Krystalizacja białek, uzyskanie stałej sieci biomolekuł, wyjaśnia strukturę białek i umożliwia badanie funkcji białek. Krystalizacja polega na suszeniu oczyszczonego białka pod wpływem kombinacji wielu czynników, w tym pH, temperatury, siły jonowej i stężenia białka. Po uzyskaniu kryształów strukturę białka można wyjaśnić za pomocą dyfrakcji promieniowania rentgenowskiego i obliczeń modelu gęstości elektronów.
Ten film przedstawia krystalizację białek i pokazuje ogólną procedurę. Procedura obejmuje ekspresję i oczyszczanie białek, krystalizację i dyfrakcję promieniowania rentgenowskiego. Zastosowania krystalizacji białek obejmują in silico projektowanie leków, oznaczanie miejsca wiązania i analizę struktury białek błonowych.
Krystalizacja białek, uzyskanie stałej sieci biomolekuł, wyjaśnia strukturę białek i umożliwia badanie funkcji białek. Krystalizacja polega na suszeniu oczyszczonego białka pod wpływem kombinacji wielu czynników, w tym pH, temperatury, siły jonowej i stężenia białka. Po uzyskaniu kryształów strukturę białka można wyjaśnić za pomocą dyfrakcji promieniowania rentgenowskiego i obliczeń modelu gęstości elektronów.
Ten film przedstawia krystalizację białek i pokazuje ogólną procedurę. Procedura obejmuje ekspresję i oczyszczanie białek, krystalizację i dyfrakcję promieniowania rentgenowskiego. Zastosowania krystalizacji białek obejmują in silico projektowanie leków, oznaczanie miejsca wiązania i analizę struktury białek błonowych.
Krystalizacja białka to proces otrzymywania ukratowanej stałej formy białka. Kryształy te są szczególnie cenne dla biologów strukturalnych, pomagając w badaniu funkcji białek. Inne techniki, takie jak mass spec lub SDS-PAGE, mogą dostarczyć informacji tylko o jednowymiarowej strukturze białek. Krystalizację białek uzupełniają techniki rekombinowanej ekspresji białek i dyfrakcji rentgenowskiej. Ten film pokaże zasady krystalizacji białek, ogólną procedurę laboratoryjną i kilka jej zastosowań w dziedzinie biochemicznej.
Pierwszym krokiem wymaganym w procesie jest uzyskanie miligramowych ilości bardzo czystego białka, zwykle przy użyciu rekombinowanej ekspresji białka. Gen odpowiadający białku będącemu przedmiotem zainteresowania jest klonowany do wektora ekspresji, a wyrażane białko jest łączone ze znacznikiem powinowactwa, takim jak polihistydyna, aby pomóc w oczyszczaniu za pomocą chromatografii powinowactwa. Aby dowiedzieć się więcej, obejrzyj film z tej kolekcji na temat chromatografii powinowactwa.
Tworzenie się oczyszczonego białka w kryształy zależy od odpowiedniej kombinacji wielu czynników, w tym pH, siły jonowej, stężeń środka strącającego i białka, temperatury i szybkości równowagi. Najczęściej stosowaną metodą jest dyfuzja pary, która dzieli się na dwie kategorie: opadanie w pozycji wiszącej i opadanie w pozycji siedzącej. Kropla zawierająca czyste białko, bufor i środek strącający, który jest jonowym ciałem stałym, które wiąże cząsteczki wody, zmniejszając dostępność wody dla białka i naśladując wyższe stężenie białka, znajduje się w zamkniętej mikrostudzience ze zbiornikiem z bardziej stężoną mieszaniną tego samego buforu i środka strącającego. Na początku stężenia białka i środka strącającego są zbyt niskie, aby spowodować krystalizację. W trakcie eksperymentu woda odparowuje z kropli i gromadzi się w zbiorniku; Zmniejszenie ilości wody w kropelce powoduje przesycenie układu i może dojść do zarodkowania, a następnie krystalizacji. Transfer netto wody z kropli jest w równowadze, a system jest utrzymywany do momentu zakończenia procesu.
Do wizualizacji struktury 3D wykorzystuje się dyfrakcję rentgenowską. Aby uzyskać dane rentgenowskie z kryształu, umieszcza się go w monochromatycznej wiązce promieniowania rentgenowskiego, gdzie jest naświetlany wiązką pod wszystkimi kątami. Każda ekspozycja dostarcza obrazu, gdzie każda plamka jest dyfrakcyjnym promieniowaniem rentgenowskim, które wyłania się z kryształu i jest rejestrowane przez detektor. Dane są łączone w celu stworzenia modelu ułożenia atomów w krysztale. Uzyskana struktura krystaliczna demonstruje trójwymiarowe rozmieszczenie atomów, z typową rozdzielczością 2 angstremów.
Teraz, gdy omówiliśmy zasady krystalizacji białek, spójrzmy na uogólniony protokół.
Aby rozpocząć procedurę, wektor ekspresyjny zawierający gen będący przedmiotem zainteresowania jest przekształcany w komórki. Komórki są inkubowane, a w połowie fazy logarytmicznej ekspresja jest inicjowana przez dodanie induktora, takiego jak IPTG, który wyzwala transkrypcję mRNA genu. Po ekspresji białka surowy materiał jest zawieszany w buforze do lizy, a następnie klarowany przez odwirowanie.
Oczyszczony lizat jest następnie ładowany do kolumny niklowej, a białko znakowane polihistydyną wiąże się z kolumną, podczas gdy wszystkie inne biomolekuły są wypłukiwane.
Po uzyskaniu kilku miligramów czystego białka jest ono gotowe do krystalizacji przez dyfuzję pary. 24-dołkowa taca wrzutowa do zawieszania/siedzenia jest wypełniona roztworami buforowymi chlorku sodu i octanu sodu o różnych stężeniach. W przypadku metody z kroplą siedzącą równe objętości białka i roztworu zbiornikowego są pipetowane na półkę nad każdym dołkiem, a następnie taca jest przykrywana przezroczystą taśmą. Tacę umieszcza się następnie w komorze inkubacyjnej, a studzienki są monitorowane pod kątem wzrostu następnego dnia, a następnie co kilka dni.
Po uzyskaniu odpowiedniego kryształu jest on gotowy do analizy dyfrakcji rentgenowskiej. Kryształ jest montowany na goniometrze w celu ustawienia kryształu w wybranych orientacjach. Kryształ jest oświetlany monochromatyczną wiązką promieni rentgenowskich pod wszystkimi kątami, tworząc wzór dyfrakcyjny. Oprogramowanie konwertuje dwuwymiarowe obrazy, wykonane w różnych orientacjach, na trójwymiarowy model gęstości elektronów w krysztale, określając położenie atomów w krysztale.
Teraz, gdy dokonaliśmy przeglądu procedury, przyjrzyjmy się kilku przydatnym zastosowaniom krystalizacji białek i innej technice krystalizacji.
Krystalizacja białek może być stosowana do projektowania leków in silico. Trójwymiarowa struktura podstawowego białka polimerazy 2 wirusa grypy, która została powiązana z infekcją wirusową u ssaków, została określona przez krystalizację i dyfrakcję promieniowania rentgenowskiego. Potencjalne miejsca wiązania w białku są wizualizowane, a za pomocą programu dokującego zaprojektowano trójwymiarową cząsteczkę, która wszczepi się w szczelinę w białku.
Przydatną techniką jest również kokrystalizacja kompleksów białko-DNA. Białka wiążące DNA modulują szeroką gamę funkcji biologicznych, takich jak transkrypcja i polimeryzacja DNA oraz naprawa DNA; Struktury krystaliczne tych kompleksów mogą dostarczyć informacji na temat funkcji, mechanizmu i charakteru specyficznej interakcji białek. Białko E. coli SeqA, negatywny regulator replikacji DNA, uległo współkrystalizacji z hemimetylowanym DNA.
Integralne białka błonowe, takie jak receptory sprzężone z białkiem G lub GCPR, są trudne do krystalizacji ze względu na ograniczoną ilość powierzchni polarnej dostępnej do tworzenia kontaktów sieci krystalicznej, co doprowadziło do rozwoju krystalizacji białek wspomaganych białkiem fuzyjnym. Geny kodujące receptor adrenergiczny β2, GCPR i lizozym zostały wstawione do wektora ekspresyjnego. Krystalizację białka fuzyjnego β2AR- lizozymu osiągnięto dzięki zwiększonej zewnątrzkomórkowej powierzchni hydrofilowej nad naturalnie hydrofobowym β2AR, dostarczanym przez lizozym, niezbędny do tworzenia oddziaływań upakowania w sieci krystalicznej.
Właśnie obejrzałeś film JoVE na temat krystalizacji białek. Ten film opisał jego zasady, uogólniony protokół i niektóre jego zastosowania w dziedzinie biomedycyny. Dzięki za oglądanie!
Krystalizacja białek, uzyskanie stałej sieci biomolekuł, wyjaśnia strukturę białek i umożliwia badanie funkcji białek. Krystalizacja polega na suszeniu oczyszczonego białka pod wpływem kombinacji wielu czynników, w tym pH, temperatury, siły jonowej i stężenia białka. Po uzyskaniu kryształów strukturę białka można wyjaśnić za pomocą dyfrakcji promieniowania rentgenowskiego i obliczeń modelu gęstości elektronów.
Ten film przedstawia krystalizację białek i pokazuje ogólną procedurę. Procedura obejmuje ekspresję i oczyszczanie białek, krystalizację i dyfrakcję promieniowania rentgenowskiego. Zastosowania krystalizacji białek obejmują in silico projektowanie leków, oznaczanie miejsca wiązania i analizę struktury białek błonowych.
Krystalizacja białka to proces otrzymywania ukratowanej stałej formy białka. Kryształy te są szczególnie cenne dla biologów strukturalnych, pomagając w badaniu funkcji białek. Inne techniki, takie jak mass spec lub SDS-PAGE, mogą dostarczyć informacji tylko o jednowymiarowej strukturze białek. Krystalizację białek uzupełniają techniki rekombinowanej ekspresji białek i dyfrakcji rentgenowskiej. Ten film pokaże zasady krystalizacji białek, ogólną procedurę laboratoryjną i kilka jej zastosowań w dziedzinie biochemicznej.
Pierwszym krokiem wymaganym w procesie jest uzyskanie miligramowych ilości bardzo czystego białka, zwykle przy użyciu rekombinowanej ekspresji białka. Gen odpowiadający białku będącemu przedmiotem zainteresowania jest klonowany do wektora ekspresji, a wyrażane białko jest łączone ze znacznikiem powinowactwa, takim jak polihistydyna, aby pomóc w oczyszczaniu za pomocą chromatografii powinowactwa. Aby dowiedzieć się więcej, obejrzyj film z tej kolekcji na temat chromatografii powinowactwa.
Tworzenie się oczyszczonego białka w kryształy zależy od odpowiedniej kombinacji wielu czynników, w tym pH, siły jonowej, stężeń środka strącającego i białka, temperatury i szybkości równowagi. Najczęściej stosowaną metodą jest dyfuzja pary, która dzieli się na dwie kategorie: opadanie w pozycji wiszącej i opadanie w pozycji siedzącej. Kropla zawierająca czyste białko, bufor i środek strącający, który jest jonowym ciałem stałym, które wiąże cząsteczki wody, zmniejszając dostępność wody dla białka i naśladując wyższe stężenie białka, znajduje się w zamkniętej mikrostudzience ze zbiornikiem z bardziej stężoną mieszaniną tego samego buforu i środka strącającego. Na początku stężenia białka i środka strącającego są zbyt niskie, aby spowodować krystalizację. W trakcie eksperymentu woda odparowuje z kropli i gromadzi się w zbiorniku; Zmniejszenie ilości wody w kropelce powoduje przesycenie układu i może dojść do zarodkowania, a następnie krystalizacji. Transfer netto wody z kropli jest w równowadze, a system jest utrzymywany do momentu zakończenia procesu.
Do wizualizacji struktury 3D wykorzystuje się dyfrakcję rentgenowską. Aby uzyskać dane rentgenowskie z kryształu, umieszcza się go w monochromatycznej wiązce promieniowania rentgenowskiego, gdzie jest naświetlany wiązką pod wszystkimi kątami. Każda ekspozycja dostarcza obrazu, gdzie każda plamka jest dyfrakcyjnym promieniowaniem rentgenowskim, które wyłania się z kryształu i jest rejestrowane przez detektor. Dane są łączone w celu stworzenia modelu ułożenia atomów w krysztale. Uzyskana struktura krystaliczna demonstruje trójwymiarowe rozmieszczenie atomów, z typową rozdzielczością 2 angstremów.
Teraz, gdy omówiliśmy zasady krystalizacji białek, spójrzmy na uogólniony protokół.
Aby rozpocząć procedurę, wektor ekspresyjny zawierający gen będący przedmiotem zainteresowania jest przekształcany w komórki. Komórki są inkubowane, a w połowie fazy logarytmicznej ekspresja jest inicjowana przez dodanie induktora, takiego jak IPTG, który wyzwala transkrypcję mRNA genu. Po ekspresji białka surowy materiał jest zawieszany w buforze do lizy, a następnie klarowany przez odwirowanie.
Oczyszczony lizat jest następnie ładowany do kolumny niklowej, a białko znakowane polihistydyną wiąże się z kolumną, podczas gdy wszystkie inne biomolekuły są wypłukiwane.
Po uzyskaniu kilku miligramów czystego białka jest ono gotowe do krystalizacji przez dyfuzję pary. 24-dołkowa taca wrzutowa do zawieszania/siedzenia jest wypełniona roztworami buforowymi chlorku sodu i octanu sodu o różnych stężeniach. W przypadku metody z kroplą siedzącą równe objętości białka i roztworu zbiornikowego są pipetowane na półkę nad każdym dołkiem, a następnie taca jest przykrywana przezroczystą taśmą. Tacę umieszcza się następnie w komorze inkubacyjnej, a studzienki są monitorowane pod kątem wzrostu następnego dnia, a następnie co kilka dni.
Po uzyskaniu odpowiedniego kryształu jest on gotowy do analizy dyfrakcji rentgenowskiej. Kryształ jest montowany na goniometrze w celu ustawienia kryształu w wybranych orientacjach. Kryształ jest oświetlany monochromatyczną wiązką promieni rentgenowskich pod wszystkimi kątami, tworząc wzór dyfrakcyjny. Oprogramowanie konwertuje dwuwymiarowe obrazy, wykonane w różnych orientacjach, na trójwymiarowy model gęstości elektronów w krysztale, określając położenie atomów w krysztale.
Teraz, gdy dokonaliśmy przeglądu procedury, przyjrzyjmy się kilku przydatnym zastosowaniom krystalizacji białek i innej technice krystalizacji.
Krystalizacja białek może być stosowana do projektowania leków in silico. Trójwymiarowa struktura podstawowego białka polimerazy 2 wirusa grypy, która została powiązana z infekcją wirusową u ssaków, została określona przez krystalizację i dyfrakcję promieniowania rentgenowskiego. Potencjalne miejsca wiązania w białku są wizualizowane, a za pomocą programu dokującego zaprojektowano trójwymiarową cząsteczkę, która wszczepi się w szczelinę w białku.
Przydatną techniką jest również kokrystalizacja kompleksów białko-DNA. Białka wiążące DNA modulują szeroką gamę funkcji biologicznych, takich jak transkrypcja i polimeryzacja DNA oraz naprawa DNA; Struktury krystaliczne tych kompleksów mogą dostarczyć informacji na temat funkcji, mechanizmu i charakteru specyficznej interakcji białek. Białko E. coli SeqA, negatywny regulator replikacji DNA, uległo współkrystalizacji z hemimetylowanym DNA.
Integralne białka błonowe, takie jak receptory sprzężone z białkiem G lub GCPR, są trudne do krystalizacji ze względu na ograniczoną ilość powierzchni polarnej dostępnej do tworzenia kontaktów sieci krystalicznej, co doprowadziło do rozwoju krystalizacji białek wspomaganych białkiem fuzyjnym. Geny kodujące receptor adrenergiczny ?2, GCPR i lizozym zostały wstawione do wektora ekspresyjnego. Krystalizację białka fuzyjnego lizozymu ?2AR- osiągnięto dzięki zwiększonej zewnątrzkomórkowej powierzchni hydrofilowej nad naturalnie hydrofobowym ?2AR, dostarczanej przez lizozym, niezbędny do tworzenia oddziaływań upakowania w sieci krystalicznej.
Właśnie obejrzałeś film JoVE na temat krystalizacji białek. Ten film opisał jego zasady, uogólniony protokół i niektóre jego zastosowania w dziedzinie biomedycyny. Dzięki za oglądanie!
Chapters in this video
0:00
Overview
0:50
Principles of Protein Crystallization
3:16
Protocol for Protein Expression, Crystallization, and X-Ray Diffraction
5:15
Applications
7:20
Summary
Videos from this collection: