Prądy całokomórkowe wywołane przez zaciągnięcie GABA w wycinkach mózgu

Ogólnym celem tej techniki zaciągania jest przeprowadzenie podawania farmakologicznego w zapisie z użyciem klamry krosowej dla całych komórek. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie elektrofizjologii, takie jak podawanie farmakologiczne. Główną zaletą tej techniki jest to, że stężenie leku wokół miejsca rejestracji gwałtownie wzrasta, zapobiegając w ten sposób odczulaniu receptorów błonowych.

Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które dopiero zaczynają korzystać z tej metody, będą miały trudności, ponieważ przygotowanie ostrego wycinka kory przedczołowej i pozycja mikropipety puff są stosunkowo trudne. Aby rozpocząć tę procedurę, zmiażdż zamrożony roztwór do cięcia, aby uzyskać błoto pośniegowe. Utrzymuj rozsypany roztwór na lodzie i bąbelkuj go 95% tlenem i 5% dwutlenkiem węgla.

Następnie umieść wypreparowaną głowę w zlewce wypełnionej lodowatym roztworem do krojenia i wyjmij ją po kilku sekundach. Przetnij czaszkę wzdłuż linii środkowej w kierunku ogonowo-rostralnym cienkimi nożyczkami i usuń boczne części czaszki. Następnie usuń mózg cienką szpatułką i wrzuć go do lodowatego roztworu do cięcia.

Następnie umieść mózg na pokrywie dziewięciocentymetrowej szalki Petriego wypełnionej lodem. Opłucz mózg lodowatym roztworem do cięcia. Następnie odetnij móżdżek i opuszkę węchową żyletką.

Następnie nałóż klej cyjanoakrylowy na uchwyt próbki Vibratome. Ostrożnie umieść blok mózgu na kropli kleju, rostralną stroną do góry i natychmiast zanurz go w lodowatym roztworze do cięcia. Ustaw uchwyt ostrza pod kątem 15 stopni w stosunku do płaszczyzny poziomej.

Pokrój tkanki mózgowe na 350-mikronowe wycinki koronalne. Następnie przenieś szkiełka do komory regeneracyjnej wypełnionej ACSF i inkubuj je przez godzinę przy ciągłym bulgotaniu 95% tlenu i 5% dwutlenku węgla. W naszym eksperymencie przygotowanie ostrego wycinka kory przedczołowej ma również kluczowe znaczenie w procedurze.

Zdrowy wycinek mózgu oznacza aktywne neurony, które można szczelnie załatać. W tej procedurze należy wykonać szklane mikropipety borokrzemianowe do użytku jako elektrody rejestrujące lub mikropipety dmuchające. W przypadku elektrod rejestrujących rezystancja końcówek mieści się w zakresie od czterech do sześciu megaomów, podczas gdy mikropipety zaciągające mają średnice końcówek w zakresie od dwóch do pięciu mikrometrów.

Dodaj bloker kanałów sodowych do ACSF, aby zablokować szybki kanał sodowy, a tym samym potencjały czynnościowe, i utrzymać stałe natężenie przepływu tego roztworu od dwóch do trzech mililitrów na minutę w komorze zapisu. Stale bąbelkuj ACSF 95% tlenu, 5% dwutlenku węgla, aby zapewnić żywotność plastrów. Przenieś wycinek mózgu do komory nagrywającej za pomocą pipety Pasteura z cienką końcówką naciętą tak, aby pasował do rozmiaru wycinka.

Następnie umieść platynową kotwicę nad plasterkiem, aby przytrzymać go na platformie. Następnie napełnij mikropipety rejestrujące roztworem wewnętrznym i napełnij mikropipety zaciągnięte GABA o stężeniu 10 mikromolowym, 50 mikromolowym i 100 mikromolowym lub ACSF jako kontrolę nośnika. Aby zapobiec zablokowaniu przez zanieczyszczenia, przed zanurzeniem elektrody rejestrującej w ACSF należy zastosować lekkie nadciśnienie za pomocą jednomililitrowej strzykawki.

Pod mikroskopem ustaw elektrodę rejestrującą i mikropipetę zaciągającą się tak, aby końcówki znalazły się na środku monitora. Następnie zidentyfikuj neuron docelowy. Wyreguluj ostrość mikroskopu, stopniowo obniżając mikropipetę dmuchaną i umieść ją nad neuronem rejestrującym pod kątem 45 stopni.

Zachowaj odległość między końcówką mikropipety dmuchanej a docelowym neuronem w zakresie od 20 do 40 mikrometrów. Powoli i ostrożnie zbliż się do neuronu z elektrodą rejestrującą, a następnie zwolnij nadciśnienie. Zastosuj słabe i krótkie ssanie przez rurkę podłączoną do uchwytu elektrody, aby utworzyć uszczelnienie gigaomowe.

Utrzymuj napięcie na poziomie zero miliwoltów. Po utworzeniu uszczelki gigaomowej należy skompensować szybką i wolną pojemność ręcznie lub automatycznie. Następnie zastosuj krótkie i mocne ssanie przez rurkę, aby przejść do trybu całej komórki.

Następnie rejestruj wywołane prądy IPSC w trybie cęgów napięciowych. Dostarczaj pojedyncze lub sparowane zaciągnięcia GABA przez mikropipetę puff sterowaną przez generator krokowy napięcia Master-8. Zmień czas trwania zaciągnięcia, aby uzyskać najlepsze wyniki wywołanych prądów IPSC, i zmierz wywołane prądy IPSC w modelu depresji wywołanej przez LPS.

Pokazano tutaj próbki IPSC indukowane przez 10, 50 i 100 mikromolowych GABA. A oto krzywe odpowiedzi czasu trwania zaciągnięcia. Powtarzające się prądy wywoływane przez GABA przy 50 mikromolowych zaciągnięciach w odstępach między zaciągnięciami wynoszącymi jedną, dwie lub trzy sekundy są pokazane tutaj.

Po opanowaniu, tę technikę można wykonać w dwie godziny, jeśli jest wykonywana prawidłowo. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o uzyskaniu zdrowych wycinków mózgu. Po opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się podawaniem farmakologicznym do zbadania wpływu leku na elektrofizjologię.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przeprowadzać podawanie farmakologiczne w nagraniu z użyciem klamry krosowej dla całych komórek. Nie zapominaj, że praca z TTX może być bardzo niebezpieczna i podczas wykonywania tej procedury należy zawsze zachować środki ostrożności, takie jak noszenie rękawiczek.