Pomiar odkształcalności i niejednorodności krwinek czerwonych we krwi za pomocą ektacytometrii

Ogólnym celem tej techniki jest pomiar odkształcalności krwinek czerwonych i niejednorodności komórkowej za pomocą ektacytometrii. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w ektacytometrii, takie jak to, jak odkształcalne są erytrocyty, jak niejednorodna jest próbka krwi i jak eksperyment zmienia się w funkcji choroby. Głównymi zaletami tej techniki są dostępność, wygoda i niezawodność w pomiarze odkształcalności i niejednorodności populacji czerwonych krwinek.

Techniki te mogą być przydatne do monitorowania odpowiedzi na terapię u pacjentów z niedokrwistością sierpowatokrwinkową. Ponieważ odkształcalność i niejednorodność krwinek czerwonych są skorelowane ze składem i stężeniem hemoglobiny. Metody te można zastosować w innych chorobach charakteryzujących się zmniejszoną odkształcalnością krwinek czerwonych, takich jak cukrzyca, gdzie zmniejszona odkształcalność krwinek czerwonych może przyczyniać się do choroby mikrokrążenia.

Zacznij od podłączenia rurki osmolarnej o zerowym osmolarnym roztworze PVP o niskiej osmolarności, a rurki osmolarnej 500 do roztworu PVP o wysokiej osmolarności. Upewnij się, że bob jest całkowicie opuszczony do miseczki. Uruchom oprogramowanie i zalej maszynę, wybierając opcję Hardware Check (Kontrola sprzętu), a następnie instrumentację IO. Poczekaj, aż instrument zakończy cykl zalewania.

Po zakończeniu cyklu wyjmij bob z kubka i całkowicie osusz bob i kubek chusteczką czyszczącą o niskiej ilości kłaczków. Delikatnie wymieszaj świeżo pobraną próbkę krwi pełnej, kilkakrotnie odwracając fiolkę. Następnie odpipetować 25 mikrolitrów krwi pełnej do pięciu mililitrów izoosmolarnego roztworu PVP.

Po zamknięciu fiolki należy delikatnie wymieszać, kilkakrotnie odwracając ją do góry dnem. Wybierz odkształcalność z menu głównego oprogramowania, a następnie utwórz nową analizę i dodaj szczegóły eksperymentu. Następnie podnieś pokrywę ektacytometru i sprawdź, czy bob jest całkowicie opuszczony do kubka i czy kubek się obraca.

Odpipetuj jeden mililitr roztworu krwi PVP do przestrzeni między kubkiem a bobem. Następnie lekko podnieś bob, aby sprowadzić próbkę w dół. Poczekaj, aż wszystkie pęcherzyki wyjdą z roztworu, a następnie zamknij pokrywkę ektacytometru.

Dostosuj wzmocnienie do 200, przesuwając strzałkę wzdłuż paska przewijania w oprogramowaniu. Gdy temperatura jest stabilna na poziomie 37 stopni Celsjusza, a obraz dyfrakcyjny jest stabilny, naciśnij start. Obserwuj wzory dyfrakcyjne w miarę postępu akwizycji danych, aby upewnić się, że pozostają okrągłe, eliptyczne lub w kształcie rombu.

Po zakończeniu zbierania danych wydrukuj raport i wyczyść go. Wzór dyfrakcyjny uzyskany ze zdrowej krwi w odpowiedzi na naprężenie ścinające pokazuje oczekiwany wzór eliptyczny. Wskaźnik wydłużenia oblicza się za pomocą równania przedstawionego poniżej.

Gdy próbka jest zasysana, przepłucz przestrzeń między kubkiem a bobem, spryskując przestrzeń dejonizowaną wodą, podczas gdy instrument pozostaje w czystym cyklu. Po zakończeniu cyklu czyszczenia wyjmij bob z kubka i całkowicie osusz bob i kubek chusteczką czyszczącą o niskiej ilości kłaczków. Prawidłowe suszenie ma kluczowe znaczenie, ponieważ resztki wody będą lizować czerwone krwinki, powodując zakłócenia.

Wybierz opcję eksportuj, aby zapisać raport. Na koniec kliknij przycisk menu głównego w oprogramowaniu, aby powrócić do strony głównej. Po załadowaniu kolejnej próbki do ektacytometru, jak poprzednio, należy upewnić się, że na ekranie wyświetlany jest stabilny obraz dyfrakcyjny.

Dostosuj wzmocnienie kamery, przesuwając linijkę wzdłuż ekranu, aż uzyska wysokość dyfrakcji 3.8 cm. Użyj linijki, aby sprawdzić wysokość obrazu na ekranie komputera. Następnie naciśnij start i obserwuj akwizycję danych jak poprzednio.

To zdjęcie przedstawia wzór dyfrakcyjny o średnicy 3,8 cm uzyskany z krwi pacjenta z anemią sierpowatą. Po oczyszczeniu ektacytometru, jak pokazano wcześniej, powtórz procedurę, aby uzyskać wzory dyfrakcyjne na wysokości 4,5 cm i 5,4 cm. Zniekształcenie wzoru dyfrakcyjnego występuje w niejednorodnych próbkach krwi, ponieważ sztywne krwinki czerwone nie wyrównują się prawidłowo z odkształcalnymi komórkami, co powoduje wzór dyfrakcyjny w kształcie rombu.

Ten wzór zniekształceń jest coraz bardziej wykrywalny, ponieważ wzmocnienie kamery jest dostosowywane w celu generowania większych wzorów dyfrakcyjnych. W przypadku ektacytometrii gradientu osmotycznego zacznij od dodania 250 mikrolitrów krwi pełnej do fiolki zawierającej pięć mililitrów izoosmolarnego PVP i delikatnie wymieszaj. Wybierz Osmoscan z menu głównego w oprogramowaniu.

Następnie umieścić fiolkę zawierającą roztwór PVP we krwi pod igłą po lewej stronie urządzenia. Opuścić igłę tak długo, aż dotknie dna fiolki. Upewnij się, że rurka jest prawidłowo podłączona do roztworów o niskim i wysokim osmolarze w celu uzyskania gradientu.

Zamknij pokrywę ektacytometru i otwórz drzwiczki w dolnej połowie, aby umożliwić view krwi wchodzącej do rurki. Naciśnij przycisk Nowa analiza i wpisz szczegóły eksperymentu. Po ustawieniu wzmocnienia kamery na 200, pozwól maszynie pracować, aż krew dostanie się do kubka z rurki pod instrumentem.

Gdy na ekranie komputera pojawi się stabilny wzór dyfrakcyjny, rozpocznij akwizycję danych, naciskając przycisk Rozpocznij teraz w oknie dialogowym. Pozwól ektacytometrowi uzyskać dane do około 500 miliosmoli na kilogram, a następnie zatrzymaj instrument. Wydrukuj raport.

Następnie wyjmij starą fiolkę z krwią PVP i zastąp ją czystą fiolką zawierającą wodę dejonizowaną. Opuścić igłę tak, aby dotknęła dna fiolki, a następnie nacisnąć przycisk płukania w oknie dialogowym, aby przepłukać system gradientowy. Po zakończeniu płukania naciśnij opcję czyszczenia w oknie dialogowym na monitorze komputera i wybierz eksport, aby zapisać raport.

Osusz bob i kubek jak poprzednio. Jednorodne populacje krwi, znalezione u zdrowych ochotników, nie wytwarzają różnych krzywych odkształcalności, gdy mierzone są rozmiary dyfrakcji. Natomiast heterogeniczne populacje krwi, takie jak krew pacjentów z niedokrwistością sierpowatokrwinkową, wykazują znaczne spadki miar odkształcalności w funkcji wielkości wzoru dyfrakcyjnego.

W krwi sierpowatej, gdy stopień zniekształcenia wzoru dyfrakcyjnego jest mierzony jako funkcja EI max, jest on skorelowany z hemoglobiną S i dorosłym wariantem hemoglobiny, hemoglobiną A2. Transfuzja koryguje zniekształcenie, na co wskazuje jego odwrotna zależność od procentowej zawartości prawidłowej hemoglobiny u dorosłych we krwi. Niezależnie od tego, czy stopień zniekształcenia wzoru dyfrakcyjnego jest mierzony jako funkcja naprężenia ścinającego wymaganego do osiągnięcia połowy maksymalnej odkształcalności, czy jako funkcja EI max, jest on skorelowany z hemoglobiną płodu. Kluczowe parametry ektacytometrii gradientu osmotycznego, takie jak EI max, EI min i O min, dostarczają dodatkowych informacji odpowiednio na temat uwodnienia komórek, stosunku powierzchni do objętości i kruchości osmotycznej.

Po opanowaniu techniki te można wykonać w ciągu około godziny, jeśli zostaną wykonane prawidłowo. Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak mikroskopia, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące odkształcalności poszczególnych erytrocytów. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak mierzyć odkształcalność i niejednorodność surowicy w próbkach krwi.