Nowatorski test obrazowania na żywo in vitro fagocytozy za pośrednictwem astrocytów przy użyciu synaptosomów sprzężonych ze wskaźnikiem pH

Ten protokół przedstawia test fagocytozy in vitro do pomiaru zdolności fagocytarnej astrocytów. Oczyszczone astrocyty i mikroglej szczurów są używane wraz z synaptosomami sprzężonymi ze wskaźnikiem pH. Metoda ta może wykrywać kinetykę pochłaniania i degradacji w czasie rzeczywistym oraz zapewnia odpowiednią platformę przesiewową do identyfikacji czynników modulujących fagocytozę astrocytów.

Ogólnym celem tego eksperymentu jest wykrycie kinetyki pochłaniania i degradacji komórek glejowych w czasie rzeczywistym, takich jak astrocyty i mikroglej, poprzez obrazowanie in vitro na żywo fagocytozy synaptosomów sprzężonych ze wskaźnikiem pH. Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie neurobiologii, takie jak to, w jaki sposób fagocytoza komórek glejowych jest regulowana w zdrowych i chorych mózgach. Główną zaletą tej techniki jest to, że możemy skutecznie monitorować i analizować kinetykę fagocytarną komórek glejowych w czasie rzeczywistym poprzez obrazowanie na żywo komórek hodowanych in vitro.

Metoda ta może być również stosowana do badań przesiewowych pod kątem czynników i związków, które regulują zdolność pochłaniania i degradacji komórek glejowych. Rozpocznij od odwirowania rozmrożonych próbek synaptosomów przez trzy do czterech minut w temperaturze 21 092 G i czterech stopniach Celsjusza. Po odessaniu supernatantów ponownie zawiesić granulki w 200 mikrolitrach 0,1 molowego węglanu sodu na probówkę, dodając dwa mikrolitry wskaźnika pH do każdej próbki po ich dokładnym wymieszaniu.

Po delikatnym wirze chronić roztwory przed światłem za pomocą osłon z folii aluminiowej i umieścić próbki w wytrząsarce typu twist z delikatnym mieszaniem na dwie godziny w temperaturze pokojowej. Pod koniec inkubacji dodać jeden mililitr PBS Dulbecco lub DPBS i zebrać synaptosomy przez odwirowanie, ponownie zawieszając osad w jednym mililitrze świeżego DPBS na pranie. Po ostatnim odwirowaniu ponownie zawiesić niefunkcjonalny osad synaptosomu w 200 mikrolitrach DPBS uzupełnionych 5% DMSO.

Aby zobrazować na żywo pochłanianie synaptosomu, najpierw usuń supernatant z każdej studzienki zlewającej się kultury astrocytów i szybko przemyj komórki trzy razy jednym mililitrem DPBS na płukanie. Po ostatnim praniu dodaj 300 mikrolitrów immunopożywki zasadowej astrocytów i pięć mikrolitrów synaptosomów sprzężonych ze wskaźnikiem pH, a także wszelkie dodatkowe czynniki, które mogą modulować fagocytozę komórek glejowych. Pozwól synaptosomom osiąść na dnie studzienek i przyłączyć się do receptorów fosfatydyloseryny na astrocytach w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% Co2.

Po 40 minutach wyrzucić supernatanty i szybko, ale delikatnie umyć studzienki trzykrotnie jednym mililitrem DPBS na przemycie. Po ostatnim płukaniu dodaj 500 mikrolitrów świeżej pożywki uzupełnionej interesującymi czynnikami do odpowiednich studzienek i przenieś płytkę do przyrządu do obrazowania na żywo. Wybierz pozycje obrazowania, dostosuj ostrość, czas ekspozycji, jasność i moc diody LED, a następnie ustaw format obrazu, przedział czasu i całkowitą liczbę cykli obrazowania na żywo zgodnie z eksperymentalnymi potrzebami.

Następnie rozpocznij obrazowanie na żywo eksperymentów z fagocytozą. W odpowiednim eksperymentalnym punkcie końcowym otwórz program do analizy obrazu i zaimportuj sekwencję obrazów poklatkowych. Przekonwertuj obrazy na 8-bitową skalę szarości i zainicjuj odejmowanie tła z promieniem paska toczenia wynoszącym 50 pikseli.

Następnie otwórz wtyczkę Time Series Analyzer V3 i przeciągnij interesujący Cię region do wtyczki. W menedżerze obszaru zainteresowań kliknij przycisk Dodaj. We wtyczce Time Series V3 kliknij pozycję Get Total Intensity (Pobierz łączną intensywność).

Następnie zapisz wyniki i zintegruj dane. Po ich przygotowaniu synaptosomy wyrażają fosfatydyloserynę na swoich zewnętrznych błonach, co sugeruje utratę funkcji, co można rozpoznać po receptorach fosfatydyloseryny na astrocytach i mikrogleju. Gdy synaptosomy sprzężone ze wskaźnikiem pH są fagocytozowane, emitują jaskrawoczerwone fluorescencje.

Aby określić ilościowo fagocytozę komórek glejowych, można zmierzyć obszar sygnału czerwonej fluorescencji lub indeks fagocytarny. Chociaż astrocyty są skuteczne w fagocytozowaniu dużej liczby synaptosomów sprzężonych ze wskaźnikiem pH, mikroglej szybciej pochłania i degraduje synaptosomy. Co ciekawe, czynniki wydzielane przez astrocyty, które są zawarte w pożywce kondycjonowanej przez astrocyty, są niezbędne do zwiększenia fagocytozy za pośrednictwem astrocytów i mikrogleju.

Co więcej, mysie astrocyty z nokautem MEGF10 wykazywały znacznie upośledzoną zdolność fagocytarną w porównaniu z komórkami typu dzikiego. Po opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom z dziedziny neurobiologii i biologii komórek glejowych do zbadania mechanizmów związanych z modulacją fagocytozy komórek glejowych jako potencjalnej metody leczenia różnych zaburzeń neurologicznych.