Name: Wysokoprzepustowe sekwencjonowanie równoległe w celu pomiaru sprawności Leptospira interrogans Mutanty insercji transpozonów podczas infekcji złotego chomika syryjskiego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-18T12:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 50 s
Description: Poznaj technikę wysokoprzepustowego sekwencjonowania transpozonów do identyfikacji genów wirulencji Leptospira interrogans w modelu złotego chomika syryjskiego. Metoda umożliwia badanie sprawności mutantów in vivo i in vitro.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Veterans Affairs Merit Award (dla D.A.H.) oraz grant National Institute of Health R01 AI 034431 (dla D.A.H.).

<ol><li>Murray, G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+transposon+mutagenesis+in+pathogenic+Leptospira+species%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Genome-wide transposon mutagenesis in pathogenic Leptospira species.</a> Infect Immun. 77 (2), 810-816 (2009).</li>
<li>Adler, B., Lo, M., Seemann, T., Murray, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenesis+of+leptospirosis%3A+the+influence+of+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Vet+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Pathogenesis of leptospirosis: the influence of genomics.</a> Vet Microbiol. 153 (1-2), 73-81 (2011).</li>
<li>Marcsisin, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+a+high-throughput+screen+to+identify+Leptospira+mutants+unable+to+colonize+the+carrier+host+or+cause+disease+in+the+acute+model+of+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Use of a high-throughput screen to identify Leptospira mutants unable to colonize the carrier host or cause disease in the acute model of infection.</a> J Med Microbiol. 62, 1601-1608 (2013).</li>
<li>van Opijnen, T., Bodi, K. L., Camilli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tn-seq%3A+high-throughput+parallel+sequencing+for+fitness+and+genetic+interaction+studies+in+microorganisms%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Tn-seq: high-throughput parallel sequencing for fitness and genetic interaction studies in microorganisms.</a> Nat Methods. 6 (10), 767-772 (2009).</li>
<li>van Opijnen, T., Lazinski, D. W., Camilli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+fitness+and+genetic+interactions+determined+by+Tn-seq%2C+a+high-throughput+massively+parallel+sequencing+method+for+microorganisms%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Genome-wide fitness and genetic interactions determined by Tn-seq, a high-throughput massively parallel sequencing method for microorganisms.</a> Curr Protoc Microbiol. 36, 1E.3.1-1E.3.24 (2015).</li>
<li>Troy, E. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+barriers+to+Borrelia+burgdorferi+dissemination+during+infection+using+massively+parallel+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Understanding barriers to Borrelia burgdorferi dissemination during infection using massively parallel sequencing.</a> Infect Immun. 81 (7), 2347-2357 (2013).</li>
<li>Wunder, E. A. Jr, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+PCR+reveals+rapid+dissemination+of+Leptospira+interrogans+after+intraperitoneal+and+conjunctival+inoculation+of+hamsters%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Real-time PCR reveals rapid dissemination of Leptospira interrogans after intraperitoneal and conjunctival inoculation of hamsters.</a> Infect Immun. 84 (7), 2105-2115 (2016).</li>
<li>Lourdault, K., Aviat, F., Picardeau, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+quantitative+real-time+PCR+for+studying+the+dissemination+of+Leptospira+interrogans+in+the+guinea+pig+infection+model+of+leptospirosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Use of quantitative real-time PCR for studying the dissemination of Leptospira interrogans in the guinea pig infection model of leptospirosis.</a> J Med Microbiol. 58, 648-655 (2009).</li>
<li>Coutinho, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetics+of+Leptospira+interrogans+infection+in+hamsters+after+intradermal+and+subcutaneous+challenge%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Negl+Trop+Dis%22%5BJournal%5D)">Kinetics of Leptospira interrogans infection in hamsters after intradermal and subcutaneous challenge.</a> PLoS Negl Trop Dis. 8 (11), e3307(2014).</li>
<li>Athanazio, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rattus+norvegicus+as+a+model+for+persistent+renal+colonization+by+pathogenic+Leptospira+interrogans%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Trop%22%5BJournal%5D)">Rattus norvegicus as a model for persistent renal colonization by pathogenic Leptospira interrogans.</a> Acta Trop. 105 (2), 176-180 (2008).</li>
<li>Ratet, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+bioluminescent+Leptospira+interrogans+in+mice+reveals+renal+colonization+as+a+stealth+escape+from+the+blood+defenses+and+antibiotics%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Negl+Trop+Dis%22%5BJournal%5D)">Live imaging of bioluminescent Leptospira interrogans in mice reveals renal colonization as a stealth escape from the blood defenses and antibiotics.</a> PLoS Negl Trop Dis. 8 (12), e3359(2014).</li>
<li>Gutierrez, M. G., Yoder-Himes, D. R., Warawa, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+identification+of+virulence+factors+required+for+respiratory+melioidosis+using+Tn-seq+mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Infect+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Comprehensive identification of virulence factors required for respiratory melioidosis using Tn-seq mutagenesis.</a> Front Cell Infect Microbiol. 5 (78), (2015).</li>
<li>Gawronski, J. D., Wong, S. M., Giannoukos, G., Ward, D. V., Akerley, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+insertion+mutants+within+libraries+by+deep+sequencing+and+a+genome-wide+screen+for+Haemophilus+genes+required+in+the+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Tracking insertion mutants within libraries by deep sequencing and a genome-wide screen for Haemophilus genes required in the lung.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (38), 16422-16427 (2009).</li>
<li>Gallagher, L. A., Shendure, J., Manoil, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-scale+identification+of+resistance+functions+in+Pseudomonas+aeruginosa+using+Tn-seq%5BTitle%5D)+AND+%22MBio%22%5BJournal%5D)">Genome-scale identification of resistance functions in Pseudomonas aeruginosa using Tn-seq.</a> MBio. 2 (1), (2011).</li>
<li>Slamti, L., Picardeau, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+a+library+of+random+mutants+in+the+spirochete+Leptospira+biflexa+using+a+mariner+transposon%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Construction of a library of random mutants in the spirochete Leptospira biflexa using a mariner transposon.</a> Methods Mol Biol. 859, (2012).</li>
<li>Picardeau, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conjugative+transfer+between+Escherichia+coli+and+Leptospira+spp.+as+a+new+genetic+tool%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Conjugative transfer between Escherichia coli and Leptospira spp. as a new genetic tool.</a> Appl Environ Microbiol. 74 (1), 319-322 (2008).</li>
<li>Lourdault, K., Matsunaga, J., Haake, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+parallel+sequencing+to+measure+fitness+of+Leptospira+interrogans+transposon+insertion+mutants+during+acute+infection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Negl+Trop+Dis%22%5BJournal%5D)">High-throughput parallel sequencing to measure fitness of Leptospira interrogans transposon insertion mutants during acute infection.</a> PLoS Negl Trop Dis. 10 (11), e0005117(2016).</li>
<li>Ellinghausen, H. C., McCullough, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nutrition+of+Leptospirapomona+and+growth+of+13+other+serotypes%3A+Fractionation+of+oleic+albumin+complex+and+a+medium+of+bovine+albumin+and+polysorbate+80%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Vet+Res%22%5BJournal%5D)">Nutrition of Leptospirapomona and growth of 13 other serotypes: Fractionation of oleic albumin complex and a medium of bovine albumin and polysorbate 80.</a> Am J Vet Res. 26, 45-51 (1965).</li>
<li>Johnson, R. C., Harris, V. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+pathogenic+and+saprophytic+letospires.+I.+Growth+at+low+temperatures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Differentiation of pathogenic and saprophytic letospires. I. Growth at low temperatures.</a> J Bacteriol. 94 (1), 27-31 (1967).</li>
<li>Demarre, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+family+of+mobilizable+suicide+plasmids+based+on+broad+host+range+R388+plasmid+%28IncW%29+and+RP4+plasmid+%28IncPa%29+conjugative+machineries+and+their+cognate+Escherichia+coli+host+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Res+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A new family of mobilizable suicide plasmids based on broad host range R388 plasmid (IncW) and RP4 plasmid (IncPa) conjugative machineries and their cognate Escherichia coli host strains.</a> Res Microbiol. 156 (2), 245-255 (2005).</li>
<li>Vallenet, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroScope%3A+a+platform+for+microbial+genome+annotation+and+comparative+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Database+%28Oxford%29%22%5BJournal%5D)">MicroScope: a platform for microbial genome annotation and comparative genomics.</a> Database (Oxford). , bap021(2009).</li>
<li>Goodman, A. L., Wu, M., Gordon, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+microbial+fitness+determinants+by+insertion+sequencing+using+genome-wide+transposon+mutant+libraries%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protocols%22%5BJournal%5D)">Identifying microbial fitness determinants by insertion sequencing using genome-wide transposon mutant libraries.</a> Nat. Protocols. 6 (12), 1969-1980 (2011).</li>
<li>Miller, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMiller%2C+J+%22Spirochetes+in+body+fluids+and+tissues+manual+of+investigative+methods%22">Spirochetes in body fluids and tissues manual of investigative methods</a>. , 22-23 (1971).</li>
<li>Ristow, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+OmpA-like+protein+Loa22+is+essential+for+leptospiral+virulence%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">The OmpA-like protein Loa22 is essential for leptospiral virulence.</a> PLoS Pathog. 3 (7), (2007).</li>
<li>Croda, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+mutagenesis+in+pathogenic+Leptospira+species%3A+disruption+of+the+LigB+gene+does+not+affect+virulence+in+animal+models+of+leptospirosis%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Targeted mutagenesis in pathogenic Leptospira species: disruption of the LigB gene does not affect virulence in animal models of leptospirosis.</a> Infect Immun. 76 (12), 5826-5833 (2008).</li>
<li>Haake, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hamster+model+of+leptospirosis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Hamster model of leptospirosis.</a> Curr Protoc Microbiol. 12, 2(2006).</li>
<li>Giardine, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Galaxy%3A+a+platform+for+interactive+large-scale+genome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Galaxy: a platform for interactive large-scale genome analysis.</a> Genome Res. 15 (10), 1451-1455 (2005).</li>
<li>Goecks, J., Nekrutenko, A., Taylor, J., Galaxy, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Galaxy%3A+a+comprehensive+approach+for+supporting+accessible%2C+reproducible%2C+and+transparent+computational+research+in+the+life+sciences%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Galaxy: a comprehensive approach for supporting accessible, reproducible, and transparent computational research in the life sciences.</a> Genome Biol. 11 (8), R86(2010).</li>
<li>Blankenberg, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Galaxy%3A+a+web-based+genome+analysis+tool+for+experimentalists%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Galaxy: a web-based genome analysis tool for experimentalists.</a> Curr Protoc Mol Biol. (Chapter 19), 11-21 (2010).</li>
<li>Afgan, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Galaxy+platform+for+accessible%2C+reproducible+and+collaborative+biomedical+analyses%3A+2016+update%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">The Galaxy platform for accessible, reproducible and collaborative biomedical analyses: 2016 update.</a> Nucleic Acids Res. 8 (44), (2016).</li>
<li>McCoy, K. M., Antonio, M. L., van Opijnen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MAGenTA%3B+a+Galaxy+implemented+tool+for+complete+Tn-Seq+analysis+and+data+visualization%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">MAGenTA; a Galaxy implemented tool for complete Tn-Seq analysis and data visualization.</a> Bioinformatics. , 1367(2017).</li>
<li>Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrafast+and+memory-efficient+alignment+of+short+DNA+sequences+to+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome.</a> Genome Biol. 10 (3), R25(2009).</li>
<li>Kamp, H. D., Patimalla-Dipali, B., Lazinski, D. W., Wallace-Gadsden, F., Camilli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+fitness+landscapes+of+Vibrio+cholerae+at+important+stages+of+its+life+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Gene fitness landscapes of Vibrio cholerae at important stages of its life cycle.</a> PLoS Pathog. 9 (12), e1003800(2013).</li>
<li>Poggi, D., Oliveira de Giuseppe, P., Picardeau, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibiotic+resistance+markers+for+genetic+manipulations+of+Leptospira+spp%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Antibiotic resistance markers for genetic manipulations of Leptospira spp.</a> Appl Environ Microbiol. 76 (14), 4882-4885 (2010).</li>
<li>van Opijnen, T., Camilli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transposon+insertion+sequencing%3A+a+new+tool+for+systems-level+analysis+of+microorganisms%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Transposon insertion sequencing: a new tool for systems-level analysis of microorganisms.</a> Nat Rev Microbiol. 11 (7), 435-442 (2013).</li>
<li>Pappas, C. J., Picardeau, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+gene+expression+in+Leptospira+spp.+by+Transcription+activator-like+effectors+demonstrates+a+potential+role+for+LigA+and+LigB+in+Leptospira+interrogans+virulence%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Control of gene expression in Leptospira spp. by Transcription activator-like effectors demonstrates a potential role for LigA and LigB in Leptospira interrogans virulence.</a> Appl Environ Microbiol. 81 (22), 7888-7892 (2015).</li>
<li>Koskiniemi, S., Sun, S., Berg, O. G., Andersson, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection-driven+gene+loss+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Selection-driven gene loss in bacteria.</a> PLoS Genet. 8 (6), e1002787(2012).</li>
<li>Troy, E. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+Tn-seq+analysis+of+carbohydrate+utilization+and+vertebrate+infectivity+of+Borrelia+burgdorferi%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Global Tn-seq analysis of carbohydrate utilization and vertebrate infectivity of Borrelia burgdorferi.</a> Mol Microbiol. 101 (6), 1003-1023 (2016).</li>
<li>Ramsey, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+genetic+screen+identifies+previously+uncharacterized+Borrelia+burgdorferi+genes+important+for+resistance+against+reactive+oxygen+and+nitrogen+species%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Negl+Trop+Dis%22%5BJournal%5D)">A high-throughput genetic screen identifies previously uncharacterized Borrelia burgdorferi genes important for resistance against reactive oxygen and nitrogen species.</a> PLoS Negl Trop Dis. 13 (2), e1006225(2017).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Chociaż wyniki naszego eksperymentu pilotażowego dla chomików z prowokacją dootrzewnową z 42 mutantami L. interrogans są przedstawione17, spodziewamy się, że większe pule mutantów mogą być badane przez Tn-Seq. Ponieważ częstość transkoniugantów jest niska (100-200 transkoniugantów/krycie), konieczne jest kilka kryć, aby wygenerować wystarczającą liczbę mutantów do dużych eksperymentów Tn-Seq. Utrzymanie dużej liczby mutantów w płynnych kulturach stanowi wyzwanie logistyczne, z którym nale...

Identyfikacja genów wirulencji dla niektórych bakterii, takich jak Leptospira spp., jest trudna ze względu na ograniczoną liczbę dostępnych narzędzi genetycznych. Jednym z powszechnie stosowanych podejść jest stworzenie kolekcji mutantów poprzez losową mutagenezę transpozonów, a następnie identyfikację miejsca insercji w każdym mutancie i testowanie wirulencji poszczególnych mutantów transpozonów w modelu zwierzęcym. Takie podejście jest czasochłonne, kosztowne i wymaga dużej liczby zwierząt.
Gdy po raz pierwszy opracowano losową mutagenezę dla patogenu Leptospira interrogans, geny odpowiedzialne za wirulencję zostały zidentyfikowane poprzez testowanie poszczególnych mutantów na modelu zwierzęcym1. Mutanty wybrano na podstawie takich kryteriów, jak ich potencjalna rola w sygnalizacji lub ruchliwości lub przewidywane położenie błony zewnętrznej lub powierzchni. Ponieważ większość genów leptospirali koduje hipotetyczne białka o nieznanej funkcji2, selekcja mutantów na podstawie tych kryteriów ogranicza możliwość odkrycia nowych genów wirulencji leptospirali.
Niedawno, pule mutantów transpozonów L. interrogans zostały przebadane pod kątem zakaźności w modelach chomików i myszy3. Każde zwierzę zostało wyzwane, a pula składająca się z maksymalnie 10 mutantów. Zakaźność mutanta została oceniona jako pozytywna, jeśli została wykryta za pomocą PCR kultur uzyskanych z krwi i nerek. Testy PCR były pracochłonne, ponieważ wymagały indywidualnej reakcji PCR dla każdego mutanta w puli. Ponieważ częstość występowania każdego mutanta w kulturach nie została określona ilościowo, podejście było skłaniane ku identyfikacji wysoce atenuowanych mutantów.
Opisujemy technikę sekwencjonowania transpozonów (Tn-Seq), jako strategię bardziej efektywnego badania genów wirulencji. Tn-seq polega na stworzeniu biblioteki mutantów poprzez mutagenezę transpozonów, po której następuje masowe sekwencjonowanie równoległe4,5,6. Krótko mówiąc, mutanty transpozonów są łączone, szczepione zwierzętom, a następnie odzyskiwane z różnych narządów (pule wyjściowe). DNA z pul wyjściowych jest ekstrahowane i trawione za pomocą enzymów restrykcyjnych lub ścinane za pomocą sonikacji. Wykonywane są dwie rundy PCR ukierunkowane na połączenia miejsc wprowadzania transpozonów. Ten krok umożliwia dodanie adapterów niezbędnych do sekwencjonowania. Otrzymane produkty PCR są analizowane za pomocą sekwencjonowania o wysokiej przepustowości w celu zidentyfikowania miejsca insercji transpozonów każdego mutanta w puli wraz z ich względną liczebnością, która jest porównywana z początkowym składem puli mutantów.
Główną zaletą tego podejścia jest możliwość jednoczesnego badania dużej liczby mutantów z małą liczbą zwierząt. Tn-Seq nie wymaga wcześniejszej wiedzy na temat miejsc insercji transpozonów, co zwiększa szanse na odkrycie nowych genów specyficznych dla Leptospira zaangażowanych w wirulencję w krótszym czasie i z większą wydajnością. Ponieważ obciążenie leptospiralą w tkankach jest stosunkowo wysokie w modelach gryzoni podatnych na śmiertelną infekcję (zwykle 104 do 108 bakterii/g tkanki)7,8,9, a także w zbiornikach hostów10,11, tkanki mogą być bezpośrednio analizowane bez konieczności hodowli, zmniejszając odchylenia spowodowane wzrostem in vitro.
W badaniach Tn-Seq z większością opisanych do tej pory patogenów bakteryjnych, wysoka częstotliwość mutagenezy insercyjnej pozwoliła na infekcję dużymi pulami zawierającymi mutanty mające łącznie wiele blisko rozmieszczonych insercji transpozonów w obrębie każdego genu4,12,13,14. Tn-Seq został również opracowany dla bakterii, dla której częstość mutagenezy jest znacznie niższa6. W przypadku Leptospira biblioteka mutantów transpozonów może być generowana przez wprowadzenie transpozonu do mobilizowalnego plazmidu przez koniugację, jak opisano przez Slamti et al15. Jednak częstość mutagenezy transpozonów L. interrogans jest niska. Kiedy transpozon Himar1 został wprowadzony na plazmidzie koniugacyjnym, stwierdzono, że częstość transkoniugantów wynosi tylko 8,5 x 10-8 na komórkę biorcy ze szczepem Lai L. interrogans16 i prawdopodobnie będzie podobnie słaba w przypadku większości innych szczepów L. interrogans. Opisany tutaj protokół jest częściowo oparty na protokole opracowanym dla Borrelia burgdorferi, w którym częstość mutagenezy insercyjnej transpozonów jest również niska6.
Dla naszego eksperymentu pilotażowego z protokołem17, przeprowadziliśmy mutagenezę transpozonów z L. interrogans serowar Manilae szczep L495 ze względu na sukces innych grup w izolowaniu mutantów inserozyjności transpozonów w szczepie wraz z jego niską LD50 (dawką śmiertelną) dla zjadliwości1. Przebadaliśmy 42 mutanty za pomocą Tn-Seq i zidentyfikowaliśmy kilku kandydatów na mutanty z wadami zjadliwości, w tym dwa z insercjami w kandydującym genie cyklazy adenylanowej. Indywidualne testy dwóch mutantów u chomików potwierdziły, że mają one niedobór zjadliwości17.

<table><tbody><tr><td>Siarczan kanamycyny z Streptomyces kanamyceticus</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>K4000</td><td></td></tr><tr><td>Kwas 2,6-diaminopimeliczny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1377</td><td></td></tr><tr><td>Spektynomycyna dichlorowodorek pentahydrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S4014</td><td></td></tr><tr><td>Axio Lab A1 z kondendensem ciemnego pola</td><td>Zeiss</td><td>490950-001-000</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do oczyszczania krwi i tkanek DNeasy</td><td>Qiagen</td><td>69504/69506</td><td></td></tr><tr><td>MinElute PCR Purification</td><td>Qiagen</td><td>28004/28006</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR zestaw do oczyszczania</td><td>Qiagen</td><td>28104/28106</td><td></td></tr><tr><td>Model 505 Sonic Dismembrator</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB-505</td><td></td></tr><tr><td>2,5-calowy róg kubkowy</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB-4625</td><td></td></tr><tr><td>Koralik Ruptor 24</td><td>Omni International</td><td>19-010</td><td>Krok 3.1.2.4</td></tr><tr><td>Końcowa deoksynukleotydylotransferaza</td><td>Promega</td><td>M828C</td><td></td></tr><tr><td>Master mix Phusion</td><td>Thermo Scientific</td><td>F531</td><td>Przygotowanie bibliotek genomicznych, krok 3.4.</td></tr><tr><td>DreamTaq Master Mix</td><td>Thermo Scientific</td><td>K9011/K9012</td><td>Identyfikacja miejsca wprowadzenia transpozonu, krok 1.2.</td></tr><tr><td>dCTP</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0151</td><td></td></tr><tr><td>ddCTP</td><td>Affymetrix/ USBProducts</td><td>77112</td><td></td></tr><tr><td>T100 Termocykler</td><td>BioRad</td><td>1861096</td><td></td></tr><tr><td>Qubit 2.0 fluorometr</td><td>Invitrogen</td><td>Q32866</td><td>krok 3.6.</td></tr><tr><td>Zestaw testowy Qubit dsDNA HS</td><td>Invitrogen</td><td>Q32851/Q32854</td><td>krok 3.6.</td></tr><tr><td>Technologie żywotności</td> <td>probówek do testów kubitowych</td><td>Q32856</td><td>krok 3.6.</td></tr><tr><td>PBS pH 7,2 (1X)</td><td>Gibco</td><td>20012-027 20012-050</td><td></td></tr><tr><td>Jednorazowy skalpel No10</td><td>Feather</td><td>2975#10</td><td></td></tr><tr><td>Plastikowe probówki K2 EDTA 2 ml</td><td>Vacutainer 367841</td><td></td><td></td></tr><tr><td>strzykawka BD U-100 z 26G x &frac12; &rdquo; igły</td><td>BD vacutainer</td><td>329652</td><td>wyzwanie IP, krok 2.2.1.</td></tr><tr><td>3 ml strzykawka z końcówką Luer-Lok</td><td>Vacutainer BD</td><td>309657</td><td>Nakłucie serca, krok 2.4.2.</td></tr><tr><td>Vacutainer BD</td> <td>z igłą 25G X 5/8"</td><td>305901</td><td>Nakłucie serca, krok 2.4.2.</td></tr><tr><td>Podstawa ze szkła spiekanego 25 mm z korkiem</td><td>EMD Millipore</td><td>XX1002502</td><td>System filtracji, krok 1.1.7.</td></tr><tr><td>Aluminiowy zacisk sprężynowy 25 mm</td><td>EMD Millipore</td><td>XX1002503</td><td>System jednostki filtracyjnej, krok 1.1.7.</td></tr><tr><td>Lejek ze szkła borokrzemianowego o pojemności 15 ml</td><td>EMD Millipore</td><td>XX1002514</td><td>System filtracji, krok 1.1.7.</td></tr><tr><td>Kolba Erlenmeyera z ramieniem bocznym o pojemności 125 ml</td><td>EMD Millipore</td><td>XX1002505</td><td>System jednostki filtracyjnej, krok 1.1.7.</td></tr><tr><td>Filtr octanowo-celulozowy VVPP (wielkość porów 0,1 mm; średnica 25 mm)</td><td>EMD Millipore</td><td>VVLP02500</td><td></td></tr></tbody></table>

wysokoprzepustowe sekwencjonowanie równoległe w celu pomiaru sprawności leptospira interrogans mutanty insercji transpozonów podczas infekcji złotego chomika syryjskiego

High-throughput Parallel Sequencing to Measure Fitness of Leptospira interrogans Transposon Insertion Mutants During Golden Syrian Hamster Infection

W tym manuskrypcie opisujemy technikę sekwencjonowania transpozonów (Tn-Seq) w celu identyfikacji i ilościowego określenia mutantów Leptospira interrogans, które zmieniły swoją przydatność podczas infekcji złotych chomików syryjskich. Tn-Seq łączy losową mutagenezę transpozonów z mocą technologii sekwencjonowania o wysokiej przepustowości. Zwierzęta są poddawane próbie pobrania puli mutantów transpozonów (pula wejściowa), a następnie pobraniu krwi i tkanek kilka dni później w celu zidentyfikowania i ilościowego określenia liczby mutantów w każdym narządzie (pule wyjściowe). Pule wyjściowe są porównywane z pulą wejściową w celu oceny dopasowania in vivo każdego mutanta. Takie podejście umożliwia badania przesiewowe dużej puli mutantów u ograniczonej liczby zwierząt. Z niewielkimi modyfikacjami protokół ten można przeprowadzić z dowolnym zwierzęcym modelem leptospirozy, modelami żywiciela rezerwuarowego, takimi jak szczury i modelami ostrej infekcji, takimi jak chomiki, a także z badaniami in vitro. Tn-Seq stanowi potężne narzędzie do badań przesiewowych w kierunku mutantów z wadami sprawności in vivo i in vitro.

Tworzenie biblioteki mutantów transpozonych u L. interrogans poprzez koniugację wymaga zastosowania jednostki filtracyjnej, jak pokazano na Rysunku 1. Z każdego procesu kojarzenia odzyskano 100-200 transkonjugantów.
Miejsce insercji transpozonu identyfikuje się w każdym mutancie poprzez sekwencjonowanie produktu PCR uzyskanego za pomocą półlosowej reakcji PCR, która celuje w koniec transpoz...

Opisujemy tutaj technikę, która łączy mutagenezę transpozonów z sekwencjonowaniem o wysokiej przepustowości w celu identyfikacji i ilościowego określenia transpozonów mutantów leptospiralnych w tkankach po wyzwaniu chomików. Protokół ten może być stosowany do badań przesiewowych mutantów pod kątem przeżycia i rozprzestrzeniania się u zwierząt, a także może być stosowany w badaniach in vitro.

Wysokoprzepustowe sekwencjonowanie równoległe w celu pomiaru sprawności Leptospira interrogans Mutanty insercji transpozonów podczas infekcji złotego chomika syryjskiego

In this manuscript, we describe a transposon sequencing (Tn-Seq) technique to identify and quantify Leptospira interrogans mutants altered in fitness ...

Ogólnym celem tej wysokoprzepustowej techniki sekwencjonowania transpozonów jest identyfikacja i ilościowe określenie mutantów transpozonów z defektami dopasowania in vivo i in vitro, a tym samym identyfikacja genów Leptospira zaangażowanych w zjadliwość. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie Leptospira, takie jak identyfikacja genów zaangażowanych w kolonizację, rozprzestrzenianie się i przetrwanie bakterii w gospodarzu. Główną zaletą tej techniki jest to, że duża liczba mutantów może być badana przy użyciu ograniczonej liczby zwierząt.Chociaż metoda ta została zaprojektowana w celu zbadania przydatności mutantów Leptospira interrogans w modelu chomika z ostrą leptospirozą, może być również stosowana za pomocą modeli przewlekłych infekcji, badań in vitro i innych szczepów Leptospira. Procedurę zademonstrują Kritel Lourdault i Karen Evangelista, obie post-doc z mojego laboratorium. Najpierw zmontuj jednostkę filtrującą.Umieść podstawę na 125-mililitrowej kolbie Erlenmeyera z bocznym ramieniem. Umieść filtr z celulozy octanowej u podstawy i zaciśnij lejek na podstawie. Podłącz jednostkę filtrującą do systemu próżniowego.Następnie dodaj pięć mililitrów ku

high-throughput-parallel-sequencing-to-measure-fitness-leptospira

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Enterobacter sp. YSU rośnie w pożywce z minimalnymi solami glukozy. Auksotrofy są generowane przez przekształcenie go w transposom, który losowo wstawia się do genomu gospodarza. Mutanty są znajdowane przez replikowanie posiewu ze złożonej pożywki do minimalnej pożywki. Przerwane geny są identyfikowane przez ratowanie genów i sekwencjonowanie.

Wytwarzanie auksotrofów Enterobacter sp. YSU z wykorzystaniem mutagenezy transpozonów

Coxiella burnetii jest obligatoryjną wewnątrzkomórkową bakterią Gram-ujemną odpowiedzialną za chorobę odzwierzęcą Q gorączkę. W tym miejscu opisujemy metody generowania mutantów transpozonów fluorescencyjnych Coxiella, a także automatyczną identyfikację i analizę powstałych fenotypów internalizacji, replikacji i cytotoksyczności.

Wytwarzanie i wielofenotypowe badania przesiewowe o wysokiej zawartości mutantów transpozonów Coxiella burnetii

Przedstawiona tutaj jest prosta metoda tworzenia biblioteki wstawiania transpozonów o dużej gęstości w Escherichia coli lub Shigella flexneri przy użyciu koniugacji bakteryjnej. Protokół ten pozwala na stworzenie kolekcji setek tysięcy unikalnych mutantów w bakteriach poprzez losową insercję genomową transpozonu.

Stworzenie gęstej biblioteki insercji transpozonów za pomocą koniugacji bakteryjnej w szczepach enterobakteryjnych, takich jak Escherichia coli czy Shigella flexneri

Pronuclear (PN) wstrzykiwanie systemu CRISPR (Clustered regularly interspaced short palindromic repeats) i systemu CRISPR-related protein-9 nucleazy (CRISPR/Cas9) jest wysoce efektywną metodą produkcji genetycznie modyfikowanych złotych chomików syryjskich. W niniejszym artykule opisujemy szczegółowy protokół wstrzykiwania PN do produkcji chomików z nokautem genów za pomocą systemu CRISPR/Cas9.

Produkcja genetycznie modyfikowanych złotych chomików syryjskich metodą wstrzyknięcia projądrowego kompleksu CRISPR/Cas9

To oparte na molekularnym podejściu do określania sprawności bakterii umożliwia precyzyjne i dokładne wykrywanie mikroorganizmów za pomocą unikalnych kodów kreskowych genomowego DNA, które są określane ilościowo za pomocą cyfrowego PCR. W protokole opisano obliczanie indeksu konkurencyjnego dla szczepów Salmonella; Technologia ta jest jednak łatwa do zaadaptowania do protokołów wymagających bezwzględnej kwantyfikacji każdego genetycznie plastycznego organizmu.

Cyfrowy indeks konkurencyjności oparty na PCR do wysokoprzepustowej analizy sprawności w Salmonelli

Wzajemna hemizygotyczność poprzez sekwencjonowanie (RH-seq) to nowa, potężna metoda mapowania genetycznych podstaw różnic między gatunkami. Pule hemizygot są generowane przez mutagenezę transpozonów, a ich sprawność jest śledzona poprzez wzrost konkurencyjności przy użyciu sekwencjonowania o wysokiej długości czasu. Analiza uzyskanych danych wskazuje geny leżące u podstaw tej cechy.

Mapowanie genetyczne różnic w termotolerancji między gatunkami drożdży Saccharomyces za pomocą analizy wzajemnej hemizygotyczności całego genomu

Opisujemy metodę generowania nasyconych bibliotek mutantów transpozonów w bakteriach Gram-ujemnych i późniejszego przygotowania bibliotek amplikonów DNA do sekwencjonowania o wysokiej przepustowości. Jako przykład skupiamy się na patogenie ESKAPE, Acinetobacter baumannii, ale ten protokół jest podatny na szeroką gamę organizmów Gram-ujemnych.

Generowanie bibliotek insercji transpozonów w bakteriach Gram-ujemnych w celu sekwencjonowania o wysokiej przepustowości

Tutaj opisane jest zastosowanie interferencji CRISPR (CRISPRi) do specyficznego wyciszania genów u gatunków Leptospira. Komórki Leptospira są przekształcane przez koniugację z plazmidami eksprymującymi dCas9 (katalitycznie "martwy" Cas9) i jednoprowadnicowym RNA (sgRNA), odpowiedzialnym za parowanie zasad z pożądanym celem genomowym. Przedstawiono metody walidacji wyciszania genów.

Zastosowanie interferencji CRISPR (CRISPRi) do wyciszania genów u patogennych gatunków Leptospira

To jest dostosowana metoda identyfikacji potencjalnych czynników kolonizacji owadów w korzystnym symbiontie Burkholderia. Gospodarz chrząszcza jest zainfekowany losową zmutowaną biblioteką wygenerowaną przez mutagenezę transpozonów, a złożoność biblioteki po kolonizacji jest porównywana z kontrolą wyhodowaną in vitro.

Sekwencjonowanie insercji transpozonów jako narzędzie do wyjaśnienia czynników kolonizacji bakteryjnej u mieczyków Burkholderia gladioli z chrząszczami Lagria villosa

Tutaj prezentujemy podłużną ocenę chomików złocistych zakażonych dootrzewnowo (IP) lub dodziąsłowy (IG) L. infantum-Luc za pomocą obrazowania bioluminescencyjnego i PCR. Chomiki oceniano 1 dzień po zakażeniu (1 dpi), 1 tydzień po zakażeniu (8 dpi) i 3 tygodnie po zakażeniu (22 dpi) i usypano w 50. dpi i 8 miesięcy po zakażeniu.

In vivo (in vivo) Obrazowanie chomików zakażonych Leishmania infantum przez inokulację dziąseł aksenicznych amastigotów eksprymujących lucyferazy

Protokół ten zapewnia modułowy workflow BSL-2, łączący testy biomasy kryształowo-fioletowej, kinetykę kontrastu fazowego poklatkowego, konfokalne mapowanie 3D/matrycowe macierzy, ultrastrukturę SEM oraz moduł in vivo dla infekcji chomików, aby kultywować, ilościować, charakteryzować i badać funkcjonalną rolę biofilmu Leptospira , umożliwiając standaryzowaną ocenę mutantów i interwencji antybiofilmowych w różnych laboratoriach.

Modułowy workflow do analizy ilościowej, strukturalnej i funkcjonalnej biofilmów Leptospira

Poznaj technikę wysokoprzepustowego sekwencjonowania transpozonów do identyfikacji genów wirulencji Leptospira interrogans w modelu złotego chomika syryjskiego. Metoda umożliwia badanie sprawności mutantów in vivo i in vitro.

Wysokoprzepustowe sekwencjonowanie równoległe w celu pomiaru sprawności Leptospira interrogans Mutanty insercji transpozonów podczas infekcji złotego chomika syryjskiego (Wideo) | JoVE Journal

Wysokoprzepustowe sekwencjonowanie równoległe w celu pomiaru sprawności Leptospira interrogans Mutanty insercji transpozonów podczas infekcji złotego chomika syryjskiego

Przeglądaj więcej filmów