Częściowe podwiązanie dróg żółciowych u myszy: kontrolowany model zlokalizowanej cholestazy obturacyjnej
28 marca 2018
Tutaj prezentujemy częściowe podwiązanie dróg żółciowych jako chirurgiczny model uszkodzenia i regeneracji wątroby u gryzoni.
Ogólnym celem tej interwencji chirurgicznej jest obserwacja skutków miejscowej obturacyjnej cholestazy. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie hepatologii dotyczące tego, jak zidentyfikować mechanizmy regeneracji wątroby. Główną zaletą tej techniki jest to, że można dokonać znaczących porównań między podwiązanym płatem doświadczalnym a niepodwiązanym płatem kontrolnym w obrębie tego samego zwierzęcia.
Dzisiejszą procedurę zademonstruje dr Toshimasa Nakao, doktor habilitowany z laboratorium chirurgii transplantacyjnej. Po potwierdzeniu braku reakcji na szczypanie palca u znieczulonej myszy C57 black 6 w wieku od 8 do 12 tygodni, ogol okolice brzucha maszynką do strzyżenia włosów i umieść zwierzę pod mikroskopem chirurgicznym. Przymocuj kończyny do stołu i za pomocą sterylnych wacików sekwencyjnie zdezynfekuj obszar operacyjny za pomocą 0,3 do 0,5 mililitra jodu powidonu i 70% etanolu.
Następnie wykonaj nacięcie w linii środkowej od mieczyka mieczykowatego do kości łonowej i użyj mikro retraktora, aby otworzyć jamę brzuszną. Użyj kleszczyków do komarów, aby cofnąć mieczyk mieczykowaty w kierunku głowy myszy i użyj miękkiej gliny, aby przytrzymać kleszcze i mieczyk w tej pozycji. Nawodnij jamę brzuszną jednym do dwóch mililitrów wysterylizowanego PBS o temperaturze 37 stopni Celsjusza i użyj mokrych wacików, aby delikatnie przesunąć jelito cienkie w kierunku głowy myszy.
Przetnij więzadła między jelitem cienkim a zaotrzewnową, aby uniknąć uszkodzenia tkanki i owiń jelito cienkie i grube mokrą gąbką z włókniny. Umieść tkankę jelita po ogonowej stronie jamy brzusznej i użyj małej mokrej gąbki z włókniny, aby delikatnie cofnąć całą wątrobę w kierunku mieczykowatej, aby odsłonić wnękę wątroby i więzadło wątrobowo-żumienne. Zlokalizuj wnękę wątroby, wspólny przewód żółciowy po brzusznej stronie żyły wrotnej oraz drogi żółciowe lewej i prawej wątroby, które spływają do głównego zbiegu dróg żółciowych we wnęce wątroby.
Za pomocą nylonowego szwu 10-0 i strony igły do szwów podwiązaj lewy płat wątrobowego przewodu żółciowego. Po założeniu szwu należy przywrócić jelito cienkie i grube do ich anatomicznego położenia i potwierdzić brak skrętu jelita lub krwawienia śródbrzusznego. Następnie zdejmij kleszczyki do komarów, oddzielnie zamknij warstwy mięśni i skóry ciągłymi szwami 4-0 Vicryl i umieść mysz pod lampą grzewczą z monitorowaniem aż do pełnego wyzdrowienia.
Porównanie biochemii wątroby w surowicy między myszami z częściowymi podwiązanymi drogami żółciowymi a myszami transgenicznymi z pełnymi podwiązanymi drogami żółciowymi w celu nierozpuszczalnej agregacji białek wątroby ujawnia minimalne uszkodzenie wątroby lub cholestazę u myszy z częściowymi podwiązanymi drogami żółciowymi oraz poważne uszkodzenie i nagromadzenie enzymów u zwierząt transgenicznych z kompletnymi podwiązanymi drogami żółciowymi. Ponieważ myszy poddane częściowemu podwiązaniu dróg żółciowych z czasem rozwinęły się specyficzna dla płata obturacyjna cholestaza, podwiązany płat wydaje się nieco jaśniejszy 14 dni po operacji w porównaniu z płatami niepodwiązanymi, które zachowały swój normalny ciemnoczerwonawo-brązowy kolor. Podwiązany płat wykazuje również wzrost proliferacji dróg żółciowych i zwłóknienia w porównaniu z płatami niepodwiązanymi w odpowiedzi na miejscową cholestazę wywołaną podwiązaniem.
Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu 10 do 12 minut, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Po tej procedurze można zastosować inne metody, takie jak śledzenie linii, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące naprowadzania komórek macierzystych do miejsc uszkodzenia i regeneracji wątroby. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak dokonywać znaczących porównań za pomocą częściowego podwiązania dróg żółciowych w celu zidentyfikowania skutków miejscowych i ogólnoustrojowych.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia częściowe podwiązanie przewodu żółciowego jako model chirurgiczny do badania uszkodzenia i regeneracji wątroby u gryzoni. Metoda ta umożliwia obserwację miejscowej cholestazy zatorowej oraz jej wpływu na mechanizmy funkcjonowania wątroby.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Hepatologia
- Regeneracja wątroby
- Modele chirurgiczne
Wstęp
- Zrozumienie uszkodzenia i regeneracji wątroby ma kluczowe znaczenie w hepatologii.
- Lokalna cholestaza zatorowa może dostarczyć cennych informacji na temat mechanizmów funkcjonowania wątroby.
- Badania porównawcze prowadzone na tym samym zwierzęciu zwiększają wiarygodność wyników.
- Model ten jest szczególnie użyteczny w badaniu dynamiki regeneracji wątroby.
Cel badania
- Obserwacja wpływu częściowego podwiązania przewodu żółciowego na uszkodzenie wątroby.
- Identyfikacja mechanizmów zaangażowanych w regenerację wątroby.
- Ustanowienie wiarygodnego modelu chirurgicznego do przyszłych badań hepatologicznych.
Zastosowane metody
- Wykorzystanie znieczulonych myszy szczepu C57 black 6 do przeprowadzenia procedury.
- Wygolenie i zdezynfekowanie okolicy brzusznej przed operacją.
- Unieruchomienie kończyn na stole operacyjnym w celu zapewnienia stabilności.
- Przeprowadzenie operacji pod mikroskopem chirurgicznym w celu zapewnienia precyzji.
Główne wyniki
- Wykazano wykonalność modelu chirurgicznego.
- Ustanowiono metodę porównywania podwiązanych i niepodwiązanych płatów wątroby.
- Dostarczono informacji na temat procesów regeneracyjnych wątroby.
- Umożliwiono dalsze badania nad mechanizmami uszkodzeń wątroby.
Wnioski
- Częściowe podwiązanie przewodu żółciowego jest cennym modelem do badania uszkodzeń wątroby.
- Technika ta umożliwia kontrolowane porównania w obrębie tego samego organizmu.
- Przyszłe badania mogą opierać się na tym modelu, aby dalej zgłębiać procesy regeneracji wątroby.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie przemysłowe
Częściowe podwiązanie przewodu żółciowego (pBDL) stanowi kontrolowany model badania miejscowej cholestazy zastękowej, umożliwiając bezpośrednie porównanie podwiązanego i niepodwiązanego płata wątroby w obrębie tego samego zwierzęcia. Taka konstrukcja z wewnętrzną kontrolą zmniejsza zmienność, ogranicza liczbę wykorzystywanych zwierząt i wspiera merytoryczną weryfikację mechanizmów w procesie walidacji celów hepatologicznych. Podejście to zwiększa pewność prognostyczną poprzez izolację odpowiedzi poszczególnych płatów na gromadzenie żółci oraz szlaki włóknienia.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie hipotez terapeutycznych związanych z miejscowym uszkodzeniem wątroby i szlakami regeneracji.
- Wartość operacyjna: Wspiera ograniczanie ryzyka biologicznego poprzez porównywanie odpowiedzi konkretnych płatów na cholestazę w ramach identycznego tła genetycznego i środowiskowego.
- Wartość prognostyczna: Ułatwia selekcję projektów w portfolio poprzez odróżnienie systemicznych od miejscowych efektów działania leków na proliferację i włóknienie przewodów żółciowych.
Przesiewy i opracowanie testów
- Wartość naukowa: Przygotowuje zwalidowane systemy istotne dla przebiegu choroby do późniejszej standaryzacji testów z wykorzystaniem odczytów biochemicznych specyficznych dla poszczególnych płatów.
- Wartość operacyjna: Zwiększa powtarzalność dzięki zastosowaniu kontrol wewnętrznych, co zmniejsza zapotrzebowanie na oddzielne grupy pozorowane i minimalizuje zmienność międzyosobniczą.
- Skalowalność: Umożliwia ponowne wykorzystanie platformy w modelach przedklinicznych badających mechanizmy działania leków oraz migrację komórek w kontekście cholestazy.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Odpowiada systemom istotnym dla przebiegu choroby poprzez modelowanie ludzkiej cholestazy obstrukcyjnej z proliferacją przewodów żółciowych i włóknieniem specyficznym dla płata.
- Ciągłość translacyjna: Łączy etap odkryć z walidacją przedkliniczną, umożliwiając badania nad śledzeniem linii komórkowych oraz homingiem komórek macierzystych po ligaturze.
- Postęp z uwzględnieniem ryzyka: Wspiera decyzje typu go/no-go poprzez ilościowe określenie lokalnych i systemowych odpowiedzi biomarkerów na zalegające składniki żółci.
Integracja potoku i przepływu pracy
pBDL wpisuje się w ciąg procesu odkrywczego – od walidacji celu po badania przedkliniczne, szczególnie w programach ukierunkowanych na hepatologię, badających mechanizmy uszkodzeń wątroby oraz odpowiedzi regeneracyjne.
- Biologia odkryć: Wspiera testowanie hipotez, umożliwiając porównanie płatów związanych i niezwiązanych w celu wyizolowania lokalnych efektów cholestazy.
- Przesiewy: Dostarcza gotowych do analizy systemów biologicznych z mierzalnymi wynikami, takimi jak biochemia surowicy wątrobowej i zmiany histologiczne w proliferacji przewodów żółciowych.
- Analityka: Zapewnia ilościowe pomiary zmiennych zależnych, w tym poziomy enzymów, zabarwienie płatów i wskaźniki włóknienia, w celu porównania warunków eksperymentalnych.
- Badania translacyjne: Zapewnia ciągłość przedkliniczną poprzez wspieranie analiz pooperacyjnych, takich jak śledzenie linii komórkowych (lineage tracing), w celu badania rekrutacji komórek macierzystych do miejsc uszkodzeń.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Służy jako wielokrotnego użytku platforma chirurgiczna do badania efektów leków i mechanizmów komórkowych w zlokalizowanych modelach chorób wątroby.
Wpływ operacyjny i korporacyjny
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną poprzez redukcję niejednoznaczności mechanistycznej dzięki wewnętrznym porównaniom między płatami.
- Wartość operacyjna: Poprawia standaryzację i powtarzalność poprzez wyeliminowanie zmienności międzyosobniczej dzięki zastosowaniu kontroli w obrębie jednego zwierzęcia.
- Wartość strategiczna: Zwiększa efektywność kapitałową poprzez zmniejszenie strat zwierząt i wydatków w porównaniu z modelami całkowitego podwiązania przewodów żółciowych.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację skorygowaną o ryzyko poprzez odróżnienie zlokalizowanej toksyczności leku od systemowych efektów wątrobowych.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w mikrochirurgii oraz dostępu do mikroskopów chirurgicznych w celu precyzyjnego podwiązania lewego przewodu żółciowego wątrobowego.
- Zależność od instrumentarium, w tym nici nylonowych 10-0, kleszczyków typu mosquito oraz narzędzi do utrzymania pola jałowego.
- Konieczność standaryzacji procedur monitorowania pooperacyjnego i pobierania próbek do biochemii surowicy pomiędzy zespołami.
- Uwzględnienie kwestii adaptacyjnych przy rozszerzaniu modelu na inne szczepy myszy lub badaniu różnych płatów.
- Ograniczenie do badań, w których obstrukcja specyficzna dla danego płata jest wystarczająca do modelowania interesującego stanu chorobowego u ludzi.
