Multipleksowa analiza immunofluorescencyjna i kwantyfikacja wewnątrznowotworowych limfocytów T PD-1 + Tim-3 + CD8 +
8 lutego 2018
Badanie mikrośrodowiska guza może zidentyfikować prognostyczne lub predykcyjne biomarkery klinicznej odpowiedzi na immunoterapię. Przedstawiona tutaj jest innowacyjna metoda oparta na obrazowaniu wielospektralnym fluorescencji in situ w celu automatycznej analizy i zliczania różnych subpopulacji limfocytów T CD8 +. Ta powtarzalna i niezawodna technika nadaje się do dużych analiz kohortowych.
Ogólnym celem tej multipleksowanej analizy immunofluorescencyjnej jest automatyczne zliczanie komórek na podstawie ich fenotypu. Metoda ta umożliwia multifluorescencję i automatyczne zliczanie komórek w celu analizy fenotypu i funkcji komórek odpornościowych guza w mikrośrodowisku guza. Technologia ta ułatwiła wygenerowanie dwóch rodzajów złożonego rokowania dla przewidywanych przez Twoje markerów pochodzących bezpośrednio z mikrośrodowiska guza.
Ogólnie rzecz biorąc, osoby nowe w tej metodzie mogą mieć trudności, ponieważ procedura typowania fenograficznego jest bardzo długa, a wynikowe surowe dane wymagają dalszego przetwarzania. Po raz pierwszy wpadliśmy na pomysł tej metody, gdy próbowaliśmy scharakteryzować fenotyp i interakcje immunologiczne komórek annhodge miranty. Po rozmrożeniu za pomocą ręcznika papierowego ostrożnie osusz szkiełka wokół odcinków tkanki, a następnie zakreśl tkanki hydrofobowym pisakiem barierowym.
Gdy bariera wyschnie, utrwal próbki w 100% acetonie na pięć minut, a następnie wysusz na powietrzu przez dwie minuty, a następnie umyj szkiełka w TBS przez 10 minut. Preparaty należy posmarować 3 kroplami 0,1% Avidin przez 10 minut w ciemności, a następnie dotknąć lub przesunąć szkiełka, aby pokryć tkankę roztworem Avidin. Dodaj 3 krople 01% biotyny do każdej próbki, a następnie dotknij lub przesuń biotynę po próbkach, a następnie przemyj TBS, jak pokazano.
Następnie zablokuj wszelkie niespecyficzne wiązania za pomocą 100 mikrolitrów 5% normalnej surowicy w TBS przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Pod koniec inkubacji postukaj w szkiełka, aby usunąć nadmiar surowicy i inkubuj szkiełka w 100 mikrolitrach podstawowego koktajlu przeciwciał będących przedmiotem zainteresowania przez godzinę w wilgotnej komorze. Myć szkiełka z przeciwciałami w TBST przez pięć minut.
Po wysuszeniu oznaczyć komórki 100 mikrolitrami interesującego nas koktajlu przeciwciał wtórnych przez 30 minut w wilgotnej komorze, a następnie 10-minutowe płukanie w TBS. Inkubować wysuszone szkiełka znakowane przeciwciałami wtórnymi ze 100 mikrolitrami interesującego nas koktajlu przeciwciał trzeciorzędowych przez 30 minut, a następnie 10 minut płukania TBS. Pod koniec prania wysusz szkiełka i zamontuj chusteczki za pomocą podłoża montażowego uzupełnionego dapi.
Następnie zwiń każde szkiełko za pomocą szkiełka nakrywkowego i pozwól medium montażowemu zastygnąć przez co najmniej dwie godziny. Aby zeskanować szkiełka, otwórz oprogramowanie mikroskopu i załaduj protokół skanowania obrazu. Załaduj pierwsze szkiełko na stolik mikroskopu.
Następnie na pasku narzędzi kliknij ustaw ekspozycję i dostosuj czas ekspozycji dla każdego filtra, aż do uzyskania wystarczającego, ale nienasyconego sygnału. Kliknij start w górnym panelu i otwórz folder LabID. Wprowadź identyfikator pierwszego slajdu i kliknij przycisk Dalej.
Aby uzyskać przegląd szkiełka w jasnym świetle pola przy 4-krotnym powiększeniu, kliknij obrazowanie monochromatyczne i znajdź próbkę. Aby wybrać obszar tkanki do skanowania, naciśnij Control i użyj kursora, aby zaznaczyć lub odznaczyć interesujące Cię obszary do skanowania przy 4-krotnym powiększeniu. Aby uzyskać fluorescencyjny czerwony/niebieski/zielony obraz każdego regionu, kliknij przycisk Imagine o niskim poborze mocy.
Aby wybrać pole o dużej mocy, naciśnij Control i wybierz co najmniej pięć obszarów zainteresowania, które odpowiadają obszarom tkanki, które będą skanowane przy 20-krotnym powiększeniu. Następnie, aby uzyskać wielospektralną akwizycję obrazu każdego pola, kliknij opcję High Power Imagine, a następnie kliknij opcję Przechowywanie danych, aby zapisać obrazy w odpowiednim folderze o identyfikatorze laboratorium. Aby utworzyć nowy projekt, w menu pliku wybierz nowy projekt, w menu funkcji wyszukiwania wybierz segmentację komórek, a następnie w menu typowania fenometru wybierz opcję typowanie feno, a następnie kliknij przycisk konfiguruj.
W polu Format obrazu wybierz opcję multi spectral. W formacie próbki wybierz fluorescencję. Aby zintegrować reprezentatywne obrazy z projektem, w menu pliku kliknij otwórz obraz i wybierz 10-30 reprezentatywnych obrazów z całej serii.
Aby usunąć auto fluorescencję, otwórz niezabarwiony slajd i wybierz źródło biblioteki oraz odpowiednie fluorofory. Kliknij opcję Automatyczne kwitnienie i wybierz obszar automatycznego kwitnienia na pustym slajdzie. Aby wygenerować obraz złożony, wybierz opcję Przygotuj wszystko, aby zintegrować bibliotekę fluorescencji i widma automatycznej fluorescencji.
Kliknij ikonę oka, aby otworzyć panel edytora widoku i usuń zaznaczenie opcji autofluorescencji, aby przyciąć sygnał autofluorescencji. Wybierz odpowiedni kolor dla każdego znacznika. Aby podzielić komórki na segmenty, w menu przedziałów wybierz jądra i błonę.
W menu jąder ustaw DAPI jako plamę przeciwjądrową. Kliknij segmenty komórek i sprawdź segmentację jąder w błonach komórkowych. Aby fenotyp komórek, w menu fenotyp kliknij przycisk dodaj.
Aby utworzyć kategorie fenotypu komórki, wybierz więcej niż pięć reprezentatywnych dla kombinacji Fluorophor i Fluorophor, a następnie kliknij przycisk Train Classifier. Klasyfikator tworzy algorytm, który przypisuje fenotyp dla każdej komórki z przedziałem ufności. Powiększ i sprawdź fenotypy komórek.
Następnie kliknij fenotyp wszystko, aby zapisać algorytm fenotypu i projekt obrazu, w menu plik wybierz zapisz projekt. Następnie nazwij projekt i zapisz go. Aby przeprowadzić analizę wsadową serii, należy wybrać analizę kąpieli i wybrać zapisany projekt.
Wybierz folder, w którym mają być przechowywane dane wsadowe. Dodaj obrazy do analizy, a następnie kliknij przycisk Uruchom. Na końcu analizy sprawdź jakość obrazu kompozytowego i zweryfikuj typowanie fenograficzne wszystkich obrazów w serii.
Analiza naciekających nowotwór limfocytów T CD8-dodatnich na czystej próbce raka nerkowokomórkowego za pomocą fluorescencyjnego obrazowania wielospektralnego ujawnia, że około połowa limfocytów T CD8-dodatnich jest pojedynczo dodatnich dla PD-1 i około 1/3 podwójnie dodatnich dla PD-1 i Tim-3. Po zintegrowaniu tych różnych sygnałów komórkowych na wycinku tkanki, pomiar intensywności kwitnienia PD-1 na dodatnich limfocytach T PD-1 Tim-3 dodatnich w porównaniu z PD-1, ujemnych dla CD8 komórek T Tim-3 ujemnych, ujawnia, że MFI PD-1 jest wyższy, gdy Tim-3 ulega koekspresji, co wzmacnia funkcjonalne znaczenie ekspresji Tim-3. W tym reprezentatywnym eksperymencie 66% pacjentów z nowotworem nerki było również dodatnich pod względem ekspresji liganda PD-1, a 100% było dodatnich dla liganda Tim-3 Galaktyny-9.
Ocena kliniczna tkanek nowotworowych od pacjentów z rakiem nerkowokomórkowym wykazała również pozytywną korelację między liczbą i odsetkiem naciekających nowotwór limfocytów T CD-8 dodatnich eksprymujących PD-1 i Tim-3 oraz parametrów oceny prognostycznej, ale nie PD-1 dodatnich CD-8 bez ekspresji Tim-3. Co ciekawe, pacjenci z rakiem nerkowokomórkowym z limfocytami T CD-8 z jednoczesną ekspresją PD1 i Tim 3 powyżej mediany procentowej byli bardziej narażeni na nawrót, podczas gdy stwierdzono, że ekspresja PD-1 bez ekspresji co Tim-3 nie jest skorelowana z nawrotem choroby. Chociaż próbowałem tej procedury, ważne jest, aby pamiętać, aby przejrzeć fenotyp komórek z dwoma oddzielnymi badaczami, w tym patologiem, jeśli to możliwe.
Zgodnie z tą procedurą można wykonać inne czynności, takie jak cytometria, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące funkcjonalnego wpływu autofenotypu po stymulacji x-vivo. Po jej opracowaniu, technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się rakiem do zbadania odpowiedzi immunologicznych w dotkniętych narządach.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia innowacyjną metodę multipleksowej immunofluorescencji do automatycznego zliczania komórek odpornościowych guza na podstawie ich fenotypu. Technika ta została opracowana w celu analizy mikrośrodowiska guza oraz identyfikacji biomarkerów prognostycznych odpowiedzi na immunoterapię.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Immunologia
- Onkologia
- Biologia komórki
Wstęp
- Mikrośrodowisko guza odgrywa kluczową rolę w progresji nowotworu i odpowiedzi na leczenie.
- Komórki T CD8 + są istotne dla odpowiedzi immunologicznej w guzach.
- Istniejące metody liczenia komórek mogą być czasochłonne i wymagać rozbudowanego przetwarzania danych.
- Celem niniejszego badania jest usprawnienie analizy fenotypów komórek odpornościowych.
Cel badania
- Opracowanie wiarygodnej metody automatycznego liczenia komórek odpornościowych w próbkach nowotworowych.
- Ułatwienie analizy dużych kohort w badaniach nad rakiem.
- Poprawa zrozumienia oddziaływań odpornościowych w obrębie mikrośrodowiska guza.
Zastosowane metody
- Multipleksowa immunofluorescencja do analizy fenotypu komórek.
- Multispektralne obrazowanie fluorescencyjne in situ do automatycznego zliczania.
- Przygotowanie skrawków tkanek z barierami hydrofobowymi do obrazowania.
- Techniki przetwarzania danych do analizy populacji komórek.
Główne wyniki
- Metoda ta umożliwia efektywne zliczanie subpopulacji limfocytów T CD8+ .
- Wyniki wskazują na potencjalne markery prognostyczne pochodzące z mikrośrodowiska guza.
- Technika ta jest powtarzalna i odpowiednia do badań na dużą skalę.
- Lepsze zrozumienie dynamiki komórek odpornościowych w guzach.
Wnioski
- Ta innowacyjna metoda usprawnia analizę komórek odpornościowych guza.
- Stanowi ona ramy dla identyfikacji biomarkerów w immunoterapii.
- Podejście to można dostosować do różnych zastosowań badawczych w onkologii.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Analiza wielokolorowej immunofluorescencji umożliwia zautomatyzowaną kwantyfikację fenotypów komórek odpornościowych w mikrośrodowisku guza, wspierając walidację celów terapeutycznych oraz odkrywanie biomarkerów w immuno-onkologii. Poprzez pomiar koekspresji receptorów hamujących, takich jak PD-1 i Tim-3, na komórkach T CD8+, metoda ta zapewnia wiarygodność prognostyczną w zakresie stratyfikacji pacjentów i odpowiedzi terapeutycznej. Podejście to rozwiązuje kluczowy problem na etapie odkrywania leków: przełożenie przestrzennego profilowania immunologicznego na praktyczne wnioski służące do selekcji projektów w portfolio oraz minimalizacji ryzyka mechanistycznego.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Weryfikuje hipotezy terapeutyczne poprzez wyjaśnienie wzorców koekspresji PD-1 i Tim-3 w naciekających nowotwór komórkach T CD8+.
- Wartość operacyjna: Umożliwia redukcję ryzyka biologicznego poprzez funkcjonalną walidację celów w postaci markerów wyczerpania w raku komórkowym nerki.
- Wartość strategiczna: Zwiększa pewność prognostyczną i wspiera selekcję projektów w portfolio poprzez powiązanie częstotliwości występowania limfocytów T PD-1+/Tim-3+ ze złym rokowaniem i ryzykiem nawrotu.
Przesiewy i opracowanie testów
- Wartość naukowa: Przygotowanie zwalidowanych systemów biologicznych do dalszych etapów analizy poprzez standaryzowaną obrazowanie wielospektralne i fenotypowanie.
- Wartość operacyjna: Zapewnienie powtarzalności testów i wyników ilościowych dzięki zautomatyzowanemu liczeniu i segmentacji komórek.
- Wartość strategiczna: Zwiększenie gotowości do screeningu i możliwości ponownego wykorzystania platformy poprzez integrację przygotowania biblioteki fluorescencyjnej oraz usuwanie autofluorescencji.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Wykazuje istotność w kontekście choroby poprzez korelację komórek T CD8+ PD-1+/Tim-3+ z oceną prognostyczną w raku jasnokomórkowym nerki.
- Wartość operacyjna: Wspiera ciągłość translacyjną od etapu odkrycia do walidacji przedklinicznej za pomocą obrazowania kompozytowego i trenowania algorytmów fenotypowych.
- Wartość strategiczna: Dostarcza informacji dla decyzji o rozwoju projektu z uwzględnieniem ryzyka poprzez zidentyfikowanie koekspresji Tim-3 jako funkcjonalnie istotnego biomarkera, niezależnego od samej ekspresji PD-1.
Integracja rurociągów i przepływów pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum procesu odkrywania – od testowania hipotez po identyfikację substancji wiodących – umożliwiając profilowanie immunologiczne, które pozwala ocenić pewność wyboru celu oraz dopasowanie biomarkerów translacyjnych.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków sygnałowych poprzez kwantyfikację koekspresji PD-1 i Tim-3 w limfocytach T CD8+ w mikrośrodowisku guza.
- Przesiewanie: Zapewnia gotowość i powtarzalność testu dzięki zautomatyzowanemu obrazowaniu multispektralnemu i zestandaryzowanym przepływom pracy w fenotypowaniu.
- Analityka: Generuje pomiary ilościowe, takie jak MFI dla PD-1 oraz procenty komórek podwójnie dodatnich, umożliwiając porównania między różnymi warunkami.
- Badania translacyjne: Zapewnia ciągłość przedkliniczną poprzez korelację prognostyczną w próbkach raka komórkowego nerki, wspierając dopasowanie biomarkerów.
- Wykorzystanie w skali przedsiębiorstwa: Służy jako powtarzalna metoda profilowania immunologicznego w różnych typach nowotworów, ograniczając redundancję w opracowywaniu testów.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Pewność prognostyczna, walidacja celu, redukcja niejednoznaczności mechanistycznej w szlakach wyczerpania limfocytów T.
- Wartość operacyjna: Standaryzacja, powtarzalność i skalowalność multipleksowej immunofluorescencji w ilościowym oznaczaniu komórek odpornościowych.
- Wartość strategiczna: Lepsze decyzje typu go/no-go, efektywność kapitałowa i zredukowane ryzyko biologiczne na późnych etapach dzięki wczesnej identyfikacji biomarkerów.
- Wpływ na portfolio: Priorytetyzacja skorygowana o ryzyko oraz decyzje o dalszym rozwoju w oparciu o progi dla limfocytów T PD-1+/Tim-3+ powiązane z nawrotem choroby.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w barwieniu immunofluorescencyjnym, obrazowaniu wielospektralnym oraz obsłudze oprogramowania do analizy obrazów w celu fenotypowania.
- Zależne od dostępności aparatury, w tym mikroskopów fluorescencyjnych z możliwościami wielospektralnymi oraz systemów kontroli środowiskowej do przygotowania preparatów.
- Wymaga międzyzespołowej standaryzacji paneli przeciwciał, ustawień czasu ekspozycji oraz algorytmów fenotypowania we wszystkich ośrodkach.
- Wiąże się z koniecznością dostosowania metod do różnych typów tkanek, sposobów utrwalania oraz protokołów odmaskowania antygenów.
- Obejmuje ograniczenia praktyczne, takie jak czasochłonne procedury fenotypowania oraz złożone przetwarzanie danych surowych wymagające kontroli jakości po akwizycji obrazów.
