Name: Uraz balonowy w celu wywołania przerostu mięśniowo-wewnętrznej w aorcie brzusznej myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-07T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 32 s
Description: Poznaj technikę urazu balonowego aorty brzusznej u myszy w celu wywołania przerostu mięśniowo-wewnętrznej. Model ten umożliwia badanie mechanizmów patologicznych i szybką progresję choroby.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują Christiane Pahrmann za jej pomoc techniczną.
D.W. był wspierany przez Fundację Maxa Kade'a. T.D. otrzymał granty od Fundacji Else Kröner (2012_EKES.04) i Deutsche Forschungsgemeinschaft (DE2133/2-1_. S. S. otrzymał granty badawcze od Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG; SCHR992/3- 1, SCHR992/4-1).

Zwierzęta otrzymały humanitarną opiekę zgodnie z Przewodnikiem po zasadach postępowania ze zwierzętami laboratoryjnymi, przygotowanym przez Instytut Zasobów Zwierząt Laboratoryjnych i opublikowanym przez National Institutes of Health. Wszystkie protokoły dotyczące zwierząt zostały zatwierdzone przez właściwe władze lokalne ("Amt für Gesundheit und Verbraucherschutz, Hansestadt (Urząd Zdrowia i Ochrony Konsumentów) Hamburg").
1. Przygotowanie cewnika
UWAGA: Zapoznaj się z Tabelą Materiałów, aby uzyskać informacje na temat cewnika.
<ol>
	<li>Wyjmij cewnik z uchwytu cewnika.</li>
	<li>Wyciągnij prowadnik ze światła przez dystalny port na zewnątrz.</li>
	<li>Umieść kroplę kleju cyjanoakrylowego na dystalnym końcu cewnika. 
	Uwaga: Nosić rękawice lateksowe lub nitrylowe.</li>
	<li>Umieść prowadnik w porcie RX cewnika i przesuń go przez światło do dystalnego portu. Następnie lekko pociągnij prowadnik do tyłu, aby pozostawić odstęp ~5 mm do końca.</li>
	<li>Odczekaj 5 minut, aby klej wyschł.</li>
	<li>Przesuń prowadnicę, powinna być zamocowana. Jeśli nadal jest mobilny, powtórz kroki 1.3 - 1.6.</li>
	<li>Napełnij strzykawkę o pojemności 3 ml 1,5 ml 0,9% soli fizjologicznej i podłącz ją do portu do napełniania balonów.</li>
	<li>Nacisnąć tłok strzykawki, aby sprawdzić napełnienie balonu. Pozostawić 0,6 ml soli fizjologicznej w strzykawce.</li>
</ol>
2. Przygotowanie myszy
<ol>
	<li>Uzyskać samce myszy w wieku 14 tygodni o wadze około 30 g. 
	UWAGA: Wykorzystaliśmy zwierzęta pozyskane z Instytutu Zwierząt Doświadczalnych. Użyliśmy tutaj C57BL/6J.</li>
	<li>Użyj komory indukcyjnej, aby znieczulić mysz 2,0-2,5% izofuranem (500 ml/min natężenie przepływu tlenu).</li>
	<li>Połóż mysz na plecach na poduszce grzewczej i utrzymuj znieczulenie za pomocą maski na twarz zakrywającej usta i nos myszy. Sprawdź, czy znieczulenie jest wystarczająco głębokie, ściskając tylne łapy i ogon, aby zweryfikować brak odruchów.</li>
	<li>Usuń włosy na brzuchu za pomocą trymera do włosów.</li>
	<li>Rozłóż tylne nogi i ustal ich pozycję za pomocą taśmy.</li>
	<li>Zdezynfekuj okolice brzucha za pomocą jodu powidonu, a następnie 80% etanolu. Powtórz ten krok jeszcze dwa razy.</li>
	<li>Użyj serwety chirurgicznej, aby upewnić się, że miejsce operacji nie zostanie zanieczyszczone. Otwórz warstwy skóry i mięśni wzdłuż linea alba za pomocą nożyczek (lub skalpela), aby odsłonić narządy jamy brzusznej.</li>
	<li>Połóż jelita w rękawicy nawilżanej z 0,9% solą fizjologiczną i zawiń, aby były wilgotne.</li>
	<li>Użyj dwóch cienkich kleszczyków, aby usunąć tkankę tłuszczową powyżej aorty brzusznej.</li>
	<li>Za pomocą strzykawki insulinowej (30G) wstrzyknij 250 μl roztworu heparyny (50 U/ml) do żyły głównej dolnej (IVC) i odczekaj 3 minuty na jego ogólnoustrojową dystrybucję. Heparyna zahamuje hemostazę i zapobiegnie niepożądanemu krzepnięciu podczas operacji.</li>
	<li>Za pomocą dwóch kleszczy rozetnij aortę podnerkową aż do jej rozwidlenia i wychodzących naczyń rozgałęzionych.</li>
	<li>Podwiązywać naczynia boczne, które mają być umieszczone w zaciśniętym obszarze, za pomocą kauteryzatora wysokotemperaturowego.</li>
	<li>Zatrzymaj przepływ krwi, zaciskając aortę podnerkową bezpośrednio pod tętnicami nerkowymi.</li>
	<li>Umieść drugi zacisk w dystalnej pozycji tuż nad rozwidleniem aorty.</li>
	<li>Wykonaj małe poziome nacięcie za pomocą nożyczek w punkcie środkowym między zaciskami wzdłuż naczynia. 
	UWAGA: Wielkość nacięcia powinna być równa 1/3 obwodu naczynia.</li>
	<li>Wprowadzić strzykawkę z igłą (30 G) do nacięcia i przepłukać aortę 250 μl roztworu heparyny (50 U/ml).</li>
	<li>Używając szwów 10-0, umieść po jednym węźle z każdej strony nacięcia.</li>
	<li>Rozszerz aortę, wprowadzając rozszerzacz naczynia do nacięcia i lekko rozchyl naczynie. Powtórz dylatację 2 do 3 razy.</li>
	<li>Nawilż cewnik balonowy 0,9% solą fizjologiczną.</li>
	<li>Włóż spłaszczony cewnik balonowy do aorty i przesuń go w kierunku bliższego zacisku na aorcie.</li>
	<li>Po dotarciu do bliższego zacisku ostrożnie otwórz proksymalny zacisk i napompuj balon, aby zapobiec wyciekowi krwi, wstrzykując ~ 0,6 ml soli fizjologicznej. 
	UWAGA: Stosunek napompowanego balonu do naczynia wynosi 1,5:1.</li>
	<li>Przesuń cewnik do tyłu o około 2 cm.</li>
	<li>Odciągnąć rozszerzony cewnik do tyłu, jednocześnie lekko opróżniając balon, zwalniając strzykawkę.</li>
	<li>Ponownie zamocuj zacisk proksymalnym, gdy cewnik dotrze do nacięcia aorty. Całkowicie opróżnij balon i usuń go.</li>
	<li>Przepłukać aortę 250 μl roztworu heparyny (50 j./ml) za pomocą strzykawki 30G.</li>
	<li>Zamknij nacięcie aorty za pomocą szwów 10-0. Umieść przerwane szwy po każdej stronie bocznej, a następnie jeden lub dwa szwy po stronie brzusznej.</li>
	<li>Otwórz dystalny zacisk. W przypadku krwawienia należy ponownie zamknąć zacisk i założyć dodatkowe szwy.</li>
	<li>Ostrożnie otwórz proksymalny zacisk.</li>
	<li>Umieść dwa waciki na szwie, aby go podeprzeć i zatrzymać krwawienie.</li>
	<li>Umieść wchłanialne hemostatyki na szwie, aby go podtrzymać. 
	UWAGA: Tętno aortalne powinno być widoczne dystalnie od nacięcia.</li>
	<li>Umieść jelita z powrotem w jamie brzusznej.</li>
	<li>Przepłukać jamę brzuszną sterylnym 0,9% roztworem soli fizjologicznej, który został wstępnie podgrzany do temperatury 37 °C.</li>
	<li>Zamknij warstwę mięśni brzucha za pomocą szwów biegowych 6-0.</li>
	<li>Zamknij skórę za pomocą szwów biegowych 5-0.</li>
	<li>Należy wstrzyknąć podskórnie 4-5 mg/kg karprofenu przed umożliwieniem myszowi obudzenia się. Monitoruj zwierzę, aż odzyska przytomność, utrzymuj leżącą mostek. Trzymaj zwierzę samo w klatce do czasu całkowitego wyzdrowienia.</li>
	<li>Dodaj metamizol do wody pitnej (50 mg/100 ml) jako lek przeciwbólowy przez 3 dni i codziennie monitoruj zwierzę. Zwykle myszy lubią słodki smak metamizolu i zaczynają pić natychmiast po operacji. Jeśli jest to preferowane, zamiast metamizolu. można stosować środki do wstrzykiwań o przedłużonym uwalnianiu.
	UWAGA: Okres obserwacji dla tego modelu wynosi 28 dni.</li>
</ol>
3. Histopatologia
<ol>
	<li>Zbierz aortę uszkodzoną przez balon po 28 dniach, przygotowując myszy zgodnie z opisem w krokach od 2.2 do 2.9.</li>
	<li>Użyj nożyczek, aby usunąć aortę uszkodzoną przez balon (między rozwidleniem a 0,3 mm powyżej naczyń nerkowych) i poddać mysz eutanazji, wycinając jej serce.</li>
	<li>Przepłukać światło naczynia 0,9% NaCl.</li>
	<li>Utrwal zebrane naczynie w 4% paraformaldehydzie (PFA) przez noc i odwadniaj je w rosnących stężeniach etanolu, zaczynając od 70% etanolu przez 2 godziny, 80% etanolu przez 1 godzinę, 95% etanolu przez 2 godziny i 100% etanolu przez 5 godzin. Następnie inkubować próbki w ksylenie przez 2 godziny 3 razy, przed infiltracją próbek parafiną. 
	UWAGA: Zamiast przepłukiwać zebrane naczynie 0,9% NaCl, można je przepłukać 4% PFA. 
	Uwaga: PFA i ksylen są toksyczne i należy obchodzić się z nimi ze szczególną ostrożnością.</li>
	<li>Zanurzyć próbkę w parafinie i pokroić w plastry o grubości 5 μm za pomocą mikrotomu.</li>
	<li>Odparafinować szkiełka ksylenem 3 razy przez 5 minut.</li>
	<li>Nawilżaj szkiełka tkankowe za pomocą zmniejszającej się serii etanolu. Zacznij od 100% etanolu 2 razy przez 5 minut, a następnie 3 minuty 95%, 80% i 70% etanolu.</li>
	<li>Barwić szkiełka za pomocą trichromowego barwienia Massona zgodnie z opisem18.</li>
	<li>Odwodnić poplamione szkiełka w 100% etanolu 2 razy po 10 minut każda. Wyczyść ksylenem 2 razy przez 10 minut każdy i zamontuj w podłożu montażowym.</li>
	<li>Obejrzyj preparaty pod mikroskopem jasnego pola. Użyj obiektywu o 5-krotnym powiększeniu i aperturze numerycznej 0,12 do zdjęcia poglądowego lub obiektywu z 20-krotnym powiększeniem i aperturą numeryczną 0,35 do szczegółowej obserwacji.</li>
</ol>
4. Mikroskopia immunofluorescencyjna
<ol>
	<li>Nawilżaj szkiełka tkankowe za pomocą zmniejszającej się serii etanolu. Zacznij od 100% etanolu 2 razy przez 5 minut, a następnie 3 minuty 95%, 80% i 70% etanolu.</li>
	<li>Pobranie antygenu należy przeprowadzić poprzez podgrzewanie szkiełek w roztworze do pobierania antygenu w parowarze przez 20 minut.</li>
	<li>Pozwól szkiełkom ostygnąć do temperatury pokojowej.</li>
	<li>Po trzykrotnym umyciu szkiełek solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS), należy nanieść roztwór blokujący antygen na odcinki na 30 minut.</li>
	<li>Myj szkiełka trzy razy przez 5 minut za pomocą PBS.</li>
	<li>Inkubować skrawki z pierwszorzędowym przeciwciałem rozcieńczonym w pierwszorzędowym rozcieńczalniku przeciwciał. 
	UWAGA: Odpowiednie stężenie i czas inkubacji należy dobierać osobno dla każdego przeciwciała.</li>
	<li>Przemyć szkiełka trzy razy przez 5 minut PBS w celu usunięcia niezwiązanego przeciwciała.</li>
	<li>Inkubować skrawki ze wstępnie sprzężonym przeciwciałem drugorzędowym rozcieńczonym w rozcieńczalniku przeciwciał drugorzędowych. 
	UWAGA: Odpowiednie stężenie i czas inkubacji należy dobierać osobno dla każdego przeciwciała.</li>
	<li>Usunąć niezwiązane przeciwciała, myjąc szkiełka trzykrotnie przez 5 minut.</li>
	<li>Przeciwbarwić jądra komórkowe za pomocą 4',6-diamidyn-2-fenyloindolu (DAPI) przez 15 minut; końcowe stężenie DAPI powinno wynosić 350 nM.</li>
	<li>Zamontuj szkiełka w roztworze montażowym zgodnym z immunofluorescencją. 
	UWAGA: Użycie niewłaściwego rozwiązania montażowego może przesłonić sygnał fluorescencji.</li>
	<li>Zobacz preparaty z mikroskopem fluorescencyjnym. Użyj obiektywu o powiększeniu 40x i przysłonie numerycznej 1,3.</li>
</ol>

<ol><li>Kochanek, K. D., Xu, J., Murphy, S. L., Minino, A. M., Kung, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deaths%3A+final+data+for+2009%5BTitle%5D)+AND+%22Natl+Vital+Stat+Rep%22%5BJournal%5D)">Deaths: final data for 2009.</a> Natl Vital Stat Rep. 60 (3), 1-116 (2011).</li>
<li>Austin, G. E., Ratliff, N. B., Hollman, J., Tabei, S., Phillips, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intimal+proliferation+of+smooth+muscle+cells+as+an+explanation+for+recurrent+coronary+artery+stenosis+after+percutaneous+transluminal+coronary+angioplasty%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Coll+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Intimal proliferation of smooth muscle cells as an explanation for recurrent coronary artery stenosis after percutaneous transluminal coronary angioplasty.</a> J Am Coll Cardiol. 6 (2), 369-375 (1985).</li>
<li>Greenwald, S. E., Berry, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+vascular+grafts%3A+the+importance+of+mechanical+and+haemodynamic+properties%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Improving vascular grafts: the importance of mechanical and haemodynamic properties.</a> J Pathol. 190 (3), 292-299 (2000).</li>
<li>Majesky, M. W., Schwartz, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Smooth+muscle+diversity+in+arterial+wound+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+Pathol%22%5BJournal%5D)">Smooth muscle diversity in arterial wound repair.</a> Toxicol Pathol. 18 (4 Pt 1), 554-559 (1990).</li>
<li>Owens, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+differentiation+of+vascular+smooth+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Regulation of differentiation of vascular smooth muscle cells.</a> Physiol Rev. 75 (3), 487-517 (1995).</li>
<li>Owens, G. K., Kumar, M. S., Wamhoff, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+regulation+of+vascular+smooth+muscle+cell+differentiation+in+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Molecular regulation of vascular smooth muscle cell differentiation in development and disease.</a> Physiol Rev. 84 (3), 767-801 (2004).</li>
<li>Kleemann, R., Zadelaar, S., Kooistra, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokines+and+atherosclerosis%3A+a+comprehensive+review+of+studies+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc+Res%22%5BJournal%5D)">Cytokines and atherosclerosis: a comprehensive review of studies in mice.</a> Cardiovasc Res. 79 (3), 360-376 (2008).</li>
<li>Karas, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coronary+intimal+proliferation+after+balloon+injury+and+stenting+in+swine%3A+an+animal+model+of+restenosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Coll+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Coronary intimal proliferation after balloon injury and stenting in swine: an animal model of restenosis.</a> J Am Coll Cardiol. 20 (2), 467-474 (1992).</li>
<li>Ip, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+platelets%2C+thrombin+and+hyperplasia+in+restenosis+after+coronary+angioplasty%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Coll+Cardiol%22%5BJournal%5D)">The role of platelets, thrombin and hyperplasia in restenosis after coronary angioplasty.</a> J Am Coll Cardiol. 17 (6 Suppl B), 77B-88B (1991).</li>
<li>Mason, R. G., Read, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Some+species+differences+in+fibrinolysis+and+blood+coagulation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Mater+Res%22%5BJournal%5D)">Some species differences in fibrinolysis and blood coagulation.</a> J Biomed Mater Res. 5 (1), 121-128 (1971).</li>
<li>Lafont, A., Faxon, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Why+do+animal+models+of+post-angioplasty+restenosis+sometimes+poorly+predict+the+outcome+of+clinical+trials%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc+Res%22%5BJournal%5D)">Why do animal models of post-angioplasty restenosis sometimes poorly predict the outcome of clinical trials?</a> Cardiovasc Res. 39 (1), 50-59 (1998).</li>
<li>Matter, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+balloon-induced+inflammation%2C+proliferation%2C+and+neointima+formation+in+apolipoprotein+E+%28ApoE%29+knockout+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Increased balloon-induced inflammation, proliferation, and neointima formation in apolipoprotein E (ApoE) knockout mice.</a> Stroke. 37 (10), 2625-2632 (2006).</li>
<li>Lindner, V., Fingerle, J., Reidy, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+model+of+arterial+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Mouse model of arterial injury.</a> Circ Res. 73 (5), 792-796 (1993).</li>
<li>Simon, D. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decreased+neointimal+formation+in+Mac-1%28-%2F-%29+mice+reveals+a+role+for+inflammation+in+vascular+repair+after+angioplasty%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Decreased neointimal formation in Mac-1(-/-) mice reveals a role for inflammation in vascular repair after angioplasty.</a> J Clin Invest. 105 (3), 293-300 (2000).</li>
<li>Sata, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mouse+model+of+vascular+injury+that+induces+rapid+onset+of+medial+cell+apoptosis+followed+by+reproducible+neointimal+hyperplasia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Cell+Cardiol%22%5BJournal%5D)">A mouse model of vascular injury that induces rapid onset of medial cell apoptosis followed by reproducible neointimal hyperplasia.</a> J Mol Cell Cardiol. 32 (11), 2097-2104 (2000).</li>
<li>Moroi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+genetic+deficiency+of+endothelial+nitric+oxide%2C+gender%2C+and+pregnancy+in+vascular+response+to+injury+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Interaction of genetic deficiency of endothelial nitric oxide, gender, and pregnancy in vascular response to injury in mice.</a> J Clin Invest. 101 (6), 1225-1232 (1998).</li>
<li>Painter, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myointimal+hyperplasia%3A+pathogenesis+and+implications.+2.+Animal+injury+models+and+mechanical+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Artif+Organs%22%5BJournal%5D)">Myointimal hyperplasia: pathogenesis and implications. 2. Animal injury models and mechanical factors.</a> Artif Organs. 15 (2), 103-118 (1991).</li>
<li>Stubbendorff, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducing+myointimal+hyperplasia+versus+atherosclerosis+in+mice%3A+an+introduction+of+two+valid+models%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Inducing myointimal hyperplasia versus atherosclerosis in mice: an introduction of two valid models.</a> J Vis Exp. (87), e51459(2014).</li>
<li>Deuse, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dichloroacetate+prevents+restenosis+in+preclinical+animal+models+of+vessel+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Dichloroacetate prevents restenosis in preclinical animal models of vessel injury.</a> Nature. 509 (7502), 641-644 (2014).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W artykule przedstawiono model mysi do badania rozwoju przerostu mięśniowo-błony włosowej i umożliwiono eksplorację leżących u ich podstaw procesów patologicznych oraz testowanie nowych leków lub opcji terapeutycznych.
Najważniejszym krokiem w tym protokole jest denudacja aorty. Na tym etapie należy zachować szczególną ostrożność, ponieważ nadmierna denudacja doprowadzi do powstania tętniaka i niepowodzenia modelu. Z drugiej strony, jeśli denudacja zostanie wykonana w niewystarczającym stopniu...

Zwężenie tętnic w tętnicach wieńcowych i obwodowych ma duży wpływ na zachorowalność i śmiertelność pacjentów1. Jednym z podstawowych mechanizmów patologicznych jest przerost mięśni mięśniowo-błoniastych (MH), który charakteryzuje się zwiększoną proliferacją, migracją i syntezą białek macierzy zewnątrzkomórkowej z komórek mięśni gładkich naczyń krwionośnych (SMC)2. SMC znajdują się w warstwie pożywki naczynia i migrują po stymulacji na powierzchnię światła. Sygnały stymulujące obejmują czynniki wzrostu, cytokiny, kontakt komórka-komórka, lipidy, składniki macierzy zewnątrzkomórkowej oraz mechaniczne siły ścinania i rozciągania3,4,5,6. Urazy ściany naczynia, patologiczne lub jatrogenne, powodują uszkodzenie komórek śródbłonka i komórek mięśni gładkich oraz stymulują reakcje zapalne, a tym samym prowadzą do MH7.
Różne modele zwierzęce są obecnie dostępne do badania uszkodzeń tętnic i przerostu mięśni włosowych. Duże zwierzęta, takie jak świnie czy psy, mają tę zaletę, że mają podobną anatomię tętnic i naczyń wieńcowych jak ludzie i są szczególnie odpowiednie do badań nad technikami, procedurami i urządzeniami do angioplastyki8. Jednak modele świń mają tę wadę, że mają wyższą trombugeniczność9,10, podczas gdy psy mają tylko łagodną reakcję na uszkodzenie naczynia11. Ponadto wszystkie duże modele zwierząt wymagają specjalnych warunków mieszkaniowych, sprzętu i personelu, co wiąże się z wysokimi kosztami i nie zawsze jest dostępne w placówce. Małe modele zwierzęce obejmują szczury i myszy. W porównaniu ze szczurami myszy mają tę zaletę, że są tańsze i istnieją różne modele nokautujące. Model opisany w tym filmie można połączyć z myszami ApoE-/- karmionymi zachodnią dietą, aby ściśle naśladować warunki kliniczne angioplastyki w naczyniach miażdżycowych12. Poprzednie modele powodowały uszkodzenie naczyń krwionośnych poprzez uraz drutu13, wysuszenie płynu14, spring15, lub uraz mankietu16. Ponieważ charakter urazu będzie miał ogromny wpływ na rozwój i konstytucję MH, użycie cewnika balonowego do wywołania uszkodzenia naczynia jest najlepszym sposobem naśladowania warunków klinicznych.
W tym artykule opisujemy nowatorską metodę indukcji MH za pomocą cewnika balonowego u myszy. Zastosowanie cewnika balonowego (1,2 mm x 6 mm) z portem RX (<klasa silna="xfig">Rysunek 1A) pozwala na zeskrobanie warstwy wewnętrznej i jednocześnie na indukcję nadmiernego rozdęcia naczynia. Oba te czynniki są ważnymi czynnikami wyzwalającymi rozwój MH. Czas obserwacji dla tego modelu wynosi 28 dni17.

<table><tbody><tr><td>10-0 Szew Ethilon</td><td></td><td>Ethicon 2814G</td><td></td></tr><tr><td>3 mL Strzykawka</td><td>BD Medical</td><td>309658</td><td></td></tr><tr><td>37% HCl</td> Szew prolenowy <td>Sigma-Aldrich</td><td>H1758</td><td></td></tr><tr><td>5-0</td><td>Ethicon</td><td>EH7229H</td><td></td></tr><tr><td>6-0 szew prolenowy</td><td>Ethicon</td><td>8706H</td><td></td></tr><tr><td>Acid Fuchsin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8129-25G</td><td>Barwienie trichromem</td></tr><tr><td>Roztwór do odzyskiwania antygenu</td><td>Dako</td><td>S1699</td><td></td></tr><tr><td>Azophloxin</td><td>Waldeck</td><td>1B-103</td><td>Barwienie trichromem</td></tr><tr><td>Bepanthen Maść do oczu i nosa</td><td>Bayer</td><td>1578675</td><td>Maść do oczu</td></tr><tr><td>Roztwór Betadine Betadine</td><td>Purdue Pharma</td><td>NDC: 67618-152</td><td></td></tr><tr><td>C57BL / 6J</td><td>Charles River</td><td>Numer katalogowy 000664</td><td></td></tr><tr><td>Aplikator zaciskowy</td><td>Fine Science Tools</td><td>18056-14</td><td>JAW WYMIARY: 4 x 0,75 mm
DŁUGOŚĆ: 13 mm</td></tr><tr><td>Kolagen 3</td><td>abcam</td><td>ab7778</td><td>Przeciwciało</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Thermo Fischer</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Donkey anty-kozie IgG AF555</td><td>Invitrogen</td><td>A21432</td><td>Przeciwciało wtórne</td></tr><tr><td>Donkey anty-Rabbit IgG AF488</td><td>Invitrogen</td><td>A21206</td><td>Przeciwciało wtórne</td></tr><tr><td>Donkey anty-Rabbit IgG AF488</td><td>Invitrogen</td><td>A11055</td><td>Wtórne przeciwciało</td></tr><tr><td>Osioł anty-królik IgG AF555</td><td>Invitrogen</td><td>A31572</td><td>Przeciwciało drugorzędowe</td></tr><tr><td>Etanol 70%</td><td>Th. Geyer</td><td>2270</td><td></td></tr><tr><td>Etanol 96%</td><td>Th. Geyer</td><td>2295</td><td></td></tr><tr><td>Etanol absolutny</td><td>Th. Geyer</td><td>2246</td><td></td></tr><tr><td>FAP</td><td>abcam</td><td>ab28246</td><td>Kleszcze przeciwciał</td></tr><tr><td>drobne</td><td>Narzędzia</td> <td>do nauki11251-20</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze standardowe</td><td>Fine Science Tools</td><td>11023-10</td><td></td></tr><tr><td>Lodowaty kwas octowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>537020</td><td></td></tr><tr><td>Maszynka do strzyżenia włosów</td><td>WAHL</td><td>8786-451A ARCO SE</td><td></td></tr><tr><td>Heparyna</td><td>Rotexmedica</td><td>PZN 3862340</td><td>25.000 I.E./mL</td></tr><tr><td>Zestaw do kauteryzacji wysokotemperaturowej</td><td>Bovie</td><td>18010-00</td><td></td></tr><tr><td>Image-iT FX Signal Enhancer</td><td>Invitrogen</td><td>I36933</td><td>Roztwór blokujący</td></tr><tr><td>Jasnozielony SF</td><td>Waldeck</td><td>1B-211</td><td>Barwienie trichromowe</td></tr><tr><td>Zacisk mikrochirurgiczny</td><td>Fine Science Tools</td><td>18055-04</td><td>Micro-Serrefine -</td></tr><tr><td>Cewnik rozszerzający wieńcowe 4 mm MINI TREK 1,20 mm x 6 mm / Rapid-Exchange</td><td>Abbott</td><td>1012268-06U</td><td></td></tr><tr><td>Hydrat kwasu molibdetofosforowego</td><td>Merck</td><td>1.00532.0100</td><td>Barwienie trichromowe</td></tr><tr><td>NaCl 0,9%</td><td>B.Braun</td><td>PZN 06063042 Art. Nr.: 3570160</td><td></td></tr><tr><td>Uchwyt igły</td><td>Fine Science Tools</td><td>12075-14</td><td></td></tr><tr><td>Novaminsulfon</td><td>Ratiopharm</td><td>PZN 03530402</td><td>Metamizole</td></tr><tr><td>Orange G</td><td>Waldeck</td><td>1B-221</td><td>Barwienie trichromowe</td></tr><tr><td>Parafina</td><td>Leica biosystems</td><td>REF 39602004</td><td></td></tr><tr><td>PBS pH 7,4</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>PFA 4%</td> <td>Mikroskopia elektronowa Nauka</td><td>#157135S</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór Puceau S</td><td>Serva Elektroforeza</td><td>33427</td><td>Barwienie trichromowe Pierwszorzędowy</td></tr><tr><td>rozcieńczalnik przeciwciał</td><td>Dako</td><td>S3022</td><td></td></tr><tr><td>Prolong Gold Roztwór montażowy</td><td>Thermo Fischer</td><td>P36930</td><td>Roztwór montażowy do szkiełek barwionych immunofluorescencyjnie</td></tr><tr><td>Wymienna cienka końcówka</td><td>Bovie</td><td>H101</td><td></td></tr><tr><td>Rezorcyna-Fuchsin Weigert</td><td>Waldeck</td><td>2E-30</td><td>Barwienie trichromowe</td></tr><tr><td>Rimadyl</td><td>Pfizer</td><td>400684.00.00</td> Nożyczki <td>karprofenowe</td></tr><tr><td></td><td>Narzędzia naukowe</td><td>14028-10</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki</td><td>Narzędzia</td> <td>naukowe w stylu Vannas15000-03</td><td></td></tr><tr><td>Drugorzędowy rozcieńczalnik przeciwciał</td><td>Dako</td><td>S0809</td><td></td></tr><tr><td>Szybko działający klej MINIS 3x1g</td><td>UHU</td><td>45370</td> Stojak na slajdy <td>cyjanoakrylowe</td></tr><tr><td></td><td>Ted Pella</td><td>21057</td><td></td></tr><tr><td>SM22</td><td>abcam</td><td>ab10135</td><td>Przeciwciało</td></tr><tr><td>SMA</td><td>abcam</td><td>ab21027</td><td></td></tr><tr><td>Naczynie do barwienia</td> przeciwciał <td>Ted Pella</td><td>21075</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop chirurgiczny</td><td>Leica</td><td>M651</td><td></td></tr><tr><td>Tabotamp fibrylarny</td><td>Ethicon</td><td>431962</td><td>Wchłanialna</td></tr><tr><td>taśma chirurgiczna Transpore</td> hemostat <td>3M</td><td>1527-1</td><td></td></tr><tr><td>U-100 Strzykawka insulinowa</td><td>BD Medyczny</td><td></td> rozszerzacz naczyń 324825 <td></td></tr><tr><td></td><td>Fine Science Tools</td><td>18603-14</td><td></td></tr><tr><td>Vitro-Clud</td><td>Langenbrinck</td><td>04-0001</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw hematoksyliny żelaza Weigerts</td><td>Merck</td><td>1.15973.0002</td><td>Barwienie trichromowe</td></tr><tr><td>Ksylen</td><td>Th. Geyer</td><td>3410</td><td></td></tr></tbody></table>

uraz balonowy w celu wywołania przerostu mięśniowo-wewnętrznej w aorcie brzusznej myszy

Balloon-based Injury to Induce Myointimal Hyperplasia in the Mouse Abdominal Aorta

Wykorzystanie modeli zwierzęcych jest niezbędne dla lepszego zrozumienia MH, jednej z głównych przyczyn zwężenia tętnicy. W tym artykule przedstawiamy model obnażenia mysiego balonu, który jest porównywalny z ustalonymi modelami uszkodzeń naczyń u dużych zwierząt. Model denudacji aorty z cewnikami balonowymi naśladuje warunki kliniczne i prowadzi do porównywalnych zmian patobiologicznych i fizjologicznych. Krótko, po wykonaniu poziomego nacięcia w aorcie brzusznej, cewnik balonowy zostanie wprowadzony do naczynia, napompowany i wprowadzony wstecznie. Napompowanie balonu doprowadzi do uszkodzenia błony wewnętrznej i nadmiernego rozdęcia naczynia. Po usunięciu cewnika nacięcie aorty zostanie zamknięte pojedynczymi szwami. Model przedstawiony w tym artykule jest powtarzalny, łatwy do wykonania oraz można go szybko i niezawodnie ustalić. Jest szczególnie przydatny do oceny drogich eksperymentalnych środków terapeutycznych, które można stosować w sposób ekonomiczny. Stosując różne szczepy myszy z nokautem, można ocenić wpływ różnych genów na rozwój MH.

Denudacja balonowa jest odpowiednim modelem do badania rozwoju MH u myszy. Zwierzęta dobrze regenerują się po zabiegu i wykazują doskonałą kondycję fizyczną po operacji. Ustanowiliśmy ten model u 50 myszy, przy czym wskaźnik śmiertelności wynikający z procedury chirurgicznej wyniósł mniej niż 3%. Ryciny 1B-C przedstawiają kluczowe etapy operacji. Po nacięciu skóry wzdłuż linea alba, należy zidentyfikować aorta abdominalis. N...

Ten artykuł demonstruje model mysi do badania rozwoju przerostu mięśniowo-intimalnego (MH) po uszkodzeniu balonu aorty.

Uraz balonowy w celu wywołania przerostu mięśniowo-wewnętrznej w aorcie brzusznej myszy

The use of animal models is essential for a better understanding of MH, one major cause for arterial stenosis.In this article, we demonstrate a murine ...

Ogólnym celem tego mysiego systemu modelowego jest zbadanie rozwoju przerostu mięśniowo-błony włosowej po uszkodzeniu balonika aorty. Ten system modelowy może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące przerostu mięśniowo-wewnętrznego, takie jak czynniki przyczyniające się do jego rozwoju. Badając rozwój przerostu mięśniowo-intimale u myszy transgenicznych, mamy nadzieję lepiej zrozumieć patomechanizm choroby.Kolejną zaletą tego modelu zwierzęcego jest to, że choroba postępuje szybko. W ciągu zaledwie kilku tygodni zostaliśmy przebadani na myszach. Najpierw przygotuj wymagany cewnik.Wyjmij go z uchwytu i wyciągnij przewód doprowadzający przez prześwit przez dystalny port. Następnie wlej kroplę cyjanoakrylanu na dystalny koniec cewnika i przeprowadź przewód doprowadzający przez port RX, a następnie przez światło i na zewnątrz dystalnego portu. Następnie lekko pociągnij drut doprowadzający do tyłu, aby pozostawić około pięciu milimieterów wystających i pozwól klejowi wyschnąć.Później napełnij trzymililitrową strzykawkę 1,5 mililitra 0,9% soli fizjologicznej i podłącz ją do portu do pompowania balonów cewnika. Następnie naciśnij tłok, aby przetestować napompowanie balonu. Pozostaw około 0,6 mililitra soli fizjologicznej w strzykawce.Następnie przygotuj mysz do zabiegu. Znieczulić go w komorze izofluranowej, a później, podczas zabiegu, dostarczyć izofluran przez stożek nosowy. Przed kontynuowaniem potwierdź wystarczającą głębokość znieczulenia, szczypiąc tylne łapy i ogon, aby zweryfikować brak odruchów.Następnie usuń włosy na brzuchu za pomocą trymera do włosów i utrwal pozycję tylnych nóg za pomocą taśmy. Na koniec zdezynfekuj okolice brzucha za pomocą trzech naprzemiennych peelingów jodu powidonu, a następnie 80% etanolu. Zacznij od wypreparowania, otwórz warstwy skóry i mięśni wzdłuż kresy białej, aby odsłonić narządy jamy brzusznej.Następnie odsuń jelita na bok, zawiń je w gazę nasączoną solą fizjologiczną, aby były wilgotne. Teraz za pomocą dwóch cienkich kleszczyków usuń tkankę tłuszczową powyżej aorty brzusznej. Następnie ze strzykawki insulinowej wstrzyknij około 12 jednostek siarczanu heparyny do IVC i odczekaj trzy minuty na dystrybucję ogólnoustrojową.Następnie użyj kleszczy, aby wypreparować aortę podnerkową aż do rozwidlenia i odsłonić wychodzące gałęzie. Następnie za pomocą kauteryzacji podwiązaj naczynia boczne wzdłuż aorty podnerkowej w obszarze, który zostanie zaciśnięty. Następnie zatrzymaj przepływ krwi, zaciskając naczynie bezpośrednio pod tętnicami nerkowymi i zaciskając w pozycji dystalnej tuż nad rozwidleniem aorty.Teraz wykonaj małe poziome nacięcie wzdłuż naczynia w środku między zaciskami. Nacięcie powinno wynosić około 1/3 obwodu naczynia. Następnie za pomocą strzykawki insulinowej przepłucz aortę roztworem heparyny jak poprzednio.Następnie umieść szwy 10-0 z pojedynczymi węzłami po każdej stronie nacięcia. Aby kontynuować, rozszerz aortę. Umieść rozszerzacz naczynia w nacięciu i lekko rozsuń naczynie.Zrób to dwa lub trzy razy. Następnie przygotuj cewnik balonowy, zwilżając go solą fizjologiczną. Następnie włóż opróżniony cewnik balonowy do aorty i przesuń go w kierunku bliższego zacisku.Ostrożnie otwórz zacisk proksymalny i napompuj balon, aby zapobiec wyciekowi krwi, wstrzykując około 0,6 mililitra soli fizjologicznej. Następnie przesuń cewnik do tyłu o około dwa centymetry. Odciągnij cewnik do tyłu, jednocześnie lekko opróżniając balon.Gdy cewnik dotrze do nacięcia aorty, ponownie załóż zacisk proksymalnym. Następnie całkowicie opróżnij balon i usuń go. Teraz przepłucz aortę roztworem heparyny.Następnie kontynuuj, zamykając nacięcie aorty za pomocą przerywanych szwów 10-0 po każdej bocznej stronie. Następnie jeden lub dwa szwy po stronie brzusznej. Następnie otwórz dystalny zacisk, sprawdź, czy nie ma krwawienia i w razie potrzeby załóż dodatkowe szwy.Gdy nie ma krwawienia, ostrożnie otwórz proksymalny zacisk. Użyj wacików na szwach, aby podeprzeć i spowolnić krwawienie. Następnie umieść wchłanialne hemostatyki na szwach, aby je podtrzymać.Przy otwartych obu zaciskach tętno aortalne powinno być widoczne dystalnie od nacięcia. Teraz umieść jelita z powrotem w jamie brzusznej i przepłucz jamę brzuszną solą fizjologiczną ogrzaną do 37 stopni Celsjusza. Następnie zamknij warstwę mięśni brzucha za pomocą szwów biegowych 6-0.A następnie zamknij skórę za pomocą szwów biegnących 5-0. Następnie natychmiast wstrzyknij podskórnie środek przeciwbólowy, zanim zwierzę się obudzi. Teraz monitoruj mysz, aż odzyska przytomność i będzie w stanie utrzymać leżący mostek.Gdy zwierzę odzyska przytomność, trzymaj je w spokoju, dopóki całkowicie nie wyzdrowieje. Dostarczaj metamizol do wody pitnej przez trzy dni. Pamiętaj, aby codziennie sprawdzać mysz, aby zapewnić dobrą regenerację.Dedenudacja balonowa jest odpowiednią metodą badania rozwoju przerostu mięśniowo-intimalnego u myszy. Zwierzęta dobrze wyzdrowiały po operacji i były w doskonałej kondycji fizycznej. Mniej niż 3% zmarło w ponad 50 operacjach.Przerost mięśniowo-błony włosowej rozwijał się stopniowo w przeszczepie. Barwienie histologiczne trichromem Massona wykazało tworzenie się mięśniówki mięśniowej wewnątrz wewnętrznej blaszki elastycznej. Zmiany w mięśniu włosowym składały się głównie ze składników komórkowych dodatnich na SM22, wskazujących na komórki mięśni gładkich i komórki ECM, takie jak miofibroblasty, również pokazane na czerwono.Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wykonywać urazy balonowe u myszy. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w 20 minut, jeśli jest wykonywana prawidłowo.

balloon-based-injury-to-induce-myointimal-hyperplasia-mouse-abdominal

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Ten film pokazuje dwa modele rozwoju blaszki miażdżycowej w tętnicach mysich i podkreśla różnice w przeroscie mięśniowo-brzuszkowym i miażdżycy.

Wywoływanie przerostu mięśniowo-wewnętrznego, a miażdżyca u myszy: wprowadzenie dwóch prawidłowych modeli

Ten protokół wykorzystuje cewnik balonowy do spowodowania uszkodzenia śródświetlnego tętnicy szyjnej szczura i wywołania przerostu neointimalu. Jest to dobrze ugruntowany model do badania mechanizmów przebudowy naczyń krwionośnych w odpowiedzi na uraz. Jest również szeroko stosowany do określania ważności potencjalnych podejść terapeutycznych.

Uszkodzenie balonu naczyniowego i podanie śródświetlne w tętnicy szyjnej szczura

Opisujemy technikę chirurgiczną, która powoduje uszkodzenie drutu w tętnicy udowej u myszy, aby wywołać przerost neointimalny, który służy jako modelowy system testowania dla okołonaczyniowego dostarczania związków terapeutycznych do hamowania restenozy.

Mysi model uszkodzenia drutu tętnicy udowej z implantacją okołonaczyniowego plastra do dostarczania leków

Restenoza po zabiegach sercowo-naczyniowych (operacja pomostowania, angioplastyka lub stentowanie) jest poważnym problemem zmniejszającym trwałość tych procedur. Idealna terapia hamowałaby proliferację komórek mięśni gładkich (VSMC), jednocześnie promując regenerację śródbłonka. Opisano model jednoczesnej oceny proliferacji VSMC i funkcji śródbłonka in vivo.

Mysi uraz zmiażdżenia aorty: skuteczny model in vivo proliferacji komórek mięśni gładkich i funkcji śródbłonka

Zwierzęce modele miażdżycy są niezbędne do zrozumienia mechanizmu i zbadania nowszych metod zapobiegania rozwojowi lub pękaniu płytki nazębnej, głównej przyczynie zgonów w uprzemysłowionym świecie. Protokół ten wykorzystuje połączenie uszkodzenia balonu i diety bogatej w cholesterol w celu wywołania blaszek miażdżycowych w tętnicy biodrowej królika.

Króliczy model przyspieszonej miażdżycy: perspektywa metodologiczna uszkodzenia balonika tętnicy biodrowej

Tutaj prezentujemy protokół heterotopowego przeszczepu aorty u myszy przy użyciu techniki mankietu bez szwów w mysim modelu szyjki macicy. Model ten może być wykorzystany do badania patologii leżącej u podstaw przewlekłej waskulopatii przeszczepu allogenicznego (CAV) i może pomóc w ocenie nowych środków terapeutycznych w celu zapobiegania jej powstawaniu.

Mysi model przeszczepu aorty szyjnej przy użyciu zmodyfikowanej techniki mankietu bez szwów

Uszkodzenie balonu tętnicy szyjnej szczura naśladuje zabieg angioplastyki klinicznej wykonywany w celu przywrócenia przepływu krwi w naczyniach miażdżycowych. Model ten indukuje reakcję na uszkodzenie tętnicy poprzez rozdęcie ściany tętnicy i obnażenie warstwy wewnętrznej komórek śródbłonka, ostatecznie powodując przebudowę i reakcję hiperplastyczną błony wewnętrznej.

Segmentowe uszkodzenie balonu tętnicy szyjnej szczura z kontrolowanym ciśnieniem z okołoprzybytkowym zastosowaniem terapeutycznym

Obecny protokół opisuje ustandaryzowaną metodę chirurgiczną dla modelu AAA wywołanego elastazą poprzez bezpośrednie zastosowanie elastazy do przydanki podnerkowej aorty brzusznej u myszy.

Mysi model tętniaka aorty brzusznej indukowany przez okołonaczyniowe zastosowanie elastazy

Ten protokół opisuje mysi model tętniaka aorty brzusznej (AAA) wywołanego fosforanem wapnia w celu zbadania cech patologicznych i mechanizmów molekularnych AAA.

Model tętniaka aorty brzusznej myszy wywołany fosforanem wapnia

Ten manuskrypt przedstawia protokół tworzenia mysiego modelu tętniaka aorty brzusznej myszy przy użyciu chlorku wapnia i elastazy, łącząc zalety poprzednich metod modelowania. Model ten można wykorzystać do badania mechanizmów patofizjologicznych leżących u podstaw tętniaków aorty brzusznej.

Mysi model tętniaka aorty brzusznej za pomocą okołoprzybytkowego nacieku chlorku wapnia i elastazy

Ten protokół zapewnia powtarzalną i niezawodną metodę wywoływania tętniaków tętnicy brzusznej (TTB) u myszy C57BL/6 przy użyciu uczulenia elastyny i przynaczynowego stosowania elastazy, jako model TTB, który obejmuje komponent uczulenia immunologicznego.

Wiarygodne stworzenie modelu tętniaka tętnicy brzusznej u myszy przy użyciu uczulenia na elastynę i peryvaskularnej elastazy

Poznaj technikę urazu balonowego aorty brzusznej u myszy w celu wywołania przerostu mięśniowo-wewnętrznej. Model ten umożliwia badanie mechanizmów patologicznych i szybką progresję choroby.

Uraz balonowy w celu wywołania przerostu mięśniowo-wewnętrznej w aorcie brzusznej myszy

Przeglądaj więcej filmów