4.12: Testy koimmunoprecypitacyjne i pull-down

Testy koimmunoprecypitacyjne (CoIP) i pull-down są ściśle powiązanymi metodami identyfikacji stabilnych interakcji białko-białko. Metody te są związane z immunoprecypitacją, metodą oddzielania białka docelowego związanego z przeciwciałem od białek niezwiązanych. W CoIP białko związane z przeciwciałem jest samo związane z innym białkiem, które nie wiąże się z przeciwciałem, po czym następuje proces separacji, który zachowuje kompleks białko-białko. Różnica w testach pull-down polega na tym, że białka przynęty znakowane powinowactwem zastępują przeciwciała, a chromatografia powinowactwa jest stosowana do izolowania kompleksów białko-białko.

Ten film wyjaśnia CoIP, testy pull-down i ich implementację w laboratorium. Omówiono protokół krok po kroku dla każdej techniki, w tym odczynników, aparatury i przyrządów używanych do oczyszczania i analizy związanych białek. Ponadto sekcja dotycząca zastosowań w tym filmie opisuje procedurę badania, w jaki sposób białka myksowirusa hamują nukleoproteiny grypy, badanie roli jonów wapnia w kalmodulinie za pomocą testu pull-down oraz zmodyfikowany test pull-down do charakteryzowania przejściowych interakcji białek.

Interakcje białko-białko odgrywają znaczącą rolę w wielu różnych funkcjach biologicznych. Większość interakcji białko-białko i ich skutki biologiczne nie zostały jeszcze zidentyfikowane. Koimmunoprecypitacja lub CoIP i testy pull-down to dwie ściśle powiązane metody identyfikacji stabilnych interakcji białko-białko. W tym filmie omówiono zasady obu testów, ich ogólne procedury laboratoryjne i zastosowania tych technik.

Testy CoIP i pull-down są wariantami immunoprecypitacji, metody selektywnego izolowania gatunku białka ze złożonego roztworu. W eksperymencie immunoprecypitacyjnym przeciwciało specyficzne dla białka docelowego może utworzyć kompleks immunologiczny z tym celem w próbce. Kompleks jest następnie wychwytywany na stałym podłożu, zwykle białku A związanym z kulką sefarozy. Wszelkie białka, które nie zostały wychwycone, są usuwane przez etapy wirowania. Białko jest następnie uwalniane z przeciwciała i stałego podłoża poprzez gotowanie w redukującym buforze ładującym próbkę SDS-PAGE.

Koimmunoprecypitacja jest przeprowadzana w ten sam sposób, z tą różnicą, że nienaruszone kompleksy białkowe są wychwytywane na stałym podłożu. Przeciwciało wiąże się z białkiem docelowym, które z kolei jest związane z innym białkiem, które nie jest celem przeciwciała. Podobnie jak w przypadku immunoprecypitacji, kompleks białkowy jest uwalniany z przeciwciała i stałego nośnika poprzez gotowanie w redukującym buforze ładującym próbkę SDS-PAGE.

Testy pull-down są podobne do koimmunoprecypitacji, różnią się jedynie użyciem białka "przynęty", a nie przeciwciała. Dzięki technikom biologii molekularnej to białko przynęty jest modyfikowane ze znacznikiem powinowactwa, takim jak szereg reszt histydyny. Te znaczniki powinowactwa są opisane w "Separacje biomolekuł oparte na chromatografii". Białko jest następnie wychwytywane na unieruchomionym ligandzie powinowactwa specyficznym dla znacznika. Uchwycone białko jest następnie inkubowane z próbką zawierającą białka, które tworzą kompleksy z "przynętą". Kompleks białkowy jest uwalniany ze wsparcia powinowactwa poprzez przemycie roztworem zawierającym konkurencyjny analit specyficzny dla znacznika białka "przynęty". Testy pull-down są przydatne do potwierdzania interakcji białek przewidywanych przez koimmunoprecypitację oraz do odkrywania nieznanych interakcji białkowych.

Teraz, gdy zasady koimmunoprecypitacji i testów pull-down zostały omówione, przyjrzyjmy się ich procedurom laboratoryjnym.

Najpierw omówmy koimmunoprecypitację. Do szeregu probówek do mikrofuge dodaje się: bufor PBS i 50% roztwór białka A-sefalozy, kompleksu żywica-białko, który wiąże się z przeciwciałem. Rurki mikrofuge są obracane, aby zapewnić odpowiednie rozprowadzenie, a następnie żywica jest przemywana dodatkowym buforem PBS. Lizat komórkowy zawierający pożądane białko i 2 μg przeciwciała dodaje się do probówek do mikrofuge, a mieszaninę obraca się przez 1 godzinę w temperaturze 4 μC. Kulki są granulowane przez odwirowanie, supernatant jest odrzucany, a kulki są ponownie trzykrotnie przemywane buforem w celu usunięcia niezwiązanego białka. Kulki zawierające kompleks przeciwciało-białko znajdują się w buforze redukcyjnym SDS-PAGE do ładowania próbki, do usunięcia kompleksu z przeciwciała i do analizy za pomocą SDS-PAGE i immunoblottingu.

Teraz omówimy procedurę testów pull-down: Białko "przynęty" ulega ekspresji w plazmidzie z odpowiednim znacznikiem powinowactwa. Po osiągnięciu wzrostu w fazie logarytmicznej komórki są poddawane lizie, a następnie odwirowywane. Zawieszone kulki streptawidyny i sefarozy, które wychwytują białko "przynęty" znakowane biotyną, są pipetowane do probówki do mikrofuge. Kulki są następnie odwirowywane, a supernatant ostrożnie usuwany przez aspirację. Kulki są następnie przemywane buforem, odwirowywane, a supernatant usuwany.

Komórki zawierające domniemane białko "ofiary", które ma powinowactwo do białka "przynęty", są zbierane przez odwirowanie. Supernatant dodaje się następnie do probówki do mikrodymy zawierającej żywicę i inkubuje w temperaturze 4 ? C przez 3 godziny na shakerze. Żywica jest następnie odwirowywana, supernatant usuwany, a żywica myta w celu usunięcia niezwiązanego białka. Bufor elucyjny dodaje się do żywicy, a mieszaninę inkubuje się w temperaturze pokojowej przez 30 minut na wytrząsarce. Żywica jest następnie odwirowywana, a supernatant zawierający pożądany kompleks jest analizowany przez immunoblotting.

Teraz, gdy dokonaliśmy przeglądu procedur, przyjrzyjmy się niektórym przydatnym zastosowaniom testów koimmunoprecypitacji i testów pull-down.

Koimmunoprecypitacja może być przydatna w lepszym zrozumieniu mechanizmu działania enzymów. Białka oporności na myksowirusy lub Mx hamują szeroki zakres wirusów, w tym grypę A, której mechanizm jest słabo poznany. Koimmunoprecypitację zastosowano do zbadania interakcji między mysim białkiem Mx1 a nukleoproteiną grypy.

Testy pull-down okazały się przydatne w badaniu wpływu drugich przekaźników, czyli białek przekazujących sygnał ze środowiska komórkowego. Są one składnikiem szlaku sygnałowego, w którym wiele białek oddziałuje na siebie w odpowiedzi na sygnały środowiskowe. Jony wapnia działają jako wtórni przekaźniki, wiążąc się z kalmoduliną, która z kolei wiąże się z szeroką gamą białek, pośrednicząc w wielu typach reakcji biologicznych. Bez wapnia białko nie może wiązać się z kalmoduliną. Przeprowadzono test pull-down w celu zbadania zdolności białek do wiązania się z kalmoduliną w obecności lub braku jonów wapnia.

Testy koimmunoprecypitacji i pull-down są zwykle stosowane do analizy stabilnych lub silnych interakcji białek, ale nie przejściowych. Niedawny wynalazek w testach typu pull-down, HaloTag, uprościł badanie przejściowych interakcji białek; HaloTag to genetycznie kodowany znacznik fuzji białek, połączony z białkiem będącym przedmiotem zainteresowania, zdolny do reakcji chemicznej ze stałym nośnikiem haloalkanowym. Jeśli pożądana jest analiza funkcjonalna, kompleks białkowy, pomniejszony o znacznik, w całości może zostać wyizolowany przez inkubację z proteazą wirusa wytrawiania tytoniu.

Właśnie obejrzałeś film JoVE na temat testów koimmunoprecypitacji i pull-down. Ten film opisał zasady obu metod, ogólne procedury laboratoryjne i niektóre z ich zastosowań.

Dzięki za oglądanie!