Ocena mechanizmów kontroli naczyniowej z wykorzystaniem wideomikroskopii izolowanych tętnic opornych szczurów
December 5th, 2017
Ten manuskrypt opisuje protokoły mikroskopii wideo in vitro do oceny funkcji naczyniowej w tętnicach oporowych mózgu szczurów. W manuskrypcie opisano również techniki oceny gęstości mikronaczyń za pomocą znakowanej fluorescencyjnie lektyny i perfuzji tkanek za pomocą laserowej przepływometrii dopplerowskiej.
Ogólnym celem tej procedury jest wykorzystanie izolowanych tętnic oporowych do zbadania reaktywności naczyń na bodźce wazoaktywne. Pokaże również, w jaki sposób oceniać zmiany w mechanizmach kontroli mięśni gładkich i pasywnych właściwościach mechanicznych. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania z zakresu biologii naczyniowej dotyczące mechanizmów kontroli śródbłonka i mięśni gładkich naczyń krwionośnych w tętnicach małooporowych w różnych stanach.
Główną zaletą tej techniki jest to, że tętnice o małym oporze mogą być izolowane ze środowiska komórek miąższowych i utrzymywane w normalnym ciśnieniu, podczas gdy badane są reakcje na bodźce wazoaktywne. Implikacje tej techniki rozciągają się w kierunku terapii i diagnostyki dysfunkcji naczyń krwionośnych. Tego typu manipulacja nie jest możliwa in vivo.
Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w chorobę naczyń obwodowych, może być również stosowana w chorobie wieńcowej. Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ etapy mikrokaniulacji są trudne do nauczenia się ze względu na delikatność procedury i konieczność uniknięcia uszkodzenia tętnicy. W dniu eksperymentu przygotuj dwa litry fizjologicznego roztworu soli w dwulitrowej kolbie Erlenmeyera.
Dodając 20-krotny zapas buforowy, upewnij się, że roztwór stale równoważy się z mieszaniną gazów i mieszaj ją za pomocą mieszadła magnetycznego. Następnie obserwuj pH, dodając do mieszaniny 0,28 grama fosforanu sodu. W razie potrzeby należy obniżyć pH, dodając krople sześciu normalnych roztworów kwasu solnego lub 6,5 normalnego roztworu wodorotlenku sodu z pipety Pasteura, tak aby pH pozostało na poziomie 7,4.
Następnie dodaj 1,98 grama glukozy do fizjologicznego roztworu soli. Następnie przygotuj 500 mililitrów bezwapniowego roztworu soli fizjologicznej, rozcieńczając 20-krotny roztwór podstawowy w wodzie dejonizowanej. Następnie dodać 25 mililitrów buforu 20X do kolby Erlenmeyera i dodać 0,07 grama fosforanu monosodowego do roztworu, jednocześnie monitorując i dostosowując pH roztworu.
Użyj rurki tetrafluoroetylenowej, aby podłączyć zbiornik gazu zawierający odpowiednią mieszaninę gazów do kąpieli organowej. Roztwór należy w sposób ciągły rozpylać z szybkością wystarczającą do zapewnienia ciągłego, ale nie burzliwego bulgotania roztworu wpływającego do komory naczynia. Umieść również mały kamień napowietrzający połączony z mieszaniną gazów równoważących w komorze naczynia, aby pomóc w utrzymaniu składu gazowego fizjologicznego roztworu soli.
Umieść fizjologiczny roztwór soli w dwulitrowej butelce Mariotte. Dodaj centralną szklaną rurkę do korka, aby służyła jako zbiornik, który będzie w sposób ciągły dostarczał roztwór soli fizjologicznej do kąpieli narządowej farmakologicznej, która dostarcza roztwór do komory naczynia. Umieścić otwór centralnej szklanej rurki w butelce Mariotte na tym samym poziomie, co górna część roztworu soli fizjologicznej w kąpieli organowej.
Zapewni to stałe ciśnienie hydrostatyczne wysokości podnoszenia do dostarczania roztworu soli fizjologicznej do kąpieli narządowej. Użyj rurki polietylenowej połączonej ze szklaną rurką w kształcie litery J, aby dostarczyć fizjologiczny roztwór soli z butelki Mariotte do kąpieli organowej. Aby uzyskać obfitość światła, użyj rurki polietylenowej, aby podłączyć pipetę dopływową do fizjologicznego zbiornika roztworu soli składającego się z plastikowej strzykawki o pojemności 66 cm3 podniesionej do pozycji utrzymującej pożądane ciśnienie dopływu.
Monitorować ciśnienie, podłączając przetwornik ciśnienia do systemu za pomocą kurka. Następnie podłączyć pipetę odpływową do rurki polietylenowej do zbiornika podobnego do zbiornika dopływowego, aby umożliwić przepływ fizjologicznego roztworu soli przez naczynie w odpowiedzi na gradient ciśnienia. Należy również użyć podobnego przyłącza kranu i przetwornika ciśnienia, aby monitorować ciśnienie wypływu.
Usuń mózg szczura Sprague Dawley i umieść go w pozycji leżącej na plecach na szklanej szalce Petriego wypełnionej lodowatym roztworem soli fizjologicznej. Następnie umieść naczynie pod stereoskopem. Użyj nożyczek Vannas i kleszczy Dumont numer pięć z cienką końcówką, aby wyciąć środkowe tętnice mózgowe z mózgu.
Następnie oczyść resztki tkanki mózgowej ze środkowej tętnicy mózgowej za pomocą kleszczy. Przenieś tętnicę do komory naczynia, delikatnie przytrzymując ją za koniec wyciętego segmentu i ostrożnie umieść ją w komorze. Następnie nawlecz tętnicę mózgową na mikropipetę dopływową, pociągając ją w kierunku podstawy pipety, aż końcówka wsunie się w światło tętnicy.
Zabezpiecz tętnicę na pipecie dopływowej, zawiązując pętlę przygotowaną z jednożyłowego włókna uprzednio drażnionego z szwów 10-0 wokół tętnicy. Następnie przymocuj przeciwległy koniec środkowej tętnicy mózgowej do pipety odpływowej, zaciskając drugą pętlę szwu wokół naczynia i użyj mikrometru podłączonego do uchwytu pipety dopływowej, aby rozciągnąć tętnicę do jej długości in situ. Zwiąż wszystkie boczne gałęzie za pomocą pojedynczych pasm drażnionych z szwów 10-0, aby utrzymać stałe ciśnienie w tętnicy.
Następnie ustaw mikroskop wideo składający się z kamery wideo podłączonej do mikroskopu preparacyjnego, która jest podłączona do mikrometru wideo i monitora telewizyjnego. Użyj tej konfiguracji, aby zmierzyć wewnętrzną średnicę tętnicy. Oceń ton miogenny i reakcje naczyń krwionośnych na bodźce rozszerzające naczynia krwionośne, upewniając się, że tętnica wykazuje odpowiedni poziom aktywnego tonu przed eksperymentem.
Odrzuć wszystkie tętnice, które nie mają aktywnego tonu w spoczynku, z wyjątkiem naczyń, takich jak małe tętnice krezkowe, które zwykle nie wykazują aktywnego tonu spoczynkowego. Następnie dodaj rosnące stężenie acetylocholiny do komory naczynia i zmierz średnice naczynia, aby przetestować zależną od śródbłonka reaktywność kaniulowanej tętnicy oporowej. W tym przykładzie tętnica wykazuje dysfunkcję śródbłonka, o czym świadczy brak jej rozszerzania w odpowiedzi na acetylocholinę.
Pod koniec eksperymentu określ maksymalną średnicę tętnicy, dodając bezwapniowy roztwór soli fizjologicznej do perfuzatu i superfuzatu. Użyj tego pomiaru, aby obliczyć procent aktywnego tonu spoczynkowego. Wykazanie maksymalnego rozwarcia w roztworze soli fizjologicznej bez wapnia potwierdza, że niezdolność tętnicy do rozszerzenia w odpowiedzi na acetylocholinę była spowodowana dysfunkcją śródbłonka, a nie niezdolnością tętnicy do rozluźnienia się z powodu przebudowy strukturalnej naczynia.
Rysunek ten ilustruje reakcje na zależną od śródbłonka acetylocholinę rozszerzającą naczynia krwionośne w izolowanych tętnicach środkowych mózgu od samców szczurów wrażliwych na sól Dahla w trzech zwężonych szczepach kongenicznych. Pokazuje to, że zależne od śródbłonka rozszerzenie na acetylocholinę było nieobecne w wrażliwym na sól szczepie rodzicielskim i w obu szczepach kongenicznych zachowujących wrażliwy na sól allel Renana. Normalna dylatacja została przywrócona w szczepie kongenicznym przenoszącym brązowy allel norweski Renan w tle genetycznym wrażliwym na sól, co potwierdza hipotezę, że dysfunkcja śródbłonka u szczurów SS jest spowodowana upośledzoną regulacją genu Renan.
W tym eksperymencie, niepowodzenie diety o wysokiej zawartości soli w celu wyeliminowania zależnego od śródbłonka rozszerzenia na acetylocholinę u jednego konkretnego szczepu szczurów, odkrycia dotyczące czynników przyczyniających się do stresu oksydacyjnego naczyń krwionośnych i dysfunkcji śródbłonka podczas wzrostu spożycia soli w diecie. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu trzech do 3 1/2 godziny, jeśli jest wykonywana prawidłowo. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, aby bardzo ostrożnie obchodzić się z izolowaną tętnicą, aby uniknąć uszkodzenia mięśni gładkich, a zwłaszcza śródbłonka.
Po tej procedurze można zastosować inne metody, takie jak dodanie agonistów lub antagonistów receptorów zwężających naczynia krwionośne i rozszerzających naczynia krwionośne, aby odpowiedzieć na pytania, w tym mechanizmy wpływające na reaktywność naczyń krwionośnych na różne substancje i mechanizmy działania leków na naczynia krwionośne. Po jej opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom z dziedziny biologii naczyniowej i fizjologii mikrokrążenia do zbadania funkcji mięśni gładkich i śródbłonka w tętnicach oporowych z różnych łożysk naczyniowych zwierząt doświadczalnych i ludzi. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak używać tej metody do oceny mechanizmów kontroli śródbłonka i mięśni gładkich naczyń krwionośnych w tętnicach o małym oporze z różnych łożysk naczyniowych.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Niniejszy rękopis przedstawia protokoły in vitro wideo-mikroskopii do oceny funkcji naczyń krwionośnych w szczurzych mózgowych tętnicach oporu. Zawiera również szczegółowe opisy technik oceny gęstości mikronaczyń i perfuzji tkankowej.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biologia naczyń
- Funkcja mikrokrążenia
- Mechanizmy kontroli działania komórek śródbłonka i mięśni gładkich
Tło
- Tętnice oporu odgrywają kluczową rolę w regulacji przepływu krwi.
- Rozumienie reaktywności naczyń na bodźce wazoaktywne jest niezbędne w badaniach nad naczyniami.
- Izolowanie tętnic może dostarczyć wglądu w funkcjonowanie naczyń bez komplikacji in vivo.
- Niniejsze badanie ma na celu poszerzenie wiedzy na temat dysfunkcji naczyniowej i jej implikacji dla terapii.
Cel badania
- Ocena reaktywności naczyń w izolowanych tętnicach oporu.
- Ocena zmian w mechanizmach kontroli mięśni gładkich.
- Badanie pasywnych właściwości mechanicznych małych tętnic oporu.
Zastosowanie metod
- Protokoły in vitro wideo-mikroskopii.
- Fluorescencyjnie oznakowane lektyny do oceny gęstości mikronaczyń.
- Laser Doppler Flowmetry do oceny perfuzji tkankowej.
- Izolowanie tętnic oporu w celu utrzymania normalnego ciśnienia podczas testów.
Główne wyniki
- Wykazano zdolność do izolowania tętnic oporu z ich otoczenia.
- Pokazano, jak skutecznie testować reakcje na bodźce wazoaktywne.
- Dostarczono wglądu w interakcje między komórkami śródbłonka a mięśniami gładkim naczyń.
- Podkreślono implikacje diagnozowania dysfunkcji naczyniowej.
Wnioski
- Technika ta pozwala na szczegółowe badanie funkcji naczyniowych w kontrolowanym środowisku.
- Może prowadzić do postępów w rozumieniu chorób naczyniowych.
- Wyniki mogą wpłynąć na podejście terapeutyczne do dysfunkcji naczyniowej.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
This protocol enables mechanistic de-risking of vascular targets by isolating resistance arteries from confounding parenchymal influences, providing predictive confidence in endothelial and smooth muscle control mechanisms. It supports target validation in preclinical models by maintaining physiological pressure and allowing direct assessment of vasoactive responses. The approach bridges molecular reductionist findings with integrative vascular physiology, enhancing translational relevance for cardiovascular drug discovery.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by testing endothelial-dependent and independent vasodilator pathways in isolated resistance arteries.
- Operational Value: Enables functional target validation by assessing changes in smooth muscle control mechanisms and passive mechanical properties under controlled conditions.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by identifying vascular phenotypes linked to specific genetic backgrounds, such as Renan allele regulation in salt-sensitive hypertension models.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream workflows by establishing baseline vascular tone and reactivity profiles.
- Operational Value: Addresses assay standardization and reproducibility through pressure-controlled perfusion and video microscopy-based diameter measurements.
- Scalability: Highlights platform reuse across vascular beds and genetically engineered rat strains for consistent compound evaluation.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Discusses application to peripheral and coronary artery disease models through evaluation of endothelial dysfunction in genetically defined rat strains.
- Translational Continuity: Describes continuity from discovery through preclinical validation by using techniques applicable to both isolated vessels and in vivo perfusion assessments via Laser Doppler Flowmetry.
- Risk-Adjusted Advancement: Addresses mechanistic de-risking by distinguishing endothelial dysfunction from structural remodeling via calcium-free solution-induced maximal dilation.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing to lead identification, supporting mechanistic insight before compound screening in vascular biology programs.
- Discovery Biology: Explains how the method supports hypothesis testing of endothelial and vascular smooth muscle control mechanisms in small-resistance arteries under various conditions.
- Screening: Describes assay readiness through reproducible isolation and cannulation techniques that maintain arterial integrity for consistent vasoactive stimulus testing.
- Analytics: Highlights quantitative dependent variable measurements (internal diameter changes via video microscopy) that enable comparison of vasodilator and vasoconstrictor responses.
- Translational Research: Connects the method to preclinical continuity through parallel use of Laser Doppler Flowmetry for tissue perfusion and fluorescent lectin labeling for microvessel density in related vascular studies.
- Enterprise Reuse: Frames the method as a reusable capability across vascular beds and rat strains, reducing redundant model development in cardiovascular research programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation, reduction of mechanistic ambiguity in vascular control pathways.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of isolated artery preparations for consistent pharmacological profiling.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk by confirming target engagement in physiologically relevant ex vivo models.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on confirmed endothelial function and smooth muscle responsiveness in disease-relevant genetic models.
Implementation Considerations
- Required scientific expertise in microvascular dissection, cannulation techniques, and video microscopy operation.
- Instrumentation and analytical infrastructure needs including pressure-regulated perfusion systems, video microscopes with micrometers, and pressure transducers.
- Cross-team standardization requirements for arterial isolation, suture ligation, and pressure maintenance protocols across laboratories.
- Adaptation considerations across model systems, including adjustment of perfusion pressures and solution compositions for different vascular beds and species.
- Practical limitations supported by source material: delicate microcannulation steps require significant training to avoid endothelial or smooth muscle damage, and arteries lacking active resting tone (e.g., small mesenteric arteries) may be excluded from tone-dependent analyses.
