Name: Test aktywności polimerazy DNA przy użyciu znakowanego fluorescencyjnie DNA w bliskiej podczerwieni wizualizowanego za pomocą elektroforezy w żelu akrylowym (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-06T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 38 s
Description: Poznaj analizę aktywności polimerazy DNA na poziomie pojedynczego nukleotydu przy użyciu elektroforezy w żelu akrylowym i fluorescencyjnego znakowania. Ta metoda umożliwia precyzyjną obserwację wpływu modyfikacji DNA na syntezę.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Research Corporation for Scientific Advancement (Cottrell College Scholar Award #22548) oraz przez TriLink Biotechnologies (ResearchReward Grant #G139).

<ol><li>Ong, J. L., Loakes, D., Jaroslawski, S., Too, K., Holliger, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+evolution+of+DNA+polymerase%2C+RNA+polymerase+and+reverse+transcriptase+activity+in+a+single+polypeptide%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Directed evolution of DNA polymerase, RNA polymerase and reverse transcriptase activity in a single polypeptide.</a> J Mol Biol. 361 (3), 537-550 (2006).</li>
<li>Chen, T., Romesberg, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+polymerase+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+letters%22%5BJournal%5D)">Directed polymerase evolution.</a> FEBS letters. 588 (2), 219-229 (2014).</li>
<li>Leconte, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+evolution+of+DNA+polymerases+for+next-generation+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Ed+Engl%22%5BJournal%5D)">Directed evolution of DNA polymerases for next-generation sequencing.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 49 (34), 5921-5924 (2010).</li>
<li>Xia, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+evolution+of+novel+polymerase+activities%3A+mutation+of+a+DNA+polymerase+into+an+efficient+RNA+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Directed evolution of novel polymerase activities: mutation of a DNA polymerase into an efficient RNA polymerase.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (10), 6597-6602 (2002).</li>
<li>Chen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+thermophilic+DNA+polymerases+for+the+recognition+and+amplification+of+C2%27-modified+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem%22%5BJournal%5D)">Evolution of thermophilic DNA polymerases for the recognition and amplification of C2'-modified DNA.</a> Nat Chem. 8 (6), 556-562 (2016).</li>
<li>Thirunavukarasu, D., Chen, T., Liu, Z., Hongdilokkul, N., Romesberg, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+of+2%27-Fluoro-Modified+Aptamers+with+Optimized+Properties%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Selection of 2'-Fluoro-Modified Aptamers with Optimized Properties.</a> J Am Chem Soc. 139 (8), 2892-2895 (2017).</li>
<li>Taylor, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Catalysts+from+synthetic+genetic+polymers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Catalysts from synthetic genetic polymers.</a> Nature. 518 (7539), 427-430 (2015).</li>
<li>Alves Ferreira-Bravo, I., Cozens, C., Holliger, P., DeStefano, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+of+2%27-deoxy-2%27-fluoroarabinonucleotide+%28FANA%29+aptamers+that+bind+HIV-1+reverse+transcriptase+with+picomolar+affinity%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Selection of 2'-deoxy-2'-fluoroarabinonucleotide (FANA) aptamers that bind HIV-1 reverse transcriptase with picomolar affinity.</a> Nucleic Acids Res. 43 (20), 9587-9599 (2015).</li>
<li>Schultz, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Taq+DNA+Polymerase+Mutants+and+2%27-Modified+Sugar+Recognition%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Taq DNA Polymerase Mutants and 2'-Modified Sugar Recognition.</a> Biochemistry. 54 (38), 5999-6008 (2015).</li>
<li>Rosenblum, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+discovery+of+new+combinations+of+mutant+DNA+polymerases+and+modified+DNA+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Chembiochem%22%5BJournal%5D)">Design and discovery of new combinations of mutant DNA polymerases and modified DNA substrates.</a> Chembiochem. 18 (8), 816-823 (2017).</li>
<li>Creighton, S., Goodman, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gel+kinetic+analysis+of+DNA+polymerase+fidelity+in+the+presence+of+proofreading+using+bacteriophage+T4+DNA+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Gel kinetic analysis of DNA polymerase fidelity in the presence of proofreading using bacteriophage T4 DNA polymerase.</a> J Biol Chem. 270 (9), 4759-4774 (1995).</li>
<li>Joyce, C. M., Benkovic, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+polymerase+fidelity%3A+kinetics%2C+structure%2C+and+checkpoints%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">DNA polymerase fidelity: kinetics, structure, and checkpoints.</a> Biochemistry. 43 (45), 14317-14324 (2004).</li>
<li>Leconte, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery%2C+characterization%2C+and+optimization+of+an+unnatural+base+pair+for+expansion+of+the+genetic+alphabet%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Discovery, characterization, and optimization of an unnatural base pair for expansion of the genetic alphabet.</a> J Am Chem Soc. 130 (7), 2336-2343 (2008).</li>
<li>Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+sequencing+with+chain-terminating+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">DNA sequencing with chain-terminating inhibitors.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 74 (12), 5463-5467 (1977).</li>
<li>Karger, B. L., Guttman, A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2782523/">DNA Sequencing by Capillary Electrophoresis.</a> Electrophoresis. 30 (Suppl 1), S196-S202 (2009).</li>
<li>Lawyer, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-level+expression%2C+purification%2C+and+enzymatic+characterization+of+full-length+Thermus+aquaticus+DNA+polymerase+and+a+truncated+form+deficient+in+5%27+to+3%27+exonuclease+activity%5BTitle%5D)+AND+%22PCR+Methods+Appl%22%5BJournal%5D)">High-level expression, purification, and enzymatic characterization of full-length Thermus aquaticus DNA polymerase and a truncated form deficient in 5' to 3' exonuclease activity.</a> PCR Methods Appl. 2 (4), 275-287 (1993).</li>
<li>Lawyer, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+characterization%2C+and+expression+in+Escherichia+coli+of+the+DNA+polymerase+gene+from+Thermus+aquaticus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Isolation, characterization, and expression in Escherichia coli of the DNA polymerase gene from Thermus aquaticus.</a> J Biol Chem. 264 (11), 6427-6437 (1989).</li>
<li>Carroll, S. S., Cowart, M., Benkovic, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mutant+of+DNA+polymerase+I+%28Klenow+fragment%29+with+reduced+fidelity%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A mutant of DNA polymerase I (Klenow fragment) with reduced fidelity.</a> Biochemistry. 30 (3), 804-813 (1991).</li>
<li>Shendure, J., Ji, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+DNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Next-generation DNA sequencing.</a> Nat Biotechnol. 26 (10), 1135-1145 (2008).</li>
<li>Larsen, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+general+strategy+for+expanding+polymerase+function+by+droplet+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">A general strategy for expanding polymerase function by droplet microfluidics.</a> Nat Commun. 7, 11235(2016).</li>
<li>Cozens, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+Synthesis+of+Nucleic+Acids+with+Defined+Regioisomeric+2%27-5%27+Linkages%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Ed+Engl%22%5BJournal%5D)">Enzymatic Synthesis of Nucleic Acids with Defined Regioisomeric 2'-5' Linkages.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 54 (51), 15570-15573 (2015).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Tutaj opisaliśmy test charakteryzujący syntezę M-DNA za pośrednictwem polimerazy DNA. Stosując znakowane w bliskiej podczerwieni startery DNA i elektroforezę w żelu poliakrylamidowym denaturującym w celu rozdzielenia oligonukleotydów o różnych rozmiarach, możemy uzyskać rozdzielczość pojedynczego nukleotydu na oligonukleotydach, umożliwiając precyzyjny pomiar syntezy. Podejścia te mogą być stosowane zarówno do pomiaru ogólnej aktywności enzymu (sekcja 2.1), jak i do pomiaru parametrów Michaelisa-Mentena w poszczególnych ...

Polimerazy DNA przeprowadzają dokładną i wydajną syntezę DNA oraz są niezbędne do utrzymania integralności genomu. Zdolność do syntezy setek nukleotydów na sekundę bez popełniania błędów sprawia, że polimerazy DNA są również niezbędnymi narzędziami w biologii molekularnej i biotechnologii. Jednak właściwości te ograniczają również zastosowania substratów M-DNA; ogólnie rzecz biorąc, naturalne polimerazy DNA nie mogą syntetyzować wielu potencjalnie cennych substratów M-DNA, prawdopodobnie ze względu na wysoką presję selekcyjną przeciwko stosowaniu niestandardowych substratów in vivo. Wiele grup opracowało ukierunkowane podejścia ewolucyjne w celu wygenerowania zmutowanych polimeraz DNA zdolnych do syntezy M-DNA1a,2,3,4,5; Wysiłki te rozszerzyły biotechnologiczną użyteczność DNA6,7,8.
Aby ocenić zdolność zmutowanych polimeraz DNA do syntezy M-DNA, my9,10, a inni11,12,13 zazwyczaj używamy pomiarów in vitro aktywności polimerazy DNA, które są opisane w tym manuskrypcie. W tych eksperymentach polimerazy DNA są inkubowane jednocześnie z znakowanym dupleksem startera/matrycy i substratami trifosforanu nukleozydu; Produkty są oceniane za pomocą elektroforezy żelowej. W zależności od konkretnego pytania eksperymentalnego można stosować zmutowane polimerazy DNA, zmodyfikowane startery, zmodyfikowane matryce lub zmodyfikowane trifosforany nukleozydów, umożliwiające systematyczną biochemiczną ocenę aktywności zmutowanego enzymu.
Historycznie, te testy opierały się na radioaktywnym znaczniku 5' do śledzenia syntezy DNA; najczęściej stosowano 32P i 33P; zazwyczaj etykietowanie odbywa się za pomocą kinazy polinukleotydowej T411. Jednak ze względu na ograniczoną żywotność i stosunkowo wysoki koszt etykiet radioaktywnych oraz ich bezpiecznej utylizacji, nasza grupa zamiast tego używa syntetycznego 5' DNA znakowanego fluoroforem w bliskiej podczerwieni. Korzystając ze stosunkowo taniego żelowego imagera w bliskiej podczerwieni, zaobserwowaliśmy podobne granice wykrywalności jak w poprzednich badaniach z użyciem znaczników radioaktywnych (wyniki niepublikowane). Udało nam się odtworzyć wcześniejsze obserwacje9 i nie zaobserwowaliśmy żadnej dużej różnicy ilościowej w stosunku do wcześniej zmierzonych stałych szybkości (niepublikowane wyniki).
Aby przeanalizować rozmiar DNA, a tym samym zakres syntezy DNA, polegamy na metodach elektroforezy w żelu poliakrylamidowym, opracowanych pierwotnie dla sekwencjonowania Sangera14 przed nadejściem elektroforezy kapilarnej15. Odległość separacji lub ruchliwości może być wykorzystana jako miara masy cząsteczkowej; Wielkoformatowe, pionowe żele poliakrylamidowe mogą osiągać rozdzielczość pojedynczego nukleotydu, umożliwiając ilościową obserwację oligonukleotydów DNA o różnej długości.
Podsumowując, te eksperymenty są solidną metodą charakterystyki polimerazy. Ze względu na wrażliwy na czas charakter reakcji, konieczne jest przygotowanie i pielęgnacja w celu osiągnięcia powtarzalnych wyników. Ponadto, chociaż żel akrylamidowy jest bardzo skutecznym sposobem pomiaru syntezy DNA, a także wielu innych reakcji modyfikujących DNA, z rozdzielczością pojedynczego nukleotydu, może to być wyzwanie techniczne. Miejmy nadzieję, że ten protokół umożliwi użytkownikom przeprowadzanie tych eksperymentów, unikając przy tym najczęstszych błędów.

<table><tbody><tr><td>Tris HCl</td><td>Promega</td><td>H5123</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Promega</td><td>H5131</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP214-500</td><td></td></tr><tr><td>Acetylowany BSA</td><td>Promega</td><td>PR-R3961</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P4504</td><td></td></tr><tr><td>Ditiothreitol (tj. DTT)</td><td>Research Products International</td><td>D11000</td><td></td></tr><tr><td>Kwas etylenodiaminotetraoctowy (tj. EDTA) (roztwór 0,5M) Sigma</td><td></td> <td>03690-100mL</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Sigma</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>Formamid</td><td>Acros</td><td>AC42374-5000</td><td></td></tr><tr><td>Pomarańczowy G</td><td>Sigma Aldrich</td><td>O3756</td><td></td></tr><tr><td>Błękit bromofenolowy</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-701-6973</td><td></td></tr><tr><td>dNTPs</td><td>Fisher Scientific</td><td>FERR0191</td><td></td></tr><tr><td>M-dNTP (ryboNTPs)</td><td>Fisher Scientific</td><td>45-001-341 (343, 345, 347)</td><td></td></tr><tr><td>M-dNTPs (wszystkie inne zmodyfikowane NTP)</td><td>TriLink Biotechnologies</td><td>assorted</td><td></td></tr><tr><td>primer 1</td><td>IDT DNA / TriLink Biotechnologies</td><td>Niestandardowe syntezy</td><td>Używamy barwnika IR700, który można kupić jako niestandardową syntezę. Zazwyczaj kupujemy oligonukleotydy oczyszczone metodą HPLC. Sekwencja to 5'-dTAATACGACTCACTATAGGAGA, matryca</td></tr><tr><td>1</td><td>IDT DNA / TriLink Biotechnologies</td><td>Niestandardowe syntezy</td><td>Zazwyczaj kupujemy oligonukleotydy oczyszczone metodą HPLC. Sekwencja to 5'-dCGCTAGGACGGCATTGGATCAGTCTCTCTATAGTGAGTCGTATTA</td></tr><tr><td>Acrylamide</td><td>Research Products International</td><td>A11405</td><td>38,67% akrylamidu i 1,33% bis-akrylamidu</td></tr><tr><td>Tris/Boran/EDTA (TBE) stałe</td><td>Produkty Badawcze Międzynarodowe</td><td>T22020</td><td></td></tr><tr><td>Mocznik ultraczysty</td><td>Produkty badawcze Międzynarodowe</td><td>U20200</td><td></td></tr><tr><td>Taśma żelowa</td><td>CBS Scientific</td><td>GT-72-10</td><td></td></tr><tr><td>Duży biały zacisk sprężynowy polipropylen</td><td>CBS Scientific</td><td>GPC-0001</td><td></td></tr><tr><td>Nadsiarczan amonu (APS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP179</td><td></td></tr><tr><td>Tetrametyloetylenodiamina (TEMED)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP15020</td><td></td></tr><tr><td>Przekładki 0,75 mm</td><td>CBS Scientific</td><td>SGS-20-0740A</td><td></td></tr><tr><td>33x42 Zestaw płyt szklanych z karbem</td><td>CBS Scientific</td><td>SGP33-040A</td><td></td></tr><tr><td>Separator płytkowy</td><td>klinowy CBS Scientific</td><td>WPS-100</td><td></td></tr><tr><td>Grzebień do elektroforezy żelowej</td><td>CBS Scientific</td><td>SG33-0734</td><td></td></tr><tr><td>Urządzenie do elektroforezy żelowej</td><td>CBS Scientific</td><td>SG-400-33</td><td></td></tr><tr><td>woda</td><td></td><td></td> ultraczysta <td>używamy systemu Milli-Q firmy polimerazy</td></tr> <tr><td></td><td></td><td></td><td>DNA MilliporePrzygotowujemy je w naszym laboratorium na podstawie opublikowanych protokołów.</td></tr></tbody></table>

test aktywności polimerazy dna przy użyciu znakowanego fluorescencyjnie dna w bliskiej podczerwieni wizualizowanego za pomocą elektroforezy w żelu akrylowym

DNA Polymerase Activity Assay Using Near-infrared Fluorescent Labeled DNA Visualized by Acrylamide Gel Electrophoresis

Dla każdego enzymu, wymagane są solidne, ilościowe metody do charakterystyki zarówno enzymów natywnych, jak i modyfikowanych. W przypadku polimeraz DNA syntezę DNA można scharakteryzować za pomocą testu syntezy DNA in vitro, a następnie elektroforezy w żelu poliakrylamidowym. Celem tego testu jest ilościowe określenie syntezy zarówno naturalnego DNA, jak i zmodyfikowanego DNA (M-DNA). Podejścia te są szczególnie przydatne do rozdzielania oligonukleotydów z rozdzielczością pojedynczego nukleotydu, umożliwiając obserwację poszczególnych etapów podczas enzymatycznej syntezy oligonukleotydów. Metody te zostały zastosowane do oceny szeregu właściwości biochemicznych i biofizycznych, takich jak pomiar stałych szybkości w stanie ustalonym poszczególnych etapów syntezy DNA, wskaźnik błędów syntezy DNA i powinowactwo wiązania DNA. Stosując zmodyfikowane składniki, w tym między innymi zmodyfikowane trifosforany nukleozydów (NTP), M-DNA i/lub zmutowane polimerazy DNA, można skutecznie ocenić względną użyteczność par polimerazy substrat-DNA. W tym miejscu szczegółowo opisujemy sam test, w tym zmiany, które należy wprowadzić, aby dostosować się do nietradycyjnych strategii znakowania DNA starterowego, takich jak DNA znakowane fluorescencyjnie w bliskiej podczerwieni. Dodatkowo szczegółowo opisaliśmy kluczowe kroki techniczne dotyczące nalewania i uruchamiania żelu akrylowego, które często mogą być wyzwaniem technicznym.

Przedstawiono wyniki poprawnej analizy żelowej z poliakryloamidu dla jakościowej charakterystyki ogólnej aktywności (opisanej w sekcji 2.1, Rycina 1) oraz kinetyki stanu stacjonarnego (opisanej w uwadze na końcu sekcji 2.1, Rycina 2>). Przedstawiono również przykład nieudanej analizy żelowej z poliakryloamidu (Rycina 3).
Należy zauważyć, że...

Ten protokół opisuje charakterystykę syntezy modyfikowanego DNA przez polimerazę DNA poprzez obserwację zmian w DNA znakowanym fluorescencyjnie w bliskiej podczerwieni za pomocą elektroforezy żelowej i obrazowania żelowego. Żele akrylamidowe są używane do obrazowania w wysokiej rozdzielczości separacji krótkich kwasów nukleinowych, które migrują z różną szybkością w zależności od wielkości.

Test aktywności polimerazy DNA przy użyciu znakowanego fluorescencyjnie DNA w bliskiej podczerwieni wizualizowanego za pomocą elektroforezy w żelu akrylowym

For any enzyme, robust, quantitative methods are required for characterization of both native and engineered enzymes. For DNA polymerases, DNA synthesis ...

Ogólnym celem tej procedury jest analiza aktywności polimerazy DNA na poziomie pojedynczych nukleotydów. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu badań nad polimerazą DNA, takie jak określenie, które konkretne etapy syntezy DNA są ograniczane przez modyfikacje DNA. Główną zaletą tej techniki jest możliwość obserwacji zmian pojedynczych nukleotydów, co umożliwia precyzyjne śledzenie aktywności polimerazy.Podczas wykonywania tej procedury ważne jest wcześniejsze zaplanowanie wszystkich etapów. Wiele z nich jest zależnych od czasu. Przed rozpoczęciem procedury należy najpierw przygotować bufory, mieszaninę dupleksów DNA oraz rozcieńczenie białka zgodnie z opisem w protokole tekstowym.Następnie ustaw temperaturę suchego bloku na 50 °C. Dodaj 24 µL mieszaniny wyżarzowanego dupleksu do probówki do mikrocentrifugi zawierającej 25 µL 2X dNTPs. Po tym czasie przenieś 9,8 µL tej mieszaniny do probówki do mikrocentrifugi zawierającej 20 µL pomarańczowego buforu gaszącego (quenching buffer orange), aby przygotować kontrolę bez enzymu.Następnie dodaj 0,8 µL enzymu 50X do mieszaniny dNTP w formie dupleksu. Użyj pipety o dużej objętości, aby dokładnie wymieszać roztwór. Inkubuj w bloku grzewczym.Zatrzymaj reakcję, pobierając 10 µL każdej mieszaniny reakcyjnej i dodając ją do probówki do mikrowirówki zawierającej 20 µL buforu zatrzymującego orange. Przygotuj mieszaninę akrylamidu do elektroforezy żelowej zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Następnie dokładnie umyj mydłem i wodą dwie płyty do żelu o wymiarach 33 cm na 42 cm.Osusz każdą powierzchnię płytki za pomocą ręczników papierowych, a następnie użyj delikatnych ściereczek do precyzyjnego czyszczenia, aby osuszyć pozostałe obszary. Przepłucz osuszone płytki 70% etanolem i ponownie przetrzyj każdą z nich ściereczkami. Po tym kroku opłucz dłoń w rękawiczce wodą dejonizowaną, a następnie za pomocą zwilżonych palców delikatnie zwilż niektóre dystansory o grubości 0,75 mm.Umieść przekładki wzdłuż krawędzi naciętej płyty. Użyj chłonnych ręczników, aby usunąć wodę, która mogła rozpryskać się na płyty. Złóż płyty, a następnie za pomocą taśmy do żeli zaklej dno i boki, pozostawiając górę niezaklejona.Upewnij się, że taśma jest równo dopasowana i szczelnie przyklejona. Za pomocą żyletki odetnij końce taśmy. Następnie dodaj dodatkową warstwę taśmy na spodzie żelu.Po przygotowaniu odczynników należy wziąć butelkę z atomizerem i zdjąć stożkowy lejek. Za pomocą cylindra miarowego należy wlać 125 mililitrów wody. Następnie za pomocą permanentnego markerem należy zaznaczyć poziom wody na zewnętrznej ściance butelki.Wylać wodę. Następnie przygotować pierścienie korkowe oraz „kanapkę” z płytek obok zlewu, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Pustą butelkę do rozpylania oraz przygotowane roztwory APS i TEMED ustawić po drugiej stronie zlewu.Przygotuj grzebień o odpowiedniej liczbie zębów oraz cztery zaciski. Następnie do butelki z rozpylaczem wlej 20% roztwór żelu akryloamidowego do zaznaczonego poziomu. Jednocześnie dodaj 120 µL TEMED oraz 600 µL APS do roztworu żelu poliakryloamidowego.Szybko dodaj dodatkowe 600 µL APS. Bezzwłocznie zakręć butelkę z dozownikiem i wymieszaj, delikatnie obracając naczynie. Następnie umieść kanapkę z płytkami w zlewie.Rozpocznij wlewanie, wywierając powolny i jednostajny nacisk na butelkę, aby zapewnić równomierny przepływ roztworu żelu. Wlewaj do momentu, aż żel dotrze do obszaru z wycięciem i zacznie go lekko przelewać. Przechyl płytki, aby usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza.Następnie należy włożyć grzebień do zestawu płytek. Umieść zaciski na grzebieniu w taki sposób, aby dociskały go, zapewniając równomierny rozkład studzienek. Szybko wlej pozostały roztwór żelu z butelki do odpowiedniego pojemnika na odpady.Przepłucz butelkę trzy razy wodą dejonizowaną za pomocą butelki z myjką, aby ją oczyścić. Na początek usuń wszystkie żabki biurowe z zestawu płytek. Za pomocą żyletki przetnij i usuń taśmę żelową z krawędzi.Przetrzyj szklane powierzchnie ręcznikami papierowymi i wodą, aby usunąć jak największą ilość pozostałości spolimeryzowanego żelu. Użyj żyletki wzdłuż krawędzi, aby zeskrobać pozostały żel. Następnie równomiernie wypchnij grzebień z obu stron, aby go usunąć.Za pomocą żyletki odetnij nadmiar żelu wzdłuż górnej krawędzi kanapki z płytkami. Następnie przetnij żel wzdłuż naciętej krawędzi płytki. Używając strzykawki i wody dejonizowanej, wypłucz studzienki, aby usunąć wszelkie zanieczyszczenia.Upewnij się, że każdy dołek można wypełnić wodą i nie jest on zablokowany przez nadmiar spolimeryzowanego żelu. Następnie umieść zestaw płyt w aparacie w taki sposób, aby dłuższa płyta była skierowana na zewnątrz, a wycięty obszar na wewnątrz. Przypnij zestaw płyt wraz z płytą aluminiową do aparatu.Do zewnętrznej strony płyty dołącz dodatkowe żabki, aby zapewnić równomierne prowadzenie prądu. Dolej bufor TBE w ilości wystarczającej do zakrycia wcięć u podstawy oraz wgłębników u góry. Przeprowadź elektroforezę żelową przy mocy 50 W przez 20 minut, aby rozgrzać płyty.Następnie należy użyć strzykawki i buforu TBE, aby oczyścić dołki. Płukanie strzykawką należy powtórzyć kilka razy, aby upewnić się, że z dołków usunięto wszystkie pozostałe sole buforu. W kolejnym kroku należy przygotować skrajne ścieżki po każdej stronie, zgodnie z opisem w protokole tekstowym.Do odpowiednich studzienek żelu należy dodać 3 µL 95% formamidu z błękitem bromofenolowym. Po nałożeniu wszystkich próbek należy odczekać jedną minutę, aż osiądą. Po podłączeniu aparatury i źródła zasilania należy ustawić moc w zakresie od 50 do 55 W.Prowadź elektroforezę przez około trzy godziny lub do momentu, aż czoło barwnika błękitu bromofenolowego przemieści się co najmniej na dwie trzecie długości żelu. Następnie wykonaj obrazowanie żelu zgodnie z opisem w protokole tekstowym. W niniejszym badaniu opracowano test służący do charakterystyki syntezy modyfikowanego DNA katalizowanej przez polimerazę DNA.Pomyślna jakościowa charakterystyka całkowitej aktywności wykazuje poszczególne pasma, które są wyraźne i regularne. Aktywność ocenia się na podstawie zarówno długości produktów, jak i części znakowanego primera, która została przekształcona w większe produkty. Jak widać, E6 i E5 są enzymami o najwyższej aktywności, podczas gdy E4 i E1 wykazują najniższą aktywność.Za pomocą tych metod można również przeprowadzić analizę ilościową z wykorzystaniem kinetyki stanu stacjonarnego. Ponieważ syntetyzowane są jedynie produkty N oraz N+1, pojedyncze zdarzenie można skutecznie skwantyfikować. Przedstawiona tutaj podstawowa metodologia może zostać zastosowana również do badania wielu innych enzymów modyfikujących DNA lub RNA poza polimerazami.

dna-polymerase-activity-assay-using-near-infrared-fluorescent-labeled

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Egzonukleazy odgrywają kluczową rolę w zapewnieniu stabilności genomu. Utrata funkcji egzonukleazy WRN powoduje przedwczesne starzenie się. Badanie substratów i innych wymagań nukleazy in vitro może pomóc w wyjaśnieniu jej roli in vivo. Tutaj demonstrujemy szybki i powtarzalny test oparty na fluorescencji do pomiaru jego aktywności nukleazy.

Test egzonukleazy oparty na fluorescencji w celu scharakteryzowania DmWRNexo, ortologu ludzkiej egzonukleazy progeroidalnej WRN i jej zastosowania do innych nukleaz

Przedstawiamy strategiczny plan i protokół identyfikacji niekodujących wariantów genetycznych wpływających na wiązanie DNA czynnika transkrypcyjnego (TF). Przedstawiono szczegółowy protokół eksperymentalny dla testu przesunięcia ruchliwości elektroforetycznej (EMSA) i testu powinowactwa DNA (DAPA) analizy wiązania TF DNA zależnego od genotypu.

Badania przesiewowe w kierunku funkcjonalnych niekodujących wariantów genetycznych przy użyciu testu przesunięcia ruchliwości elektroforetycznej (EMSA) i testu precypitacji powinowactwa DNA (DAPA)

Opisujemy tutaj zoptymalizowany protokół fluorescencyjnych testów przesunięcia mobilności elektroforetycznej (fEMSA) przy użyciu oczyszczonych białek SOX-2 wraz z sondami DNA znakowanymi barwnikiem fluorescencyjnym w podczerwieni jako studium przypadku, aby rozwiązać ważne pytanie biologiczne.

Zoptymalizowany protokół do oznaczania przesunięcia ruchliwości elektroforetycznej przy użyciu oligonukleotydów znakowanych barwnikiem fluorescencyjnym w podczerwieni

Półelastyczne polimery wykazują unikalne właściwości mechaniczne, które są szeroko stosowane przez żywe systemy. Jednak systematyczne badania nad biopolimerami są ograniczone, ponieważ właściwości takie jak sztywność polimeru są niedostępne. Niniejszy manuskrypt opisuje, w jaki sposób to ograniczenie jest obchodzone przez programowalne nanorurki DNA, umożliwiając eksperymentalne badania wpływu sztywności włókien.

Nanorurki DNA jako wszechstronne narzędzie do badania polimerów półelastycznych

Ta metoda pozwala na selektywne barwienie i kwantyfikację DNA w żelach poprzez nasączenie żelu w roztworze SYBR Green I/Nitro Blue Tetrazolium, a następnie wystawienie go na działanie światła słonecznego lub źródła niebieskiego światła. Powoduje to powstanie widocznego osadu i nie wymaga prawie żadnego sprzętu, dzięki czemu idealnie nadaje się do użytku w terenie.

Metoda barwienia DNA oparta na wytrącaniu się formazanu wywołanym ekspozycją na światło niebieskie

Ten protokół opisuje nieradioaktywny test do pomiaru aktywności kinaz polinukleotydowych (PNK) na małych substratach DNA i RNA.

Test nieradioaktywny do pomiaru fosforylacji polinukleotydów małych substratów nukleotydowych

Nanomaszyny oparte na DNAzyme mogą być używane do wysoce selektywnego i czułego wykrywania kwasów nukleinowych. W artykule opisano szczegółowy protokół projektowania nanomaszyn opartych na DNAzyme z rdzeniem 10-23 przy użyciu wolnego oprogramowania i ich zastosowania w wykrywaniu fragmentu wirusa Epsteina-Barr jako przykładu.

DNAzyme 10-23 - Nanomaszyny do rozpoznawania kwasów nukleinowych

Tutaj przedstawiono protokół oznaczania enzymów metabolizujących kwasy nukleinowe, na przykładzie enzymów ligazy, nukleazy i polimerazy. Test wykorzystuje znakowane fluorescencyjnie i nieznakowane oligonukleotydy, które można łączyć w dupleksy naśladujące uszkodzenia RNA i / lub DNA lub pośrednie szlaki, co pozwala na scharakteryzowanie zachowania enzymu.

Wykorzystanie zmodyfikowanych syntetycznych oligonukleotydów do oznaczania enzymów metabolizujących kwasy nukleinowe

W pracy przedstawiono prosty, przyjazny dla użytkownika ratiometryczny test FRET do wykrywania i ilościowej oceny aktywności DNazy oraz wykazano jego zastosowanie w analizie słabej nukleazy.

Ocena aktywności DNazy za pomocą ratiometrycznego transferu energii rezonansu fluorescencji

Protokół ten demonstruje wykonanie testu pojedyncząłego w celu wizualizacji na żywo rozwijania DNA za pomocą helikazy CMG. Opisuje (1) przygotowanie substratu DNA, (2) oczyszczanie fluorescencyjnie znakowanej helikazy Drosophila melanogaster CMG, (3) przygotowanie komórki przepływowej mikrofluidycznej do mikroskopii całkowitej fluorescencji odbicia wewnętrznego (TIRF) oraz (4) test odwijania DNA pojedyncząłą.

Wizualizacja rozwijania DNA w czasie rzeczywistym pojedyncząłą cząsteczką przez helikazę CMG

Ten protokół opisuje test replikacji pojedynczej cząsteczki DNA oparty na mikroskopii fluorescencyjnej, umożliwiając wizualizację w czasie rzeczywistym interakcji między polimerazami DNA a przeszkodami, takimi jak struktury G-quadruplex.

Wizualizacja fluorescencji pojedynczej cząsteczki dynamiki polimerazy DNA w G-kwadrupleksach

Poznaj analizę aktywności polimerazy DNA na poziomie pojedynczego nukleotydu przy użyciu elektroforezy w żelu akrylowym i fluorescencyjnego znakowania. Ta metoda umożliwia precyzyjną obserwację wpływu modyfikacji DNA na syntezę.

Test aktywności polimerazy DNA przy użyciu znakowanego fluorescencyjnie DNA w bliskiej podczerwieni wizualizowanego za pomocą elektroforezy w żelu akrylowym (Wideo) | JoVE Journal

Test aktywności polimerazy DNA przy użyciu znakowanego fluorescencyjnie DNA w bliskiej podczerwieni wizualizowanego za pomocą elektroforezy w żelu akrylowym

Przeglądaj więcej filmów