Multipleksowa analiza immunofluorescencyjna i kwantyfikacja wewnątrznowotworowych limfocytów T PD-1 + Tim-3 + CD8 +
February 8th, 2018
Badanie mikrośrodowiska guza może zidentyfikować prognostyczne lub predykcyjne biomarkery klinicznej odpowiedzi na immunoterapię. Przedstawiona tutaj jest innowacyjna metoda oparta na obrazowaniu wielospektralnym fluorescencji in situ w celu automatycznej analizy i zliczania różnych subpopulacji limfocytów T CD8 +. Ta powtarzalna i niezawodna technika nadaje się do dużych analiz kohortowych.
Ogólnym celem tej multipleksowanej analizy immunofluorescencyjnej jest automatyczne zliczanie komórek na podstawie ich fenotypu. Metoda ta umożliwia multifluorescencję i automatyczne zliczanie komórek w celu analizy fenotypu i funkcji komórek odpornościowych guza w mikrośrodowisku guza. Technologia ta ułatwiła wygenerowanie dwóch rodzajów złożonego rokowania dla przewidywanych przez Twoje markerów pochodzących bezpośrednio z mikrośrodowiska guza.
Ogólnie rzecz biorąc, osoby nowe w tej metodzie mogą mieć trudności, ponieważ procedura typowania fenograficznego jest bardzo długa, a wynikowe surowe dane wymagają dalszego przetwarzania. Po raz pierwszy wpadliśmy na pomysł tej metody, gdy próbowaliśmy scharakteryzować fenotyp i interakcje immunologiczne komórek annhodge miranty. Po rozmrożeniu za pomocą ręcznika papierowego ostrożnie osusz szkiełka wokół odcinków tkanki, a następnie zakreśl tkanki hydrofobowym pisakiem barierowym.
Gdy bariera wyschnie, utrwal próbki w 100% acetonie na pięć minut, a następnie wysusz na powietrzu przez dwie minuty, a następnie umyj szkiełka w TBS przez 10 minut. Preparaty należy posmarować 3 kroplami 0,1% Avidin przez 10 minut w ciemności, a następnie dotknąć lub przesunąć szkiełka, aby pokryć tkankę roztworem Avidin. Dodaj 3 krople 01% biotyny do każdej próbki, a następnie dotknij lub przesuń biotynę po próbkach, a następnie przemyj TBS, jak pokazano.
Następnie zablokuj wszelkie niespecyficzne wiązania za pomocą 100 mikrolitrów 5% normalnej surowicy w TBS przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Pod koniec inkubacji postukaj w szkiełka, aby usunąć nadmiar surowicy i inkubuj szkiełka w 100 mikrolitrach podstawowego koktajlu przeciwciał będących przedmiotem zainteresowania przez godzinę w wilgotnej komorze. Myć szkiełka z przeciwciałami w TBST przez pięć minut.
Po wysuszeniu oznaczyć komórki 100 mikrolitrami interesującego nas koktajlu przeciwciał wtórnych przez 30 minut w wilgotnej komorze, a następnie 10-minutowe płukanie w TBS. Inkubować wysuszone szkiełka znakowane przeciwciałami wtórnymi ze 100 mikrolitrami interesującego nas koktajlu przeciwciał trzeciorzędowych przez 30 minut, a następnie 10 minut płukania TBS. Pod koniec prania wysusz szkiełka i zamontuj chusteczki za pomocą podłoża montażowego uzupełnionego dapi.
Następnie zwiń każde szkiełko za pomocą szkiełka nakrywkowego i pozwól medium montażowemu zastygnąć przez co najmniej dwie godziny. Aby zeskanować szkiełka, otwórz oprogramowanie mikroskopu i załaduj protokół skanowania obrazu. Załaduj pierwsze szkiełko na stolik mikroskopu.
Następnie na pasku narzędzi kliknij ustaw ekspozycję i dostosuj czas ekspozycji dla każdego filtra, aż do uzyskania wystarczającego, ale nienasyconego sygnału. Kliknij start w górnym panelu i otwórz folder LabID. Wprowadź identyfikator pierwszego slajdu i kliknij przycisk Dalej.
Aby uzyskać przegląd szkiełka w jasnym świetle pola przy 4-krotnym powiększeniu, kliknij obrazowanie monochromatyczne i znajdź próbkę. Aby wybrać obszar tkanki do skanowania, naciśnij Control i użyj kursora, aby zaznaczyć lub odznaczyć interesujące Cię obszary do skanowania przy 4-krotnym powiększeniu. Aby uzyskać fluorescencyjny czerwony/niebieski/zielony obraz każdego regionu, kliknij przycisk Imagine o niskim poborze mocy.
Aby wybrać pole o dużej mocy, naciśnij Control i wybierz co najmniej pięć obszarów zainteresowania, które odpowiadają obszarom tkanki, które będą skanowane przy 20-krotnym powiększeniu. Następnie, aby uzyskać wielospektralną akwizycję obrazu każdego pola, kliknij opcję High Power Imagine, a następnie kliknij opcję Przechowywanie danych, aby zapisać obrazy w odpowiednim folderze o identyfikatorze laboratorium. Aby utworzyć nowy projekt, w menu pliku wybierz nowy projekt, w menu funkcji wyszukiwania wybierz segmentację komórek, a następnie w menu typowania fenometru wybierz opcję typowanie feno, a następnie kliknij przycisk konfiguruj.
W polu Format obrazu wybierz opcję multi spectral. W formacie próbki wybierz fluorescencję. Aby zintegrować reprezentatywne obrazy z projektem, w menu pliku kliknij otwórz obraz i wybierz 10-30 reprezentatywnych obrazów z całej serii.
Aby usunąć auto fluorescencję, otwórz niezabarwiony slajd i wybierz źródło biblioteki oraz odpowiednie fluorofory. Kliknij opcję Automatyczne kwitnienie i wybierz obszar automatycznego kwitnienia na pustym slajdzie. Aby wygenerować obraz złożony, wybierz opcję Przygotuj wszystko, aby zintegrować bibliotekę fluorescencji i widma automatycznej fluorescencji.
Kliknij ikonę oka, aby otworzyć panel edytora widoku i usuń zaznaczenie opcji autofluorescencji, aby przyciąć sygnał autofluorescencji. Wybierz odpowiedni kolor dla każdego znacznika. Aby podzielić komórki na segmenty, w menu przedziałów wybierz jądra i błonę.
W menu jąder ustaw DAPI jako plamę przeciwjądrową. Kliknij segmenty komórek i sprawdź segmentację jąder w błonach komórkowych. Aby fenotyp komórek, w menu fenotyp kliknij przycisk dodaj.
Aby utworzyć kategorie fenotypu komórki, wybierz więcej niż pięć reprezentatywnych dla kombinacji Fluorophor i Fluorophor, a następnie kliknij przycisk Train Classifier. Klasyfikator tworzy algorytm, który przypisuje fenotyp dla każdej komórki z przedziałem ufności. Powiększ i sprawdź fenotypy komórek.
Następnie kliknij fenotyp wszystko, aby zapisać algorytm fenotypu i projekt obrazu, w menu plik wybierz zapisz projekt. Następnie nazwij projekt i zapisz go. Aby przeprowadzić analizę wsadową serii, należy wybrać analizę kąpieli i wybrać zapisany projekt.
Wybierz folder, w którym mają być przechowywane dane wsadowe. Dodaj obrazy do analizy, a następnie kliknij przycisk Uruchom. Na końcu analizy sprawdź jakość obrazu kompozytowego i zweryfikuj typowanie fenograficzne wszystkich obrazów w serii.
Analiza naciekających nowotwór limfocytów T CD8-dodatnich na czystej próbce raka nerkowokomórkowego za pomocą fluorescencyjnego obrazowania wielospektralnego ujawnia, że około połowa limfocytów T CD8-dodatnich jest pojedynczo dodatnich dla PD-1 i około 1/3 podwójnie dodatnich dla PD-1 i Tim-3. Po zintegrowaniu tych różnych sygnałów komórkowych na wycinku tkanki, pomiar intensywności kwitnienia PD-1 na dodatnich limfocytach T PD-1 Tim-3 dodatnich w porównaniu z PD-1, ujemnych dla CD8 komórek T Tim-3 ujemnych, ujawnia, że MFI PD-1 jest wyższy, gdy Tim-3 ulega koekspresji, co wzmacnia funkcjonalne znaczenie ekspresji Tim-3. W tym reprezentatywnym eksperymencie 66% pacjentów z nowotworem nerki było również dodatnich pod względem ekspresji liganda PD-1, a 100% było dodatnich dla liganda Tim-3 Galaktyny-9.
Ocena kliniczna tkanek nowotworowych od pacjentów z rakiem nerkowokomórkowym wykazała również pozytywną korelację między liczbą i odsetkiem naciekających nowotwór limfocytów T CD-8 dodatnich eksprymujących PD-1 i Tim-3 oraz parametrów oceny prognostycznej, ale nie PD-1 dodatnich CD-8 bez ekspresji Tim-3. Co ciekawe, pacjenci z rakiem nerkowokomórkowym z limfocytami T CD-8 z jednoczesną ekspresją PD1 i Tim 3 powyżej mediany procentowej byli bardziej narażeni na nawrót, podczas gdy stwierdzono, że ekspresja PD-1 bez ekspresji co Tim-3 nie jest skorelowana z nawrotem choroby. Chociaż próbowałem tej procedury, ważne jest, aby pamiętać, aby przejrzeć fenotyp komórek z dwoma oddzielnymi badaczami, w tym patologiem, jeśli to możliwe.
Zgodnie z tą procedurą można wykonać inne czynności, takie jak cytometria, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące funkcjonalnego wpływu autofenotypu po stymulacji x-vivo. Po jej opracowaniu, technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się rakiem do zbadania odpowiedzi immunologicznych w dotkniętych narządach.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Niniejsze badanie prezentuje innowacyjną metodę wielokanałowej analizy immunofluorescencyjnej do automatycznego liczenia komórek odpornościowych nowotworu na podstawie ich fenotypu. Technika ta została zaprojektowana w celu analizy mikrośrodowiska nowotworu i identyfikacji biomarkerów prognostycznych odpowiedzi na immunoterapię.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Immunologia
- Onkologia
- Biologia komórki
Tło
- Mikrośrodowisko nowotworu odgrywa kluczową rolę w progresji raka i odpowiedzi na leczenie.
- Komórki T CD8 + są ważne dla odpowiedzi immunologicznej w nowotworach.
- Istniejące metody liczenia komórek mogą być czasochłonne i wymagać rozległej obróbki danych.
- Niniejsze badanie ma na celu usprawnienie analizy fenotypu komórek odpornościowych.
Cel badania
- Opracowanie niezawodnej metody automatycznego liczenia komórek odpornościowych w próbkach nowotworowych.
- Ułatwienie dużych analiz kohorty w badaniach nad rakiem.
- Poprawa rozumienia interakcji immunologicznych w mikrośrodowisku nowotworowym.
Stosowane metody
- Wielokanałowa immunofluorescencja do analizy fenotypu komórek.
- In situ wielospektralne obrazowanie fluorescencyjne do automatycznego liczenia.
- Przygotowanie sekcji tkankowych z hydrofobowymi barierami do obrazowania.
- Techniki przetwarzania danych do analizy populacji komórek.
Główne wyniki
- Metoda pozwala na efektywne liczenie subpopulacji komórek T CD8 +.
- Wyniki wskazują na potencjalne markery prognostyczne pochodzące z mikrośrodowiska nowotworu.
- Technika jest powtarzalna i nadaje się do badań na dużą skalę.
- Ulepszone rozumienie dynamiki komórek odpornościowych w nowotworach.
Wnioski
- Ta innowacyjna metoda poprawia analizę komórek odpornościowych nowotworu.
- Daje ramy do identyfikacji biomarkerów dla immunoterapii.
- Podejście to można dostosować do różnych zastosowań badawczych w onkologii.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Multiplexed immunofluorescence analysis enables automated quantification of immune cell phenotypes in the tumor microenvironment, supporting target validation and biomarker discovery in immuno-oncology. By measuring co-expression of inhibitory receptors such as PD-1 and Tim-3 on CD8+ T cells, the method provides predictive confidence for patient stratification and therapeutic response. This approach addresses a key discovery-stage challenge: translating spatial immune profiling into actionable insights for portfolio triage and mechanistic de-risking.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by clarifying PD-1 and Tim-3 co-expression patterns on tumor-infiltrating CD8+ T cells.
- Operational Value: Enables biological de-risking through functional target validation of exhaustion markers in renal cell carcinoma.
- Strategic Value: Supports predictive confidence and portfolio triage by linking PD-1+/Tim-3+ T-cell frequency to poor prognosis and relapse risk.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream workflows via standardized multispectral imaging and phenotyping.
- Operational Value: Ensures assay reproducibility and quantitative outputs through automated cell counting and segmentation.
- Strategic Value: Enhances screening readiness and platform reuse by integrating fluorescence library preparation and autofluorescence removal.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Demonstrates disease relevance through correlation of PD-1+/Tim-3+ CD8+ T cells with prognostic scoring in renal cell carcinoma.
- Operational Value: Supports translational continuity from discovery to preclinical validation via composite imaging and phenotype algorithm training.
- Strategic Value: Informs risk-adjusted advancement decisions by identifying Tim-3 co-expression as a functionally relevant biomarker independent of PD-1 alone.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from hypothesis testing to lead identification, enabling immune profiling that informs target confidence and translational biomarker alignment.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by quantifying PD-1 and Tim-3 co-expression on CD8+ T cells in the tumor microenvironment.
- Screening: Delivers assay readiness and reproducibility through automated multispectral imaging and standardized phenotyping workflows.
- Analytics: Generates quantitative measurements such as PD-1 MFI and double-positive cell percentages to enable cross-condition comparison.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity via prognostic correlation in renal cell carcinoma specimens, supporting biomarker alignment.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable capability for immune profiling across tumor types, reducing redundant assay development.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence, target validation, reduction of mechanistic ambiguity in T-cell exhaustion pathways.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of multiplexed immunofluorescence for immune cell quantification.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk through early biomarker identification.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on PD-1+/Tim-3+ T-cell thresholds linked to relapse.
Implementation Considerations
- Requires expertise in immunofluorescence staining, multispectral imaging, and image analysis software for phenotyping.
- Dependent on instrumentation including fluorescence microscopes with multispectral capabilities and environmental controls for slide preparation.
- Necessitates cross-team standardization of antibody panels, exposure settings, and phenotyping algorithms across sites.
- Involves adaptation considerations for varying tissue types, fixation methods, and antigen retrieval protocols.
- Includes practical limitations such as lengthy phenotyping procedures and complex raw data processing requiring post-acquisition quality checks.
