Name: Nowatorski test obrazowania na żywo in vitro fagocytozy za pośrednictwem astrocytów przy użyciu synaptosomów sprzężonych ze wskaźnikiem pH (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-05T13:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 43 s
Description: Poznaj metodę obrazowania na żywo fagocytozy przez astrocyty i mikroglej przy użyciu synaptosomów ze wskaźnikiem pH. Technika umożliwia analizę kinetyki fagocytozy w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Autorzy dziękują Yeon-Joo Jung za jej eksperymentalne wsparcie podczas oczyszczania synaptosomów oraz Jungjoo Park za zdjęcia synaptosomów z ekspozycją na PS. Ponadto dziękujemy wszystkim członkom laboratorium Chunga za pomocną dyskusję. Prace te były wspierane przez grant Narodowej Fundacji Badawczej Korei (NRF) finansowany przez rząd koreański (MSIP) (NRF-2016M3C7A1905391 i NRF-2016R1C1B3006969) (W.-S. C).

<ol><li>Singh, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytes+Assemble+Thalamocortical+Synapses+by+Bridging+NRX1alpha+and+NL1+via+Hevin%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Astrocytes Assemble Thalamocortical Synapses by Bridging NRX1alpha and NL1 via Hevin.</a> Cell. 164 (1-2), 183-196 (2016).</li>
<li>Allen, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocyte+glypicans+4+and+6+promote+formation+of+excitatory+synapses+via+GluA1+AMPA+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Astrocyte glypicans 4 and 6 promote formation of excitatory synapses via GluA1 AMPA receptors.</a> Nature. 486 (7403), 410-414 (2012).</li>
<li>Xu, J., Xiao, N., Xia, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thrombospondin+1+accelerates+synaptogenesis+in+hippocampal+neurons+through+neuroligin+1%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Thrombospondin 1 accelerates synaptogenesis in hippocampal neurons through neuroligin 1.</a> Nat Neurosci. 13 (1), 22-24 (2010).</li>
<li>Chung, W. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytes+mediate+synapse+elimination+through+MEGF10+and+MERTK+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Astrocytes mediate synapse elimination through MEGF10 and MERTK pathways.</a> Nature. 504 (7480), 394-400 (2013).</li>
<li>Schafer, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+sculpt+postnatal+neural+circuits+in+an+activity+and+complement-dependent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Microglia sculpt postnatal neural circuits in an activity and complement-dependent manner.</a> Neuron. 74 (4), 691-705 (2012).</li>
<li>Ma, Z., Stork, T., Bergles, D. E., Freeman, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuromodulators+signal+through+astrocytes+to+alter+neural+circuit+activity+and+behaviour%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Neuromodulators signal through astrocytes to alter neural circuit activity and behaviour.</a> Nature. 539 (7629), 428-432 (2016).</li>
<li>Parkhurst, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+promote+learning-dependent+synapse+formation+through+brain-derived+neurotrophic+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Microglia promote learning-dependent synapse formation through brain-derived neurotrophic factor.</a> Cell. 155 (7), 1596-1609 (2013).</li>
<li>Iram, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Megf10+Is+a+Receptor+for+C1Q+That+Mediates+Clearance+of+Apoptotic+Cells+by+Astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Megf10 Is a Receptor for C1Q That Mediates Clearance of Apoptotic Cells by Astrocytes.</a> J Neurosci. 36 (19), 5185-5192 (2016).</li>
<li>Tasdemir-Yilmaz, O. E., Freeman, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytes+engage+unique+molecular+programs+to+engulf+pruned+neuronal+debris+from+distinct+subsets+of+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Astrocytes engage unique molecular programs to engulf pruned neuronal debris from distinct subsets of neurons.</a> Genes Dev. 28 (1), 20-33 (2014).</li>
<li>Jones, R. S., Minogue, A. M., Connor, T. J., Lynch, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyloid-beta-induced+astrocytic+phagocytosis+is+mediated+by+CD36%2C+CD47+and+RAGE%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroimmune+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Amyloid-beta-induced astrocytic phagocytosis is mediated by CD36, CD47 and RAGE.</a> J Neuroimmune Pharmacol. 8 (1), 301-311 (2013).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TREM2+lipid+sensing+sustains+the+microglial+response+in+an+Alzheimer%27s+disease+model%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">TREM2 lipid sensing sustains the microglial response in an Alzheimer's disease model.</a> Cell. 160 (6), 1061-1071 (2015).</li>
<li>Sekar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Schizophrenia+risk+from+complex+variation+of+complement+component+4%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Schizophrenia risk from complex variation of complement component 4.</a> Nature. 530 (7589), 177-183 (2016).</li>
<li>Hong, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complement+and+microglia+mediate+early+synapse+loss+in+Alzheimer+mouse+models%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Complement and microglia mediate early synapse loss in Alzheimer mouse models.</a> Science. 352 (6286), 712-716 (2016).</li>
<li>Chung, W. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+allele-dependent+role+for+APOE+in+controlling+the+rate+of+synapse+pruning+by+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Novel allele-dependent role for APOE in controlling the rate of synapse pruning by astrocytes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (36), 10186-10191 (2016).</li>
<li>Purice, M. D., Speese, S. D., Logan, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delayed+glial+clearance+of+degenerating+axons+in+aged+Drosophila+is+due+to+reduced+PI3K%2FDraper+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Delayed glial clearance of degenerating axons in aged Drosophila is due to reduced PI3K/Draper activity.</a> Nat Commun. 7, 12871(2016).</li>
<li>Loov, C., Mitchell, C. H., Simonsson, M., Erlandsson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Slow+degradation+in+phagocytic+astrocytes+can+be+enhanced+by+lysosomal+acidification%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Slow degradation in phagocytic astrocytes can be enhanced by lysosomal acidification.</a> Glia. , (2015).</li>
<li>Xiao, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancing+astrocytic+lysosome+biogenesis+facilitates+Abeta+clearance+and+attenuates+amyloid+plaque+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Enhancing astrocytic lysosome biogenesis facilitates Abeta clearance and attenuates amyloid plaque pathogenesis.</a> J Neurosci. 34 (29), 9607-9620 (2014).</li>
<li>Lu, T. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axon+degeneration+induces+glial+responses+through+Draper-TRAF4-JNK+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Axon degeneration induces glial responses through Draper-TRAF4-JNK signalling.</a> Nat Commun. 8, 14355(2017).</li>
<li>Dunkley, P. R., Jarvie, P. E., Robinson, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+Percoll+gradient+procedure+for+preparation+of+synaptosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">A rapid Percoll gradient procedure for preparation of synaptosomes.</a> Nat Protoc. 3 (11), 1718-1728 (2008).</li>
<li>Stigliani, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glia+re-sealed+particles+freshly+prepared+from+adult+rat+brain+are+competent+for+exocytotic+release+of+glutamate%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Glia re-sealed particles freshly prepared from adult rat brain are competent for exocytotic release of glutamate.</a> J Neurochem. 96 (3), 656-668 (2006).</li>
<li>Foo, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+method+for+the+purification+and+culture+of+rodent+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Development of a method for the purification and culture of rodent astrocytes.</a> Neuron. 71 (5), 799-811 (2011).</li>
<li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> J Vis Exp. (65), (2012).</li>
<li>Cahoy, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transcriptome+database+for+astrocytes%2C+neurons%2C+and+oligodendrocytes%3A+a+new+resource+for+understanding+brain+development+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A transcriptome database for astrocytes, neurons, and oligodendrocytes: a new resource for understanding brain development and function.</a> J Neurosci. 28 (1), 264-278 (2008).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W artykule przedstawiono metody długoterminowego badania fagocytozy in vitro metodą obrazowania in vitro z wykorzystaniem oczyszczonych komórek glejowych i synaptosomów sprzężonych ze wskaźnikiem pH. Pokazujemy, że w porównaniu z mikroglejem, astrocyty mają różną zdolność pochłaniania i degradacji podczas fagocytozy synaptosomów. Ponadto nasze dane sugerują, że czynniki wydzielane przez astrocyty, które zawierają cząsteczki pomostowe, takie jak GAS6, ProteinS i MEGE8, są niezbędne dla wydajnej fagocytozy zależne...

Komórki glejowe, które odnoszą się do niepobudliwych komórek w mózgu, są głównym typem komórek w ośrodkowym układzie nerwowym (OUN). Wcześniej komórki glejowe były uważane za zwykłe komórki podporowe, które odgrywają głównie pasywną rolę w utrzymaniu przetrwania neuronów i podstawowych właściwości synaptycznych. Jednak pojawiające się dowody ujawniły, że komórki glejowe odgrywają bardziej aktywną rolę w różnych aspektach neurobiologii, takich jak utrzymanie homeostazy mózgu, pośredniczenie w tworzeniu synaps1,2,3 i eliminacja synaps4,5 oraz modulowanie plastyczności synaptycznej6,7. Komórki glejowe w OUN obejmują astrocyty, mikroglej i oligodendrocyty. Wykazano, że wśród tych komórek astrocyty i mikroglej odgrywają role fagocytarne, pochłaniając synapsy4,5, komórki apoptotyczne8, neuromal debris9 oraz białka chorobotwórcze, takie jak blaszki beta amyloidu10,11. W rozwijającym się mózgu astrocyty eliminują synapsy w grzbietowym jądrze kolankowatym bocznym (dLGN) poprzez fagocytozę zależną od MERTK i MEGF104. Podobnie, mikroglej eliminuje również synapsy pokryte C1q na etapach rozwoju poprzez klasyczną kaskadę dopełniacza5. Co ciekawe, zasugerowano, że defekty w przycinaniu synaps mogą być jednym z inicjatorów kilku zaburzeń neurologicznych. Na przykład wykazano, że mutacje w składniku dopełniacza 4 (C4), które zwiększają przycinanie synaps za pośrednictwem dopełniacza przez mikroglej, są silnie związane z występowaniem schizofrenii u ludzi12. Niedawny artykuł wykazał również, że klasyczny szlak dopełniacza jest hiperaktywowany w początkowych stadiach choroby Alzheimera i indukuje wczesną utratę synaps w tej chorobie13.
W porównaniu z fagocytozą za pośrednictwem mikrogleju, mniej jasne jest, czy fagocytoza za pośrednictwem astrocytów przyczynia się do inicjacji i progresji różnych zaburzeń neurologicznych. Jednak niedawny artykuł sugeruje, że czynniki, które zmieniają tempo normalnego przycinania synaps przez astrocyty, mogą zakłócać homeostazę mózgu i przyczyniać się do podatności i patologii na AD14. Szybkość przycinania synaps przez astrocyty jest silnie kontrolowana przez izomery ApoE, przy czym allel ochronny dla AD (ApoE2) silnie zwiększa częstość, a allel ryzyka dla AD (ApoE4) znacznie obniża tempo. Co więcej, myszy transgeniczne wykazujące ekspresję ApoE4 zgromadziły znacznie więcej synaptycznego C1q niż myszy kontrolne lub ApoE214. Dane te sugerują, że upośledzona fagocytoza za pośrednictwem astrocytów we wczesnym mózgu AD może indukować akumulację starzejących się synaps pokrytych C1q / szczątków synaptycznych, które aktywują fagocytozę mikrogleju za pośrednictwem dopełniacza, prowadząc do degeneracji synaptycznej. Upośledzona zdolność fagocytarna astrocytów u nosicieli ApoE4 może również przyczyniać się do niekontrolowanej akumulacji blaszek beta amyloidu w mózgach dotkniętych chorobą Alzheimera.
Ponadto, wykazano, że komórki glejowe w mózgu starzejącego się Drosophila tracą swoją zdolność fagocytarną z powodu zmniejszonej translacji Drapera, homologu Megf10, którego astrocyty używają do fagocytozy synaps. Przywrócenie poziomów Drapera uratowało zdolność fagocytarną komórek glejowych, które skutecznie usuwały uszkodzone szczątki aksonów w starzejącym się mózgu w podobnym stopniu, jak w młodym mózgu, co wskazuje, że wywołane starzeniem się zmiany w zdolności fagocytarnej astrocytów mogą przyczyniać się do zakłócenia homeostazy mózgu15.
Na podstawie tych nowych odkryć, modulowanie zdolności fagocytarnej astrocytów może być atrakcyjną strategią terapeutyczną w celu zapobiegania i leczenia różnych zaburzeń neurologicznych. W związku z tym podjęto kilka prób zwiększenia zdolności fagocytarnej astrocytów, na przykład poprzez indukowanie zakwaszenia lizosomów kwaśnymi nanocząstkami16 i nadekspresyjnym czynnikiem transkrypcyjnym EB (TFEB), co może zwiększyć biogenezę lizosomów17. Pomimo tych prób nadal nie jest jasne, w jaki sposób astrocyty i komórki mikrogleju różnią się kinetyką fagocytarną i czy powinniśmy zwiększać, czy zmniejszać ich zdolności fagocytarne w różnych chorobach.
W tym artykule prezentujemy nowatorski test in vitro do wykrywania zdolności fagocytarnej astrocytów w czasie rzeczywistym. Dane wskazują na różną kinetykę pochłaniania i degradacji w astrocytach i mikrogleju. Pożywka kondycjonowana astrocytami (ACM), która zawiera czynniki wydzielane z astrocytów, jest niezbędna do efektywnej fagocytozy zarówno astrocytów, jak i mikrogleju. Co więcej, Megf10, receptor fagocytarny w astrocytach i homolog Ced-1 i Drapera, odgrywa kluczową rolę w fagocytozie, w której pośredniczy astrocyty8,18.

<table><tbody><tr><td>Oczyszczanie synaptosomów</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>GE healthcare nauki przyrodnicze</td><td>17-0891-01</td><td></td></tr><tr><td>Szybki start Zestaw do oznaczania białek Bradford 2</td><td>BIO-RAD</td><td>5000202</td><td></td></tr><tr><td>pH konjugacja wskaźnika</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>dimetylosulfotlenku (DMSO)</td> <td>LPS</td><td></td><td></td>DMSO100</tr><tr><td>pHrodo czerwony, sukcynimidylowy ester</td><td>Molecula sondy</td><td>P36600</td><td></td></tr><tr><td>Immunopanning</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10X Earle' s zrównoważony roztwór soli (EBSS)</td><td>Sigma</td><td>E7510</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej</td><td>Bovogen</td><td>BSA025</td><td></td></tr><tr><td>Deoksyrebonukleaza 1 (DNaza)</td><td>Worthington</td><td>Is002007</td><td></td></tr><tr><td>(DMEM)</td><td>Gibco</td><td>11960-044</td><td></td></tr><tr><td>(dPBS)</td><td>Welgene</td><td>LB001-02</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca płodu (FBS)</td><td>Gibco</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>Griffonia simplicifolia Lectin(BSL-1)</td><td>Vector Labs</td><td>L-1100</td><td></td></tr><tr><td>Kozia anty-mysia IgG+IgM(H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>115-005-044</td><td></td></tr><tr><td>Kozia anty-mysia IgM (&mu-łańcuch)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>115-005-020</td><td></td></tr><tr><td>Naskórkowy czynnik wzrostu wiążący heparynę</td><td>Sigma</td><td>E4643</td><td></td></tr><tr><td>Ludzkie przeciwciało HepaCAM</td><td>R& Systemy D</td><td>MAB4108</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało monoklonalne integryny beta 5 (KN52)</td><td>eBioscience</td><td>14-0497-82</td><td></td></tr><tr><td>L-cysteina</td><td>Sigma</td><td>C7880</td><td></td></tr><tr><td>L-glutaminian</td><td>Gibco</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>N-acetly-L-cyteina (NAC)</td><td>Sigma</td><td>A8199</td><td></td></tr><tr><td>Pożywka neuropodstawowa</td><td>Gibco</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>O4 hybridoma supernatant(mysz IgM)</td><td>Bansal et al.23</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Papain</td><td>Worthington</td><td>Is003126</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina/streptomycyna</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Pluristrainer 20 &mu; m</td><td>PluriSelect</td><td>43-50020-03</td><td></td></tr><tr><td>Poli-D-lizyna</td><td>Sigma</td><td>P6407</td><td></td></tr><tr><td>Progesteron</td><td>Sigma</td><td>P8783</td><td></td></tr><tr><td>Dichlorowodorek putrescyny</td><td>Sigma</td><td>P5780</td><td></td></tr><tr><td>Oczyszczony szczurzy anty-mysi CD45</td><td>BD Pharmingen</td><td>550539</td><td></td></tr><tr><td>Oczyszczony mysi anty-szczur CD45</td><td>BD Pharmingen</td><td>554875</td><td></td></tr><tr><td>Pirogronian sodu</td><td>Gibco</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>Selenin sodu</td><td>Sigma</td><td>S5261</td><td></td></tr><tr><td>Transferyna</td><td>Sigma</td><td>T1147</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna</td><td>Sigma</td><td>T9935</td><td></td></tr><tr><td>Inhibitor trypsyny</td><td>Worthington</td><td>LS003086</td><td></td></tr><tr><td>Ultra-przezroczysta rurka (rurka, cienkościenna, ultraprzezroczysta)</td><td>Beckman Coulter</td><td>344059</td><td></td></tr><tr><td>Collect IP-ACM</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Macrosep Advance Urządzenia odśrodkowe z membraną Omega (10k)</td><td>PALL</td><td>MAP010C37</td><td></td></tr><tr><td>Urządzenia odśrodkowe Macrosep Advance z membraną Omega (30k)</td>Test obrazowania na żywo <td>PALL</td><td>MAP030C37</td><td></td></tr><tr><td>Fagocytoza</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Juli stage</td><td>Wtyczki NanoEntek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Time Series Analyzer V3</td><td>https://imagej.nih.gov/ij/plugins/time-series.html</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

nowatorski test obrazowania na żywo in vitro fagocytozy za pośrednictwem astrocytów przy użyciu synaptosomów sprzężonych ze wskaźnikiem ph

A Novel In Vitro Live-imaging Assay of Astrocyte-mediated Phagocytosis Using pH Indicator-conjugated Synaptosomes

Astrocyty są głównym typem komórek w mózgu i bezpośrednio stykają się z synapsami i naczyniami krwionośnymi. Chociaż komórki mikrogleju są uważane za główne komórki odpornościowe i tylko fagocyty w mózgu, ostatnie badania wykazały, że astrocyty uczestniczą również w różnych procesach fagocytarnych, takich jak eliminacja synaps rozwojowych i usuwanie blaszek beta amyloidu w chorobie Alzheimera (AD). Pomimo tych odkryć, skuteczność pochłaniania astrocytów i degradacji ich celów jest niejasna w porównaniu z mikroglejem. Ten brak informacji wynika głównie z braku systemu testów, w którym kinetyka fagocytozy za pośrednictwem astrocytów i mikrogleju jest łatwo porównywalna. Aby osiągnąć ten cel, opracowaliśmy długoterminowy test fagocytozy in vitro do obrazowania in vitro, aby ocenić zdolność fagocytarną oczyszczonych astrocytów i mikrogleju. W tym teście wykrywanie pochłaniania i degradacji w czasie rzeczywistym jest możliwe przy użyciu synaptosomów sprzężonych ze wskaźnikiem pH, które emitują jaskrawoczerwoną fluorescencję w organellach kwaśnych, takich jak lizosomy. Nasz nowatorski test zapewnia proste i skuteczne wykrywanie fagocytozy za pomocą obrazowania na żywo. Ponadto ten test fagocytozy in vitro może być wykorzystany jako platforma przesiewowa do identyfikacji substancji chemicznych i związków, które mogą zwiększać lub hamować zdolność fagocytarną astrocytów. Ponieważ wykazano, że nieprawidłowe przycinanie synaps i akumulacja patogennych białek powodują zaburzenia psychiczne lub choroby neurodegeneracyjne, substancje chemiczne i związki, które modulują zdolność fagocytarną komórek glejowych, powinny być pomocne w leczeniu różnych zaburzeń neurologicznych.

W tym in vitro do testu fagocytozy z długotrwałym obrazowaniem na żywo wykorzystano synaptosomy z homogenatów mózgu dorosłych myszy, które oddzielono w roztworze gradientowym pomiędzy 23% a 10% roztworem gradientowym za pomocą ultrawirowania (Rycina 3). Po przygotowaniu synaptosomy eksponowały PS w swojej błonie zewnętrznej (Rycina 4), co sugeruje, że utraciły one swoją funkcję i mogą być rozpoznawane przez receptory PS ...

Ten protokół przedstawia test fagocytozy in vitro do pomiaru zdolności fagocytarnej astrocytów. Oczyszczone astrocyty i mikroglej szczurów są używane wraz z synaptosomami sprzężonymi ze wskaźnikiem pH. Metoda ta może wykrywać kinetykę pochłaniania i degradacji w czasie rzeczywistym oraz zapewnia odpowiednią platformę przesiewową do identyfikacji czynników modulujących fagocytozę astrocytów.

Nowatorski test obrazowania na żywo in vitro fagocytozy za pośrednictwem astrocytów przy użyciu synaptosomów sprzężonych ze wskaźnikiem pH

Astrocytes are the major cell type in the brain and directly contact synapses and blood vessels. Although microglial cells have been considered the major ...

Ogólnym celem tego eksperymentu jest wykrycie kinetyki pochłaniania i degradacji komórek glejowych w czasie rzeczywistym, takich jak astrocyty i mikroglej, poprzez obrazowanie in vitro na żywo fagocytozy synaptosomów sprzężonych ze wskaźnikiem pH. Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie neurobiologii, takie jak to, w jaki sposób fagocytoza komórek glejowych jest regulowana w zdrowych i chorych mózgach. Główną zaletą tej techniki jest to, że możemy skutecznie monitorować i analizować kinetykę fagocytarną komórek glejowych w czasie rzeczywistym poprzez obrazowanie na żywo komórek hodowanych in vitro.Metoda ta może być również stosowana do badań przesiewowych pod kątem czynników i związków, które regulują zdolność pochłaniania i degradacji komórek glejowych. Rozpocznij od odwirowania rozmrożonych próbek synaptosomów przez trzy do czterech minut w temperaturze 21 092 G i czterech stopniach Celsjusza. Po odessaniu supernatantów ponownie zawiesić granulki w 200 mikrolitrach 0,1 molowego węglanu sodu na probówkę, dodając dwa mikrolitry wskaźnika pH do każdej próbki po ich dokładnym wymieszaniu.Po delikatnym wirze chronić roztwory przed światłem za pomocą osłon z

a-novel-vitro-live-imaging-assay-astrocyte-mediated-phagocytosis

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Niniejszy protokół szczegółowo opisuje sposób ilościowego oznaczania liczby synaps zarówno w dysocjowanych kulturach neuronowych, jak i w przekrojach mózgu z wykorzystaniem immunocytochemii. Przy użyciu przeciwciał specyficznych dla poszczególnych przedziałów komórkowych znakujemy terminale presynaptyczne oraz miejsca specjalizacji postsynaptycznej. Synapsy definiujemy jako punkty kolokalizacji sygnałów generowanych przez te markery.

Ilościowe oznaczanie synaps: test oparty na immunocytochemii do ilościowego oznaczania liczby synaps

W tym filmie przeprowadzamy test fagocytozy mikrogleju na nerwiaka zarodkowego przy użyciu indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych. Test pomaga ocenić upośledzenie funkcji mikrogleju w chorobach neurodegeneracyjnych.

Test fagocytozy mikrogleju: test in vitro w celu ustalenia modelu fagocytozy mikrogleju dla komórek nerwiaka zarodkowego przy użyciu makrofagów iPSC

W tym filmie oceniamy zdolność fagocytarną oczyszczonych astrocytów in vitro za pomocą testu obrazowania na żywo. Test służy jako skuteczna platforma przesiewowa do identyfikacji związków chemicznych, które mogą zwiększać lub hamować zdolność fagocytarną astrocytów.

Test fagocytozy in vitro: metoda oparta na obrazowaniu na żywo do badania fagocytozy synaptosomy w czasie rzeczywistym za pośrednictwem astrocytów

Źródło: Funes, S., et. al., Ludzkie komórki podobne do mikrogleju: różnicowanie z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych i test fagocytozy żywych komórek in vitro przy użyciu ludzkich synaptosomów. J. Vis. Exp. (2022)Ten film przedstawia test do badania zdolności fagocytarnej komórek podobnych do mikrogleju przy użyciu wrażliwych na pH synaptosomów znakowanych barwnikiem fluorescencyjnym.

Test fagocytozy żywych komórek komórek podobnych do mikrogleju przy użyciu ludzkich synaptosomów

Tutaj opisujemy adaptację protokołów używanych do indukowania plastyczności homeostatycznej w neuronach do badania plastyczności receptorów sprzężonych z białkiem G astrocytów. Metoda ta, ostatnio wykorzystana do badania zmian w mGluR grupy astrocytarnej I u młodych myszy, może być stosowana do pomiaru skalowania różnych astrocytarnych GPCR w tkance dorosłych myszy in situ i in vivo oraz do lepszego zrozumienia wrażliwości receptorów astrocytarnych na zmiany aktywności neuronalnej.

Indukowanie plastyczności receptorów astrocytarnych poprzez manipulację szybkością odpalania neuronów

Mikroglej to komórki odpornościowe ośrodkowego układu nerwowego (OUN) o dużej zdolności do fagocytozy lub pochłaniania materiału w swoim środowisku zewnątrzkomórkowym. W tym miejscu opisano szeroko stosowany, wiarygodny i wysoce ilościowy test do wizualizacji i pomiaru pochłaniania składników synaptycznych za pośrednictwem mikrogleju.

Test pochłaniania: protokół oceny interakcji między fagocytami OUN a neuronami

Fagocytoza mikrogleju jest kluczowa dla utrzymania homeostazy tkanek, a nieodpowiednia funkcja fagocytarna została zamieszana w patologię. Jednak ocena funkcji mikrogleju in vivo jest technicznie trudna. Opracowaliśmy prostą, ale solidną technikę precyzyjnego monitorowania i ilościowego określania potencjału fagocytarnego mikrogleju w warunkach fizjologicznych.

Ocena funkcji fagocytarnej mikrogleju siatkówki in vivo przy użyciu testu opartego na cytometrii przepływowej

Tutaj opisujemy metodę obrazowania na żywo in vitro, która umożliwia wizualizację wewnątrzkomórkowego transportu organelli i transportu białek błony komórkowej w mysich astrocytach. W protokole tym przedstawiono również metodologię analizy obrazu w celu wyznaczenia tras transportu i kinetyki transportu ładunków.

Wizualizacja i analiza transportu wewnątrzkomórkowego organelli i innych ładunków w astrocytach

Choroby neurodegeneracyjne są związane z rozregulowanymi funkcjami mikrogleju. W artykule przedstawiono test in vitro fagocytozy komórek nerwiaka zarodkowego za pomocą makrofagów iPSC. Odczyty z mikroskopii ilościowej opisano zarówno dla obrazowania poklatkowego żywych komórek, jak i obrazowania o wysokiej zawartości komórek stałych.

Test obrazowania ilościowego in vitro na fagocytozę martwych komórek nerwiaka zarodkowego za pomocą makrofagów iPSC

Ten protokół opisuje proces różnicowania ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) w komórki podobne do mikrogleju do eksperymentów in vitro. Dołączamy również szczegółową procedurę generowania ludzkich synaptosomów z dolnych neuronów ruchowych pochodzących z iPSC, które można wykorzystać jako substrat do testów fagocytozy in vitro przy użyciu systemów obrazowania żywych komórek.

Ludzkie komórki podobne do mikrogleju: różnicowanie z indukowanymi pluripotencjalnymi komórkami macierzystymi i test fagocytozy żywych komórek in vitro przy użyciu ludzkich synaptosomów

Tutaj prezentujemy dwa protokoły do ilościowego oznaczania pochłaniania mikrogleju przez synapsy vGLUT1-dodatnie oraz surowych synaptosomów pHRodo znakowanych na czerwono za pomocą cytometrii przepływowej.

Kwantyfikacja pochłaniania mikrogleju przez materiał synaptyczny za pomocą cytometrii przepływowej

Poznaj metodę obrazowania na żywo fagocytozy przez astrocyty i mikroglej przy użyciu synaptosomów ze wskaźnikiem pH. Technika umożliwia analizę kinetyki fagocytozy w czasie rzeczywistym.

Nowatorski test obrazowania na żywo in vitro fagocytozy za pośrednictwem astrocytów przy użyciu synaptosomów sprzężonych ze wskaźnikiem pH (Wideo) | JoVE Journal

Nowatorski test obrazowania na żywo in vitro fagocytozy za pośrednictwem astrocytów przy użyciu synaptosomów sprzężonych ze wskaźnikiem pH

Przeglądaj więcej filmów