszczeniu odblaskowych znaczników na wysokich kończynach myszy i umożliwieniu im chodzenia na bieżni podczas nagrywania za pomocą szybkiej kamery. Parametry kinematyczne są następnie wyodrębniane z obrazu wideo za pomocą oprogramowania do analizy ruchu. Pierwszym krokiem jest wykonanie znaczników, które zostaną umieszczone na tylnej nodze zwierzęcia.

Odbicie światła od tych markerów pozwala na wydobycie współrzędnych punktów anatomicznych na nodze z filmów. Aby rozpocząć, wybij żądaną liczbę okręgów z arkusza papieru odblaskowego. Każda mysz wymaga pięciu znaczników na nagranie, dwóch dużych i trzech małych.

Za pomocą cienkich nożyczek wykonaj cięcie rozciągające się od obwodu do środka koła. Odklej papierowy podkład, aby odsłonić powierzchnię klejącą za pomocą cienkich kleszczyków. Chwyć marker kleszczami i palcem zwiń marker w siebie, aby utworzyć stożek.

Aby zrobić mały marker, wykonaj dłuższe cięcie i mocniej zwiń stożek. Aby zrobić duży marker, wykonaj krótsze cięcie i luźniej zwiń stożek. Za pomocą gorącego pistoletu do klejenia wypełnij wnętrze stożka klejem i przyklej go do kawałka tektury.

Ważne jest, aby całkowicie wypełnić marker klejem, aby zapobiec zapadaniu się markera podczas obsługi podczas nagrywania. Gdy klej wyschnie, odetnij marker za pomocą skalpela. Upewnij się, że odciąłeś się od swojego ciała.

Kolejnym krokiem jest przygotowanie zwierzęcia do nagrywania. Aby to zrobić, odblaskowe znaczniki muszą być przyklejone do tylnej kończyny myszy w odpowiednich miejscach anatomicznych. Odbywa się to w lekkim znieczuleniu.

Umieść mysz w komorze indukcyjnej i znieczulenie 2,5% izofluranem. Po utracie przytomności przenieś mysz z komory indukcyjnej na stożek nosowy lub poduszkę grzewczą z recyrkulacyjną wodą. Nałóż miejscowy lubrykant na oba oczy.

Ogol pożądaną tylną kończynę rozciągającą się od kostki do kręgosłupa i dolnej części żeber. W tej demonstracji odtwarzamy ruchy prawej kończyny tylnej, ale można użyć jednej lub obu kończyn. Zlokalizuj grzebień biodrowy, zbliżając oba kolana do kciuka i palca wskazującego i dotykając tuż poniżej żeber.

Zaznacz to miejsce za pomocą trwałego markera. Zlokalizuj biodro, wysuwając nogę i przesuwając ją do przodu ido tyłu. Umieść znacznik nad stawem biodrowym, który jest punktem artykulacji między głową kości udowej a miednicą.

Za pomocą elastycznej linijki zmierz i zapisz długość kości piszczelowej lub trzonu myszy. Zmierz i zapisz również długość kości udowej lub uda. Aby odizolować czwarty palec u nogi w celu umieszczenia markera, przyklej resztę stopy.

Chwyć mały marker kleszczami i zanurz płaski koniec w kleju. Umieść mały marker na czubku czwartego palca. Umieść kolejny mały marker na stawie śródstopno-paliczkowym.

Umieść ostatni mały marker na kostce. Umieść duży marker na stawie biodrowym bezpośrednio nad śladem na skórze. Umieść drugi duży marker na znaku nad grzebieniem biodrowym.

Usuń taśmę ze stopy. Umieść mysz w klatce ratunkowej i natychmiast przetransportuj ją do pomieszczenia do nagrywania chodu. Kolejnym krokiem jest nagranie myszy chodzącej po bieżni.

To zdjęcie przedstawia naszą konfigurację nagrywania na bieżni, pokazującą światło, szybką kamerę i bieżnię. Przed zarejestrowaniem chodu myszy zrób zdjęcie bloku kalibracyjnego o znanych wymiarach na bieżni. Umożliwi to konwersję pikseli w filmie na rzeczywiste pomiary.

Bardzo ważne jest, aby kąt kamery i pozycja, w której wykonywane jest zdjęcie kalibracyjne, pozostały takie same podczas nagrywania zachowania podczas chodzenia. Umieść mysz w bieżni. Stopniowo zwiększaj prędkość bieżni, aby ustawić mysz we właściwym kierunku.

Powoli przyspieszaj do 20 centymetrów na sekundę, co jest idealną prędkością biegu do uzyskiwania nagrań stałego chodu. Aby uzyskać dokładną analizę, najlepiej jest rejestrować od ośmiu do 12 cykli kroków stabilnego chodzenia. Jest to przykład konsekwentnego chodzenia.

Poniżej znajduje się ten sam film pokazany z połową prędkości. Ponieważ myszy chodzą tak szybko, przydatne może być oglądanie filmów z mniejszą prędkością, aby policzyć cykle kroków i lepiej docenić wzorzec chodu. To jeden z przykładów myszy EAE chodzącej po bieżni.

Ta mysz nie jest w stanie utrzymać ciężaru ciała, ponieważ jej miednica znajduje się bardzo nisko nad ziemią. Dodatkowo ma trudności z podniesieniem stopy z ziemi podczas fazy wymachu. Jest to przykład innej myszy EAE, która ma mniej poważne deficyty motoryczne.

Mysz EAE chodzi na palcach ze zmniejszonym ruchem w stawie skokowym. Daje to myszowi nierówny chód. Poniżej znajdują się przykłady zachowań, które będą skumulować analizę.

Nagrania, w tym te zachowania, nie powinny być używane. Opóźnienie występuje, gdy mysz przestaje chodzić i przemieszcza się na tył bieżni, ale następnie wznawia chodzenie. Może się to zdarzyć w każdej myszy, ale będzie się to zdarzać częściej przy niższych prędkościach.

Wychowanie następuje, gdy mysz przenosi ciężar ciała na tylne kończyny tylne i podnosi głowę i górną część ciała. Takie zachowanie jest powszechne u niespokojnych myszy. Poniżej znajdują się przykłady słabego oświetlenia, które doprowadzi do problemów z analizą położenia znaczników w czasie i przestrzeni.

Jeśli oświetlenie jest zbyt słabe, znaczniki mogą nie odbijać wystarczającej ilości światła, aby mogły zostać rozpoznane przez oprogramowanie komputerowe. Na tym filmie znaczniki palców u nóg nie są łatwo widoczne z powodu niewystarczającego oświetlenia. Jeśli oświetlenie jest zbyt jasne, obiekty inne niż znaczniki mogą odbijać zbyt dużo światła i zostać rozpoznane jako znacznik.

Na tym filmie znaczniki palców wydają się łączyć z odblaskowymi częściami bieżni. Dane z markerów odblaskowych na chodzących myszach można wykorzystać do stworzenia patyczkowych modeli nogi, z których można wyodrębnić parametry kinematyczne. Jest to nagranie spacerującej myszy z nałożonym na siebie patyczkowym modelem nogi.

Zwróć uwagę, że w tym filmie na kolanie znajduje się szósty znacznik, który nie jest konieczny, ponieważ położenie kolana można triangulować na podstawie pozycji stawów biodrowych i skokowych oraz zmierzonych długości kości udowej i piszczelowej. Ponieważ markery nad stawem kolanowym są często niedokładne z powodu poślizgu skóry, preferowaną metodą jest triangulacja. Cykl kroków myszy można podzielić na dwie główne fazy.

Faza podporu i faza wymachu. Ten diagram kija może być użyty do jakościowego zilustrowania ruchu kończyny tylnej w czasie i przestrzeni. Przykładem tego może być ocena ruchu kończyny tylnej w różnych momentach trwania badania.

Ten przykład pokazuje, że tylna noga jest ściśnięta w fazie podporu, co wskazuje, że mysz ma trudności z utrzymaniem ciężaru ciała. Znajduje to odzwierciedlenie w zwiększonym zgięciu stawów kolanowych i skokowych. W późniejszym okresie czasu sytuacja częściowo się poprawiła.

Ten film ilustruje związek między zachowaniem podczas chodzenia a kątami stawów w czasie. Przebiegi kąta bioder, kolan i kostek można wyodrębnić z każdego nagrania. Kąty połączeń można następnie uśrednić w ciągu ośmiu do 12 kolejnych cykli kroków, co daje średni cykl krokowy, który można wykorzystać do dalszej analizy.

Ten wykres przedstawia przebieg stawu kolanowego uśredniony z 10 kolejnych cykli krokowych. Dane zostały znormalizowane tak, że długość faz podparcia i wymachu wynosi odpowiednio 100 klatek. Przezroczyste tło reprezentuje fazę wymachu, a zielone tło reprezentuje fazę postawy.

W przypadku tej myszy zachowanie chodzenia z tygodnia na tydzień było bardzo spójne, a przebiegi cyklu krokowego z każdego tygodnia znacznie się pokrywały. Jednak może również występować znaczna zmienność chodu u zdrowych myszy, jak widać na tym wykresie. Pokazany tutaj stopień zmienności jest akceptowalny i mieści się w zakresie tego, czego można oczekiwać od myszy.

Ten wykres przedstawia cykl kroków kolana z myszy EAE zarejestrowany przez trzy kolejne tygodnie. W drugim tygodniu następuje niewielka zmiana w kształcie cyklu kroków, a w trzecim tygodniu znaczne odchylenie, przez co kolano myszy jest znacznie bardziej zgięte i nie rozciąga się podczas chodzenia. Istnieje wiele parametrów, które można zmierzyć za pomocą tej techniki.

Pokrótce opiszemy trzy. Średni kąt uzyskuje się przez uśrednienie wszystkich kątów w całym znormalizowanym cyklu krokowym. W tym przypadku średni kąt zmniejsza się w trakcie badania, co sugeruje, że myszy nie rozciągają kolan tak bardzo, jak normalnie.

Zakres ruchu uzyskuje się poprzez odjęcie najmniejszego kąta od największego kąta w znormalizowanym cyklu krokowym. Ten parametr może dać wgląd w elastyczność stawu, sztywność lub słabość. W tym przykładzie zakres ruchu kolana zmniejsza się w trakcie badania, co wskazuje, że myszy nie są w stanie normalnie poruszać kolanem, prawdopodobnie z powodu osłabienia mięśni.

Różnica średniej kwadratowej to metoda stosowana do pomiaru odchylenia przebiegów cyklu krokowego od zapisu linii bazowej. Ten parametr informuje, jakie jest odchylenie od początkowego nagrania. Kinematyczna analiza chodu jest cenną techniką, którą można wykorzystać do czułego wykrywania i opisywania zmian w chodzie.

Zastosowanie kinematycznej analizy chodu do badań EAE może być cennym narzędziem w zrozumieniu funkcjonalnych konsekwencji patologii rdzenia kręgowego w tym modelu. Może to ułatwić odkrycie nowych metod leczenia stwardnienia rozsianego. Dodatkowo, analiza kinematyczna chodu nie ogranicza się do kontekstu EAE.

Technika ta była wcześniej stosowana w modelach mysich z uszkodzeniem rdzenia kręgowego, stwardnieniem zanikowym bocznym, chorobą Huntingtona i udarem mózgu, a także może być stosowana w innych modelach myszy z zaburzeniami neurologicznymi, w tym chorobą Parkinsona.