Pobieranie biofilmu w jamie ustnej do analizy mikrobiomu u zdrowych dzieci
December 31st, 2017
Zmiany w mikrobiomie jamy ustnej w dzieciństwie budzą coraz większe zainteresowanie. Porównanie różnych badań mikrobiomu ujawnia brak ustandaryzowanych protokołów pobierania próbek. Ograniczona przestrzeń sprawia, że pobieranie próbek dźwiękowych bruzd poddziąsłowych u dzieci jest wyzwaniem. Próbkowanie punktowe na papierze jest tutaj szczegółowo przedstawione jako metoda z wyboru dla tego obszaru.
Ogólnym celem tej procedury jest przedstawienie znormalizowanej metody pobierania próbek biofilmu w jamie ustnej do analizy mikrobiomu u zdrowych dzieci. Osiąga się to poprzez uprzednie przygotowanie i sterylizację narzędzi i materiałów. Następnie dziecko jest przygotowywane do pobrania biofilmu.
Następnie pobiera się biofilm z trzech miejsc: bruzdy poddziąsłowej, błony śluzowej fałdu przedsionkowego i śliny. Na koniec próbki są systematycznie przechowywane. Docelowo przeprowadzone zostaną analizy mikrobiomu jamy ustnej, aby odpowiedzieć na pytania kliniczne i naukowe.
Cześć, jestem Elżbieta i jestem ortodontą. Moje badania koncentrują się na zmianach mikrobiomu jamy ustnej, które towarzyszą leczeniu ortodontycznemu. Pobieranie próbek biofilmu z jamy ustnej może być trudne.
Przestrzeń w bruździe poddziąsłowej jest ograniczona, zwłaszcza u dzieci. Porównując nasze dane dotyczące mikrobiomu z badaniami na całym świecie, stwierdziliśmy brak ustandaryzowanych protokołów pobierania próbek. W tym filmie robimy pierwszy krok, aby wypełnić tę lukę.
Skalibrowane i sterylne groty papierowe, które są zwykle stosowane w leczeniu endodontycznym, są wycinane na pierwszym znaku pierścienia w celu ujednolicenia ich długości. Po cięciu papierowe punkty muszą zostać naświetlane promieniami UV, aby uniknąć zanieczyszczenia DNA i RNA. Probówki do przechowywania będą również sterylizowane w autoklawie i naświetlane promieniami UV.
Przed pobraniem próbki biofilmu zęby należy całkowicie oczyścić, zaczynając od nałożenia masła kakaowego. Następnie zęby są barwione płytką nazębną. Po zabarwieniu usta spłukuje się wodą.
Zęby są prawidłowo szczotkowane szczoteczką elektryczną i wodą. Nie stosuje się pasty do zębów, ponieważ zmieniłoby to biofilm w jamie ustnej. Retraktor policzków i języka służy do utrzymywania otwartych i suchych ust.
Założenie retraktora wymaga wprawnych i pewnych rąk, tak aby zminimalizować dyskomfort dziecka i aby zabieg był jak najkrótszy. Stosuje się sterylną pęsetę dentystyczną, a miejsce pobierania próbek pozostaje nienaruszone przez cały czas trwania zabiegu. Zęby są czyszczone i suszone sterylnymi wacikami, aby uniknąć wchłaniania płynu naddziąsłowego podczas pobierania próbek z papieru.
Do pobierania próbek biofilmu w jamie ustnej można stosować różne metody. Ze względu na ograniczoną przestrzeń w bruździe poddziąsłowej dzieci, metodą z wyboru jest punktowe pobieranie próbek w formie papierowej. Punkty papieru są wkładane stycznie do określonej długości czterech milimetrów przez 20 sekund.
Należy zachować szczególną ostrożność, aby nie doszło do urazu nabłonka łączącego. Papierowe punkty są następnie przycinane na trzecim znaku do znormalizowanej długości czterech milimetrów. Papierowy punkt może być również wkładany jednocześnie w to samo miejsce lub próbki mogą być łączone z kilku miejsc.
Aparat suchego pola jest usuwany w celu pobrania próbek błony śluzowej i śliny. Punkty papierowe można nakładać w ten sam sposób do pobierania próbki biofilmu błony śluzowej w fałdzie przedsionkowym. Biofilm śliny można zebrać poprzez wypluwanie niestymulowanej śliny.
W zależności od projektu badania, punkty papierowe będą przechowywane jako próbki pojedyncze, zbiorcze lub równoległe. System przechowywania oznaczony kolorami ułatwi dalsze zarządzanie próbkami. Na koniec próbki są przechowywane do analiz mikrobiomu w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.
Opracowano kilka komercyjnych zestawów do szybkiej i dokładnej identyfikacji bakterii paradontopatogennych. Punkty papierowe są wysyłane do specjalistycznych laboratoriów. Ekstrakcja, przygotowanie i analiza DNA są następnie wykonywane w ciągu trzech godzin.
DNA może być również wykorzystywane w badaniach nad mikrobiomem. Na przykład sekwencjonowanie nowej generacji skutkuje kompletnymi zestawami danych mikrobiomu. Można analizować ogólną względną liczebność niektórych gatunków bakterii, a także zmiany w mikrobiocie spowodowane zmieniającymi się warunkami.
Ten wykres słupkowy i mapa cieplna przedstawiają względną liczebność mikrobioty poddziąsłowej w poszczególnych gromadach i na poziomie kolejności. Różnice w składzie mikrobiologicznym w czasie, porównania między osobnikami lub w ich obrębie lub różne metody pobierania próbek przedstawiono na histogramach. Na rysunku przedstawiono wyniki porównania dwóch metod pobierania próbek, modu A i trybu B, na różnych poziomach taksonomicznych.
Analiza statystyczna wartości utworzonych za pomocą sekwencjonowania nowej generacji może być przedstawiona w tabelach. Różne punkty czasowe, jak pokazano w tej tabeli, mogą być analizowane na różnych poziomach taksonomicznych. Wartości P są obliczane w celu udowodnienia istotnych wyników.
Wreszcie, mikrobiom jamy ustnej na poziomie OTU można uwidocznić za pomocą głównych analiz współrzędnych. Rysunek ten przedstawia różnice wewnątrz- i międzyosobnicze u pięciu badanych. Grupowanie się określonych grup może wskazywać na zmiany w składzie mikrobiomu.
Ta animacja 3D przedstawia wyniki badania kliniczno-kontrolnego. Czerwone kropki to przypadki. Niebieskie kropki to elementy sterujące.
Wyraźne skupienie przypadków po interwencji ortodontycznej w T3, duże czerwone kropki, wizualizują zmianę w mikrobiomie. Niebieskie kropki pokazujące grupę kontrolną są równomiernie rozłożone. Metoda ta może dostarczyć informacji na temat klinicznego pobierania próbek biofilmu w bruździe poddziąsłowej zdrowych dzieci.
Wybraliśmy papierowe punkty jako najbardziej odpowiednie dla tej wrażliwej komory. W tym filmie zastosowaliśmy tę metodę tylko do stanu trwałego. Może być również stosowany w stanach mieszanych lub dojrzałych.
W przypadku niektórych pacjentów można również pobrać próbki z miejsc dotkniętych chorobami przyzębia zgodnie z tym samym protokołem. Cześć, mam na imię Barbara i jestem mikrobiologiem molekularnym. Kiedy analizuję biofilm w laboratorium, muszę polegać na bibliotece bezstronnych próbek klinicznych.
Każdy krok w interdyscyplinarnej dziedzinie badań nad mikrobiologiami jamy ustnej musi być w pełni ustandaryzowany. I jest jeszcze jeden ważny fakt. Sukces można odnieść tylko w zespole.
Dlatego zawsze traktuj swoich współpracowników miło.
Przegląd
Ten artykuł przedstawia standaryzowaną metodę pobierania próbek biofilmu jamy ustnej u zdrowych dzieci, koncentrując się na wyzwaniach związanych z pobieraniem próbek w ograniczonym obszarze kieszeni dziąsłowej. Metoda ma na celu poprawę niezawodności analiz mikrobiomu poprzez rozwiązanie braku standaryzowanych protokołów.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Badania nad mikrobiomem jamy ustnej
- Stomatologia dziecięca
- Techniki pobierania próbek mikrobiomu
Tło
- Zmiany w mikrobiomie jamy ustnej w dzieciństwie są coraz częściej badane.
- Obecne badania mikrobiomu nie mają standaryzowanych protokołów pobierania próbek.
- Pobieranie próbek z kieszeni dziąsłowej u dzieci stanowi unikalne wyzwania.
- Pobieranie próbek za pomocą pałeczek papierowych jest proponowane jako odpowiednia metoda dla tego obszaru.
Cel badania
- Ustanowienie niezawodnej metody pobierania próbek biofilmu jamy ustnej u dzieci.
- Standaryzacja procedur analizy mikrobiomu.
- Ułatwienie porównywania danych mikrobiomu między badaniami.
Zastosowane metody
- Przygotowanie i sterylizacja instrumentów i materiałów.
- Czyszczenie i przygotowanie zębów dziecka przed pobieraniem próbek.
- Pobranie próbek z kieszeni dziąsłowej, błony śluzowej i śliny za pomocą pałeczek papierowych.
- Systematyczne przechowywanie próbek do analizy mikrobiomu.
Główne wyniki
- Standaryzowane pobieranie próbek za pomocą pałeczek papierowych skutecznie zbiera próbki biofilmu.
- Próbki mogą być łączone lub przechowywane indywidualnie do analizy.
- Sekwencjonowanie nowej generacji zapewnia szczegółowe zestawy danych mikrobiomu.
- Analizy statystyczne ujawniają istotne różnice w składzie mikrobiomu.
Wnioski
- Proponowana metoda zwiększa niezawodność badań mikrobiomu jamy ustnej u dzieci.
- Standaryzacja jest kluczowa dla interdyscyplinarnych badań w dziedzinie mikrobiologii jamy ustnej.
- Współpraca między badaczami jest niezbędna dla osiągnięcia pomyślnych wyników.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Standardized oral biofilm sampling in children addresses a critical gap in pediatric microbiome research, enabling reliable data generation for target validation in oral health interventions. The method supports mechanistic de-risking by providing reproducible biological samples that reflect true microbial composition, reducing variability in preclinical assessments. This enhances predictive confidence in early discovery stages where oral microbiota shifts may indicate disease susceptibility or treatment response.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of oral microbiome composition as a biomarker for cariogenic and periopathogenic mechanisms in children.
- Operational Value: Provides a standardized sampling protocol that reduces technical variability in microbiome data generation.
- Scientific Value: Supports hypothesis testing regarding microbial shifts during childhood development and intervention periods.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological samples for downstream NGS and bioinformatic analysis, ensuring assay readiness.
- Operational Value: Facilitates sample pooling or parallel processing, improving throughput and standardization across study sites.
- Scientific Value: Generates quantitative microbial abundance data suitable for assay optimization and screening campaign design.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Delivers disease-relevant samples from healthy pediatric oral sites, establishing baseline for comparative disease modeling.
- Operational Value: Enables longitudinal tracking of microbiome shifts, supporting risk-adjusted advancement decisions in preclinical pipelines.
- Scientific Value: Provides mechanistic insights into host-microbe interactions that inform target selection and validation strategies.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by supplying standardized biological inputs for microbiome profiling, which informs target identification and validation efforts prior to lead generation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of microbial community shifts linked to oral health status and developmental stages.
- Screening: Delivers reproducible samples enabling consistent NGS-based microbial profiling for comparative compound or intervention evaluation.
- Analytics: Generates relative abundance and diversity metrics that allow cross-condition comparison and statistical assessment of microbial changes.
- Translational Research: Connects discovery-phase microbiome data to preclinical continuity by establishing healthy baselines for disease model validation.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable sampling protocol applicable across pediatric oral health studies, reducing protocol redevelopment costs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in microbiome-associated target validation by minimizing sampling-induced noise.
- Operational Value: Ensures reproducibility and standardization across sites and time points, critical for multi-center studies.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision reliability in oral health programs by reducing false positives from methodological artifacts.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of oral microbiome targets based on robust, comparable longitudinal data.
Implementation Considerations
- Requires training in pediatric dental techniques and sterile handling to ensure sample integrity and child cooperation.
- Dependent on access to UV irradiation, autoclaving, and cold storage (-80°C) infrastructure for contamination control and sample preservation.
- Necessitates cross-disciplinary coordination between dental clinicians and molecular biologists for standardized execution.
- Requires adaptation considerations when applying to mixed dentition or periodontally diseased sites, as noted in the protocol.
- Limited by the physical constraints of subgingival access in very young children, which may affect sampling consistency.
