Ocena mechanizmów kontroli naczyniowej z wykorzystaniem wideomikroskopii izolowanych tętnic opornych szczurów
5 grudnia 2017
Ten manuskrypt opisuje protokoły mikroskopii wideo in vitro do oceny funkcji naczyniowej w tętnicach oporowych mózgu szczurów. W manuskrypcie opisano również techniki oceny gęstości mikronaczyń za pomocą znakowanej fluorescencyjnie lektyny i perfuzji tkanek za pomocą laserowej przepływometrii dopplerowskiej.
Ogólnym celem tej procedury jest wykorzystanie izolowanych tętnic oporowych do zbadania reaktywności naczyń na bodźce wazoaktywne. Pokaże również, w jaki sposób oceniać zmiany w mechanizmach kontroli mięśni gładkich i pasywnych właściwościach mechanicznych. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania z zakresu biologii naczyniowej dotyczące mechanizmów kontroli śródbłonka i mięśni gładkich naczyń krwionośnych w tętnicach małooporowych w różnych stanach.
Główną zaletą tej techniki jest to, że tętnice o małym oporze mogą być izolowane ze środowiska komórek miąższowych i utrzymywane w normalnym ciśnieniu, podczas gdy badane są reakcje na bodźce wazoaktywne. Implikacje tej techniki rozciągają się w kierunku terapii i diagnostyki dysfunkcji naczyń krwionośnych. Tego typu manipulacja nie jest możliwa in vivo.
Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w chorobę naczyń obwodowych, może być również stosowana w chorobie wieńcowej. Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ etapy mikrokaniulacji są trudne do nauczenia się ze względu na delikatność procedury i konieczność uniknięcia uszkodzenia tętnicy. W dniu eksperymentu przygotuj dwa litry fizjologicznego roztworu soli w dwulitrowej kolbie Erlenmeyera.
Dodając 20-krotny zapas buforowy, upewnij się, że roztwór stale równoważy się z mieszaniną gazów i mieszaj ją za pomocą mieszadła magnetycznego. Następnie obserwuj pH, dodając do mieszaniny 0,28 grama fosforanu sodu. W razie potrzeby należy obniżyć pH, dodając krople sześciu normalnych roztworów kwasu solnego lub 6,5 normalnego roztworu wodorotlenku sodu z pipety Pasteura, tak aby pH pozostało na poziomie 7,4.
Następnie dodaj 1,98 grama glukozy do fizjologicznego roztworu soli. Następnie przygotuj 500 mililitrów bezwapniowego roztworu soli fizjologicznej, rozcieńczając 20-krotny roztwór podstawowy w wodzie dejonizowanej. Następnie dodać 25 mililitrów buforu 20X do kolby Erlenmeyera i dodać 0,07 grama fosforanu monosodowego do roztworu, jednocześnie monitorując i dostosowując pH roztworu.
Użyj rurki tetrafluoroetylenowej, aby podłączyć zbiornik gazu zawierający odpowiednią mieszaninę gazów do kąpieli organowej. Roztwór należy w sposób ciągły rozpylać z szybkością wystarczającą do zapewnienia ciągłego, ale nie burzliwego bulgotania roztworu wpływającego do komory naczynia. Umieść również mały kamień napowietrzający połączony z mieszaniną gazów równoważących w komorze naczynia, aby pomóc w utrzymaniu składu gazowego fizjologicznego roztworu soli.
Umieść fizjologiczny roztwór soli w dwulitrowej butelce Mariotte. Dodaj centralną szklaną rurkę do korka, aby służyła jako zbiornik, który będzie w sposób ciągły dostarczał roztwór soli fizjologicznej do kąpieli narządowej farmakologicznej, która dostarcza roztwór do komory naczynia. Umieścić otwór centralnej szklanej rurki w butelce Mariotte na tym samym poziomie, co górna część roztworu soli fizjologicznej w kąpieli organowej.
Zapewni to stałe ciśnienie hydrostatyczne wysokości podnoszenia do dostarczania roztworu soli fizjologicznej do kąpieli narządowej. Użyj rurki polietylenowej połączonej ze szklaną rurką w kształcie litery J, aby dostarczyć fizjologiczny roztwór soli z butelki Mariotte do kąpieli organowej. Aby uzyskać obfitość światła, użyj rurki polietylenowej, aby podłączyć pipetę dopływową do fizjologicznego zbiornika roztworu soli składającego się z plastikowej strzykawki o pojemności 66 cm3 podniesionej do pozycji utrzymującej pożądane ciśnienie dopływu.
Monitorować ciśnienie, podłączając przetwornik ciśnienia do systemu za pomocą kurka. Następnie podłączyć pipetę odpływową do rurki polietylenowej do zbiornika podobnego do zbiornika dopływowego, aby umożliwić przepływ fizjologicznego roztworu soli przez naczynie w odpowiedzi na gradient ciśnienia. Należy również użyć podobnego przyłącza kranu i przetwornika ciśnienia, aby monitorować ciśnienie wypływu.
Usuń mózg szczura Sprague Dawley i umieść go w pozycji leżącej na plecach na szklanej szalce Petriego wypełnionej lodowatym roztworem soli fizjologicznej. Następnie umieść naczynie pod stereoskopem. Użyj nożyczek Vannas i kleszczy Dumont numer pięć z cienką końcówką, aby wyciąć środkowe tętnice mózgowe z mózgu.
Następnie oczyść resztki tkanki mózgowej ze środkowej tętnicy mózgowej za pomocą kleszczy. Przenieś tętnicę do komory naczynia, delikatnie przytrzymując ją za koniec wyciętego segmentu i ostrożnie umieść ją w komorze. Następnie nawlecz tętnicę mózgową na mikropipetę dopływową, pociągając ją w kierunku podstawy pipety, aż końcówka wsunie się w światło tętnicy.
Zabezpiecz tętnicę na pipecie dopływowej, zawiązując pętlę przygotowaną z jednożyłowego włókna uprzednio drażnionego z szwów 10-0 wokół tętnicy. Następnie przymocuj przeciwległy koniec środkowej tętnicy mózgowej do pipety odpływowej, zaciskając drugą pętlę szwu wokół naczynia i użyj mikrometru podłączonego do uchwytu pipety dopływowej, aby rozciągnąć tętnicę do jej długości in situ. Zwiąż wszystkie boczne gałęzie za pomocą pojedynczych pasm drażnionych z szwów 10-0, aby utrzymać stałe ciśnienie w tętnicy.
Następnie ustaw mikroskop wideo składający się z kamery wideo podłączonej do mikroskopu preparacyjnego, która jest podłączona do mikrometru wideo i monitora telewizyjnego. Użyj tej konfiguracji, aby zmierzyć wewnętrzną średnicę tętnicy. Oceń ton miogenny i reakcje naczyń krwionośnych na bodźce rozszerzające naczynia krwionośne, upewniając się, że tętnica wykazuje odpowiedni poziom aktywnego tonu przed eksperymentem.
Odrzuć wszystkie tętnice, które nie mają aktywnego tonu w spoczynku, z wyjątkiem naczyń, takich jak małe tętnice krezkowe, które zwykle nie wykazują aktywnego tonu spoczynkowego. Następnie dodaj rosnące stężenie acetylocholiny do komory naczynia i zmierz średnice naczynia, aby przetestować zależną od śródbłonka reaktywność kaniulowanej tętnicy oporowej. W tym przykładzie tętnica wykazuje dysfunkcję śródbłonka, o czym świadczy brak jej rozszerzania w odpowiedzi na acetylocholinę.
Pod koniec eksperymentu określ maksymalną średnicę tętnicy, dodając bezwapniowy roztwór soli fizjologicznej do perfuzatu i superfuzatu. Użyj tego pomiaru, aby obliczyć procent aktywnego tonu spoczynkowego. Wykazanie maksymalnego rozwarcia w roztworze soli fizjologicznej bez wapnia potwierdza, że niezdolność tętnicy do rozszerzenia w odpowiedzi na acetylocholinę była spowodowana dysfunkcją śródbłonka, a nie niezdolnością tętnicy do rozluźnienia się z powodu przebudowy strukturalnej naczynia.
Rysunek ten ilustruje reakcje na zależną od śródbłonka acetylocholinę rozszerzającą naczynia krwionośne w izolowanych tętnicach środkowych mózgu od samców szczurów wrażliwych na sól Dahla w trzech zwężonych szczepach kongenicznych. Pokazuje to, że zależne od śródbłonka rozszerzenie na acetylocholinę było nieobecne w wrażliwym na sól szczepie rodzicielskim i w obu szczepach kongenicznych zachowujących wrażliwy na sól allel Renana. Normalna dylatacja została przywrócona w szczepie kongenicznym przenoszącym brązowy allel norweski Renan w tle genetycznym wrażliwym na sól, co potwierdza hipotezę, że dysfunkcja śródbłonka u szczurów SS jest spowodowana upośledzoną regulacją genu Renan.
W tym eksperymencie, niepowodzenie diety o wysokiej zawartości soli w celu wyeliminowania zależnego od śródbłonka rozszerzenia na acetylocholinę u jednego konkretnego szczepu szczurów, odkrycia dotyczące czynników przyczyniających się do stresu oksydacyjnego naczyń krwionośnych i dysfunkcji śródbłonka podczas wzrostu spożycia soli w diecie. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu trzech do 3 1/2 godziny, jeśli jest wykonywana prawidłowo. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, aby bardzo ostrożnie obchodzić się z izolowaną tętnicą, aby uniknąć uszkodzenia mięśni gładkich, a zwłaszcza śródbłonka.
Po tej procedurze można zastosować inne metody, takie jak dodanie agonistów lub antagonistów receptorów zwężających naczynia krwionośne i rozszerzających naczynia krwionośne, aby odpowiedzieć na pytania, w tym mechanizmy wpływające na reaktywność naczyń krwionośnych na różne substancje i mechanizmy działania leków na naczynia krwionośne. Po jej opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom z dziedziny biologii naczyniowej i fizjologii mikrokrążenia do zbadania funkcji mięśni gładkich i śródbłonka w tętnicach oporowych z różnych łożysk naczyniowych zwierząt doświadczalnych i ludzi. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak używać tej metody do oceny mechanizmów kontroli śródbłonka i mięśni gładkich naczyń krwionośnych w tętnicach o małym oporze z różnych łożysk naczyniowych.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia protokoły wideomikroskopii in vitro służące do oceny funkcji naczyniowej w tętnicach oporowych mózgu szczura. Szczegółowo opisano w nim również techniki oceny gęstości mikronaczyń oraz perfuzji tkankowej.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biologia naczyniowa
- Funkcja mikrokrążenia
- Mechanizmy kontrolne śródbłonka i mięśni gładkich
Wstęp
- Tętnice oporowe odgrywają kluczową rolę w regulacji przepływu krwi.
- Zrozumienie reaktywności naczyń na bodźce naczyniokurczące i naczyniorozkurczające jest niezbędne w badaniach naczyniowych.
- Izolowane tętnice mogą dostarczyć informacji na temat funkcji naczyniowej bez komplikacji związanych z badaniami in vivo.
- Celem niniejszego badania jest poszerzenie wiedzy o dysfunkcji naczyniowej i jej implikacjach terapeutycznych.
Cel badania
- Ocena reaktywności naczyń w izolowanych tętnicach oporowych.
- Ocena zmian w mechanizmach kontroli mięśni gładkich.
- Badanie pasywnych właściwości mechanicznych małych tętnic oporowych.
Zastosowane metody
- Protokoły mikroskopii wideo in vitro.
- Lektyna znakowana fluorescencyjnie do oceny gęstości mikronaczyń.
- Laserowa dopplerometria przepływu do oceny perfuzji tkankowej.
- Izolacja tętnic oporowych w celu utrzymania prawidłowego ciśnienia podczas testów.
Główne wyniki
- Wykazano umiejętność izolowania tętnic oporowych z ich środowiska.
- Przedstawiono sposób skutecznego testowania odpowiedzi na bodźce naczynioruchowe.
- Przekazano wiedzę na temat oddziaływań między śródbłonkiem a mięśnią gładką naczyń.
- Wskazano na znaczenie tych procesów dla diagnostyki dysfunkcji naczyniowych.
Wnioski
- Technika ta pozwala na szczegółowe badanie funkcji naczyniowych w kontrolowanym środowisku.
- Może ona prowadzić do postępów w rozumieniu chorób naczyniowych.
- Wyniki mogą być pomocne w opracowywaniu podejść terapeutycznych w dysfunkcjach naczyniowych.
Często zadawane pytania
Znaczenie w przemyśle
Niniejszy protokół umożliwia mechanistyczną minimalizację ryzyka w badaniach nad celami naczyniowymi poprzez izolację tętnic oporowych od zakłócających wpływów miąższowych, co zapewnia wiarygodność prognostyczną w zakresie mechanizmów kontroli śródbłonka i mięśni gładkich. Wspiera on walidację celów w modelach przedklinicznych poprzez utrzymanie fizjologicznego ciśnienia i umożliwienie bezpośredniej oceny odpowiedzi wazoaktywnych. Podejście to łączy redukcjonistyczne wyniki molekularne z integracyjną fizjologią naczyniową, zwiększając znaczenie translacyjne w procesie odkrywania leków sercowo-naczyniowych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Weryfikacja hipotez terapeutycznych poprzez badanie ścieżek rozkurczowych zależnych i niezależnych od śródbłonia w izolowanych tętnicach oporowych.
- Wartość operacyjna: Umożliwia funkcjonalną walidację celu poprzez ocenę zmian w mechanizmach kontroli mięśni gładkich oraz pasywnych właściwościach mechanicznych w kontrolowanych warunkach.
- Wartość prognostyczna: Wspiera selekcję projektów w portfolio poprzez identyfikację fenotypów naczyniowych powiązanych ze specyficznym tłem genetycznym, takich jak regulacja allelu Renan w modelach nadciśnienia wrażliwego na sól.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Przygotowanie zwalidowanych systemów biologicznych do dalszych etapów analizy poprzez ustalenie bazowego napięcia naczyniowego i profili reaktywności.
- Wartość operacyjna: Zapewnienie standaryzacji i powtarzalności analizy dzięki perfuzji z kontrolą ciśnienia oraz pomiarom średnicy w oparciu o mikroskopię wideo.
- Skalowalność: Możliwość ponownego wykorzystania platformy w różnych łożach naczyniowych i u genetycznie zmodyfikowanych szczepach szczurów w celu spójnej oceny związków.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Znaczenie dla chorób: Omówiono zastosowanie w modelach chorób tętnic obwodowych i wieńcowych poprzez ocenę dysfunkcji śródbłonka u genetycznie zdefiniowanych szczepów szczurów.
- Ciągłość translacyjna: Opisano ciągłość od etapu odkrycia po walidację przedkliniczną z wykorzystaniem technik stosowalnych zarówno do izolowanych naczyń, jak i do ocen perfuzji in vivo za pomocą laserowej dopplerowskiej flowmetrii.
- Postęp z uwzględnieniem ryzyka: Omówiono redukcję ryzyka mechanistycznego poprzez odróżnienie dysfunkcji śródbłonka od przebudowy strukturalnej za pomocą maksymalnej dylatacji indukowanej roztworem wolnym od wapnia.
Integracja potoków i przepływów pracy
Metoda ta wpisuje się w proces odkrywania leków, od weryfikacji hipotez dotyczących celu po identyfikację związków wiodących, wspierając zrozumienie mechanizmów przed etapem przesiewowym związków w programach badawczych nad biologią naczyń.
- Biologia odkrywcza: Wyjaśnia, w jaki sposób ta metoda wspiera weryfikację hipotez dotyczących mechanizmów kontroli śródbłonka i mięśni gładkich naczyń w tętnicach o małej oporności w różnych warunkach.
- Przesiewanie: Opisuje gotowość do przeprowadzania analiz dzięki powtarzalnym technikom izolacji i kanulacji, które zachowują integralność tętnic w celu spójnego testowania bodźców naczynioruchowych.
- Analityka: Podkreśla ilościowe pomiary zmiennych zależnych (zmiany średnicy wewnętrznej za pomocą mikroskopii wideo), które umożliwiają porównanie odpowiedzi rozszerzających i zwężających naczynia.
- Badania translacyjne: Łączy tę metodę z ciągłością przedkliniczną poprzez równoległe zastosowanie laserowej flowmetrii Dopplera do oceny perfuzji tkanek oraz fluorescencyjnego znakowania lektynami w celu określenia gęstości mikronaczyń w powiązanych badaniach naczyniowych.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Przedstawia tę metodę jako możliwość wielokrotnego zastosowania w różnych łożyskach naczyniowych i szczepach szczurów, co ogranicza konieczność redundantnego opracowywania modeli w programach badań sercowo-naczyniowych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Większa pewność prognostyczna w walidacji celu, zmniejszenie niejednoznaczności mechanistycznej w szlakach kontroli naczyniowej.
- Wartość operacyjna: Standaryzacja, powtarzalność i skalowalność preparatów izolowanych tętnic w celu uzyskania spójnego profilowania farmakologicznego.
- Wartość strategiczna: Lepsze decyzje typu go/no-go, efektywność kapitałowa oraz zredukowane ryzyko biologiczne na późnych etapach dzięki potwierdzeniu oddziaływania na cel w fizjologicznie istotnych modelach ex vivo.
- Wpływ na portfolio: Priorytetyzacja skorygowana o ryzyko oraz decyzje o dalszym rozwoju w oparciu o potwierdzoną funkcję śródbłonka i reaktywność mięśni gładkich w genetycznych modelach istotnych dla danej choroby.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymagana wiedza specjalistyczna z zakresu mikrodysekcji naczyń, technik kanulacji oraz obsługi mikroskopii wideo.
- Zapotrzebowanie na instrumentację i infrastrukturę analityczną, w tym systemy perfuzji z regulacją ciśnienia, mikroskopy wideo z mikrometrymi oraz przetworniki ciśnienia.
- Wymogi standaryzacji międzyzespołowej w zakresie izolacji tętnic, ligacji szwami oraz protokołów utrzymywania ciśnienia w różnych laboratoriach.
- Kwestie adaptacji w różnych systemach modelowych, w tym dostosowanie ciśnień perfuzyjnych i składów roztworów dla różnych łożysk naczyniowych i gatunków.
- Ograniczenia praktyczne wynikające z materiałów źródłowych: delikatne etapy mikrokanulacji wymagają znacznego przeszkolenia w celu uniknięcia uszkodzeń śródbłonka lub mięśni gładkich, a tętnice pozbawione aktywnego napięcia spoczynkowego (np. małe tętnice krezkowe) mogą zostać wyłączone z analiz zależnych od napięcia.
