Name: In vivo (in vivo) Monitorowanie ekspresji genu zegara okołodobowego w jądrze nadskrzyżowaniowym myszy za pomocą reporterów fluorescencyjnych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-04T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 44 s
Description: Poznaj metodę fluorescencyjnego monitorowania ekspresji genu zegara okołodobowego w jądrze nadskrzyżowaniowym u myszy w czasie rzeczywistym. Technika umożliwia pomiary w warunkach światło-ciemność i ciemność-ciemność.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dziękujemy członkom laboratorium Zhang za prowadzenie stymulujących dyskusji, a członkom laboratorium Zhan za pomoc techniczną. Badania te były wspierane przez granty 31500860 (dla C.Z.) NSFC, 2012CB837700 (dla E.E.Z. i C.Z.) programu 973 z M.O.S.T. z Chin oraz przez finansowanie przez Samorząd Miejski Pekinu. E.E.Z. był wspierany przez chiński "Program Rekrutacyjny Globalnych Ekspertów ds. Młodzieży".

Wszystkie procedury w tym protokole zostały przeprowadzone za zgodą Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) Narodowego Instytutu Nauk Biologicznych w Pekinie, zgodnie z regulacjami rządowymi Chin.
1. Budowa Reportera Fluorescencji Cry1
Uwaga: Poprzednie badania okołodobowe z użyciem systemu bioluminescencji2,12,13 łączą promotor okołodobowy ze zdestabilizowaną lucyferazy (dLuc) w celu wywołania rytmicznej ekspresji dLuc. Aby rozwinąć reporter fluorescencji, zdestabilizowaną lucyferazy zastąpiono zdestabilizowanym białkiem fluorescencyjnym (dVenus) w celu wywołania rytmicznej ekspresji dVenus. Generacja reportera P(Cry1)-dVenus jest opisana poniżej, której konstrukcja jest obecnie przesyłana do Addgene i wkrótce będzie dostępna do użytku akademickiego.
<ol>
	<li>Amplifikacja funkcjonalnego mysiego promotora Cry1 (region genu Cry1 od +328 do -1208 pz, miejsce rozpoczęcia transkrypcji oznaczone jako ''-1''). Do amplifikacji fragmentu DNA promotora Cry1 należy użyć enzymu PCR (KOD Plus Neo), starterów F1 i R1 (patrz Tabela 2), genomu myszy jako matrycy oraz protokołu PCR producenta.</li>
	<li>Amplifikacja intronu 336 genu Cry1, który jest ważny dla funkcji zegara okołodobowego Cry114. Użyj enzymu PCR, starterów F2 i R2, genomu myszy jako matrycy i protokołu PCR producenta do amplifikacji fragmentu DNA intronu 336.</li>
	<li>Wzmocnij Wenus. Użyj enzymu PCR, starterów F3 i R3, plazmidu pVENUS-N1 jako matrycy oraz protokołu PCR producenta do amplifikacji fragmentu DNA Wenus.</li>
	<li>Amplifikacja fragmentu DNA NLS-D2. Użyj enzymu PCR, starterów F4 i R4, plazmidu pcDNA3.3-d2eGFP jako matrycy oraz protokołu PCR producenta do amplifikacji fragmentu DNA NLS-D2.</li>
	<li>Zsyntetyzuj fragment DNA 1 jako ekson 1.</li>
	<li>Zsyntetyzuj fragment DNA 2 jako łącznik między intronem 336 a fragmentem DNA Wenus.</li>
	<li>Przeciąć plazmid wektorowy pAAV-EF1a-podwójnie floksowany-hChR2(H134R)-mCherry-WPRE-HGHpA za pomocą enzymów MluI i EcoRI. Użyj zestawu do ekstrakcji żelu, aby oczyścić większy fragment DNA. Korzystaj z protokołu producenta.</li>
	<li>Korzystając z mieszanki montażowej Gibsona i jej standardowego protokołu, złóż wszystkie fragmenty DNA razem, aby wytworzyć reporter pAAV-P(Cry1)-intron336-Venus-NLS-D2-WPRE-HGHpA. Korzystaj z protokołu producenta.</li>
</ol>
2. Produkcja wirusa związanego z adenowirusem15
<ol>
	<li>Przygotuj następujące zapasy plazmidowego DNA: 31,25 μg pRV1, 31,25 μg pH21, 125 μg pFdelta6 i 62,5 μg pAAV-P(Cry1)-intron336-Venus-NLS-D2-WPRE-HGHpA.</li>
	<li>Przygotuj pięć 15 cm szalek z komórkami 293T i poczekaj, aż komórki staną się zlewające się w 90%.</li>
	<li>Transfekcja plazmidów do komórek 297T zgodnie z protokołem odczynnika do transfekcji. Do każdej potrawy użyj 6,25 μg pRV1, 6,25 μg pH21, 25 μg pFfdelta6, 12,5 μg pAAV-P(Cry1)-intron336-Venus-NLS-D2-WPRE-HGHpA i 120 μl odczynnika do transfekcji.</li>
	<li>72 godziny po transfekcji odłączyć komórki od każdej płytki za pomocą pistoletu do pipetowania; zebrać komórki do dwóch probówek o pojemności 50 ml.</li>
	<li>Osadzać komórki w masie 800 x g przez 10 minut i wyrzucić supernatant. Przemyć komórki, umieszczając 20 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) w każdej probówce; Osadzać komórki w masie 800 x g przez 10 minut i odrzucić supernatant.</li>
	<li>Zawiesić osady w 150 mM NaCl i 20 mM roztworze Tris o pH 8,0; użyć 25 ml roztworu/probówki. Dodać 1,25 ml świeżo przygotowanego 10% deoksycholanu sodu (wdH2O) do każdej probówki. Dodaj nukleazę benzonazy do końcowego stężenia 50 jednostek na ml i dokładnie wymieszaj. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę.</li>
	<li>Usuń resztki komórkowe, odwirowując przy 3000 x g przez 15 minut. Ponadto upewnij się, że wszystkie zanieczyszczenia zostały usunięte, przepychając mieszaninę przez filtr strzykawkowy 0,45 μm; Ten krok pomoże zapobiec blokowaniu kolumn heparyny.</li>
	<li>Ustawić kolumny z heparyną za pomocą pompy perystaltycznej; ustawić natężenie przepływu na 1 ml/min, upewniając się, że do kolumn nie są wprowadzane pęcherzyki powietrza.</li>
	<li>Zrównoważyć kolumny 10 ml 150 mM NaCl, 20 mM roztworu Tris o pH 8,0. Dodaj roztwór zawierający wirusa do każdej kolumny. Przemyć kolumny 20 ml 100 mM NaCl, 20 mM roztworu Tris o pH 8,0. Następnie, za pomocą strzykawki o pojemności 5 ml, przemyć kolumny 1 ml 200 mM roztworu NaCl i 20 mM Tris o pH 8,0, a następnie 1 ml 300 mM roztworu NaCl i 20 mM Tris o pH 8,0.</li>
	<li>Użyj strzykawki o pojemności 5 ml, aby wymyć wirusa za pomocą 3 ml 400 mM roztworu NaCl, 20 mM Tris, pH 8,0, następnie 4 ml 450 mM NaCl, 20 mM roztworu Tris, pH 8,0, a na koniec 3 ml 500 mM NaCl, 20 mM roztworu Tris, pH 8,0. Zbierz wydobyte materiały.</li>
	<li>Aby uzyskać stężenie rekombinowanego wirusa związanego z adenowirusem (rAAV), należy załadować wyekstrahowane materiały, po 4 ml na raz, do odśrodkowych jednostek filtrujących z granicą masy cząsteczkowej 100 000 mas cząsteczkowych. Odwirować każdą próbkę o objętości 4 ml o masie 2000 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej, odrzucając przepływ.</li>
	<li>Gdy wszystkie wyekstrahowane materiały zostaną przepuszczone przez odśrodkowe jednostki filtracyjne, dodać 4 ml PBS i odwirować mieszaninę do około 250 μl. Usunąć rAAV (miano wirusa powinno wynosić około 2 - 8 x 1012 cząstek wirusa na ml) z odśrodkowych jednostek filtrujących, podwielokrotność i przechowywać w temperaturze -80 °C do momentu użycia. Na tym etapie wirus może być przechowywany przez kilka miesięcy.</li>
</ol>
3. Wstrzyknięcie rAAV i wstawienie światłowodu do SCN dorosłej myszy
<ol>
	<li>Wstrzyknięcie okołodobowych fluorescencyjnych reporterowych rAAV do SCN
	<ol>
		<li>Załadować 5 μl rAAV (miano wirusa wynosi około 2 - 8 x 1012 cząstek wirusa na ml) do mikrostrzykawki.</li>
		<li>Znieczulić dorosłą mysz (w wieku od 2 do 5 miesięcy, tło C57BL/6) Nembutalem (80 mg/kg) we wstrzyknięciu dootrzewnowym. Sprawdź, czy znieczulenie jest wystarczająco głębokie przy braku reakcji na uszczypnięcie palca u nogi.</li>
		<li>Użyj nożyczek, aby usunąć sierść z głowy myszy, a następnie zamontuj mysz w aparacie stereotaktycznym. Zapewnij źródło ciepła znieczulonym zwierzętom za pomocą cyrkulacyjnego koca z gorącą wodą lub innego urządzenia grzewczego. 
		UWAGA: Alternatywnie użyj kremu do depilacji lub elektrycznych maszynek do strzyżenia włosów, aby usunąć sierść.</li>
		<li>Oczyść miejsce operacyjne odpowiednimi środkami dezynfekującymi. Na przykład może to obejmować sterylną wodę lub alkohol i jod, betadynę lub rozcieńczoną chlorheksydynę w naprzemiennych peelingach. Powtórz co najmniej 3 razy. Ułóż miejsce operacji.</li>
		<li> Użyj nożyczek, aby wykonać nacięcie w skórze głowy i odsłonić czaszkę.</li>
		<li>Ustaw aparat stereotaktyczny tak, aby bregma i lambda znajdowały się w tej samej płaszczyźnie poziomej; utwórz dwa symetryczne punkty bregmy w tej samej płaszczyźnie poziomej.</li>
		<li>Użyj sterylnego bawełnianego wacika nasączonego 4%H2O2/H2O, aby skorodować okostną mózgu. Następnie użyj czystego, sterylnego bawełnianego wacika, aby oczyścić i osuszyć powierzchnię czaszki.</li>
		<li>Za pomocą mikrowiertła wykonaj otwór o średnicy około 1 mm, 0,46 mm z tyłu i 0,25 mm z boku do bregmy.</li>
		<li>fiUżyj czystego, bawełnianego, sterylnego wacika z roztworem soli fizjologicznej, aby usunąć fragmenty kości z odsłoniętej powierzchni mózgu.</li>
		<li>Wprowadzić mikrostrzykawkę do mózgu, upewniając się, że końcówka mikrostrzykawki znajduje się 0,46 mm z tyłu i 0,25 mm z boku do bregmy oraz na głębokość 5,7 mm od powierzchni czaszki.</li>
		<li>Wstrzyknąć 500 nL rAAV (50 nL min-1) do SCN, pozostawiając mikrostrzykawkę na miejscu na 10 minut po wstrzyknięciu, aby zapewnić całkowitą dyfuzję rAAV.</li>
		<li>Powoli wyjąć mikrostrzykawkę.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Włóż światłowód do obszaru SCN.
	<ol>
		<li>Za pomocą noża do światłowodów przytnij włókno o długości 17 mm, upewniając się, że każda strona światłowodu jest gładka.</li>
		<li>Włóż światłowód do tulejki ceramicznej i przymocuj światłowód do ceramicznej tulejki za pomocą nadtlenku ketonu metylowo-etylowego (klej AB), upewniając się, że powierzchnie światłowodu i tulejki ceramicznej są wyrównane.</li>
		<li>Oczyść włókno zimnym roztworem sterylizującym lub tlenkiem etylenu.</li>
		<li>Po wstrzyknięciu rAAV (krok 3.1.11) włóż ceramiczny światłowód zawierający tulejkę do SCN.</li>
		<li>Przymocuj ceramiczną skuwkę i światłowód do czaszki za pomocą żywicy dentystycznej i pozostaw do wyschnięcia.</li>
		<li>Posmaruj powierzchnię żywicy dentystycznej tylnym lakierem do paznokci. Powtórzyć procedury opisane w ppkt 3.1.2 do 3.2.5, pomijając faktyczne wstrzyknięcie rAAV w celu kontroli.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Opieka pooperacyjna
	<ol>
		<li>Podawaj myszom pooperacyjne leki przeciwbólowe, takie jak buprenorfina 2 mg/kg masy ciała, podskórnie, dwa razy dziennie.</li>
		<li>Umieść myszy w klatce regeneracyjnej, gdy wyjdą z narkozy.</li>
		<li>Myszy domowe pojedynczo w 12 godzinach światła/ciemności (natężenie światła ~100 luksów na dnie klatki) z jedzeniem/wodą dostępną ad libitum. Przed dalszymi eksperymentami należy przeznaczyć osiem dni, aby zapewnić wystarczający czas na regenerację i zapewnić optymalną ekspresję reportera fluorescencji.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Monitorowanie i gromadzenie danych fluorescencyjnych in vivo
<ol>
	<li>Osiem dni po zabiegu połącz światłowód na głowie myszy z monitorem sygnału fluorescencji (np. Gene Observer). Sprawdź sygnał fluorescencyjny w SCN myszy kontrolnych, aby ustalić sygnał tła. Przeprowadzić obserwację i pomiar tego sygnału za pomocą monitora sygnału fluorescencyjnego.</li>
	<li>Oceń sygnał fluorescencyjny myszy eksperymentalnej przy tej samej operacji myszy kontrolnej. Wyklucz myszy, które otrzymały wektor wirusowy, ale wyświetlają tylko sygnał tła z analizy, ponieważ prawdopodobnie oznacza to, że końcówka światłowodu przegapiła SCN. Po tych wstępnych środkach należy umieścić myszy w klatkach domowych na kolejne 3 tygodnie, aby sygnał fluorescencyjny mógł się ustabilizować.</li>
	<li>Po 3 tygodniach połącz myszy z monitorem sygnału fluorescencji. Mierzyć fluorescencję przez 15 s co 10 minut, z częstotliwością 100 Hz. Podczas tych pomiarów myszy swobodnie poruszają się w swoich klatkach z jedzeniem/wodą dostępną ad libitum. Użyj natężenia światła na dnie klatki ~100 luksów, a mocy lasera na końcówce światłowodu między 15 - 20 μW.</li>
	<li>Po zakończeniu wszystkich nagrań, przetapiaj myszy 4% paraformaldehydem, a następnie usuń i pokrój mózgi, aby sprawdzić położenie światłowodu. Wyklucz myszy z analizy, jeśli końcówka światłowodu nie jest prawidłowo wszczepiona do SCN.</li>
</ol>
5. Analiza i prezentacja danych
<ol>
	<li>Mierz sygnał fluorescencji co 10 minut przez 15 s, z częstotliwością 100 Hz, aby uzyskać 1500 punktów danych. Średnia z tych 1500 punktów przekłada się na sygnał fluorescencyjny w dowolnym punkcie czasowym. Wykreślenie wielu średnich w czasie tworzy krzywą sygnału do czasu, która odpowiada rytmowi transkrypcji Cry1 w kontrolnych warunkach oświetleniowych w SCN swobodnie poruszających się myszy.</li>
</ol>

<ol><li>Welsh, D. K., Takahashi, J. S., Kay, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suprachiasmatic+nucleus%3A+cell+autonomy+and+network+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Suprachiasmatic nucleus: cell autonomy and network properties.</a> Annual Review of Physiology. 72, 551-577 (2010).</li>
<li>Zhang, E. E., Kay, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clocks+not+winding+down%3A+unravelling+circadian+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Clocks not winding down: unravelling circadian networks.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11, 764-776 (2010).</li>
<li>Takahashi, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+architecture+of+the+mammalian+circadian+clock%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Transcriptional architecture of the mammalian circadian clock.</a> Nature Reviews Genetics. 18, 164-179 (2017).</li>
<li>Yoo, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PERIOD2%3A%3ALUCIFERASE+real-time+reporting+of+circadian+dynamics+reveals+persistent+circadian+oscillations+in+mouse+peripheral+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U+S+A%22%5BJournal%5D)">PERIOD2::LUCIFERASE real-time reporting of circadian dynamics reveals persistent circadian oscillations in mouse peripheral tissues.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 101, 5339-5346 (2004).</li>
<li>Davidson, A. J., Castanon-Cervantes, O., Leise, T. L., Molyneux, P. C., Harrington, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+jet+lag+in+the+mouse+suprachiasmatic+nucleus+and+peripheral+circadian+timing+system%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Visualizing jet lag in the mouse suprachiasmatic nucleus and peripheral circadian timing system.</a> European Journal of Neuroscience. 29, 171-180 (2009).</li>
<li>Savelyev, S. A., Larsson, K. C., Johansson, A. S., Lundkvist, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Slice+preparation%2C+organotypic+tissue+culturing+and+luciferase+recording+of+clock+gene+activity+in+the+suprachiasmatic+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Slice preparation, organotypic tissue culturing and luciferase recording of clock gene activity in the suprachiasmatic nucleus.</a> Journal of Visualized Experiments. (48), (2011).</li>
<li>Yamaguchi, S., et al. <a target="_blank" href="https://www.nature.com/articles/35055628">Gene expression: View of a mouse clock gene ticking.</a> Nature. 409, 684-684 (2001).</li>
<li>Ono, D., Honma, K. I., Honma, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circadian+and+ultradian+rhythms+of+clock+gene+expression+in+the+suprachiasmatic+nucleus+of+freely+moving+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Reports%22%5BJournal%5D)">Circadian and ultradian rhythms of clock gene expression in the suprachiasmatic nucleus of freely moving mice.</a> Science Reports. 5, 12310(2015).</li>
<li>Ono, D., Honma, S., Honma, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circadian+PER2%3A%3ALUC+rhythms+in+the+olfactory+bulb+of+freely+moving+mice+depend+on+the+suprachiasmatic+nucleus+but+not+on+behaviour+rhythms%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Circadian PER2::LUC rhythms in the olfactory bulb of freely moving mice depend on the suprachiasmatic nucleus but not on behaviour rhythms.</a> European Journal of Neuroscience. 42, 3128-3137 (2015).</li>
<li>Ono, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissociation+of+Per1+and+Bmal1+circadian+rhythms+in+the+suprachiasmatic+nucleus+in+parallel+with+behavioral+outputs%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Dissociation of Per1 and Bmal1 circadian rhythms in the suprachiasmatic nucleus in parallel with behavioral outputs.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 114, E3699-E3708 (2017).</li>
<li>Reppert, S. M., Weaver, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordination+of+circadian+timing+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Coordination of circadian timing in mammals.</a> Nature. 418, 935-941 (2002).</li>
<li>Liu, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redundant+function+of+REV-ERBalpha+and+beta+and+non-essential+role+for+Bmal1+cycling+in+transcriptional+regulation+of+intracellular+circadian+rhythms%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Redundant function of REV-ERBalpha and beta and non-essential role for Bmal1 cycling in transcriptional regulation of intracellular circadian rhythms.</a> PLoS Genetics. 4, e1000023(2008).</li>
<li>Maywood, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+core+circadian+feedback+loop+in+suprachiasmatic+nucleus+of+mCry1-luc+transgenic+reporter+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Analysis of core circadian feedback loop in suprachiasmatic nucleus of mCry1-luc transgenic reporter mouse.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 110, 9547-9552 (2013).</li>
<li>Ukai-Tadenuma, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delay+in+feedback+repression+by+cryptochrome+1+is+required+for+circadian+clock+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Delay in feedback repression by cryptochrome 1 is required for circadian clock function.</a> Cell. 144, 268-281 (2011).</li>
<li>McClure, C., Cole, K. L., Wulff, P., Klugmann, M., Murray, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+and+titering+of+recombinant+adeno-associated+viral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Production and titering of recombinant adeno-associated viral vectors.</a> Journal of Visualized Experiments. 57, e3348(2011).</li>
<li>Yamaguchi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mice+genetically+deficient+in+vasopressin+V1a+and+V1b+receptors+are+resistant+to+jet+lag%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Mice genetically deficient in vasopressin V1a and V1b receptors are resistant to jet lag.</a> Science. 342, 85-90 (2013).</li>
<li>Nagano, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+abrupt+shift+in+the+day%2Fnight+cycle+causes+desynchrony+in+the+mammalian+circadian+center%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">An abrupt shift in the day/night cycle causes desynchrony in the mammalian circadian center.</a> Journal of Neuroscience. 23, 6141-6151 (2003).</li>
<li>Golombek, D. A., Rosenstein, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiology+of+Circadian+Entrainment%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Physiology of Circadian Entrainment.</a> Physiological Reviews. 90, 1063-1102 (2010).</li>
<li>Mei, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+in+vivo+recording+of+circadian+rhythms+in+brains+of+freely+moving+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Long-term in vivo recording of circadian rhythms in brains of freely moving mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 115, 4276-4281 (2018).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

W przeciwieństwie do metod ex vivo, takich jak hodowla plastrów 4,5, RT-PCR16 i hybrydyzacja in situ 17, które wymagają zabicia zwierząt, metoda rejestracji in vivo pozwala badaczom badać okołodobową ekspresję genów u żywego zwierzęcia. W związku z tym technologia ta zapewnia możliwość oceny wpływu różnych zaburzeń fizycznych (np. braku snu, stresu, spożycia pokarmu itp.)...

U ssaków jądro nadskrzyżowaniowe (SCN) zarządza rytmem dobowym całego ciała, koordynując reakcję jednostki na egzogenne zmiany środowiskowe (np. światło, temperaturę, stres, itp.)1. Składniki zegara rdzeniowego składają się z Per1-3, Cry1-2, Clock i Bmal1 i odgrywają kluczową rolę w regulacji zegara okołodobowego każdej komórki. Każda komórka w SCN zawiera aktywator transkrypcji, CLOCK/BMAL1, który działa jak heterodimer indukujący ekspresję PER i CRY. Kompleks PER/CRY następnie hamuje funkcję CLOCK/BMAL1, tworząc pętlę sprzężenia zwrotnego transkrypcji-translacji, która trwa około 24 godzin2,3.
Poprzednie badania nad SCN głównie wykorzystywały metodę hodowli warstwowej SCN ex vivo4,5,6 i, chociaż to podejście dostarczyło cennych informacji, jego ograniczenia ograniczyły naszą zdolność do uzyskania danych dotyczących wpływu innych jąder mózgu na SCN, jak również wpływu bodźców egzogennych (np., światła) na komórkach znajdujących się w tym krytycznym regionie. W 2001 roku grupa Hitoshi Okamury była pierwszą, która użyła systemu bioluminescencji do monitorowania in vivo ekspresji genów zegara okołodobowego w SCN u swobodnie poruszających się myszy7. Grupa Kena-ichi Honmy spędziła ostatnie kilka lat na dalszym rozwijaniu systemu rejestracji bioluminescencji in vivo w SCN8,9,10. Łącznie badania te dały naukowcom możliwość monitorowania zegara okołodobowego w ciągłej ciemności lub po impulsie świetlnym. Ponieważ jednak bioluminescencja jest zbyt słaba, aby umożliwić ciągłe monitorowanie podczas cyklu światło/ciemność, w połączeniu z faktem, że światło jest dominującym sygnałem wymaganym do porywania zegarów okołodobowych za pośrednictwem SCN11, rośnie zapotrzebowanie na rozwój metod eksperymentalnych, które przezwyciężą ograniczenia związane z rejestracją bioluminescencji. Niniejszy raport opisuje system oparty na fluorescencji, który został skonstruowany w celu monitorowania zegara okołodobowego SCN in vivo u swobodnie poruszających się myszy. Ta łatwa w użyciu metoda pozwala na ciągłe monitorowanie podczas cyklu światło/ciemność i pozwala na długoterminową obserwację transkrypcji genów zegara okołodobowego w SCN w czasie rzeczywistym i w wysokiej rozdzielczości czasowej.

<table><tbody><tr><td>KOD Plus</td><td>Neo TOYOBO</td><td>KOD-401</td><td>Odczynnik</td></tr><tr><td>pVENUS-N1</td><td>addgene</td><td>#61854</td><td>Plasmid</td></tr><tr><td></td><td>pcDNA3.3_d2eGFP addgene</td><td>#26821</td><td>Plasmid</td></tr><tr><td>pAAV-EF1a-double floxed-hChR2(H134R)-mCherry-WPRE-HGHpA</td><td>addgene</td><td>#20297</td><td>Plasmid</td></tr><tr><td>MluI</td><td>Thermo Scientific</td><td>FD0564</td><td>Odczynnik</td></tr><tr><td>EcoRI</td><td>Thermo Scientific</td><td>FD0274</td><td>Odczynnik</td></tr><tr><td>Gibson Assembly Mix</td><td>NEB</td><td>E2611s</td><td>Odczynnik</td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Thermo Scientific</td><td>12566014</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik Filtr strzykawkowy</td><td>EMD Millipore</td><td>SLHV033RS</td><td>0,45&nbsp; &mikro; m&nbsp;</td></tr><tr><td>Kolumny heparyny HiTrap</td><td>gelifesciences</td><td>17-0406-01</td><td>1 ml&nbsp;</td></tr><tr><td>Filtr odśrodkowy Amicon ultra-4</td><td>EMD Millipore</td><td>&nbsp; UFC810024</td><td>100 000 MWCO</td></tr><tr><td>Nukleaza benzonazowa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1014</td><td>Odczynnik</td></tr><tr><td>Deoksycholan sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5670</td><td>Przygotuj świeży roztwór dla każdej partii</td></tr><tr><td>myszy aparat stereotaktyczny</td><td>B& E TEKSYSTEMS LTD</td><td>#SR-5M/6M</td><td>Sprzęt</td></tr><tr><td>pentobarbital</td><td>SigmaAldrich</td><td>#1507002</td><td>Odczynnik</td></tr><tr><td>mysz stereotaktyczny</td><td>B& E TEKSYSTEMS LTD</td><td>#SR-5M/6M</td><td>Sprzęt</td></tr><tr><td>Roztwór nadtlenku wodoru</td><td>SigmaAldrich</td><td>#216763</td><td>Odczynnik</td></tr><tr><td>Światłowód</td><td>Thorlabs</td><td>FT200EMT</td><td>0,39 NA, &Oslash; 200 i mikro; m</td></tr><tr><td>pompa mikrostrzykawkowa</td><td></td><td>Wtryskiwacz Nanolitr 2000, okucie ceramiczne WPI</td><td></td> Equipment</tr><tr><td></td><td>Shanghai Fiblaser</td><td></td><td>230 i thinsp; &mu; m I.D., 2,5 mm OD</td></tr><tr><td>Obserwator genów</td><td>BiolinkOptics</td><td></td><td>Sprzęt</td></tr></tbody></table>

in vivo (in vivo) monitorowanie ekspresji genu zegara okołodobowego w jądrze nadskrzyżowaniowym myszy za pomocą reporterów fluorescencyjnych

In Vivo Monitoring of Circadian Clock Gene Expression in the Mouse Suprachiasmatic Nucleus Using Fluorescence Reporters

Ta technika łączy zapisy fluorescencji za pośrednictwem światłowodu z precyzyjnym dostarczaniem rekombinowanych reporterów genów opartych na adenowirusie. Ten nowy i łatwy w użyciu system monitorowania fluorescencji in vivo został opracowany w celu rejestrowania rytmu transkrypcyjnego genu zegarowego, Cry1, w jądrze nadskrzyżowaniowym (SCN) swobodnie poruszających się myszy. W tym celu zaprojektowano reporter fluorescencji transkrypcyjnej Cry1 i umieszczono go w wirusie związanym z adenowirusem. Oczyszczony, skoncentrowany wirus wstrzyknięto do mysiego SCN, a następnie wprowadzono światłowód, który następnie przymocowano do powierzchni mózgu. Zwierzęta zostały zwrócone do swoich domowych klatek i pozostawiono im 1-miesięczny okres rekonwalescencji po operacji, aby zapewnić wystarczającą ekspresję reportera. Fluorescencja została następnie zarejestrowana u swobodnie poruszających się myszy za pomocą systemu monitorowania in vivo, który został skonstruowany w naszej placówce. W przypadku systemu rejestracji in vivo laser o długości fali 488 nm został sprzężony z rozdzielaczem wiązki 1 × 4, który dzielił światło na cztery wyjścia wzbudzenia laserowego o równej mocy. Ta konfiguracja umożliwiła nam nagrywanie z czterech zwierząt jednocześnie. Każdy z wyemitowanych sygnałów fluorescencyjnych został zebrany za pomocą fotopowielacza i karty akwizycji danych. W przeciwieństwie do poprzedniej techniki rejestracji zegara okołodobowego in vivo, ten fluorescencyjny system zapisu in vivo pozwolił na rejestrację ekspresji genów zegara okołodobowego podczas cyklu światła.

Projekt fluorescencyjnego raportera Cry1 przedstawiono na Ryc. 1A. Stosując opisaną powyżej metodę, do jądra nadskrzyżowaniowego (SCN) dorosłej myszy pomyślnie wstrzyknięto 50 nL rAAV-P(Cry1)-intron36-Venus-NLS-D2, co zaowocowało silną ekspresją Venus (Ryc. 1B, 1C). Sygnały fluorescencji zarejestrowane w warunkach 12h/12h światło/ciemność (LD) oraz ciemność/ciemność (DD) (Ry...

Ta nowo opracowana technologia oparta na fluorescencji umożliwia długoterminowe monitorowanie transkrypcji genów zegara okołodobowego w jądrze nadskrzyżowaniowym (SCN) swobodnie poruszających się myszy w czasie rzeczywistym i w wysokiej rozdzielczości czasowej.

In vivo (in vivo) Monitorowanie ekspresji genu zegara okołodobowego w jądrze nadskrzyżowaniowym myszy za pomocą reporterów fluorescencyjnych

This technique combines optical fiber mediated fluorescence recordings with the precise delivery of recombinant adeno-associated virus based gene ...

Metoda ta umożliwia monitorowanie ekspresji genów zegara okołodobowego w czasie rzeczywistym w wysokiej rozdzielczości czasowej u swobodnie poruszających się myszy. Główną zaletą tej techniki jest to, że działa ona zarówno w warunkach jasnych, ciemnych, jak i ciemnych, co jest niezwykle ważne dla badań zegara okołodobowego. Za pomocą noża do światłowodów wytnij włókno o długości 17 milimetrów.Upewnij się, że każda strona światłowodu jest gładka. Włóż światłowód do ceramicznej tulejki i przymocuj światłowód do ceramicznej tulei z nadtlenkiem ketonu metylowo-etylowego. Upewnij się, że powierzchnie światłowodu i tulejki ceramicznej są zlicowane.Oczyść światłowód bawełnianym wacikiem nasączonym 75% etnolem. I utrzymuj go w czystości, aż będzie gotowy do włożenia. Procedurę wstrzykiwania należy rozpocząć od uprzedniego załadowania pięciu mikrolitrów rekombinowanego AAV do mikrostrzykawki.Następnie, po znieczuleniu dorosłej myszy przy użyciu instytucjonalnie zatwierdzonego protokołu, sprawdź, czy znieczulenie jest wystarczające przez brak reakcji na uszczypnięcie palca u nogi. Następnie użyj nożyczek, aby usunąć sierść z głowy myszy. A następnie zamontuj głowę myszy w aparacie stereotakt

in-vivo-monitoring-circadian-clock-gene-expression-mouse

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Opisano procedurę przygotowania skrawków zawierających jądro nadskrzyżowaniowe (SCN) podwzgórza dorosłej myszy oraz szybką metodę hodowli tkanki SCN w warunkach hodowli organotypowej. Ponadto opisano pomiar oscylacyjnej ekspresji białek genów zegarowych z wykorzystaniem dynamicznej technologii reporterowej lucyferazy.

Przygotowanie skrawków, organotypowe hodowanie tkanek i rejestracja aktywności genów zegarowych za pomocą lucyferazy w jądrze nadskrzyżowaniowym

Zegary okołodobowe funkcjonują w obrębie poszczególnych komórek, tzn. są autonomiczne komórkowo. W niniejszej pracy opisujemy metody tworzenia autonomicznych komórkowo modeli zegara z wykorzystaniem nieinwazyjnej technologii bioluminescencji w czasie rzeczywistym opartej na lucyferazie. Komórki reporterowe stanowią praktyczne, funkcjonalne systemy modelowe do badania biologii okołodobowej.

Monitorowanie komórkowych autonomicznych rytmów okołodobowych ekspresji genów z wykorzystaniem reporterów bioluminescencyjnych lucyferazy

Zegar okołodobowy reguluje około jednej trzeciej transkryptomu Arabidopsis, ale procent genów, które wracają do pomiaru czasu, pozostaje nieznany. Tutaj wizualizujemy metodę szybkiej oceny fenotypów okołodobowych w dowolnej zmutowanej linii Arabidopsis przy użyciu obrazowania luminescencyjnego reportera okołodobowego przejściowo ulegającego ekspresji w protoplastach.

Szybka analiza fenotypów okołodobowych w protoplastach Arabidopsis transfekowanych zegarem luminescencyjnym

Tutaj opisujemy ustawienia do równoległego monitorowania bioluminescencji okołodobowej i aktywności wydzielniczej ludzkich komórek wysp trzustkowych i pierwotnych miotub. W tym celu zastosowaliśmy dostarczanie genu lentiwirusowego za pomocą reportera zegara rdzeniowego lucyferazy, a następnie synchronizację in vitro i zbieranie pożywki odpływowej przez ciągłą peryfuzję komórek.

Równoległy pomiar ekspresji genów zegara okołodobowego i wydzielania hormonów w pierwotnych hodowlach komórkowych człowieka

Przedstawiono test bioluminescencji in vitro w celu określenia komórkowego rytmu dobowego w komórkach nabłonka sutka. Metoda ta wykorzystuje plazmidy reporterowe komórek ssaków eksprymujące zdestabilizowaną lucyferazy pod kontrolą promotora genu PERIOD 2. Można go dostosować do innych typów komórek w celu oceny specyficznego dla narządu wpływu na rytm okołodobowy.

In vitro Test bioluminescencji w celu scharakteryzowania rytmu okołodobowego w komórkach nabłonka sutka

Genetycznie kodowana lucyferazy jest popularnym nieinwazyjnym raportem ekspresji genów. Zastosowanie zautomatyzowanego rejestratora ALLIGATOR do obrazowania podłużnego lucyferazy pod kątem gazu i temperatury umożliwia rejestrację podłużną komórek bioluminescencyjnych w szerokim zakresie warunków. Tutaj pokazujemy, w jaki sposób ALLIGATOR może być stosowany w kontekście badań nad rytmami okołodobowymi.

Elastyczny pomiar reporterów bioluminescencyjnych za pomocą zautomatyzowanego podłużnego obrazowania lucyferazy zoptymalizowanego pod kątem gazu i temperatury rejestratora (ALLIGATOR)

Celem tego protokołu jest stworzenie ex vivo hodowli mózgu larw Drosophila zoptymalizowanej do monitorowania okołodobowych rytmów molekularnych za pomocą długoterminowego fluorescencyjnego obrazowania poklatkowego. Omówiono również zastosowanie tej metody do testów farmakologicznych.

Obrazowanie na żywo fluorescencji w rozdzielczości pojedynczej komórki zegarów okołodobowych Drosophila w hodowli mózgu larw

Neuronalne komórki macierzyste/progenitorowe wykazują różną dynamikę ekspresji komponentów sygnalizacyjnych Notch, które prowadzą do różnych wyników zdarzeń komórkowych. Taką dynamiczną ekspresję można ujawnić poprzez monitorowanie w czasie rzeczywistym, a nie przez analizę statyczną, przy użyciu bardzo czułego systemu obrazowania bioluminescencyjnego, który umożliwia wizualizację szybkich zmian w ekspresji genów.

Obrazowanie bioluminescencyjne w czasie rzeczywistym dynamiki sygnalizacji Notch podczas neurogenezy myszy

Rytmy okołodobowe, które istnieją w większości organizmów, regulują czasową organizację organoidów biologicznych processes. 3D ostatnio pojawiły się jako fizjologicznie istotny model in vitro. Protokół ten opisuje zastosowanie bioluminescencyjnych reporterów do obserwacji rytmów okołodobowych w organoidach, umożliwiając badania in vitro rytmów okołodobowych w układach wielokomórkowych.

Monitorowanie oscylacji okołodobowych za pomocą reportera bioluminescencji w organoidach

To badanie wprowadza strategie chemogenową i opartą na świetle fioletowym, aby umożliwić niezawodne przesunięcie fazy dobowej w ciągu dnia.

Wywoływanie przesunięć fazy dobowej za pomocą metod chemogenetycznych i spektralnych

Poznaj metodę fluorescencyjnego monitorowania ekspresji genu zegara okołodobowego w jądrze nadskrzyżowaniowym u myszy w czasie rzeczywistym. Technika umożliwia pomiary w warunkach światło-ciemność i ciemność-ciemność.

In vivo (in vivo) Monitorowanie ekspresji genu zegara okołodobowego w jądrze nadskrzyżowaniowym myszy za pomocą reporterów fluorescencyjnych (Wideo) | JoVE Journal

In vivo (in vivo) Monitorowanie ekspresji genu zegara okołodobowego w jądrze nadskrzyżowaniowym myszy za pomocą reporterów fluorescencyjnych

Przeglądaj więcej filmów