Name: Prądy całokomórkowe wywołane przez zaciągnięcie GABA w wycinkach mózgu (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 32 s
Description: Poznaj technikę puff do szybkiego podawania leków podczas całokomórkowych zapisów patch-clamp w wycinkach kory przedczołowej. Ta metoda zapobiega desensytacji receptorów i umożliwia precyzyjne badania elektrofizjologiczne.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Autorzy chcieliby podziękować następującym organizacjom: Narodowej Fundacji Nauk Przyrodniczych Chin (31171018, 31171355), Wydziałowi Nauki i Technologii Guangdong (2013KJCX0054), Fundacji Nauk Przyrodniczych Prowincji Guangdong (2014A030313418, 2014A030313440) oraz Biuru Nauki i Technologii w Kantonie (201607010320).

Trzymanie zwierząt i wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z procedurami zatwierdzonymi przez Komitet Etyki ds. Badań na Zwierzętach na Uniwersytecie Normalnym Południowych Chin, zgodnie z Wytycznymi dotyczącymi opieki nad zwierzętami ustanowionymi przez Narodowy Instytut Zdrowia.
1. Przygotowanie roztworów
<ol>
	<li>Przygotuj 500 ml standardowego sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego (ACSF) zawierającego składniki opisane w naszym opublikowanym work7, jak wymieniono w Tabeli 1.
	<ol>
		<li>Użyj czystych szklanych zlewek z wodą dejonizowaną, aby przygotować świeży roztwór ACSF. Wyczyść szpatułki wodą dejonizowaną i wysusz przed użyciem, aby dodać NaCl, KCl, NaH2PO4, NaHCO3, MgSO4, D-glukozę i dodać CaCl2 po bąbelkowaniu roztworu mieszaniną 95% O2 / 5% CO2 przez ~ 20 minut (jak wyszczególniono w Tabeli 1) do 500 ml wody dejonizowanej. Mieszaj aż do całkowitego rozpuszczenia.</li>
		<li>Upewnij się, że ACSF jest całkowicie przezroczysty bez żadnych opadów. Następnie dostosuj pH do 7,2-7,4. Bąbelek z mieszaniną gazów o składzie 95%O2 i 5% CO2 przez ~20 min.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotować 250 ml roztworu do krojenia plastrów zawierającego substancje chemiczne7 opisane w Tabeli 2.
	<ol>
		<li>Dodać KCl, MgCl2, NaH2PO4, NaHCO3, cholinę ·Cl, D-glukozę i dodać CaCl2 na końcu, jak wskazano w 1.1.1, do 250 ml wody dejonizowanej i rozpuścić zgodnie z opisem w 1.1.1 i 1.1.2.</li>
		<li>Po bulgotaniu 95% O2/5% CO2 umieścić roztwór w zamrażarce na 15-20 minut, aby roztwór do krojenia stał się lodowaty i częściowo zamrożony. 
		UWAGA: Używamy tego roztworu do krojenia podczas robienia plastrów z 1-2 miesięcznych myszy; Formuła może się różnić w przypadku myszy starszych niż 2 miesiące.</li>
		<li>Przygotować roztwór LPS, rozpuszczając go w sterylnej, wolnej od endotoksyn soli fizjologicznej (0,9% NaCl). LPS podaje się dootrzewnowo (0,5 mg/kg) i rozpoczyna zapis po 2 godzinach.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Przygotowanie warstwy kory przedczołowej
<ol>
	<li>Wyjmij roztwór do krojenia z zamrażarki i homogenizuj, aby uzyskać błoto pośniegowe. Umieść roztwór na lodzie i stale bąbelkuj 95% O2/5% CO2 .</li>
	<li>Używając dużych, ostrych nożyczek, szybko odetnij głowę myszy zgodnie z opisem9 i natychmiast włóż głowę do zlewki wypełnionej lodowatym (0-4°C) roztworem do cięcia.</li>
	<li>Przetnij górną część czaszki wzdłuż linii środkowej w kierunku od ogona do nosa cienkimi nożyczkami i usuń boczne części czaszki. Usuń mózg cienką szpatułką i wrzuć do lodowatego roztworu do cięcia. 
	UWAGA: Kroki 2.2-2.3 należy wykonać szybko (najlepiej < 1 minutę).</li>
	<li>Umieść mózg na pokrywie 9-centymetrowej szalki Petriego wypełnionej lodem. Opłucz mózg lodowatym roztworem do cięcia. Odetnij móżdżek i opuszkę węchową żyletką.</li>
	<li>Nałóż klej cyjanoakrylowy na uchwyt próbki wibratomu. Ostrożnie umieść blok mózgu na kropli kleju, rostralną stroną do góry i natychmiast zanurz w lodowatym roztworze do cięcia.</li>
	<li>Ustaw uchwyt ostrza wibratomu pod kątem 15° w stosunku do płaszczyzny poziomej i przygotuj 350-μm koronalne wycinki mózgu (częstotliwość wibracji ostrza = 85 Hz, prędkość = 0,1 mm/s).</li>
	<li>Za pomocą pipety przenieść plastry do komory odzysku wypełnionej ACSF, inkubować przez 1 godzinę (w temperaturze pokojowej) przy stałym bulgotaniu 95% O2/5% CO2 .</li>
</ol>
3. Nagrywanie całej komórki
<ol>
	<li>Szklane mikropipety borokrzemianowe należy wykonać do użytku jako elektrody rejestrujące lub mikropipety do zaciągania się zgodnie ze szczegółowymi wytycznymi zawartymi w instrukcji obsługi ściągacza. Do rejestracji elektrod rezystancje końcówek mieszczą się w zakresie 4-6 MΩ, natomiast mikropipety zaciągowe mają średnice końcówek w zakresie 2-5 μm.</li>
	<li>Dodać bloker kanału Na+ (TTX, 1 μM), aby zablokować szybki kanał Na+, a tym samym potencjały czynnościowe, do ACSF i utrzymać stałe natężenie przepływu tego roztworu na poziomie 2-3 ml/min w komorze rejestracyjnej, poprzez pompę perystaltyczną do komory i zasysanie z niej. Stale bąbelkować ACSF 95% O2/5% CO2, aby zapewnić żywotność plastrów.</li>
	<li>Przenieś wycinek mózgu do komory nagraniowej za pomocą zmodyfikowanej pipety Pasteura, której cienka końcówka została przycięta tak, aby pasowała do rozmiaru wycinka. Przykryj plasterek platynową kotwą z równoległymi nylonowymi nitkami w odstępach ≥2 mm, aby utrzymać plasterek na platformie.</li>
	<li>Napełnić mikropipetę rejestrującą roztworem wewnętrznym7 (Tabela 3), a następnie napełnić mikropipety zaciągnięte GABA o stężeniach 10 μM, 50 μM i 100 μM (rozpuszczonych w ACSF) lub ACSF jako kontrola nośnika.</li>
	<li>Aby zapobiec zablokowaniu przez zanieczyszczenia, przed zanurzeniem elektrody rejestrującej w ACSF należy zastosować lekkie nadciśnienie za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml. Za pomocą mikromanipulatora pod mikroskopem (soczewka obiektywu 4x) ustaw elektrodę rejestrującą i mikropipetę zaciągania się tak, aby końcówki pojawiły się w środku obrazu wideo na monitorze (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A).</li>
	<li>Wyreguluj ostrość mikroskopu (soczewka obiektywu 40x), stopniowo obniżając mikropipetę puff i umieść ją nad neuronem rejestrującym pod kątem 45°. Utrzymuj odległość między końcówką mikropipety do zaciągania się a neuronem zapisaną w granicach 20-40 μm (<silna klasa="xfig">Rysunek 1B). Powoli i ostrożnie zbliż się do neuronu z elektrodą rejestrującą, a następnie zwolnij nadciśnienie. Zastosuj słabe i krótkie ssanie przez rurkę podłączoną do uchwytu elektrody, aby uzyskać uszczelnienie giga-omowe.</li>
	<li>Utrzymuj napięcie na poziomie 0 mV. Po utworzeniu uszczelki giga-omowej należy skompensować szybką i wolną pojemność ręcznie lub automatycznie. Następnie zastosuj krótkie i mocne ssanie przez wspomniane powyżej rurki, aby przejść w tryb całej komórki.</li>
	<li>Nagrywaj eIPSC w trybie cęgów napięciowych. Zastosuj niskie ciśnienie gazu (azot, 4 - 6 psi) do mikropipety puff za pomocą Picospritzera sterowanego przez generator krokowy napięcia Master 8, aby dostarczyć pojedyncze lub sparowane zaciągnięcia GABA (<klasa silna = "xfig">Rysunek 2).</li>
	<li>Zmień czas trwania zaciągnięcia, aby uzyskać najlepsze wyniki eIPSC (<silna klasa="xfig">Rysunek 3) i zmierz eIPSC w modelu depresji wywołanej LPS ( <silna klasa = "xfig" >Rysunek 4).</li>
</ol>

<ol><li>Neher, E., Sakmann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-channel+currents+recorded+from+membrane+of+denervated+frog+muscle+fibres%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single-channel currents recorded from membrane of denervated frog muscle fibres.</a> Nature. 260 (5554), 799-802 (1976).</li>
<li>Sakmann, B., Edwards, F., Konnerth, A., Takahashi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patch+clamp+techniques+used+for+studying+synaptic+transmission+in+slices+of+mammalian+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Q+J+Exp+Physiol%22%5BJournal%5D)">Patch clamp techniques used for studying synaptic transmission in slices of mammalian brain.</a> Q J Exp Physiol. 74 (7), 1107-1118 (1989).</li>
<li>Eyo, U. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+hyperactivity+recruits+microglial+processes+via+neuronal+NMDA+receptors+and+microglial+P2Y12+receptors+after+status+epilepticus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neuronal hyperactivity recruits microglial processes via neuronal NMDA receptors and microglial P2Y12 receptors after status epilepticus.</a> J Neurosci. 34 (32), 10528-10540 (2014).</li>
<li>Dickinson, G. D., Parker, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+determining+the+recruitment+of+inositol+trisphosphate+receptor+channels+during+calcium+puffs%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Factors determining the recruitment of inositol trisphosphate receptor channels during calcium puffs.</a> Biophys J. 105 (11), 2474-2484 (2013).</li>
<li>Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Columnar+distribution+of+activity+dependent+gabaergic+depolarization+in+sensorimotor+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Brain%22%5BJournal%5D)">Columnar distribution of activity dependent gabaergic depolarization in sensorimotor cortical neurons.</a> Mol Brain. 5, 33(2012).</li>
<li>Glykys, J., Mody, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+main+source+of+ambient+GABA+responsible+for+tonic+inhibition+in+the+mouse+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">The main source of ambient GABA responsible for tonic inhibition in the mouse hippocampus.</a> J Physiol. 582, (Pt 3) 1163-1178 (2007).</li>
<li>Chen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((APP+modulates+KCC2+expression+and+function+in+hippocampal+GABAergic+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">APP modulates KCC2 expression and function in hippocampal GABAergic inhibition.</a> Elife. 6, (2017).</li>
<li>Dunn, A. J., Swiergiel, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+interleukin-1+and+endotoxin+in+the+forced+swim+and+tail+suspension+tests+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol+Biochem+Behav%22%5BJournal%5D)">Effects of interleukin-1 and endotoxin in the forced swim and tail suspension tests in mice.</a> Pharmacol Biochem Behav. 81 (3), 688-693 (2005).</li>
<li>Engel, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular+Patch-clamp+Recordings+from+the+Somatodendritic+Domain+of+Nigral+Dopamine+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Subcellular Patch-clamp Recordings from the Somatodendritic Domain of Nigral Dopamine Neurons.</a> J Vis Exp. (117), (2016).</li>
<li>Wondolowski, J., Frerking, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subunit-dependent+postsynaptic+expression+of+kainate+receptors+on+hippocampal+interneurons+in+area+CA1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Subunit-dependent postsynaptic expression of kainate receptors on hippocampal interneurons in area CA1.</a> J Neurosci. 29 (2), 563-574 (2009).</li>
<li>Yang, L., Wang, Z., Wang, B., Justice, N. J., Zheng, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyloid+precursor+protein+regulates+Cav1.2+L-type+calcium+channel+levels+and+function+to+influence+GABAergic+short-term+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Amyloid precursor protein regulates Cav1.2 L-type calcium channel levels and function to influence GABAergic short-term plasticity.</a> J Neurosci. 29 (50), 15660-15668 (2009).</li>
<li>Huo, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prefrontal+Cortical+GABAergic+Dysfunction+Contributes+to+Aberrant+UP-State+Duration+in+APP+Knockout+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cereb+Cortex%22%5BJournal%5D)">Prefrontal Cortical GABAergic Dysfunction Contributes to Aberrant UP-State Duration in APP Knockout Mice.</a> Cereb Cortex. , (2016).</li>
<li>Zhou, W. L., Gao, X. B., Picciotto, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acetylcholine+Acts+through+Nicotinic+Receptors+to+Enhance+the+Firing+Rate+of+a+Subset+of+Hypocretin+Neurons+in+the+Mouse+Hypothalamus+through+Distinct+Presynaptic+and+Postsynaptic+Mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22eNeuro%22%5BJournal%5D)">Acetylcholine Acts through Nicotinic Receptors to Enhance the Firing Rate of a Subset of Hypocretin Neurons in the Mouse Hypothalamus through Distinct Presynaptic and Postsynaptic Mechanisms.</a> eNeuro. 2 (1), (2015).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Aplikacja Puff jest szeroko stosowana do oceny funkcji receptora postsynaptycznego 3,4,7, ale wymaga precyzyjnej kontroli w każdym eksperymencie. Opisujemy tutaj procedurę polegającą na zaciskaniu łat na całych komórkach, która demonstruje IPSC indukowane przez GABA (tj. eIPSC) w wycinkach mózgu kory przedczołowej. Rezystancja elektrody rejestrującej wynosi około 5 MΩ, natomiast średnica końcówki mikropipet puffowych wynosi okoł...

Technika patch-clamp, podstawowe narzędzie do badania sygnałów elektrycznych w neuronach, została opracowana w latach siedemdziesiątych1,2. Główną zaletą tej techniki jest to, że dostarcza wiedzy na temat tego, w jaki sposób określone terapie (np. farmakologiczne) mogą zmieniać funkcje neuronów lub kanały w czasie rzeczywistym3. Farmakologiczna ocena funkcji neuronów podczas zapisu całej komórki w wycinku mózgu wymaga zastosowania leków, takich jak agoniści lub antagoniści określonych receptorów, do rejestrowanych neuronów. Metoda ta pozwala na identyfikację zmian neuronalnych, które zachodzą po zastosowaniu określonego leku, prowadząc w ten sposób do lepszego zrozumienia fizjologicznych i patologicznych właściwości neuronów4. Chociaż podawanie farmakologiczne może być prowadzone za pomocą perfuzji5 lub puff6, ta druga technika jest lepsza. W szczególności: (i) zaciągnięcie się szybko zwiększa stężenie leku wokół zarejestrowanego neuronu do poziomu, który zapobiega odczulaniu receptorów błonowych; (ii) objętość wstrzykiwanego leku jest bardzo mała, tak że wpływ na roztwór do kąpieli jest niewielki, co w związku z tym zmniejsza wszelkie niepożądane skutki podawanych substancji chemicznych na wycinki mózgu; (iii) Protokół Puff można ustawić i zapisać, dzięki czemu eksperyment jest bardzo precyzyjnie powtarzalny; (iv) Stosowanie zaciągania się stanowi ekonomiczne stosowanie agonistów/antagonistów, szczególnie w przypadku, gdy takie odczynniki są drogie lub trudne do uzyskania.
Tutaj skupimy się na rejestrowaniu prądów całokomórkowych indukowanych przez zaciąganie GABA w starannie przygotowanych wycinkach mózgu, preparacji, która ma tę zaletę, że ma stosunkowo dobrze zachowane obwody mózgowe. W tym artykule opiszemy, w jaki sposób przeprowadzamy prądy hamujące wywołane zaciągnięciem7. Stosując wewnętrzne roztwory oparte na cezie (Cs+) i utrzymując neurony na poziomie 0 mV, wprowadzimy hamujące prądy postsynaptyczne wywołane GABA-puff (eIPSC) z odpowiednimi szczegółami technicznymi. Korzystając z mysiego modelu depresji wywołanej wstrzyknięciem lipopolisacharydu (LPS) 8, pokazujemy, że amplituda eIPSC wywołana przez zaciągnięcie GABA jest znacznie zmniejszona w plasterkach myszy z wstrzyknięciem LPS w porównaniu z kontrolami nośnika. Naszą intencją jest, aby ten artykuł pokazał, w jaki sposób technika zaciągania się jest szeroko stosowana w badaniach mających na celu ocenę wpływu wszelkich chemikaliów, związków lub leków na aktywność neuronalną w wycinkach mózgu.

<table><tbody><tr><td>Szklane mikropipety borokrzemianowe</td><td>Instrumenty migawkowe</td><td>BF150-86-10</td><td>Średnica zewnętrzna 1,50 mm; Średnica wewnętrzna 0,86 mm</td></tr><tr><td>Ściągacz do mikropipet</td><td>Instrumenty żaluzjowe</td><td>MODEL P-97&nbsp;</td><td>Ściągacz do mikropipet płonących/brwiowych</td></tr><tr><td>Mikromanipulatory</td><td>Przyrządy migawkowe</td><td>MP-285</td><td></td></tr><tr><td>Wzmacniacz sterowany komputerowo&nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>Urządzenia molekularne</td><td>Multiclamp 700B</td><td></td></tr><tr><td>Cyfrowy system akwizycji&nbsp;</td><td>Urządzenia molekularne</td><td>Digidata 1440A Kamera</td><td></td></tr><tr><td>do obrazowania Nikon</td><td>&nbsp;</td><td>2115001</td><td>Aparatura inspekcyjna</td></tr><tr><td>Mikroskopia&nbsp;</td><td>Nikon&nbsp;</td><td>Zaćmienie FN1&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Mistrz 8</td><td>A.M.P.I.</td>Stymulator <td></td><td>pulsu Master-8</td></tr><tr><td>Krajalnica wibratomowa</td><td>Leica</td><td>VT 1000S</td><td></td></tr><tr><td>Żyletka</td><td>Gillette</td><td>74-S</td><td>FLYING EAGLE</td></tr><tr><td>Monitor wideo</td><td>Panasonic</td><td>WV-BM 1410</td><td></td></tr><tr><td>502 Klej</td><td>Deli</td><td>7146</td><td>Klej cyjanoakrylowy Pompa</td></tr><tr><td>perystaltyczna</td><td>Shanghai JIA PENG Corporation</td><td>BT100-1F</td><td></td></tr><tr><td>Kamera wideo</td><td>Olympus America Medical</td><td>OLY-150</td><td></td></tr><tr><td>Pipety transferowe</td><td>Biologix</td><td>30-0138A1</td><td></td></tr></tbody></table>

prądy całokomórkowe wywołane przez zaciągnięcie gaba w wycinkach mózgu

Whole-cell Currents Induced by Puff Application of GABA in Brain Slices

Podawanie farmakologiczne jest powszechnie stosowane podczas prowadzenia rejestracji krostek na całe komórki w wycinkach mózgu. Jedną z najlepszych metod aplikacji leków podczas zapisu elektrofizjologicznego jest technika zaciągnięcia, która może być wykorzystana do badania wpływu odczynników farmakologicznych na aktywność neuronów w wycinkach mózgu. Największą zaletą zaciągania się jest to, że stężenie leku wokół miejsca rejestracji gwałtownie wzrasta, zapobiegając w ten sposób odczuleniu receptorów błonowych. Skuteczne zastosowanie aplikacji zaciągnięcia się wymaga zwrócenia szczególnej uwagi na następujące elementy: stężenie leku, parametry mikropipety zaciągającej się, odległość między końcówką mikropipety zaciągającej się a zarejestrowanym neuronem oraz czas trwania i ciśnienie napędzające zaciągnięcie (funty na cal kwadratowy, psi). W tym artykule opisano krok po kroku procedurę rejestrowania prądów całych komórek wywołanych przez wdychanie kwasu gamma-aminomasłowego (GABA) na neuron wycinka kory przedczołowej. Warto zauważyć, że tę samą procedurę można zastosować z niewielkimi modyfikacjami w innych obszarach mózgu, takich jak hipokamp i prążkowie, oraz w różnych preparatach, takich jak hodowle komórkowe.

Technika puff (aplikacja punktowa) pozwala badaczom na analizę wpływu leków na konkretne receptory znajdujące się na powierzchni danego neuronu. W niniejszym artykule skupiamy się na prądach pośredniczonych przez receptory GABA. Rysunek 1 przedstawia mikropipety do aplikacji substancji oraz do rejestracji. Aby wyeliminować wpływ ciśnienia fizycznego generowanego przez puff na rejestrowane neurony, w ramach kontroli stosuje się puff ACSF oraz sacharozy (<stron...

Opisujemy technikę zaciągania się, za pomocą której odczynniki farmakologiczne mogą być podawane podczas rejestracji krostek na całe komórki, i podkreślamy różne aspekty cech, które są kluczowe dla jej sukcesu.

Prądy całokomórkowe wywołane przez zaciągnięcie GABA w wycinkach mózgu

Pharmacological administration is commonly used when conducting whole-cell patch-clamp recording in brain slices. One of the best methods of drug ...

Ogólnym celem tej techniki zaciągania jest przeprowadzenie podawania farmakologicznego w zapisie z użyciem klamry krosowej dla całych komórek. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie elektrofizjologii, takie jak podawanie farmakologiczne. Główną zaletą tej techniki jest to, że stężenie leku wokół miejsca rejestracji gwałtownie wzrasta, zapobiegając w ten sposób odczulaniu receptorów błonowych.Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które dopiero zaczynają korzystać z tej metody, będą miały trudności, ponieważ przygotowanie ostrego wycinka kory przedczołowej i pozycja mikropipety puff są stosunkowo trudne. Aby rozpocząć tę procedurę, zmiażdż zamrożony roztwór do cięcia, aby uzyskać błoto pośniegowe. Utrzymuj rozsypany roztwór na lodzie i bąbelkuj go 95% tlenem i 5% dwutlenkiem węgla.Następnie umieść wypreparowaną głowę w zlewce wypełnionej lodowatym roztworem do krojenia i wyjmij ją po kilku sekundach. Przetnij czaszkę wzdłuż linii środkowej w kierunku ogonowo-rostralnym cienkimi nożyczkami i usuń boczne części czaszki. Następnie usuń mózg cienką szpatułką i wrzuć go do lodowatego roztworu do cięcia.Następnie umieść mózg na pokrywie dziewięciocentymetrowej szalki Pet

whole-cell-currents-induced-puff-application-gaba-brain

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Wykorzystujemy technikę patch-clamp do pomiaru prądów pojedynczych kanałów aktywowanych przez GABA (kanały GABAA, receptory GABAA) oraz generowanych przez nie prądów synaptycznych i tonicznych w neuronach. Aktywacja kanałów zmniejsza pobudliwość neuronów w stanach zdrowia i choroby 1,2,3,4.

Prądy pojedynczego kanału i prądy toniczne aktywowane przez GABA w skrawkach mózgu szczura

Ten film demonstruje zapis prądów całych komórek indukowanych przez kwas gamma-aminomasłowy, czyli GABA, w wycinku mózgu myszy w korze przedczołowej. Kontrolowane dostarczanie GABA otwiera kanały chlorkowe w neuronach postsynaptycznych, generując hamujące prądy postsynaptyczne lub IPSC. Te IPSC zwiększają się wraz z wyższymi stężeniami GABA, co odzwierciedla hamującą aktywność GABA na przekaźnictwo synaptyczne.

Rejestrowanie prądów całokomórkowych za pomocą GABA Puffing w wycinku mózgu myszy

Sieci korowe są kontrolowane przez mały, ale zróżnicowany zestaw hamujących interneuronów. Funkcjonalne badanie interneuronów wymaga zatem ukierunkowanego rejestrowania i rygorystycznej identyfikacji. Opisano tutaj podejście łączone obejmujące zapisy całych komórek z pojedynczych lub synaptycznie sprzężonych par neuronów z etykietowaniem wewnątrzkomórkowym, analizą morfologiczną post-hoc i immunocytochemiczną.

Nagrania całokomórkowych klamry krosowej z morfologicznie i neurochemicznie zidentyfikowanych interneuronów hipokampa

W tym artykule pokazujemy metodę przygotowania ostrych wycinków mózgu w temperaturze fizjologicznej, przy użyciu konwencjonalnego roztworu fizjologicznego bez specjalnych modyfikacji krojenia (takich jak dodanie sacharozy) i bez wewnątrzsercowej perfuzji zwierzęcia przed przygotowaniem plastrów.

Slice It Hot: Ostre cięcie mózgu dorosłego w temperaturze fizjologicznej

Oscylacje są podstawowymi właściwościami sieci i są modulowane przez choroby i leki. Badanie oscylacji wycinków mózgu pozwala na scharakteryzowanie izolowanych sieci w kontrolowanych warunkach. Zapewniono protokoły przygotowania ostrych wycinków mózgu do wywoływania oscylacji γ CA1.

Generowanie lokalnych oscylacji γ CA1 przez stymulację tężcową

Ten protokół opisuje podstawowe kroki proceduralne do wykonywania nagrań z użyciem krosówek dla całej komórki. Technika ta pozwala na badanie zachowania elektrycznego neuronów, a gdy jest wykonywana w wycinkach mózgu, pozwala na ocenę różnych funkcji neuronalnych z neuronów, które są nadal zintegrowane w stosunkowo dobrze zachowanych obwodach mózgowych.

Nagrania z użyciem zacisku krosowego całych komórek w wycinkach mózgu

Prezentujemy metodę łączącą zapisy z całokomórkowego patch-clampu i obrazowania dwufotonowego w celu zarejestrowania stanów przejściowych Ca2+ w dendrytach neuronalnych w ostrych wycinkach mózgu.

Dwufotonowe obrazowanie wapnia w dendrytach neuronalnych w wycinkach mózgu

Tutaj prezentujemy protokoły odkrywania związków aktywnych w receptorach GABAA, od wiązania po fizjologię i farmakologię.

Metody odkrywania nowych związków modulujących neuroprzekaźnictwo receptora kwasu gamma-aminomasłowego typu A

Modele ostrych napadów są ważne dla badania mechanizmów leżących u podstaw zdarzeń padaczkowych. Co więcej, możliwość generowania zdarzeń padaczkowych na żądanie zapewnia wysoce efektywną metodę badania dokładnej sekwencji zdarzeń leżących u podstaw ich inicjacji. W tym miejscu opisujemy ostre modele napadów korowych 4-aminopirydyny ustalone w tkance mysiej i ludzkiej.

Wytwarzanie i inicjacja na żądanie ostrej aktywności ictal w tkankach gryzoni i ludzkich

Wycinki mózgu ex vivo mogą być używane do badania wpływu lotnych środków znieczulających na wywołane reakcje na bodźce aferentne. Optogenetyka jest wykorzystywana do niezależnej aktywacji aferentów wzgórzowo-korowych i korowo-korowych do niepierwotnej kory nowej, a odpowiedzi synaptyczne i sieciowe są modulowane izofluranem.

Optogenetyczna aktywacja szlaków aferentnych w wycinkach mózgu i modulacja odpowiedzi za pomocą lotnych środków znieczulających

Ten artykuł ma na celu opisanie systematycznego protokołu uzyskiwania poziomych wycinków mózgu hipokampa u myszy. Celem tej metodologii jest zachowanie integralności szlaków włókien hipokampa, takich jak ścieżka perforantu i szlak włókien omszałych, w celu oceny procesów neurologicznych związanych z zakrętem zębatym.

Poziome wycinki hipokampa mózgu myszy

Poznaj technikę puff do szybkiego podawania leków podczas całokomórkowych zapisów patch-clamp w wycinkach kory przedczołowej. Ta metoda zapobiega desensytacji receptorów i umożliwia precyzyjne badania elektrofizjologiczne.

Prądy całokomórkowe wywołane przez zaciągnięcie GABA w wycinkach mózgu

Przeglądaj więcej filmów