Name: Prądy całokomórkowe wywołane przez zaciągnięcie GABA w wycinkach mózgu (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 32 s
Description: Poznaj technikę puff do szybkiego podawania leków podczas całokomórkowych zapisów patch-clamp w wycinkach kory przedczołowej. Ta metoda zapobiega desensytacji receptorów i umożliwia precyzyjne badania elektrofizjologiczne.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować następującym organizacjom: Narodowej Fundacji Nauk Przyrodniczych Chin (31171018, 31171355), Wydziałowi Nauki i Technologii Guangdong (2013KJCX0054), Fundacji Nauk Przyrodniczych Prowincji Guangdong (2014A030313418, 2014A030313440) oraz Biuru Nauki i Technologii w Kantonie (201607010320).

Trzymanie zwierząt i wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z procedurami zatwierdzonymi przez Komitet Etyki ds. Badań na Zwierzętach na Uniwersytecie Normalnym Południowych Chin, zgodnie z Wytycznymi dotyczącymi opieki nad zwierzętami ustanowionymi przez Narodowy Instytut Zdrowia.
1. Przygotowanie roztworów
<ol>
	<li>Przygotuj 500 ml standardowego sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego (ACSF) zawierającego składniki opisane w naszym opublikowanym work7, jak wymieniono w Tabeli 1.
	<ol>
		<li>Użyj czystych szklanych zlewek z wodą dejonizowaną, aby przygotować świeży roztwór ACSF. Wyczyść szpatułki wodą dejonizowaną i wysusz przed użyciem, aby dodać NaCl, KCl, NaH2PO4, NaHCO3, MgSO4, D-glukozę i dodać CaCl2 po bąbelkowaniu roztworu mieszaniną 95% O2 / 5% CO2 przez ~ 20 minut (jak wyszczególniono w Tabeli 1) do 500 ml wody dejonizowanej. Mieszaj aż do całkowitego rozpuszczenia.</li>
		<li>Upewnij się, że ACSF jest całkowicie przezroczysty bez żadnych opadów. Następnie dostosuj pH do 7,2-7,4. Bąbelek z mieszaniną gazów o składzie 95%O2 i 5% CO2 przez ~20 min.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotować 250 ml roztworu do krojenia plastrów zawierającego substancje chemiczne7 opisane w Tabeli 2.
	<ol>
		<li>Dodać KCl, MgCl2, NaH2PO4, NaHCO3, cholinę ·Cl, D-glukozę i dodać CaCl2 na końcu, jak wskazano w 1.1.1, do 250 ml wody dejonizowanej i rozpuścić zgodnie z opisem w 1.1.1 i 1.1.2.</li>
		<li>Po bulgotaniu 95% O2/5% CO2 umieścić roztwór w zamrażarce na 15-20 minut, aby roztwór do krojenia stał się lodowaty i częściowo zamrożony. 
		UWAGA: Używamy tego roztworu do krojenia podczas robienia plastrów z 1-2 miesięcznych myszy; Formuła może się różnić w przypadku myszy starszych niż 2 miesiące.</li>
		<li>Przygotować roztwór LPS, rozpuszczając go w sterylnej, wolnej od endotoksyn soli fizjologicznej (0,9% NaCl). LPS podaje się dootrzewnowo (0,5 mg/kg) i rozpoczyna zapis po 2 godzinach.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Przygotowanie warstwy kory przedczołowej
<ol>
	<li>Wyjmij roztwór do krojenia z zamrażarki i homogenizuj, aby uzyskać błoto pośniegowe. Umieść roztwór na lodzie i stale bąbelkuj 95% O2/5% CO2 .</li>
	<li>Używając dużych, ostrych nożyczek, szybko odetnij głowę myszy zgodnie z opisem9 i natychmiast włóż głowę do zlewki wypełnionej lodowatym (0-4°C) roztworem do cięcia.</li>
	<li>Przetnij górną część czaszki wzdłuż linii środkowej w kierunku od ogona do nosa cienkimi nożyczkami i usuń boczne części czaszki. Usuń mózg cienką szpatułką i wrzuć do lodowatego roztworu do cięcia. 
	UWAGA: Kroki 2.2-2.3 należy wykonać szybko (najlepiej < 1 minutę).</li>
	<li>Umieść mózg na pokrywie 9-centymetrowej szalki Petriego wypełnionej lodem. Opłucz mózg lodowatym roztworem do cięcia. Odetnij móżdżek i opuszkę węchową żyletką.</li>
	<li>Nałóż klej cyjanoakrylowy na uchwyt próbki wibratomu. Ostrożnie umieść blok mózgu na kropli kleju, rostralną stroną do góry i natychmiast zanurz w lodowatym roztworze do cięcia.</li>
	<li>Ustaw uchwyt ostrza wibratomu pod kątem 15° w stosunku do płaszczyzny poziomej i przygotuj 350-μm koronalne wycinki mózgu (częstotliwość wibracji ostrza = 85 Hz, prędkość = 0,1 mm/s).</li>
	<li>Za pomocą pipety przenieść plastry do komory odzysku wypełnionej ACSF, inkubować przez 1 godzinę (w temperaturze pokojowej) przy stałym bulgotaniu 95% O2/5% CO2 .</li>
</ol>
3. Nagrywanie całej komórki
<ol>
	<li>Szklane mikropipety borokrzemianowe należy wykonać do użytku jako elektrody rejestrujące lub mikropipety do zaciągania się zgodnie ze szczegółowymi wytycznymi zawartymi w instrukcji obsługi ściągacza. Do rejestracji elektrod rezystancje końcówek mieszczą się w zakresie 4-6 MΩ, natomiast mikropipety zaciągowe mają średnice końcówek w zakresie 2-5 μm.</li>
	<li>Dodać bloker kanału Na+ (TTX, 1 μM), aby zablokować szybki kanał Na+, a tym samym potencjały czynnościowe, do ACSF i utrzymać stałe natężenie przepływu tego roztworu na poziomie 2-3 ml/min w komorze rejestracyjnej, poprzez pompę perystaltyczną do komory i zasysanie z niej. Stale bąbelkować ACSF 95% O2/5% CO2, aby zapewnić żywotność plastrów.</li>
	<li>Przenieś wycinek mózgu do komory nagraniowej za pomocą zmodyfikowanej pipety Pasteura, której cienka końcówka została przycięta tak, aby pasowała do rozmiaru wycinka. Przykryj plasterek platynową kotwą z równoległymi nylonowymi nitkami w odstępach ≥2 mm, aby utrzymać plasterek na platformie.</li>
	<li>Napełnić mikropipetę rejestrującą roztworem wewnętrznym7 (Tabela 3), a następnie napełnić mikropipety zaciągnięte GABA o stężeniach 10 μM, 50 μM i 100 μM (rozpuszczonych w ACSF) lub ACSF jako kontrola nośnika.</li>
	<li>Aby zapobiec zablokowaniu przez zanieczyszczenia, przed zanurzeniem elektrody rejestrującej w ACSF należy zastosować lekkie nadciśnienie za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml. Za pomocą mikromanipulatora pod mikroskopem (soczewka obiektywu 4x) ustaw elektrodę rejestrującą i mikropipetę zaciągania się tak, aby końcówki pojawiły się w środku obrazu wideo na monitorze (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A).</li>
	<li>Wyreguluj ostrość mikroskopu (soczewka obiektywu 40x), stopniowo obniżając mikropipetę puff i umieść ją nad neuronem rejestrującym pod kątem 45°. Utrzymuj odległość między końcówką mikropipety do zaciągania się a neuronem zapisaną w granicach 20-40 μm (<silna klasa="xfig">Rysunek 1B). Powoli i ostrożnie zbliż się do neuronu z elektrodą rejestrującą, a następnie zwolnij nadciśnienie. Zastosuj słabe i krótkie ssanie przez rurkę podłączoną do uchwytu elektrody, aby uzyskać uszczelnienie giga-omowe.</li>
	<li>Utrzymuj napięcie na poziomie 0 mV. Po utworzeniu uszczelki giga-omowej należy skompensować szybką i wolną pojemność ręcznie lub automatycznie. Następnie zastosuj krótkie i mocne ssanie przez wspomniane powyżej rurki, aby przejść w tryb całej komórki.</li>
	<li>Nagrywaj eIPSC w trybie cęgów napięciowych. Zastosuj niskie ciśnienie gazu (azot, 4 - 6 psi) do mikropipety puff za pomocą Picospritzera sterowanego przez generator krokowy napięcia Master 8, aby dostarczyć pojedyncze lub sparowane zaciągnięcia GABA (<klasa silna = "xfig">Rysunek 2).</li>
	<li>Zmień czas trwania zaciągnięcia, aby uzyskać najlepsze wyniki eIPSC (<silna klasa="xfig">Rysunek 3) i zmierz eIPSC w modelu depresji wywołanej LPS ( <silna klasa = "xfig" >Rysunek 4).</li>
</ol>

<ol><li>Neher, E., Sakmann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-channel+currents+recorded+from+membrane+of+denervated+frog+muscle+fibres%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single-channel currents recorded from membrane of denervated frog muscle fibres.</a> Nature. 260 (5554), 799-802 (1976).</li>
<li>Sakmann, B., Edwards, F., Konnerth, A., Takahashi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patch+clamp+techniques+used+for+studying+synaptic+transmission+in+slices+of+mammalian+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Q+J+Exp+Physiol%22%5BJournal%5D)">Patch clamp techniques used for studying synaptic transmission in slices of mammalian brain.</a> Q J Exp Physiol. 74 (7), 1107-1118 (1989).</li>
<li>Eyo, U. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+hyperactivity+recruits+microglial+processes+via+neuronal+NMDA+receptors+and+microglial+P2Y12+receptors+after+status+epilepticus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neuronal hyperactivity recruits microglial processes via neuronal NMDA receptors and microglial P2Y12 receptors after status epilepticus.</a> J Neurosci. 34 (32), 10528-10540 (2014).</li>
<li>Dickinson, G. D., Parker, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+determining+the+recruitment+of+inositol+trisphosphate+receptor+channels+during+calcium+puffs%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Factors determining the recruitment of inositol trisphosphate receptor channels during calcium puffs.</a> Biophys J. 105 (11), 2474-2484 (2013).</li>
<li>Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Columnar+distribution+of+activity+dependent+gabaergic+depolarization+in+sensorimotor+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Brain%22%5BJournal%5D)">Columnar distribution of activity dependent gabaergic depolarization in sensorimotor cortical neurons.</a> Mol Brain. 5, 33(2012).</li>
<li>Glykys, J., Mody, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+main+source+of+ambient+GABA+responsible+for+tonic+inhibition+in+the+mouse+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">The main source of ambient GABA responsible for tonic inhibition in the mouse hippocampus.</a> J Physiol. 582, (Pt 3) 1163-1178 (2007).</li>
<li>Chen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((APP+modulates+KCC2+expression+and+function+in+hippocampal+GABAergic+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">APP modulates KCC2 expression and function in hippocampal GABAergic inhibition.</a> Elife. 6, (2017).</li>
<li>Dunn, A. J., Swiergiel, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+interleukin-1+and+endotoxin+in+the+forced+swim+and+tail+suspension+tests+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol+Biochem+Behav%22%5BJournal%5D)">Effects of interleukin-1 and endotoxin in the forced swim and tail suspension tests in mice.</a> Pharmacol Biochem Behav. 81 (3), 688-693 (2005).</li>
<li>Engel, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular+Patch-clamp+Recordings+from+the+Somatodendritic+Domain+of+Nigral+Dopamine+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Subcellular Patch-clamp Recordings from the Somatodendritic Domain of Nigral Dopamine Neurons.</a> J Vis Exp. (117), (2016).</li>
<li>Wondolowski, J., Frerking, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subunit-dependent+postsynaptic+expression+of+kainate+receptors+on+hippocampal+interneurons+in+area+CA1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Subunit-dependent postsynaptic expression of kainate receptors on hippocampal interneurons in area CA1.</a> J Neurosci. 29 (2), 563-574 (2009).</li>
<li>Yang, L., Wang, Z., Wang, B., Justice, N. J., Zheng, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyloid+precursor+protein+regulates+Cav1.2+L-type+calcium+channel+levels+and+function+to+influence+GABAergic+short-term+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Amyloid precursor protein regulates Cav1.2 L-type calcium channel levels and function to influence GABAergic short-term plasticity.</a> J Neurosci. 29 (50), 15660-15668 (2009).</li>
<li>Huo, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prefrontal+Cortical+GABAergic+Dysfunction+Contributes+to+Aberrant+UP-State+Duration+in+APP+Knockout+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cereb+Cortex%22%5BJournal%5D)">Prefrontal Cortical GABAergic Dysfunction Contributes to Aberrant UP-State Duration in APP Knockout Mice.</a> Cereb Cortex. , (2016).</li>
<li>Zhou, W. L., Gao, X. B., Picciotto, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acetylcholine+Acts+through+Nicotinic+Receptors+to+Enhance+the+Firing+Rate+of+a+Subset+of+Hypocretin+Neurons+in+the+Mouse+Hypothalamus+through+Distinct+Presynaptic+and+Postsynaptic+Mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22eNeuro%22%5BJournal%5D)">Acetylcholine Acts through Nicotinic Receptors to Enhance the Firing Rate of a Subset of Hypocretin Neurons in the Mouse Hypothalamus through Distinct Presynaptic and Postsynaptic Mechanisms.</a> eNeuro. 2 (1), (2015).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Aplikacja Puff jest szeroko stosowana do oceny funkcji receptora postsynaptycznego 3,4,7, ale wymaga precyzyjnej kontroli w każdym eksperymencie. Opisujemy tutaj procedurę polegającą na zaciskaniu łat na całych komórkach, która demonstruje IPSC indukowane przez GABA (tj. eIPSC) w wycinkach mózgu kory przedczołowej. Rezystancja elektrody rejestrującej wynosi około 5 MΩ, natomiast średnica końcówki mikropipet puffowych wynosi okoł...

Technika patch-clamp, podstawowe narzędzie do badania sygnałów elektrycznych w neuronach, została opracowana w latach siedemdziesiątych1,2. Główną zaletą tej techniki jest to, że dostarcza wiedzy na temat tego, w jaki sposób określone terapie (np. farmakologiczne) mogą zmieniać funkcje neuronów lub kanały w czasie rzeczywistym3. Farmakologiczna ocena funkcji neuronów podczas zapisu całej komórki w wycinku mózgu wymaga zastosowania leków, takich jak agoniści lub antagoniści określonych receptorów, do rejestrowanych neuronów. Metoda ta pozwala na identyfikację zmian neuronalnych, które zachodzą po zastosowaniu określonego leku, prowadząc w ten sposób do lepszego zrozumienia fizjologicznych i patologicznych właściwości neuronów4. Chociaż podawanie farmakologiczne może być prowadzone za pomocą perfuzji5 lub puff6, ta druga technika jest lepsza. W szczególności: (i) zaciągnięcie się szybko zwiększa stężenie leku wokół zarejestrowanego neuronu do poziomu, który zapobiega odczulaniu receptorów błonowych; (ii) objętość wstrzykiwanego leku jest bardzo mała, tak że wpływ na roztwór do kąpieli jest niewielki, co w związku z tym zmniejsza wszelkie niepożądane skutki podawanych substancji chemicznych na wycinki mózgu; (iii) Protokół Puff można ustawić i zapisać, dzięki czemu eksperyment jest bardzo precyzyjnie powtarzalny; (iv) Stosowanie zaciągania się stanowi ekonomiczne stosowanie agonistów/antagonistów, szczególnie w przypadku, gdy takie odczynniki są drogie lub trudne do uzyskania.
Tutaj skupimy się na rejestrowaniu prądów całokomórkowych indukowanych przez zaciąganie GABA w starannie przygotowanych wycinkach mózgu, preparacji, która ma tę zaletę, że ma stosunkowo dobrze zachowane obwody mózgowe. W tym artykule opiszemy, w jaki sposób przeprowadzamy prądy hamujące wywołane zaciągnięciem7. Stosując wewnętrzne roztwory oparte na cezie (Cs+) i utrzymując neurony na poziomie 0 mV, wprowadzimy hamujące prądy postsynaptyczne wywołane GABA-puff (eIPSC) z odpowiednimi szczegółami technicznymi. Korzystając z mysiego modelu depresji wywołanej wstrzyknięciem lipopolisacharydu (LPS) 8, pokazujemy, że amplituda eIPSC wywołana przez zaciągnięcie GABA jest znacznie zmniejszona w plasterkach myszy z wstrzyknięciem LPS w porównaniu z kontrolami nośnika. Naszą intencją jest, aby ten artykuł pokazał, w jaki sposób technika zaciągania się jest szeroko stosowana w badaniach mających na celu ocenę wpływu wszelkich chemikaliów, związków lub leków na aktywność neuronalną w wycinkach mózgu.

<table><tbody><tr><td>Szklane mikropipety borokrzemianowe</td><td>Instrumenty migawkowe</td><td>BF150-86-10</td><td>Średnica zewnętrzna 1,50 mm; Średnica wewnętrzna 0,86 mm</td></tr><tr><td>Ściągacz do mikropipet</td><td>Instrumenty żaluzjowe</td><td>MODEL P-97&nbsp;</td><td>Ściągacz do mikropipet płonących/brwiowych</td></tr><tr><td>Mikromanipulatory</td><td>Przyrządy migawkowe</td><td>MP-285</td><td></td></tr><tr><td>Wzmacniacz sterowany komputerowo&nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>Urządzenia molekularne</td><td>Multiclamp 700B</td><td></td></tr><tr><td>Cyfrowy system akwizycji&nbsp;</td><td>Urządzenia molekularne</td><td>Digidata 1440A Kamera</td><td></td></tr><tr><td>do obrazowania Nikon</td><td>&nbsp;</td><td>2115001</td><td>Aparatura inspekcyjna</td></tr><tr><td>Mikroskopia&nbsp;</td><td>Nikon&nbsp;</td><td>Zaćmienie FN1&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Mistrz 8</td><td>A.M.P.I.</td>Stymulator <td></td><td>pulsu Master-8</td></tr><tr><td>Krajalnica wibratomowa</td><td>Leica</td><td>VT 1000S</td><td></td></tr><tr><td>Żyletka</td><td>Gillette</td><td>74-S</td><td>FLYING EAGLE</td></tr><tr><td>Monitor wideo</td><td>Panasonic</td><td>WV-BM 1410</td><td></td></tr><tr><td>502 Klej</td><td>Deli</td><td>7146</td><td>Klej cyjanoakrylowy Pompa</td></tr><tr><td>perystaltyczna</td><td>Shanghai JIA PENG Corporation</td><td>BT100-1F</td><td></td></tr><tr><td>Kamera wideo</td><td>Olympus America Medical</td><td>OLY-150</td><td></td></tr><tr><td>Pipety transferowe</td><td>Biologix</td><td>30-0138A1</td><td></td></tr></tbody></table>

prądy całokomórkowe wywołane przez zaciągnięcie gaba w wycinkach mózgu

Whole-cell Currents Induced by Puff Application of GABA in Brain Slices

Podawanie farmakologiczne jest powszechnie stosowane podczas prowadzenia rejestracji krostek na całe komórki w wycinkach mózgu. Jedną z najlepszych metod aplikacji leków podczas zapisu elektrofizjologicznego jest technika zaciągnięcia, która może być wykorzystana do badania wpływu odczynników farmakologicznych na aktywność neuronów w wycinkach mózgu. Największą zaletą zaciągania się jest to, że stężenie leku wokół miejsca rejestracji gwałtownie wzrasta, zapobiegając w ten sposób odczuleniu receptorów błonowych. Skuteczne zastosowanie aplikacji zaciągnięcia się wymaga zwrócenia szczególnej uwagi na następujące elementy: stężenie leku, parametry mikropipety zaciągającej się, odległość między końcówką mikropipety zaciągającej się a zarejestrowanym neuronem oraz czas trwania i ciśnienie napędzające zaciągnięcie (funty na cal kwadratowy, psi). W tym artykule opisano krok po kroku procedurę rejestrowania prądów całych komórek wywołanych przez wdychanie kwasu gamma-aminomasłowego (GABA) na neuron wycinka kory przedczołowej. Warto zauważyć, że tę samą procedurę można zastosować z niewielkimi modyfikacjami w innych obszarach mózgu, takich jak hipokamp i prążkowie, oraz w różnych preparatach, takich jak hodowle komórkowe.

Technika puff (aplikacja punktowa) pozwala badaczom na analizę wpływu leków na konkretne receptory znajdujące się na powierzchni danego neuronu. W niniejszym artykule skupiamy się na prądach pośredniczonych przez receptory GABA. Rysunek 1 przedstawia mikropipety do aplikacji substancji oraz do rejestracji. Aby wyeliminować wpływ ciśnienia fizycznego generowanego przez puff na rejestrowane neurony, w ramach kontroli stosuje się puff ACSF oraz sacharozy (<stron...

Opisujemy technikę zaciągania się, za pomocą której odczynniki farmakologiczne mogą być podawane podczas rejestracji krostek na całe komórki, i podkreślamy różne aspekty cech, które są kluczowe dla jej sukcesu.

Prądy całokomórkowe wywołane przez zaciągnięcie GABA w wycinkach mózgu

Pharmacological administration is commonly used when conducting whole-cell patch-clamp recording in brain slices. One of the best methods of drug ...

Ogólnym celem tej techniki zaciągania jest przeprowadzenie podawania farmakologicznego w zapisie z użyciem klamry krosowej dla całych komórek. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie elektrofizjologii, takie jak podawanie farmakologiczne. Główną zaletą tej techniki jest to, że stężenie leku wokół miejsca rejestracji gwałtownie wzrasta, zapobiegając w ten sposób odczulaniu receptorów błonowych.Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które dopiero zaczynają korzystać z tej metody, będą miały trudności, ponieważ przygotowanie ostrego wycinka kory przedczołowej i pozycja mikropipety puff są stosunkowo trudne. Aby rozpocząć tę procedurę, zmiażdż zamrożony roztwór do cięcia, aby uzyskać błoto pośniegowe. Utrzymuj rozsypany roztwór na lodzie i bąbelkuj go 95% tlenem i 5% dwutlenkiem węgla.Następnie umieść wypreparowaną głowę w zlewce wypełnionej lodowatym roztworem do krojenia i wyjmij ją po kilku sekundach. Przetnij czaszkę wzdłuż linii środkowej w kierunku ogonowo-rostralnym cienkimi nożyczkami i usuń boczne części czaszki. Następnie usuń mózg cienką szpatułką i wrzuć go do lodowatego roztworu do cięcia.Następnie umieść mózg na pokrywie dziewięciocentymetrowej szalki Petriego wypełnionej lodem. Opłucz mózg lodowatym roztworem do cięcia. Następnie odetnij móżdżek i opuszkę węchową żyletką.Następnie nałóż klej cyjanoakrylowy na uchwyt próbki Vibratome. Ostrożnie umieść blok mózgu na kropli kleju, rostralną stroną do góry i natychmiast zanurz go w lodowatym roztworze do cięcia. Ustaw uchwyt ostrza pod kątem 15 stopni w stosunku do płaszczyzny poziomej.Pokrój tkanki mózgowe na 350-mikronowe wycinki koronalne. Następnie przenieś szkiełka do komory regeneracyjnej wypełnionej ACSF i inkubuj je przez godzinę przy ciągłym bulgotaniu 95% tlenu i 5% dwutlenku węgla. W naszym eksperymencie przygotowanie ostrego wycinka kory przedczołowej ma również kluczowe znaczenie w procedurze.Zdrowy wycinek mózgu oznacza aktywne neurony, które można szczelnie załatać. W tej procedurze należy wykonać szklane mikropipety borokrzemianowe do użytku jako elektrody rejestrujące lub mikropipety dmuchające. W przypadku elektrod rejestrujących rezystancja końcówek mieści się w zakresie od czterech do sześciu megaomów, podczas gdy mikropipety zaciągające mają średnice końcówek w zakresie od dwóch do pięciu mikrometrów.Dodaj bloker kanałów sodowych do ACSF, aby zablokować szybki kanał sodowy, a tym samym potencjały czynnościowe, i utrzymać stałe natężenie przepływu tego roztworu od dwóch do trzech mililitrów na minutę w komorze zapisu. Stale bąbelkuj ACSF 95% tlenu, 5% dwutlenku węgla, aby zapewnić żywotność plastrów. Przenieś wycinek mózgu do komory nagrywającej za pomocą pipety Pasteura z cienką końcówką naciętą tak, aby pasował do rozmiaru wycinka.Następnie umieść platynową kotwicę nad plasterkiem, aby przytrzymać go na platformie. Następnie napełnij mikropipety rejestrujące roztworem wewnętrznym i napełnij mikropipety zaciągnięte GABA o stężeniu 10 mikromolowym, 50 mikromolowym i 100 mikromolowym lub ACSF jako kontrolę nośnika. Aby zapobiec zablokowaniu przez zanieczyszczenia, przed zanurzeniem elektrody rejestrującej w ACSF należy zastosować lekkie nadciśnienie za pomocą jednomililitrowej strzykawki.Pod mikroskopem ustaw elektrodę rejestrującą i mikropipetę zaciągającą się tak, aby końcówki znalazły się na środku monitora. Następnie zidentyfikuj neuron docelowy. Wyreguluj ostrość mikroskopu, stopniowo obniżając mikropipetę dmuchaną i umieść ją nad neuronem rejestrującym pod kątem 45 stopni.Zachowaj odległość między końcówką mikropipety dmuchanej a docelowym neuronem w zakresie od 20 do 40 mikrometrów. Powoli i ostrożnie zbliż się do neuronu z elektrodą rejestrującą, a następnie zwolnij nadciśnienie. Zastosuj słabe i krótkie ssanie przez rurkę podłączoną do uchwytu elektrody, aby utworzyć uszczelnienie gigaomowe.Utrzymuj napięcie na poziomie zero miliwoltów. Po utworzeniu uszczelki gigaomowej należy skompensować szybką i wolną pojemność ręcznie lub automatycznie. Następnie zastosuj krótkie i mocne ssanie przez rurkę, aby przejść do trybu całej komórki.Następnie rejestruj wywołane prądy IPSC w trybie cęgów napięciowych. Dostarczaj pojedyncze lub sparowane zaciągnięcia GABA przez mikropipetę puff sterowaną przez generator krokowy napięcia Master-8. Zmień czas trwania zaciągnięcia, aby uzyskać najlepsze wyniki wywołanych prądów IPSC, i zmierz wywołane prądy IPSC w modelu depresji wywołanej przez LPS.Pokazano tutaj próbki IPSC indukowane przez 10, 50 i 100 mikromolowych GABA. A oto krzywe odpowiedzi czasu trwania zaciągnięcia. Powtarzające się prądy wywoływane przez GABA przy 50 mikromolowych zaciągnięciach w odstępach między zaciągnięciami wynoszącymi jedną, dwie lub trzy sekundy są pokazane tutaj.Po opanowaniu, tę technikę można wykonać w dwie godziny, jeśli jest wykonywana prawidłowo. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o uzyskaniu zdrowych wycinków mózgu. Po opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się podawaniem farmakologicznym do zbadania wpływu leku na elektrofizjologię.Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przeprowadzać podawanie farmakologiczne w nagraniu z użyciem klamry krosowej dla całych komórek. Nie zapominaj, że praca z TTX może być bardzo niebezpieczna i podczas wykonywania tej procedury należy zawsze zachować środki ostrożności, takie jak noszenie rękawiczek.

whole-cell-currents-induced-puff-application-gaba-brain

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Wykorzystujemy technikę patch-clamp do pomiaru prądów pojedynczych kanałów aktywowanych przez GABA (kanały GABAA, receptory GABAA) oraz generowanych przez nie prądów synaptycznych i tonicznych w neuronach. Aktywacja kanałów zmniejsza pobudliwość neuronów w stanach zdrowia i choroby 1,2,3,4.

Prądy pojedynczego kanału i prądy toniczne aktywowane przez GABA w skrawkach mózgu szczura

Ten film demonstruje zapis prądów całych komórek indukowanych przez kwas gamma-aminomasłowy, czyli GABA, w wycinku mózgu myszy w korze przedczołowej. Kontrolowane dostarczanie GABA otwiera kanały chlorkowe w neuronach postsynaptycznych, generując hamujące prądy postsynaptyczne lub IPSC. Te IPSC zwiększają się wraz z wyższymi stężeniami GABA, co odzwierciedla hamującą aktywność GABA na przekaźnictwo synaptyczne.

Rejestrowanie prądów całokomórkowych za pomocą GABA Puffing w wycinku mózgu myszy

Sieci korowe są kontrolowane przez mały, ale zróżnicowany zestaw hamujących interneuronów. Funkcjonalne badanie interneuronów wymaga zatem ukierunkowanego rejestrowania i rygorystycznej identyfikacji. Opisano tutaj podejście łączone obejmujące zapisy całych komórek z pojedynczych lub synaptycznie sprzężonych par neuronów z etykietowaniem wewnątrzkomórkowym, analizą morfologiczną post-hoc i immunocytochemiczną.

Nagrania całokomórkowych klamry krosowej z morfologicznie i neurochemicznie zidentyfikowanych interneuronów hipokampa

Oscylacje są podstawowymi właściwościami sieci i są modulowane przez choroby i leki. Badanie oscylacji wycinków mózgu pozwala na scharakteryzowanie izolowanych sieci w kontrolowanych warunkach. Zapewniono protokoły przygotowania ostrych wycinków mózgu do wywoływania oscylacji γ CA1.

Generowanie lokalnych oscylacji γ CA1 przez stymulację tężcową

Ten protokół opisuje podstawowe kroki proceduralne do wykonywania nagrań z użyciem krosówek dla całej komórki. Technika ta pozwala na badanie zachowania elektrycznego neuronów, a gdy jest wykonywana w wycinkach mózgu, pozwala na ocenę różnych funkcji neuronalnych z neuronów, które są nadal zintegrowane w stosunkowo dobrze zachowanych obwodach mózgowych.

Nagrania z użyciem zacisku krosowego całych komórek w wycinkach mózgu

Tutaj prezentujemy protokoły odkrywania związków aktywnych w receptorach GABAA, od wiązania po fizjologię i farmakologię.

Metody odkrywania nowych związków modulujących neuroprzekaźnictwo receptora kwasu gamma-aminomasłowego typu A

Modele ostrych napadów są ważne dla badania mechanizmów leżących u podstaw zdarzeń padaczkowych. Co więcej, możliwość generowania zdarzeń padaczkowych na żądanie zapewnia wysoce efektywną metodę badania dokładnej sekwencji zdarzeń leżących u podstaw ich inicjacji. W tym miejscu opisujemy ostre modele napadów korowych 4-aminopirydyny ustalone w tkance mysiej i ludzkiej.

Wytwarzanie i inicjacja na żądanie ostrej aktywności ictal w tkankach gryzoni i ludzkich

Tutaj opisujemy podstawowe kroki dla zapisów całokomórkowych krosówek z neuronów istoty żelowej (SG) w przekroju rdzenia kręgowego in vitro. Metoda ta pozwala na badanie wewnętrznych właściwości błony, przekaźnictwa synaptycznego i charakterystyki morfologicznej neuronów SG.

Przygotowanie wycinków ostrego rdzenia kręgowego do zapisu całokomórkowego patch-clamp w neuronach istoty żelatynowej

Prezentowany protokół opisuje transport i przygotowanie wyciętej ludzkiej tkanki hipokampa, której ostatecznym celem jest wykorzystanie ważnych wycinków mózgu jako narzędzia do oceny przedklinicznej potencjalnych substancji przeciwpadaczkowych.

Przygotowanie ostrych wycinków ludzkiego hipokampa do zapisów elektrofizjologicznych

Wycinki mózgu ex vivo mogą być używane do badania wpływu lotnych środków znieczulających na wywołane reakcje na bodźce aferentne. Optogenetyka jest wykorzystywana do niezależnej aktywacji aferentów wzgórzowo-korowych i korowo-korowych do niepierwotnej kory nowej, a odpowiedzi synaptyczne i sieciowe są modulowane izofluranem.

Optogenetyczna aktywacja szlaków aferentnych w wycinkach mózgu i modulacja odpowiedzi za pomocą lotnych środków znieczulających

Ten artykuł ma na celu opisanie systematycznego protokołu uzyskiwania poziomych wycinków mózgu hipokampa u myszy. Celem tej metodologii jest zachowanie integralności szlaków włókien hipokampa, takich jak ścieżka perforantu i szlak włókien omszałych, w celu oceny procesów neurologicznych związanych z zakrętem zębatym.

Poziome wycinki hipokampa mózgu myszy

Poznaj technikę puff do szybkiego podawania leków podczas całokomórkowych zapisów patch-clamp w wycinkach kory przedczołowej. Ta metoda zapobiega desensytacji receptorów i umożliwia precyzyjne badania elektrofizjologiczne.

Prądy całokomórkowe wywołane przez zaciągnięcie GABA w wycinkach mózgu

Przeglądaj więcej filmów