4.11: Ultrawirowanie w gradiencie gęstości

Ultrawirowanie w gradiencie gęstości jest powszechną techniką stosowaną do izolowania i oczyszczania biomolekuł i struktur komórkowych. Technika ta wykorzystuje fakt, że w zawiesinie cząstki, które są gęstsze niż rozpuszczalnik, osadzają się, podczas gdy te, które są mniej gęste, unoszą się na wodzie. Do przyspieszenia tego procesu stosuje się ultrawirówkę o dużej prędkości w celu oddzielenia biomolekuł w gradiencie gęstości, który można ustalić poprzez nakładanie warstw cieczy o malejącej gęstości w probówce wirówkowej.

Film będzie omawiał zasady ultrawirowania w gradiencie gęstości, w tym procedurę, która demonstruje przygotowanie próbki, tworzenie gradientu sacharozy, ultrawirowanie i pobieranie frakcjonowanych analitów. W sekcji zastosowań omówiono izolację kompleksów wielobiałkowych, izolację kompleksów kwasów nukleinowych oraz separację za pomocą gradientów gęstości chlorku cezu.

Ultrawirowanie w gradiencie gęstości jest powszechnym podejściem do izolowania i oczyszczania struktur komórkowych do eksperymentów biochemicznych. Technika ta wykorzystuje szybką wirówkę lub ultra do nieniszczącego oddzielania składników komórkowych w gradiencie gęstości. Ten film opisuje zasady ultrawirowania w gradionym gradiencie gęstości, przedstawia ogólną procedurę wykorzystującą gradient sacharozy i omawia niektóre zastosowania.

Zacznijmy od zbadania zasad działania ultrawirówek i gradientów gęstości. Zawiesina zawiera cząstki w ciekłym rozpuszczalniku. Ze względu na grawitację cząstki gęstsze niż rozpuszczalnik osadzają się na zewnątrz, podczas gdy te mniej gęste niż rozpuszczalnik unoszą się na wodzie. Im większa różnica w gęstości między cząstką a rozpuszczalnikiem, tym szybsza separacja.

Ultrawirówka zawiera jednostkę zwaną wirnikiem, która obraca się z wysoce kontrolowanymi prędkościami, symulując silne pole grawitacyjne. W obrębie tego pola różnice w gęstości między cząstkami a rozpuszczalnikiem są powiększane.

Natężenie pola zależy od prędkości obrotowej. Nawet mały wirnik o stosunkowo niskiej prędkości obrotowej może wytworzyć siłę tysiące razy większą niż pole grawitacyjne Ziemi.

Jeśli probówka zawiera kilka cieczy o różnej gęstości, wirowanie utrzyma je w oddzielnych warstwach w kolejności gęstości, przy czym najgęstsza ciecz znajduje się najbliżej podstawy. Takie nawarstwianie wielu cieczy nazywa się "gradientem gęstości". Istnieją dwa rodzaje. W gradientach krokowych ciecze o malejącej gęstości są ostrożnie nakładane jedna na drugą. W ciągłych gradientach ciecze są mieszane w różnych proporcjach, dzięki czemu gęstość zmniejsza się płynnie od podstawy w górę.

Organelle komórkowe można oddzielić za pomocą gradientu krokowego, poprzez "wirowanie izopikenne z gradientem gęstości". Jest to najprostsza i najczęstsza procedura wirowania.

Ta procedura służy do oddzielenia struktur komórkowych. Im gęstsza organella, tym dalej opada - z mitochondriami na górze i kwasami nukleinowymi na dole.

Teraz, gdy znasz już zasady stojące za tą techniką, zobaczmy ją w laboratorium.

Przed rozpoczęciem procedury należy zanotować wartości znamionowe prędkości i gęstości producenta, a ultrawirówkę sprawdzić pod kątem korozji. W tej procedurze wykorzystuje się wirnik z wahliwym łyżką.

Po pierwsze, materiał komórkowy jest wytwarzany przez homogenizację komórek, co niedestrukcyjnie uwalnia ich organelle. Homogenat może być frakcjonowany przez wstępne wirowanie z niską prędkością w celu usunięcia składników o małej gęstości. Następnie przygotowuje się roztwory sacharozy.

Sacharoza jest dodawana w coraz większych ilościach, więc każdy roztwór jest bardziej skoncentrowany, a przez to gęstszy niż poprzedni. Dokładne gęstości roztworów będą zależeć od składników, które mają zostać oddzielone, które różnią się w zależności od organizmu. Roztwory powinny mieć gęstości pomiędzy gęstościami składników, które mają być rozdzielone, przy czym ostatni roztwór powinien być gęstszy niż najgęstszy składnik analitu. Techniki rozdzielania składników gęstszych niż sacharoza, takich jak kwasy nukleinowe, są opisane w aplikacjach.

Gradient sacharozy jest teraz tworzony w czystej probówce wirówkowej. Pipeta służy do sporządzenia najbardziej stężonego roztworu sacharozy. Gdy rurka jest trzymana w pozycji pionowej, końcówka pipety jest umieszczana wysoko przy ściance, a płyn jest równomiernie dozowany w dół. Ważne jest, aby obszar roboczy był wolny od wibracji i innych zakłóceń.

Po wymianie końcówki pozostałe roztwory dodaje się w kolejności zmniejszającej się gęstości. Dozuje się je ostrożnie, aby utworzyć wyraźne warstwy i uniknąć mieszania. Na koniec około pół mililitra próbki komórkowej dodaje się na szczyt gradientu i waży się probówkę. Służy to do zrównoważenia rozkładu masy, co jest kolejnym krokiem procesu.

Wirowanie należy rozpocząć tak szybko, jak to możliwe. Rurkę umieszcza się w wirniku, który jest następnie równoważony poprzez umieszczenie ślepych roztworów o równej wadze w przeciwległych szczelinach. Wirnik umieszcza się w ultrawirówce, a system uszczelnia. Ustawiana jest temperatura, prędkość obrotowa i czas obrotowy. Typowe wartości to 4 ? C z siłą ponad 100 000 x g przez 16 godzin.

Po odwirowaniu probówkę wyjmuje się z wirnika, uważając, aby była ustawiona pionowo i nienaruszona. Różne składniki komórkowe zostały pofrakcjonowane w dyskretne pasma między warstwami roztworu. Frakcje można pobrać za pomocą strzykawki. Alternatywnie dno probówki można nakłuć drobną, wysterylizowaną igłą, a odpływ zebrać w sterylnych probówkach. Komponenty komórkowe zostały teraz wyizolowane. Można je przechowywać w temperaturze -80 ?C.

Teraz, gdy widzieliśmy już podstawową procedurę, przyjrzyjmy się niektórym aplikacjom.

Typowym zastosowaniem jest izolacja kompleksów wielobiałkowych w komórkach roślinnych. W tym przykładzie kompleksy odpowiedzialne za cykliczny przepływ elektronów są izolowane z tylakoidu, miejsca reakcji świetlnej w fotosyntezie. W tej procedurze wykorzystuje się dyskretne roztwory od 14 do 45% sacharozy. Wirowanie odbywa się ponad 100 000 x g przez 14 godzin w temperaturze 4 ?C.

Ponieważ kwasy nukleinowe są gęstsze niż sacharoza, wirowanie izopikenne nie może ich nieniszcząco oddzielić od organelli.

Stosowana jest inna technika, znana jako "wirowanie strefowe". Oddziela organelle na podstawie ich szybkości sedymentacji, która zależy nie tylko od ich gęstości, ale także od ich konformacji. Ciągły gradient służy do oddzielania komponentów na podstawie tej właściwości.

Etapy postępowania są podobne do tych stosowanych w sprawach izopiknicznych. W tym przykładzie kompleksy RNA-rybosom są izolowane przy użyciu ciągłego gradientu od 5% do 20%, odwirowywane przy 230 000 x g. Wirowanie przerywa się po kilku godzinach, aby zapobiec współwytrącaniu się.

Nici kwasów nukleinowych można oddzielić od siebie na podstawie gęstości.

Dzieje się tak, ponieważ nici bogate w guaninę i cytozynę są gęstsze niż te bogate w adeninę i tiaminę. W tym przypadku gradient nie może być wykonany z sacharozy, ponieważ sacharoza jest mniej gęsta niż kwasy nukleinowe. Zamiast tego stosuje się gradienty chlorku cezu, zwykle od 1,65 do 1,75 g/ml, ponieważ mają one wystarczającą gęstość i niską lepkość.

Tutaj widzimy, jak DNA planktonu jest oczyszczane za pomocą ciągłego gradientu chlorku cezu. Wirowanie odbywa się przy ponad 1 000 000 x g przez 18 godzin w próżni.

Właśnie obejrzałeś film JoVE na temat ultrawirowania z gradientem gęstości sacharozy. Powinieneś teraz zrozumieć, jak działa gradient gęstości, jak skonstruować gradient krokowy oraz jak załadować i obsługiwać ultrawirówkę. Dzięki za oglądanie!