Name: Test hodowli osteoklastów szpiku kostnego myszy oparty na RANKL w celu zbadania roli mTORC1 w tworzeniu osteoklastów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-15T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 37 s
Description: Poznaj metodę izolacji i hodowli osteoklastów z mysiego szpiku kostnego opartą na RANKL. Technika ta pozwala badać rolę mTORC1 w różnicowaniu komórek kostnych i może wspierać rozwój terapii osteoporozy.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują Dr. Minghan Tong i S. Kato za uprzejme dostarczenie odczynników i myszy. Dziękujemy członkom laboratorium Zou za przydatne dyskusje. Praca ta była częściowo wspierana przez granty z programu 973 z chińskiego Ministerstwa Nauki i Technologii (MOST) [2014CB964704 i 2015CB964503], Programu Badań Klinicznych 9th People's Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine. Dziękujemy za pomoc Core Facility for Cell Biology i Core Facility for Chemical Biology, CAS Center for Excellence in Molecular Cell Science, Shanghai Institute of Biochemistry and Cell Biology, Chinese Academy of Sciences.

Wszystkie procedury związane ze zwierzętami zostały przeprowadzone zgodnie z protokołem zatwierdzonym przez Stanford Administrative Panel on Laboratory Animal Care (APLAC) i zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania Shanghai Institute of Biochemistry and Cell Biology.
1. Przygotowanie
<ol>
	<li>Wygeneruj myszy z delecją specyficzną dla osteoklastów Raptor (Raptorfl / fl; Ctsk-cre, dalej RapCtsk) przez kojarzenie myszy Raptor fl/fl z myszami Ctsk-cre. Użyj myszy Raptor fl / fl jako kontroli WT w tym badaniu.</li>
	<li>Miej pojemnik z lodem, aby utrzymać odizolowaną kość.</li>
	<li>Przygotuj pożywkę hodowlaną.
	<ol>
		<li>Przygotuj pożywkę hodowlaną α-MEM, uzupełniając minimalną niezbędną pożywkę alfa (α-MEM) 1x glutaminą, penicyliną-streptomycyną i 10% płodową surowicą cielęcą.</li>
		<li>Przygotować pożywkę do indukcji makrofagów szpiku kostnego składającą się z 50 ml pożywki α-MEM i M-CSF w stężeniu 20 ng/ml.</li>
		<li>Przygotować pożywkę do indukcji osteoklastów składającą się z M-CSF i RANKL odpowiednio w stężeniu 20 ng/ml w 50 ml pożywki α-MEM.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj następujące przed barwieniem TRAP.
	<ol>
		<li>Przygotować roztwór utrwalający składający się z 6,5 ml acetonu, 2,5 ml roztworu cytrynianu i 0,8 ml 37% (obj./obj.) roztworu formaldehydu.</li>
		<li>Przygotuj roztwór do barwienia TRAP.
		<ol>
			<li>Podgrzej wodę dejonizowaną do temperatury 37 °C.</li>
			<li>Dodaj 100 μl roztworu bazowego GBC szybkiego granatu i 100 μl roztworu azotynu sodu do mikroprobówki o pojemności 1,5 ml i mieszaj przez delikatną inwersję przez 30 s. Pozostaw mieszaninę na 2 minuty.</li>
			<li>Podgrzej 9 ml wody dejonizowanej do temperatury 37 °C. Dodać 200 μl roztworu zasadowego GBC diazotowanego granatu szybkiego z kroku 1.4.2.2, 100 μl roztworu fosforanu AS-BI naftolu, 400 μl roztworu octanu i 200 μl roztworu winianu.</li>
			<li>Roztwór mieszaniny barwiącej TRAP należy przechowywać w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotować następujący bufor przed ilościowym określeniem aktywności TRAP pożywki hodowlanej.
	<ol>
		<li>Przygotować bufor winianu (50 ml): 2 ml 0,33 M kwasu L-winowego, 48 ml 0,33 M dwuzasadowego odwodnionego winianu sodu. Dostosuj wartość pH do 4,9.</li>
		<li>Przygotować bufor disodowy fosforanu 4-nitrofenylu (pNPP) (200 ml): 1,502 g glicyny, 41 mg MgCl2, 27,2 mg ZnCl2 i 180 ml wody dejonizowanej. Dostosować wartość pH do 10,4 za pomocą 3 M NaOH, a objętość do 200 ml za pomocą wody dejonizowanej.</li>
		<li>Przygotować bufor pNPP z substratem fosfatazy (na jedną płytkę 96-dołkową): 49,37 mg substratu fosfatazy i 175 μl buforu pNPP z kroku 1.5.2.</li>
		<li>Przygotuj bufor substratowy (płytka 9 ml/96-dołkowa): 6,24 ml wody dejonizowanej, 360 μl roztworu octanu i 2,4 ml buforu winianowego. Wymieszać przez wir i podgrzać w temperaturze 37 °C przed użyciem.</li>
		<li>Dodać 90 μl buforu pNPP z substratem fosfatazy (1.5.3) do 9 ml podgrzanego buforu substratowego (1.5.4) w celu uzyskania mieszaniny substratów i wirować przez 10 s.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Sekcja (Dzień -1)
<ol>
	<li>Poddaj eutanazji 3 miesięczne samice myszy WT i RapCtsk osobno za pomocą CO2. Wdychanie CO2 należy wykonywać przy użyciu odpowiedniego sprzętu przez przeszkolony personel.</li>
	<li>Zanurz 6 myszy w zlewce ze 100 ml 75% etanolu (obj./obj.) na 5 minut, aby zapobiec skażeniu bakteryjnemu, a następnie umieść na desce sekcyjnej w pozycji leżącej. Wykonaj nacięcie w dystalnej części kości piszczelowej pionowo i wypreparuj skórę wzdłuż tylnej kończyny nożyczkami okulistycznymi.</li>
	<li>Przetnij więzadło stawowe stawu biodrowego nożyczkami i zwichnij tylne kończyny od tułowia.</li>
	<li>Przetnij więzadło stawowe stawu kolanowego i ostrożnie odłącz kość piszczelową i udową od stawu kolanowego. Delikatnie usuń miękką tkankę nożyczkami.</li>
	<li>Umieść wszystkie kości jednego genotypu jednej myszy w każdym dołku sześciodołkowej płytki z 2 ml α-MEM na lodzie. 
	UWAGA: Aby zachować żywotność komórek, kość powinna być przechowywana w tych warunkach krócej niż 1 godzinę.</li>
</ol>
3. Izolacja (Dzień -1)
<ol>
	<li>Napełnij jedną studzienkę sześciodołkowej płytki 75% etanolem (3 ml), a pozostałe 5 dołków pożywką α-MEM (3 ml).</li>
	<li>Umieścić wszystkie kości jednego genotypu w płuczce etanolowej na 15 s i za każdym razem myć kości 5 razy pożywką α-MEM przez 10 s.</li>
	<li>Odetnij nasady nożyczkami i włóż igłę strzykawkową 0,45 mm do jamy kostnej i wypłucz szpik z pożywką α-MEM do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml.</li>
	<li>Przepłucz jamę kostną tą samą metodą z drugiego końca kości. Powtórz co najmniej dwa razy, aby dokładnie umyć jamę kostną, aż kość będzie blada.</li>
	<li>Odwirować szpik kostny w celu uzyskania osadu komórkowego o temperaturze 800 x g i temperaturze 4 °C przez 5 minut. Odessać supernatant.</li>
	<li>Dodać 3 ml buforu do lizy czerwonych krwinek do probówki wirówkowej i delikatnie odpipetować, aby ponownie zawiesić szpik kostny. Trzymaj probówkę wirówkową na lodzie przez 8 minut, aby zrazić czerwone krwinki.</li>
	<li>Dodaj 6 ml pożywki α-MEM do probówki wirówkowej, aby zatrzymać lizę komórek. Wirować w temperaturze 500 x g i temperaturze 4 °C przez 10 minut i zasysać supernatant.</li>
	<li>Zawiesić ponownie w 3 ml pożywki hodowlanej α-MEM i umieścić komórki na płytce sześciodołkowej (zwykle jedna mysz na studzienkę).</li>
	<li>Inkubować w temperaturze 37 °C w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 przez noc.</li>
</ol>
4. Poszycie (Dzień 0)
<ol>
	<li>Przenieść supernatant do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml w celu zebrania nieprzyłączonych komórek następnego ranka.</li>
	<li>Wirować w temperaturze 800 x g i temperaturze 4 °C przez 5 minut i odsysać supernatant.</li>
	<li>Zawiesić w 4 ml pożywki hodowlanej α-MEM.</li>
	<li>Weź 20 μl roztworu komórkowego i wymieszaj z 20 μl błękitu trypanowego. Dodać 10 μl mieszaniny do komory liczenia i uzyskać liczbę komórek na ml roztworu.</li>
	<li>Dodać odpowiednią objętość pożywki hodowlanej α-MEM, aby uzyskać roztwór komórkowy o objętości 500 000 komórek/ml.</li>
	<li>Dodać 500 μl i 50 μl pożywki indukcyjnej makrofagów szpiku kostnego do każdego dołka odpowiednio płytki 24-dołkowej i 96-dołkowej.</li>
	<li>Dodać 500 μl i 50 μl roztworu komórkowego do każdego dołka odpowiednio na płytce 24-dołkowej i 96-dołkowej.</li>
	<li>Inkubować w temperaturze 37 °C w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 przez 3 dni.</li>
</ol>
5. Zróżnicowanie (dni 3-7)
<ol>
	<li>Trzy dni po posiewie zebrać 50 μl pożywki z każdego dołka płytki 96-dołkowej i zamrozić w temperaturze -20 °C, a następnie odessać pozostałą pożywkę.</li>
	<li>Dodać 1 ml i 100 μl pożywki do indukcji osteoklastów do każdego dołka odpowiednio płytki 24-dołkowej i płytki 96-dołkowej.</li>
	<li>Inkubować w temperaturze 37 °C przez 2 dni.</li>
	<li>Zebrać 50 μl pożywki z każdej studzienki i odessać pozostałą pożywkę.</li>
	<li>Dodaj pożywkę do indukcji osteoklastów do każdej studzienki.</li>
	<li>Inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 dzień. 
	UWAGA: W tym momencie duże, wielojądrzaste osteoklasty powinny być widoczne pod odwróconym mikroskopem (<silna klasa="xfig">Ryc. 2A).</li>
	<li>Jeśli osteoklasty nie są widoczne, należy zmienić pożywkę do indukcji osteoklastów i obserwować codziennie, aż osteoklasty będą widoczne.</li>
	<li>Zebrać 50 μl pożywki z każdej studzienki 96-dołkowej płytki po utworzeniu osteoklastów.</li>
</ol>
6. Barwienie kwaśną fosfatazą odporną na winian (TRAP)
UWAGA: Dojrzałe osteoklasty mogą być obecne po 6-7 dniach hodowli in vitro (krok 4).
<ol>
	<li>Odessać podłoże i delikatnie przemyć 3 razy 1x PBS.</li>
	<li>Umieścić komórki w każdym dołku płytki 96-dołkowej za pomocą 100 μl roztworu utrwalającego przez 30 s w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Po utrwaleniu odessać roztwór utrwalający i delikatnie przemyć 3 razy wodą dejonizowaną podgrzaną do 37 °C. Odsysać wodę dejonizowaną.</li>
	<li>Dodać 100 μl barwnika TRAP do każdego dołka na 96-dołkowej płytce i umieścić płytkę w inkubatorze w temperaturze 37 °C na 30 minut, osłaniając przed światłem.</li>
	<li>Po zabarwieniu odessać plamę TRAP i delikatnie zmyć 3 razy wodą dejonizowaną.</li>
	<li>Obraz osteoklastów za pomocą odwróconego mikroskopu przy 40-krotnym powiększeniu.</li>
</ol>
7. Kwantyfikacja aktywności TRAP pożywki hodowlanej
<ol>
	<li>Zebrać 30 μl supernatantu hodowli z każdej studzienki 96-dołkowej płytki z kroku 5.1, 5.4 i 5.8; Jako kontrolę ujemną należy użyć 30 μl niehodowlanej pożywki indukcyjnej osteoklastów. Umieścić próbki na nowej płytce 96-dołkowej.</li>
	<li>Dodać 90 μl mieszaniny substratów (1.5.5) do każdego dołka płytki 96-dołkowej.</li>
	<li>Umieścić płytkę w inkubatorze w temperaturze 37 °C na 1 godzinę i chronić przed światłem.</li>
	<li>Zatrzymać reakcję, dodając 50 μl 3 M NaOH do każdego dołka płytki 96-dołkowej.</li>
	<li>Zmierzyć absorbancję przy długości fali 405 nm.</li>
</ol>
8. Western Blotting (zachodnia plama)
UWAGA: Po 6-7 dniach hodowli in vitro na płytce 24-dołkowej, dojrzałe osteoklasty powinny być widoczne.
<ol>
	<li>Zassać pożywkę.</li>
	<li>Umyj delikatnie wstępnie schłodzonym 1x PBS 3 razy.</li>
	<li>Zasysać PBS.</li>
	<li>Dodać 100 μL 1x buforu do lizy SDS zawierającego koktajl inhibitorów proteazy.</li>
	<li>Podgrzewać lizaty w temperaturze 105 °C przez 10 minut i wirować w temperaturze 12 000 × g i w temperaturze 4 °C przez 10 minut. Zebrać supernatanty zawierające białka.</li>
	<li>Oddzielić lizaty zawierające 30 μg białka przez 10% SDS-PAGE11, a następnie przenieść do membrany z polifluorku winylidenu (PVDF).</li>
	<li>Zatkaj błony 5% mlekiem beztłuszczowym na 30 minut.</li>
	<li>Inkubować błony z anty-Raptor, anty-P-S6, anty-S6, anty-β-aktyną w rozcieńczeniu 1:1 000 w 5% mleku beztłuszczowym w temperaturze 4 °C przez noc.</li>
	<li>Płukać membrany roztworem soli fizjologicznej Tris Buffered Saline z Tween-20 (TBST) przez 10 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Powtórz krok 8.9 dwa razy.</li>
	<li>Inkubować błony z przeciwciałami anty-mysim lub króliczym IgG sprzężonymi z peroksydazą chrzanową (HRP) w rozcieńczeniu 1:5 000 w 5% mleku beztłuszczowym przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Umyj membrany 3 razy TBST przez 10 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>W celu detekcji chemiluminescencyjnej dodaj zachodni substrat chemiluminescencyjny HRP na membrany i inkubuj przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Odcedź nadmiar podłoża i naświetl plamy na folię rentgenowską.</li>
</ol>

<ol><li>Boyle, W. J., Simonet, W. S., Lacey, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoclast+differentiation+and+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Osteoclast differentiation and activation.</a> Nature. 423 (6937), 337-342 (2003).</li>
<li>Jaenisch, R., Bird, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+regulation+of+gene+expression%3A+how+the+genome+integrates+intrinsic+and+environmental+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Epigenetic regulation of gene expression: how the genome integrates intrinsic and environmental signals.</a> Nature Genetics. 33, 245-254 (2003).</li>
<li>Feng, X., McDonald, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disorders+of+bone+remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Pathol%22%5BJournal%5D)">Disorders of bone remodeling.</a> Annu Rev Pathol. 6, 121-145 (2011).</li>
<li>Boyce, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+osteoclast+biology+reveal+potential+new+drug+targets+and+new+roles+for+osteoclasts%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bone+Miner+Res%22%5BJournal%5D)">Advances in osteoclast biology reveal potential new drug targets and new roles for osteoclasts.</a> J Bone Miner Res. 28 (4), 711-722 (2013).</li>
<li>Ibbotson, K. J., Roodman, G. D., McManus, L. M., Mundy, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+osteoclast-like+cells+and+their+progenitors+in+cultures+of+feline+marrow+mononuclear+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of osteoclast-like cells and their progenitors in cultures of feline marrow mononuclear cells.</a> J Cell Biol. 99 (2), 471-480 (1984).</li>
<li>Lacey, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoprotegerin+ligand+is+a+cytokine+that+regulates+osteoclast+differentiation+and+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Osteoprotegerin ligand is a cytokine that regulates osteoclast differentiation and activation.</a> Cell. 93 (2), 165-176 (1998).</li>
<li>Wong, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRANCE+is+a+novel+ligand+of+the+tumor+necrosis+factor+receptor+family+that+activates+c-Jun+N-terminal+kinase+in+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">TRANCE is a novel ligand of the tumor necrosis factor receptor family that activates c-Jun N-terminal kinase in T cells.</a> J Biol Chem. 272 (40), 25190-25194 (1997).</li>
<li>Zoncu, R., Efeyan, A., Sabatini, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mTOR%3A+from+growth+signal+integration+to+cancer%2C+diabetes+and+ageing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">mTOR: from growth signal integration to cancer, diabetes and ageing.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 12 (1), 21-35 (2011).</li>
<li>Bhaskar, P. T., Hay, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+two+TORCs+and+Akt%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">The two TORCs and Akt.</a> Dev Cell. 12 (4), 487-502 (2007).</li>
<li>Dai, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inactivation+of+Regulatory-associated+Protein+of+mTOR+%28Raptor%29%2FMammalian+Target+of+Rapamycin+Complex+1+%28mTORC1%29+Signaling+in+Osteoclasts+Increases+Bone+Mass+by+Inhibiting+Osteoclast+Differentiation+in+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Inactivation of Regulatory-associated Protein of mTOR (Raptor)/Mammalian Target of Rapamycin Complex 1 (mTORC1) Signaling in Osteoclasts Increases Bone Mass by Inhibiting Osteoclast Differentiation in Mice.</a> J Biol Chem. 292 (1), 196-204 (2017).</li>
<li>Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrook%2C+J+%22Molecular+cloning%3A+a+laboratory+manual%22">Molecular cloning: a laboratory manual</a>. , Cold spring harbor laboratory press. (1989).</li>
<li>Weischenfeldt, J., Porse, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+Marrow-Derived+Macrophages+%28BMM%29%3A+Isolation+and+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+Protoc%22%5BJournal%5D)">Bone Marrow-Derived Macrophages (BMM): Isolation and Applications.</a> CSH Protoc. 2008, (2008).</li>
<li>Bradley, E. W., Oursler, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoclast+culture+and+resorption+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Osteoclast culture and resorption assays.</a> Methods Mol Biol. 455, 19-35 (2008).</li>
<li>Tevlin, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoclast+derivation+from+mouse+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Osteoclast derivation from mouse bone marrow.</a> J Vis Exp. (93), e52056(2014).</li>
<li>Xing, L., Boyce, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RANKL-based+osteoclastogenic+assays+from+murine+bone+marrow+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">RANKL-based osteoclastogenic assays from murine bone marrow cells.</a> Methods Mol Biol. 1130, 307-313 (2014).</li>
<li>Hsu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+necrosis+factor+receptor+family+member+RANK+mediates+osteoclast+differentiation+and+activation+induced+by+osteoprotegerin+ligand%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Tumor necrosis factor receptor family member RANK mediates osteoclast differentiation and activation induced by osteoprotegerin ligand.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (7), 3540-3545 (1999).</li>
<li>Underwood, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+where+comes+the+osteoclast%3F%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pathol%22%5BJournal%5D)">From where comes the osteoclast?</a> J Pathol. 144 (4), 225-226 (1984).</li>
<li>Wein, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+bone+resorption+in+mice+by+Schnurri-3%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Control of bone resorption in mice by Schnurri-3.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (21), 8173-8178 (2012).</li>
</ol>

Wszyscy autorzy oświadczają, że nie mają konfliktu interesów.

Test osteoklastogenny jest najczęściej stosowaną metodą izolowania i hodowli osteoklastów in vitro 12,13. Podczas gdy opisano kilka indukcji osteoklastów opartych na RANKL 13,14,15, w niniejszym badaniu opisano protokół z pewnymi modyfikacjami opartymi na poprzednich metodach.
W poprzednim badaniu BMM były posiewane natychmiast po izo...

Kość jest ciągle zmieniającym się organem i jest przebudowywana przez osteoblasty i osteoklasty przez całe życie. Osteoklasty są odpowiedzialne za zmineralizowaną resorpcję macierzy, a osteoblasty syntetyzują i wydzielają nowe matryce kostne1. Równowaga między resorpcją kości a tworzeniem kości ma kluczowe znaczenie dla zdrowia kości, w tym utrzymania masy kostnej oraz reakcji na stymulację i urazy. Jeśli ta równowaga zostanie zakłócona, może dojść do szeregu chorób metabolicznych kości, w tym osteoporozy i chorób przyzębia. W tych chorobach utrata masy kostnej wynikająca z osteoklastycznej resorpcji kości przekracza zdolność kościotwórczą osteoblastów2,3. W związku z tym, aby opracować cele farmaceutyczne do leczenia chorób układu kostnego, takich jak osteoporoza, kluczowe znaczenie ma zrozumienie powstawania i biologii osteoklastów4.
Osteoklasty to unikalne gigantyczne wielojądrowe komórki znajdujące się na powierzchni kości lub w jej pobliżu, należące do rodziny monocytów/makrofagów1. Ibbotson, K. J. i wsp. opisano metodę generowania komórek podobnych do osteoklastów in vitro z pożywką zawierającą 1,25-dihydroksy-witaminę D35. Identyfikacja czynnika stymulującego tworzenie kolonii makrofagów (M-CSF) i aktywatora receptora dla liganda czynnika jądrowego κ B (RANKL) jako podstawowych czynników tworzenia osteoklastów znacznie zwiększyła skuteczność osteoklastogenezy in vitro1,6,7. Możliwość hodowli osteoklastów in vitro poszerzyła naszą wiedzę na temat wytwarzania i regulacji osteoklastów.
Ssakowy/mechanistyczny cel rapamycyny (mTOR) funkcjonuje w dwóch strukturalnie i funkcjonalnie odrębnych kompleksach, a mianowicie mTORC1 i mTORC28,9. Te dwa kompleksy wielobiałkowe różnią się od siebie różnymi składnikami i substratami końcowymi. mTORC1 zawiera unikalne białko mTOR (Raptor) związane z regulatorem, podczas gdy mTORC2 zawiera niewrażliwego na rapamycynę towarzysza mTOR (Rictor)9. mTORC1 może integrować i przesyłać ważne sygnały w celu regulacji wzrostu, proliferacji i różnicowania komórek. Niedawno wykazaliśmy, że mTORC1 odgrywa kluczową rolę w sieci katabolicznej resorpcji kości poprzez delecję Raptor w celu inaktywacji mTORC1 w osteoklastach10. Mechanizmy leżące u podstaw tego zjawiska wymagają jednak dalszych badań. W niniejszym badaniu zastosowano metodę osteoklastogenną opartą na RANKL do generowania osteoklastów z makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego (BMM) myszy typu dzikiego (WT) i RapCtsk oraz do zbadania wpływu inaktywacji mTORC1 na tworzenie osteoklastów.

<table><tbody><tr><td>Myszy Raptorfl/fl</td><td>Myszy</td><td></td> Jackson Laboratory 013188<td></td></tr><tr><td>Ctsk-cre</td> prezent <td>od S. Kato, Uniwersytet Tokijski, Tokio, Japonia</td>&alpha;-MEM Corning 10-022-CVR Glutamina Gibico 25030081 Penicylina Streptomycyna <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Gibico</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica cielęca</td><td>BioInd</td><td>04-001-1A</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowane mysie białko M-CSF</td><td>R& D</td><td>Q3U4F9</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowane mysie białko RANKL</td><td>R& D</td><td>Q3TWY5</td><td></td></tr><tr><td>Bufor do lizy RBC</td><td>Beyotime</td><td>C3702</td><td></td></tr><tr><td>Błękit trypanowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>302643</td><td></td></tr><tr><td>Aceton</td><td>Shanghai Chemical Co., Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Roztwór cytrynianu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>915</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór formaldehydu</td><td>Shanghai Chemical Co., Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zestaw fosfatazy kwasowej, leukocytów (TRAP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>387A-1KT</td><td></td></tr><tr><td>Szybki granat GBC Roztwór podstawowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3872</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór azotynu sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>914</td><td></td></tr><tr><td>Naftol AS-BI Roztwór fosforanu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3871</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór octanu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3863</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór winianu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3873</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami Dulbecco</td><td>Corning</td><td>21-031-CVR</td><td></td></tr><tr><td>Kwas L-winowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>251380</td><td></td></tr><tr><td>Winian sodu dwuzasadowy odwodnienie</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>s4797</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Shanghai Chemical Co., Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Shanghai Chemical Co. Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ZnCl2</td><td>Shanghai Chemical Co. Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Shanghai Chemical Co., Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Substrat fosfatazy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4744</td><td></td></tr><tr><td>anti-Raptor</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>2280</td><td></td></tr><tr><td>białko anty-P-rybosomalne S6 (S235/236)</td><td>Technologia sygnalizacji komórkowej</td><td>2317</td><td></td></tr><tr><td>białko antyrybosomalne S6</td><td>Technologia sygnalizacji komórkowej</td><td>2211</td><td></td></tr><tr><td>anty-&beta;-aktyna</td><td>Santa Cruz Biotechnologia</td><td>sc-130300</td><td></td></tr><tr><td>37% formaldehyd</td><td>Xilong naukowa</td><td></td><td></td></tr><tr><td>membrana z polifluorku winylidenu (PVDF)</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Western Chemiluminescent Substrate HRP (ECL)</td><td>Millipore</td><td>00000367MSDS</td><td></td></tr><tr><td>IX71</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Envision</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>0,45 mm Strzykawka</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>nożycowa</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kleszczyk</td><td></td><td></td><td></td> do komarów</tr></tbody></table>

test hodowli osteoklastów szpiku kostnego myszy oparty na rankl w celu zbadania roli mtorc1 w tworzeniu osteoklastów

A RANKL-based Osteoclast Culture Assay of Mouse Bone Marrow to Investigate the Role of mTORC1 in Osteoclast Formation

Osteoklasty to unikalne komórki resorpujące kości, które różnią się od linii monocytów/makrofagów szpiku kostnego. Dysfunkcja osteoklastów może prowadzić do szeregu chorób metabolicznych kości, w tym osteoporozy. Aby opracować cele farmaceutyczne w celu zapobiegania patologicznej utracie masy kostnej, należy zrozumieć mechanizmy, dzięki którym osteoklasty różnią się od prekursorów. Zdolność do izolowania i hodowli dużej liczby osteoklastów in vitro ma kluczowe znaczenie dla określenia roli określonych genów w różnicowaniu osteoklastów. Inaktywacja ssaczo-mechanistycznego celu kompleksu rapamycyny 1 (TORC1) w osteoklastach może zmniejszyć liczbę osteoklastów i zwiększyć masę kostną; Jednak mechanizmy leżące u podstaw tego zjawiska wymagają dalszych badań. W niniejszym badaniu opisano oparty na RANKL protokół izolacji i hodowli osteoklastów ze szpiku kostnego myszy oraz badania wpływu inaktywacji mTORC1 na tworzenie osteoklastów. Protokół ten skutecznie doprowadził do powstania dużej liczby gigantycznych osteoklastów, zwykle w ciągu jednego tygodnia. Delecja Raptor upośledzała tworzenie osteoklastów i zmniejszała aktywność kwasowej fosfatazy odpornej na winian wydzielnicze, co wskazuje, że mTORC1 ma kluczowe znaczenie dla tworzenia osteoklastów.

Stosując niniejszy protokół, w 6. dniu zaobserwowano dużą liczbę olbrzymich osteoklastów; jeśli olbrzymie osteoklasty nie są widoczne, może być wymagany jeden dodatkowy dzień różnicowania osteoklastów (Rycina 1). Pomyślną formację osteoklastów potwierdzono za pomocą barwienia TRAP (Rycina 2A). Osteoklasty stanowiły olbrzymie komórki o kolorze winnej czerwieni/fioletu z więcej niż 3 jądrami. W każdej studni płytki 96-dołkowej z BM...

Ten manuskrypt opisuje protokół izolacji i hodowli osteoklastów in vitro ze szpiku kostnego myszy oraz badania roli ssaczo-mechanistycznego celu kompleksu rapamycyny 1 w tworzeniu osteoklastów.

Test hodowli osteoklastów szpiku kostnego myszy oparty na RANKL w celu zbadania roli mTORC1 w tworzeniu osteoklastów

Osteoclasts are unique bone-resorbing cells that differentiate from the monocyte/macrophage lineage of bone marrow. Dysfunction of osteoclasts may result ...

Ogólnym celem tego protokołu jest wyizolowanie i hodowla osteoklastów in vitro ze szpiku kostnego myszy oraz zbadanie roli ssaczego celu pierwszego kompleksu rapamycyny w tworzeniu osteoklastów. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące tworzenia osteoklastów, takie jak rola mTORC1 w różnicowaniu osteoklastów. Główną zaletą tej techniki jest uzyskanie dużej liczby gigantycznych osteoklastów w ciągu jednego tygodnia.Implikacje tej techniki rozciągają się w kierunku terapii osteoporozy, ponieważ pomocne jest badanie mechanizmu, za pomocą którego osteoklasty odróżniają się od ich prekursorów. Aby rozpocząć tę procedurę, wykonaj pionowe nacięcie na dystalnym końcu kości piszczelowej myszy poddanej eutanazji i wypreparuj skórę wzdłuż tylnych kończyn. Następnie przeciąć nożyczkami więzadło stawowe stawów biodrowych i zwichnąć tylne kończyny z tułowia.Przetnij więzadło stawowe stawu kolanowego i ostrożnie odłącz od niego kość piszczelową i kość udową. Delikatnie usuń miękką tkankę nożyczkami. Umieść wszystkie kości jednej myszy w każdym dołku sześciodołkowej płytki z dwoma mililitrami alfa-MEM na lodzie.W celu izolacji napełnij jedną studzienkę sześciodołkowej płytki 75% etanolem, a pozostałe pięć studzienek alfa-MEM. Umieść wszystkie kości jednej myszy w płuczce etanolowej na 15 sekund, a następnie umyj kości pięć razy alfa-MEM przez 10 sekund za każdym razem. Odetnij nasady nożyczkami i włóż igłę strzykawkową o średnicy 0,45 milimetra do jamy kostnej.Wypłucz szpik za pomocą alpha-MEM do 50-mililitrowej probówki wirówkowej. Następnie przepłucz jamę kostną tą samą metodą z drugiego końca kości. Powtórz co najmniej dwa razy, aby dokładnie umyć jamę kostną, aż kość będzie blada.Następnie odwirować szpik kostny, aby uzyskać osad komórkowy w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez pięć minut. Następnie odessać supernatant. Dodaj trzy mililitry buforu do lizy czerwonych krwinek do probówki wirówkowej i delikatnie pipetuj w celu ponownego zawieszenia szpiku kostnego.Następnie trzymaj probówkę wirówkową na lodzie przez osiem minut, aby zlizować czerwone krwinki. Po ośmiu minutach dodaj sześć mililitrów alfa-MEM do probówki wirówkowej, aby zatrzymać lizę komórek. Wirować w temperaturze 800 g i czterech stopniach Celsjusza przez 10 minut i odessać supernatant.Następnie ponownie zawieś w trzech mililitrach pożywki hodowlanej alfa-MEM i umieść komórki na sześciodołkowej płytce. Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc. Na tym etapie przenieś supernatant do 15-mililitrowej probówki wirówkowej, aby zebrać nieprzyłączone komórki następnego ranka.Następnie odwirować w temperaturze 800 g i czterech stopniach Celsjusza przez pięć minut i odessać supernatant. Następnie ponownie zawieś komórki w czterech mililitrach pożywki hodowlanej alfa-MEM. Weź 20 mikrolitrów roztworu komórkowego i wymieszaj z 20 mikrolitrami błękitu trypanowego.Następnie dodaj 10 mikrolitrów mieszaniny do komory liczenia i uzyskaj liczbę komórek na mililitr roztworu. Następnie dodaj odpowiednią objętość pożywki hodowlanej alfa-MEM, aby uzyskać roztwór komórkowy 500 000 komórek na mililitr. Następnie dodaj 500 mikrolitrów i 50 mikrolitrów pożywki indukcyjnej makrofagów szpiku kostnego do każdej studzienki odpowiednio płytki 24-dołkowej i 96-dołkowej.Następnie dodaj 500 mikrolitrów i 50 mikrolitrów roztworu komórkowego do każdego dołka odpowiednio płytki 24-dołkowej i 96-dołkowej. Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez trzy dni. Trzy dni po posiewie zbierz 50 mikrolitrów pożywki z każdej studzienki 96-dołkowej płytki i zamroź ją w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza.Następnie odessać pozostałą pożywkę. Dodaj jeden mililitr i 100 mikrolitrów pożywki do indukcji osteoklastów do każdego dołka odpowiednio płytki 24-dołkowej i 96-dołkowej. Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dwa dni.Po dwóch dniach zbierz 50 mikrolitrów pożywki z każdej studzienki i odessaj pozostałą pożywkę. Następnie dodaj pożywkę indukcyjną osteoklastów do każdej studzienki i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez jeden dzień. Po uformowaniu się osteoklastów zbierz 50 mikrolitrów pożywki z każdej studzienki 96-dołkowej płytki.Na tym etapie należy odessać pożywkę i delikatnie przemyć próbkę trzy razy za pomocą 1X PBS. Następnie utrwal komórki w każdym dołku 96-dołkowej płytki za pomocą 100 mikrolitrów roztworu utrwalającego przez 30 sekund w temperaturze pokojowej. Po utrwaleniu odessać roztwór utrwalający i delikatnie umyć komórki trzykrotnie wodą dejonizowaną podgrzaną do 37 stopni Celsjusza.Następnie odessaj wodę dejonizowaną i dodaj 100 mikrolitrów barwnika TRAP do każdej studzienki 96-dołkowej płytki. Umieść płytkę w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza na 30 minut i osłoń ją przed światłem. Po zabarwieniu odessać plamę TRAP i delikatnie zmyć trzykrotnie wodą dejonizowaną.Następnie zobrazuj osteoklasty w odwróconym mikroskopie w 40-krotnym powiększeniu. Następnie przenieś 30 mikrolitrów zebranej wcześniej pożywki na nową 96-dołkową płytkę. Następnie dodaj 90 mikrolitrów mieszaniny substratów do każdego dołka 96-dołkowej płytki.Umieść płytkę w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza na godzinę i osłoń przed światłem. Po godzinie zatrzymaj reakcję, dodając 30 mikrolitrów trzymolowego wodorotlenku sodu do każdej studzienki 96-dołkowej płytki. Następnie zmierz absorbancję na długości fali 405 nanometrów za pomocą czytnika płytek EnVision Multilabel.Oto reprezentatywny widok osteoklastów zaobserwowanych w jasnym polu w szóstym dniu. Czerwona linia wyznaczała granicę osteoklastów. Na zdjęciu pokazano typowo gigantyczny, wielojądrowy, TRAP-dodatni osteoklast.strzałka wskazywała dwa jądra wielojądrowego osteoklastu. Ten rysunek pokazuje barwienie TRAP BMM w szóstym dniu. Pokazane są obrazy kwadratów w dużych powiększeniach odpowiednio w grupach nokautowych typu dzikiego i Ctsk-Cre Raptor.Były to mniej gigantyczne, TRAP-dodatnie osteoklasty powstałe w nokautujących BMM Ctsk-Cre Raptor w porównaniu z grupą typu dzikiego. Rysunek ten pokazuje aktywność TRAP hodowlanych BMM typu dzikiego i Ctsk-Cre Raptor knockout BMM. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu tygodnia, jeśli zostanie wykonana prawidłowo.Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o utrzymaniu żywotności makrofagów szpiku kostnego, ponieważ optymalna gęstość wysiewu żywotnych makrofagów szpiku kostnego ma kluczowe znaczenie. Zaleca się trzymanie kości na lodzie nie dłużej niż godzinę i delikatne ponowne zawieszenie komórek. Procedurę tę można łączyć z innymi metodami, takimi jak test resorpcji osteoklastów z plastrami kości, w celu zbadania normalnej i patologicznej fizjologii osteoklastów.Dzięki tej metodzie odkryliśmy, że mTORC1 odgrywa ważną rolę w tworzeniu osteoklastów, które mogą w przyszłości działać jako potencjalny cel farmakologiczny w leczeniu zaburzeń metabolicznych kości, takich jak osteoporoza.

a-rankl-based-osteoclast-culture-assay-mouse-bone-marrow-to

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Leczenie pierwotnych osteoblastów myszy kwasem retinowym wytwarza jednorodną populację rozgałęzionych komórek posiadających morfologiczne i molekularne cechy osteocytów. Metoda ta pozwala przezwyciężyć trudności związane z uzyskaniem i utrzymaniem pierwotnych osteocytów w hodowli i może być korzystna w badaniu komórek pochodzących z modeli transgenicznych.

Zastosowanie kwasu retinowego do uzyskiwania kultur osteocytów z pierwotnych osteoblastów myszy

Różnicowanie komórek prekursorowych w osteoklasty jest regulowane przez cytokiny i czynniki wzrostu. W tym artykule opisano nową technikę transferu genów do różnicowania osteoklastów in vivo oraz protokoły hodowli komórkowych do różnicowania komórek prekursorowych w osteoklasty in vitro jako metodę badania wpływu cytokin na osteoklastogenezę.

Nowatorska technika transferu genów in vivo i testy komórkowe in vitro do badania utraty masy kostnej w zaburzeniach układu mięśniowo-szkieletowego

Osteoklasty są główną komórką resorpcyjną kości w organizmie. Zdolność do izolowania osteoklastów w dużych ilościach zaowocowała znaczącym postępem w zrozumieniu biologii osteoklastów. W tym protokole opisujemy metodę izolacji, hodowli i ilościowego określania aktywności osteoklastów in vitro.

Osteoklasty pochodzące ze szpiku kostnego myszy

Sygnalizacja Notch to forma komunikacji komórkowej, która opiera się na bezpośrednim kontakcie między komórkami. Aby prawidłowo indukować sygnalizację Notch in vitro, ligandy Notch muszą być prezentowane komórkom w stanie unieruchomionym. Protokół ten opisuje metody stymulacji in vitro sygnalizacji Notch w prekursorach osteoklastów myszy.

Stymulacja sygnalizacji Notch w prekursorach osteoklastów myszy

Ten protokół opisuje rozwój przedklinicznego modelu osteoklastogenezy in vitro z monocytów krwi obwodowej hodowanych z liniami komórkowymi raka piersi w celu naśladowania interakcji komórka rakowa - osteoklast. Model ten może zostać wykorzystany do pogłębienia naszej wiedzy na temat powstawania przerzutów do kości i poprawy opcji terapeutycznych.

Opracowanie ludzkiego przedklinicznego modelu osteoklastogenezy z monocytów krwi obwodowej hodowanych wspólnie z liniami komórkowymi raka piersi

W tym artykule prezentujemy metody izolowania i różnicowania komórek zrębu szpiku kostnego i hematopoetycznych komórek macierzystych od kości długich myszy. Przedstawiono dwa różne protokoły dające różne populacje komórek odpowiednie do ekspansji i różnicowania w osteoblasty, adipocyty i osteoklasty.

Izolacja, hodowla i różnicowanie komórek zrębu szpiku kostnego i progenitorów osteoklastów od myszy

Osteoklasty to specyficzne tkankowo polikariony makrofagów wywodzące się z linii monocyty-makrofag hematopoetycznych komórek macierzystych. Protokół ten opisuje, w jaki sposób izolować komórki szpiku kostnego, aby uzyskać duże ilości osteoklastów przy jednoczesnym zmniejszeniu ryzyka wypadków występujących przy tradycyjnych metodach.

Izolacja, oczyszczanie i różnicowanie prekursorów osteoklastów ze szpiku kostnego szczura

Ten protokół obejmuje preparację mysich kości długich i izolację szpiku kostnego, w celu wytworzenia makrofagów szpiku kostnego i wytworzenia osteoklastów za pomocą czynnika stymulującego tworzenie kolonii makrofagów (M-CSF) i aktywatora receptora liganda czynnika jądrowego Kappa-B (RANKL) lub czynnika martwicy nowotworu alfa (TNF-α) i ich zatrzymanie przez przeciwciało anty-c-fms, receptor M-CSF.

Wpływ przeciwciała anty-c-fms na tworzenie i proliferację prekursora osteoklastów in vitro

Ten protokół opisuje kanoniczną metodę zrozumienia krytycznych genów kontrolujących aktywność osteoklastów in vivo. Metoda ta wykorzystuje transgeniczny model myszy i niektóre techniki kanoniczne do analizy fenotypu szkieletu.

Analiza fenotypu szkieletowego modelu myszy z warunkową delecją Stat3

Tutaj prezentujemy prostą i skuteczną procedurę testową dla testów resorpcyjnych z użyciem płytek do hodowli komórkowych pokrytych fosforanem wapnia.

Prosty protokół testu wgłębnego do wizualizacji i ilościowego określenia resorpcji osteoklastycznej in vitro

Poznaj metodę izolacji i hodowli osteoklastów z mysiego szpiku kostnego opartą na RANKL. Technika ta pozwala badać rolę mTORC1 w różnicowaniu komórek kostnych i może wspierać rozwój terapii osteoporozy.

Test hodowli osteoklastów szpiku kostnego myszy oparty na RANKL w celu zbadania roli mTORC1 w tworzeniu osteoklastów

Przeglądaj więcej filmów