Name: Wstrzyknięcie masy komórkowej trans-wewnętrznej embrionalnych komórek macierzystych prowadzi do wyższych wskaźników chimeryzmu (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 53 s
Description: Poznaj zmodyfikowaną metodę wstrzyknięcia komórek macierzystych ES do blastocyst, która zwiększa chimeryzm bez dodatkowego sprzętu. Prosta zmiana orientacji embriona poprawia wydajność produkcji chimer.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było wspierane [częściowo] przez Intramural Research Program NIH, National Institute of Environmental Health Sciences. Specjalne podziękowania dla Shyamala Peddady za analizę statystyczną. Pragniemy również podziękować Humphreyowi Yao, Gary'emu Birdowi i Yuki Arao za recenzję tego manuskryptu oraz Franco DeMayo za jego nieustające wsparcie i rady.

Wszystkie operacje zostały wykonane w ramach normalnego działania obiektu NIEHS Knock Out Mouse Core. Wszystkie myszy były utrzymywane w cyklu światło: ciemność o godzinie 12:12 i były karmione dietą NIH-31 i wodą ad libitum. Wszystkie eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie z Komitetem ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania Narodowego Instytutu Nauk o Zdrowiu Środowiskowym.
1. Przygotowanie zwierząt
<ol>
	<li>Rasa myszy dawców, samice myszy B6(Cg)-Tyr<C-2J>/J w wieku 8 - 10 tygodni naturalnie do samców myszy B6(Cg)-Tyr<c-2J>/J w wieku od 8 do 26 tygodni. Sprawdź wzrokowo wtyczki następnego ranka (E0.5).</li>
	<li>Myszy biorcy rasy szwajcarskiej Webster w wieku od 6 do 9 tygodni są naturalnie hodowane na samcach myszy szwajcarskich Webster poddanych wazektomii. Sprawdź wzrokowo wtyczki następnego ranka (E0.5).</li>
</ol>
2. Przygotowanie komórek ES
<ol>
	<li>W przypadku komórek ES AB2.2 pochodzących ze 129 źródeł, komórki hodowlane w DMEM uzupełnione 15% FBS, 1% glutaminy, 1% Penna / paciorkowca i 0,1% β-merkaptoetanolu. Hoduj wszystkie inne komórki ES zgodnie z instrukcjami dostawcy komórek ES, stosując zalecane przez nich protokoły.</li>
</ol>
3. Pobieranie zarodków
<ol>
	<li>Sekcja zwierząt
	<ol>
		<li>Przygotuj kilka naczyń o średnicy 60 mm, około 1 na 5 myszy plus 3 dodatkowe, z 10 ml pożywki do zbierania strumieniowo-ściernego (BCM) (10% FBS W DMEM) i jednej 4-dołkowej pożywki z 0,5 ml BCM na studzienkę. Zrównoważyć w temperaturze 37 °C, 5% CO2 .</li>
		<li>Poddaj eutanazji samice myszy B6(Cg)-Tyr<c-2J>/J w E3,5 za pomocą uduszenia CO2 przy natężeniu przepływu 10%.</li>
		<li>Po eutanazji ułóż myszy w pozycji leżącej na plecach i dokładnie zwilż brzuch 70% etanolem.</li>
		<li>Wykonaj pierwsze nacięcie tylko przez skórę, w środku brzucha, tak aby otwór był jak najszerszy. Następnie otwórz przez ścianę brzucha, ponownie wykonując nacięcie tak szerokie, jak to możliwe. 
		UWAGA: Wykonanie tej czynności w dwóch krokach pomaga zmniejszyć lub wyeliminować zanieczyszczenie sierści.</li>
		<li>Zaczynając od jajnika i przytrzymując poduszeczkę tłuszczową jajnika kleszczami, ostrożnie usuń jajnik, jajowód i macicę, zwracając szczególną uwagę, aby ograniczyć tkankę tłuszczową do minimum. Usuń macicę jako pojedynczą jednostkę lub jako pojedyncze rogi, bez zmian w poniższej procedurze.</li>
		<li>Po usunięciu umieść macicę w naczyniu o średnicy 60 mm zawierającym pożywkę do zbierania ścierniwa.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Usuwanie zarodków
	<ol>
		<li>Przygotować strzykawkę o pojemności 10 ml wypełnioną BCM i wyposażyć ją w igłę o pojemności 25 g.</li>
		<li>Po jednej macicy na raz, wyjmij je z naczynia podtrzymującego BCM, osusz je na tkance w celu usunięcia nadmiaru krwi i umieść w naczyniu o średnicy 60 mm pod mikroskopem preparacyjnym o małym powiększeniu.</li>
		<li>Ostrożnie i delikatnie trzymając macicę tuż poniżej dystalnego końca (w pobliżu jajowodu) kleszczami preparacyjnymi, włóż igłę do środka macicy w jak najbardziej równoległej płaszczyźnie. Włóż igłę tuż za końcówki kleszczy.</li>
		<li>Wywieraj pewien nacisk na kleszcze, aby przytrzymać macicę przy igle i wydalić około 1 ml BCM przez róg macicy. 
		UWAGA: Na tym etapie należy zachować ostrożność, ponieważ zbyt duży nacisk na strzykawkę spowoduje niekontrolowany strumień pożywki, który często opuszcza naczynie.</li>
		<li>Po przepłukaniu macicy, do 5 całych macic na miskę 60 mm, umieść naczynie z powrotem w inkubatorze do momentu pobrania.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pobieranie zarodków
	<ol>
		<li>Używając ręcznie rysowanej szklanej pipety i pipety do jamy ustnej, zbierz blastocysty pod lunetą sekcyjną, ustawioną między 25X a 35X. (<silna klasa="xfig">Rysunek 1). 
		UWAGA: Pipeta doustna składa się z elastycznej rurki o długości 30 - 40 cm, o średnicy wewnętrznej poniżej 5 mm. Włóż końcówkę pipety o pojemności 1 000 μl, skieruj najpierw do jednego końca i umieść w niej szklaną pipetę. Dodaj filtr strzykawkowy na drugi koniec, z dołączoną lufą strzykawki o pojemności 1 cm3, bez tłoka, aby działał jako ustnik.</li>
		<li>Wyjmując szalki z inkubatora i używając wzoru siatki, zbadaj każdą część szalki pod kątem zarodków. Zarodki są pobierane pojedynczo i umieszczane na kropli BCM w naczyniu wtórnym.</li>
		<li>Po zebraniu ze wszystkich szalek umyj zarodki jeszcze raz w kropli świeżego BCM, a następnie umieść w naczyniu z 4 dołkami w oczekiwaniu na wstrzyknięcie.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Wstrzyknięcie zarodka
<ol>
	<li>Komórki ES należy pobrać pojedynczo za pomocą igły do wstrzykiwań na podstawie potwierdzenia.
	<ol>
		<li>Przygotować naczynie iniekcyjne, dodając 5 - 7 ml pożywki iniekcyjnej (DMEM, 10% FBS i 20 mM HEPES) do naczynia iniekcyjnego ze szklanym dnem. Iniekcje wykonuje się w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Używając mikrowtryskiwacza powietrznego lub olejowego, zastosuj podciśnienie do igły iniekcyjnej, aby wciągnąć komórki ES. Zadbaj o to, aby między komórkami było jak najmniej miejsca. Policz komórki ES tutaj lub na etapie wstrzykiwania.</li>
		<li>Wybierz komórki ES, które są średniej lub małej wielkości w porównaniu z ogólną populacją komórek, o gładkiej powierzchni i bez widocznych defektów, takich jak wakuole. 
		UWAGA: Populacje komórek ES różnią się znacznie pod względem jakości morfologicznej, a stosowane standardy będą musiały się do nich dostosować.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wstrzyknąć zarodkom około 15 komórek ES (<silna klasa="xfig">Ryc. 1).
	<ol>
		<li>Przymocuj końcówkę pipety do drugiego mikrowstrzykiwacza powietrza i umieść zarodek w pobliżu otworu uchwytu. Zastosuj podciśnienie, aby przymocować zarodek do uchwytu.</li>
		<li>Dostosuj do osi z, przesuwając pipetę trzymającą w górę lub w dół, tak aby zarodek dotykał szkiełka, a następnie dokładnie ustaw ostrość na zonę. Następnie wyreguluj oś Z igły do wstrzykiwań tak, aby komórki ES w pobliżu końcówki były ostre.</li>
		<li>Wyreguluj teraz zarodek, delikatnie popychając igłę do wstrzykiwań u góry lub u dołu, obracając ją, aby ustawić ICM w żądanej pozycji.</li>
		<li>Wprowadzić igłę do wstrzykiwań przez zonę i ICM lub trofoblast, używając mocnego, ale kontrolowanego nacisku. Lekko docisnąć mikrowstrzykiwacz igły do wstrzykiwań, aby zapobiec zapadnięciu się blastocoelu.</li>
		<li>Gdy igła wbije się w blastocoel, należy wywrzeć nacisk na mikrowstrzykiwacz, aby przenieść komórki ES do blastocoelu zarodka. Zatrzymaj się na chwilę, gdy skos igły zacznie wychodzić z zarodka, aby ciśnienie w zarodku powróciło do normy, jednocześnie zachowując komórki. 
		UWAGA: Komórki ES grupy referencyjnej zostały wstrzyknięte normalnie, zgodnie z tradycyjnym protokołem wstrzykiwania komórek ES9, uważając, aby nie dotknąć ICM. Komórki ES zostały również wstrzyknięte przez ICM, przepychając igłę bezpośrednio przez ICM (TICM) (<silna klasa="xfig">Rysunek 2, film uzupełniający).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Transfer eEmbrionów
<ol>
	<li>Przenieś zarodki do szwajcarskich myszy Webster w E2.5, używając niechirurgicznego urządzenia do transferu zarodków, zgodnie z procedurami producenta. Ta niechirurgiczna procedura nie wymaga znieczulenia ani specjalnej opieki pooperacyjnej. Myszy domowe pojedynczo po transferze zarodków oraz podczas porodu i późniejszego odsadzenia.</li>
</ol>

<ol><li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+Genome+Engineering+Using+CRISPR%2FCas+Systems%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems.</a> Science. 339 (6), 819-823 (2013).</li>
<li>Mali, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-guided+human+genome+engineering+via+Cas9%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">RNA-guided human genome engineering via Cas9.</a> Science. 339 (6), 823-826 (2013).</li>
<li>Friedel, R., Seisenberger, C., Kaloff, C., Wurst, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EUCOMM+the+European+Conditional+Mouse+Mutagenesis+Program%5BTitle%5D)+AND+%22Brief+Funct+Genomic+Proteomic%22%5BJournal%5D)">EUCOMM the European Conditional Mouse Mutagenesis Program.</a> Brief Funct Genomic Proteomic. 6 (3), 180-185 (2007).</li>
<li>Austin, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+knockout+mouse+project%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">The knockout mouse project.</a> Nat Genet. 36 (9), 921-924 (2004).</li>
<li>Coleman, J. L., Brennan, K., Ngo, T., Balaji, P., Graham, R. M., Smith, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+Knockout+and+Reporter+Mouse+Line+Generation+and+Breeding+Colony+Establishment+Using+EUCOMM+Conditional-Ready+Embryonic+Stem+Cells%3A+A+Case+Study%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Endocrinol+%28Lausanne%29%22%5BJournal%5D)">Rapid Knockout and Reporter Mouse Line Generation and Breeding Colony Establishment Using EUCOMM Conditional-Ready Embryonic Stem Cells: A Case Study.</a> Front Endocrinol (Lausanne). 30, 105(2015).</li>
<li>Nagy, A., Rossant, J., Nagy, R., Abramow-Newerly, W., Roder, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+completely+cell+culture-derived+mice+from+early-passage+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Derivation of completely cell culture-derived mice from early-passage embryonic stem cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 90 (18), 8424-8428 (1993).</li>
<li>Eggan, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Male+and+female+mice+derived+from+the+same+embryonic+stem+cell+clone+by+tetraploid+embryo+complementation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Male and female mice derived from the same embryonic stem cell clone by tetraploid embryo complementation.</a> Nat Biotechnol. 20 (5), 455-459 (2002).</li>
<li>Eggan, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hybrid+vigor%2C+fetal+overgrowth%2C+and+viability+of+mice+derived+by+nuclear+cloning+and+tetraploid+embryo+complementation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Hybrid vigor, fetal overgrowth, and viability of mice derived by nuclear cloning and tetraploid embryo complementation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (11), 6209-6214 (2001).</li>
<li>Eakin, G. S., Hadjantonakis, A. K., Papaioannou, V. E., Behringer, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+potential+and+behavior+of+tetraploid+cells+in+the+mouse+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Developmental potential and behavior of tetraploid cells in the mouse embryo.</a> Dev Biol. 288 (1), 150-159 (2005).</li>
<li>Huang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+production+of+mice+from+embryonic+stem+cells+injected+into+four-+or+eight-cell+embryos+by+piezo+micromanipulation%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Efficient production of mice from embryonic stem cells injected into four- or eight-cell embryos by piezo micromanipulation.</a> Stem Cells. 26 (7), 1883-1890 (2008).</li>
<li>Poueymirou, W. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((F0+generation+mice+fully+derived+from+gene-targeted+embryonic+stem+cells+allowing+immediate+phenotypic+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">F0 generation mice fully derived from gene-targeted embryonic stem cells allowing immediate phenotypic analyses.</a> Nat Biotechnol. 25 (1), 91-99 (2007).</li>
<li>Behringer, R., Gertsenstein, M., Nagy, K. V., Nagy, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBehringer%2C+R+%22Manipulating+the+Mouse+embryo%22">Manipulating the Mouse embryo</a>. , 4th edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press. NY. (2014).</li>
<li>Pease, S., Saunders, T. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPease%2C+S+%22Advanced+Protocols+for+Animal+Transgenesis%22">Advanced Protocols for Animal Transgenesis</a>. , Springer-Verlag. Berlin Heidelberg. (2011).</li>
<li>Young, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+mechanical+stimulation+on+the+reprogramming+of+somatic+cells+into+human-induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res+Ther%22%5BJournal%5D)">Effects of mechanical stimulation on the reprogramming of somatic cells into human-induced pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Res Ther. 8 (1), 139(2017).</li>
</ol>

Autorzy nie mają żadnych sprzecznych interesów, które mogliby ujawnić.

Od dawna uważano, że jakiekolwiek zaburzenie ICM może prowadzić do śmiertelności, w rzeczywistości obecne protokoły mikroiniekcji blastocyst nadal ostrzegają przed tym12,13. Wykazaliśmy tutaj, że mikroiniekcja przez ICM nie jest szkodliwa dla zarodka i zwiększa wydajność chimer.
Dokładny mechanizm tego efektu nie został zidentyfikowany. Jednak mechaniczne rozerwanie ICM i towarzyszący mu hipoblast powinny zwiększyć częstość integracji ...

Przez prawie 25 lat, tworzenie genetycznie ukierunkowanych myszy było powolnym procesem, często hamowanym przez wąskie gardło na etapie mikroiniekcji komórek ES blastocyst w celu wytworzenia chimer przenoszących linię zarodkową. Ostatnie osiągnięcia, w tym CRISPR/Cas91,2 w komórkach ES i wysokoprzepustowe konsorcja generujące komórki ES, takie jak KOMP, poprawiły generację/dostępność genetycznie modyfikowanych komórek ES. Jednak generowanie chimer linii zarodkowej pozostaje wąskim gardłem w tworzeniu genetycznie zmodyfikowanych myszy z tych komórek ES3,4. Wysokoprzepustowe projekty generowania komórek ES są nękane przez dużą zmienność jakości komórek ES, co ma kluczowe znaczenie dla pomyślnego tworzenia chimer linii zarodkowej. Dodatkowo, niektóre z powszechnie wykorzystywanych linii komórkowych ES są znane z wysokiej aneuploidii i trudnej produkcji chimerów kompetentnych dla linii zarodkowej5.
Wiele metod zostało opracowanych do tworzenia myszy z wyższą chimerą lub całkowicie pochodzącymi z komórek ES myszy6,7,8,9,10. Chociaż każdy z tych systemów ma swoje zalety, mają one również swoje wady. Generowanie tetraploidalnych chimer, podczas gdy generuje myszy pochodzące w 100% z komórek ES, jest nieefektywne i generalnie ograniczone do linii niekrewniaczych 5,6. Nowsze metody wstrzykiwania moruli mogą dawać wysoki procent chimer, zbliżający się do 100%, ale generalnie wymagają znacznego dodatkowego sprzętu (lasery lub piezosy) i treningu10,11. W laboratoriach, w których techniki te są już stosowane, ta nowa metodologia może nie być konieczna.
Celem tego badania było znalezienie metody, która wykorzystuje powszechne techniki i łatwo dostępny sprzęt w celu zwiększenia tempa wytwarzania chimer, zwiększając szansę na transmisję linii zarodkowej zmutowanego allelu w celu założenia kolejnej kolonii myszy.

<table><tbody><tr><td>Igła do wstrzykiwań ES Cell</td><td>Humagen</td><td>MSC-20-0</td><td></td></tr><tr><td>NSET Urządzenie</td><td>Paratechs</td><td>60010</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco (life technologies)</td> <td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco (life technologies)</td> <td>10439-024</td><td>partie powinny być indywidualnie testowane pod kątem kompatybilności z ES Cell.</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H0887</td><td></td></tr><tr><td>&#946;-merkaptoetanol</td><td>Sigma</td><td>M7522</td><td></td></tr><tr><td>Mikromanipulator</td><td>Leica</td><td>Mikromanipulator</td><td></td></tr><tr><td>Mikro wtryskiwacz</td><td>Eppendorf AG</td><td>Cell Tram Air 5176</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Leica</td><td>DM IRB</td><td></td></tr><tr><td>4-dołkowy</td><td>talerz Thermo Scientific</td><td>176740</td><td></td></tr><tr><td>Talerz 60 mm</td><td>Sarstedt</td><td>83.3901</td><td></td></tr><tr><td>B6(Cg)-Tyr< c-2J>/J</td><td>Jackson Labs, Bar Harbor, Maine, USA</td><td>000058</td><td></td></tr><tr><td>Swiss Webster myszy</td><td>Taconic, USA</td><td>Tac:SW</td><td></td></tr><tr><td>Naczynie iniekcyjne</td><td>MatTek Corp.</td><td>P50G-0-30-F</td><td></td></tr></tbody></table>

wstrzyknięcie masy komórkowej trans-wewnętrznej embrionalnych komórek macierzystych prowadzi do wyższych wskaźników chimeryzmu

Trans-inner Cell Mass Injection of Embryonic Stem Cells Leads to Higher Chimerism Rates

W celu zwiększenia efektywności w tworzeniu genetycznie modyfikowanych myszy za pomocą metodologii ES Cell, prezentujemy adaptację do obecnego protokołu wstrzykiwania blastocyst. Tutaj donosimy, że prosta rotacja zarodka i wstrzyknięcie przez masę komórkową Trans-Inner (TICM) zwiększyło odsetek myszy chimerycznych z 31% do 50%, bez dodatkowego sprzętu lub dalszego specjalistycznego szkolenia. 26 różnych wsobnych klonów, a łącznie 35 klonów zostało wstrzykniętych w ciągu 9 miesięcy. Nie stwierdzono istotnej różnicy ani w odsetku ciąż, ani w odsetku wyzdrowień zarodków między tradycyjnymi technikami iniekcji a TICM. W związku z tym, bez większych zmian w procesie wstrzykiwania i prostego pozycjonowania blastocysty i wstrzykiwania przez ICM, uwolnienie komórek ES do jamy blastocoelu może potencjalnie poprawić ilość produkcji chimerycznej i późniejszą transmisję linii zarodkowej.

Traktując linię komórkową jako efekt losowy, do analizy danych w oprogramowaniu (np. SAS (wersja 9.2)) wykorzystano liniowy model mieszany. W każdej analizie uwzględniono liczbę przeniesionych embrionów oraz linię komórkową. Druga analiza uwzględniała również liczbę przeżyłych szczeniąt.
W niniejszym badaniu każda linia i klon komórek ES zostały zainfekowane zarówno za pomocą tradycyjnych technik, jak i techniki TICM, naprzemien...

Tutaj prezentujemy protokół zwiększający produkcję chimer bez użycia nowego sprzętu. Prosta zmiana orientacji zarodka do wstrzyknięcia może zwiększyć liczbę produkowanych zarodków i potencjalnie skrócić czas do transmisji w linii zarodkowej.

Wstrzyknięcie masy komórkowej trans-wewnętrznej embrionalnych komórek macierzystych prowadzi do wyższych wskaźników chimeryzmu

In an effort to increase efficiency in the creation of genetically modified mice via ES Cell methodologies, we present an adaptation to the current ...

Ogólnym celem tej zmodyfikowanej procedury jest zwiększenie produkcji chimerycznej bez ponoszenia dodatkowych kosztów lub długich okresów treningowych. Metoda ta może pomóc laboratoriom stać się bardziej wydajnymi w produkcji chimer, szczególnie w przypadkach, gdy komórki ES są mniej niż optymalne. Główną zaletą tej techniki jest to, że nie wymaga dodatkowego sprzętu ani specjalistycznego szkolenia.Dzisiejszą procedurę zademonstruje Thomas Hagler. Jest biologiem i doktorantem, który pracuje w głównym laboratorium. Aby pobrać zarodki, osusz macicę na tkance laboratoryjnej, aby usunąć nadmiar krwi i umieść narząd w nowym 60-milimetrowym naczyniu pod mikroskopem preparacyjnym o małym powiększeniu.Używając kleszczy preparacyjnych, aby ostrożnie i delikatnie przytrzymać macicę w pobliżu jajowodu, włóż igłę o rozmiarze 25 przymocowaną do 10-mililitrowej strzykawki zawierającej 10 mililitrów pożywki do zbierania podmuchów do środka macicy tuż za końcami kleszczy w jak najbardziej równoległej płaszczyźnie. Uciskaj kleszcze, aby zabezpieczyć igłę w macicy i delikatnie przepłucz około jednego mililitra podłoża przez róg macicy. Gdy wszystkie blastocysty zostaną wydalone, zmontuj aparat do pipet doustnych i użyj pipety do jamy ustnej, aby przenieść poszczególne zarodki do pojedynczych kropli pożywki do zbierania blastów w drugim 60-milimetrowym naczyniu.Następnie umyj każdy zarodek w drugiej kropli pożywki do zbierania blasu i przenieś zarodki do naczynia z czterema dołkami aż do ich wstrzyknięcia. Na początek użyj mikrowtryskiwacza, aby zastosować podciśnienie do igły iniekcyjnej. Umieścić naczynie z komórkami ES pod mikroskopem iniekcyjnym, do którego przymocowana jest igła do wstrzykiwań i pipeta z uchwytem zarodka.Dla powodzenia iniekcji niezbędne jest poświęcenie czasu na prawidłowe ustawienie mikroskopu. Obejmuje to odpowiednią ilość pożywki w igle i prawidłowe ustawienie osi z. Za pomocą mikrowstrzykiwacza zastosować podciśnienie do igły iniekcyjnej.Zachowując jak najmniejszą przestrzeń między komórkami, wciągaj gładko wypukłe małe i średnie komórki embrionalne bez widocznych wad z naczynia zarodków. Po zebraniu co najmniej 15 komórek umieść zarodek w pobliżu otworu posiadacza. Zastosuj podciśnienie, aby przymocować zarodek do uchwytu i przesuń pipetę podtrzymującą w górę lub w dół, aby wyregulować oś z, aż zarodek dotknie szkiełka.Dokładnie ustawić ostrość na strefie przezroczystej i wyregulować oś Z igły do wstrzykiwań, aż komórki zarodkowe w pobliżu końcówki igły będą w ostrości. W razie potrzeby należy użyć igły do wstrzykiwań, aby delikatnie przetoczyć blastocystę, aż wewnętrzna masa komórkowa znajdzie się w pozycji odpowiedniej do wstrzyknięcia. Używając mocnego, ale kontrolowanego nacisku, wprowadzić igłę do wstrzykiwań przez strefę przezroczystości do wewnętrznej masy komórkowej i lekko docisnąć mikrowstrzykiwacz igły do wstrzykiwań, aby zapobiec zapadnięciu się blastocoele.Gdy igła wbije się w blastocoele, należy przycisnąć mikrowstrzykiwacz, aby przenieść wszystkie embrionalne komórki macierzyste do zarodka, zatrzymując się na chwilę, gdy skos igły zaczyna opuszczać zarodek, aby ciśnienie w zarodku powróciło do normy, przy jednoczesnym zachowaniu komórek. Po wstrzyknięciu wszystkich blastocyst należy użyć niechirurgicznego urządzenia do transferu zarodków, aby dostarczyć zarodki do stadium embrionalnego 2,5 szwajcarskich myszy Webster zgodnie z instrukcjami producenta i trzymać myszy indywidualnie po każdym transferze przez poród i późniejsze odsadzenie. W tym reprezentatywnym eksperymencie wskaźniki ciąż pozostały niezmienione między wewnętrzną masą komórkową trans, której wstrzyknięto komórkę, a grupą kontrolną, której wstrzyknięto tradycyjnie, a równa liczba młodych przeżyła do odsadzenia od każdej grupy.Warto zauważyć, że podczas gdy liczba myszy w momencie odsadzenia pozostała niezmieniona, znacznie wyższa liczba szczeniąt z grupy, której wstrzyknięto wewnętrzną masę komórkową trans, wykazywała chimeryzm koloru sierści w porównaniu z grupą kontrolną, której wstrzyknięto. Najlepszą częścią tej techniki jest to, że wymaga ona jedynie prostej zmiany orientacji zarodka, aby ułatwić większą produkcję w chimerach. Niezbędne jest prawidłowe ustawienie mikroskopu.Jeśli mikroskop i manipulatory nie są prawidłowo ustawione i dobrze konserwowane, proces wstrzykiwania nie będzie działał. Jeśli dopiero zaczynasz przygodę z wstrzykiwaniem zarodków, powtarzanie jest jedynym sposobem na naukę. Dla początkujących obchodzenie się z zarodkami wydaje się być najtrudniejszą częścią procedury.Zdolność do efektywnego przenoszenia zarodków z jednego naczynia do drugiego bez utraty jakichkolwiek jest najważniejszą częścią eksperymentu. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, w jaki sposób prosta zmiana standardowej techniki iniekcji może pomóc Ci stać się bardziej wydajnym w produkcji chimer.

trans-inner-cell-mass-injection-embryonic-stem-cells-leads-to-higher

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Ze względu na twardy chorion i delikatne embriony, manipulacja zarodkami medaki jest bardziej skomplikowana niż w przypadku danio prążkowanego. W tym filmie zaprezentowano krok po kroku procedury manipulacji embrionami medaki, w tym usuwanie chorionu (dechorionację), unieruchamianie w agarozie do obrazowania oraz transplantację komórek w celu wytworzenia chimer. Procedury te są niezbędne do wykorzystania medaki i danio prążkowanego w laboratorium, aby w pełni skorzystać z ich komplementarnych...

Dechorionizacja zarodków ryby medaka i transplantacja komórek w celu generowania chimer

Za pomocą mikropipet z cienkimi końcówkami wstrzykujemy plazmidowe DNA do poddomen somitów lub cewek nerwowych kurczaka. Stężenie plazmidu jest tak dostosowane, aby uzyskać pojedyncze transfekowane komórki. Następnie pozwalamy komórkom przekształcić się w populacje klonalne.

Transfekcja pojedynczych komórek w zarodkach kurczęt

Wykazujemy tutaj, że przeprogramowanie epigenetyczne za pomocą transferu jąder komórek somatycznych (SCNT) może być wykorzystane jako narzędzie do tworzenia modeli mysich o zdefiniowanych specyficznościach receptorów limfocytów T (TCR). Myszy transjądrowe te wykazują ekspresję odpowiadającego TCR z ich locus endogennego pod kontrolą promotora endogennego.

Myszy transnuklearne o zdefiniowanej specyficzności receptorów limfocytów T przeciwko Toxoplasma gondii uzyskane poprzez SCNT

Generowanie linii indukowanych pluripotentnych komórek macierzystych (iPSC) prowadzi do powstania linii o różnym potencjale rozwojowym, nawet jeśli przechodzą one standardowe testy na pluripotencję. W niniejszym materiale opisujemy protokół otrzymywania myszy pochodzących w całości z iPSC, co definiuje linie iPSC jako posiadające pełną pluripotencję1.

Generowanie myszy pochodzących z indukowanych pluripotentnych komórek macierzystych

Demonstrujemy metodę szczepienia hodowanych komórek w określone miejsca wczesnych embrionów myszy, aby określić ich potencjał in vivo. Wprowadzamy również zoptymalizowaną metodę elektroporacji, która wykorzystuje szklane naczynia włosowate o znanej średnicy, co pozwala na precyzyjne dostarczenie egzogennego DNA do kilku komórek w zarodkach.

Metody precyzyjnie zlokalizowanego transferu komórek lub DNA do wczesnych zarodków myszy po implantacji

Tutaj prezentujemy protokół bezpośredniej konwersji mysich fibroblastów embrionalnych w pełni funkcjonalne i stabilne komórki macierzyste trofoblastu przez dziesięciodniową nadekspresję Tfap2c, Gata3, Eomes i Ets2.

Protokół bezpośredniej konwersji mysich fibroblastów embrionalnych w komórki macierzyste trofoblastu

Opisujemy protokół przeprowadzania przeszczepu in utero (IUT) poprzez dożylne i dożylne drogi iniekcji w modelu mysim. Protokół ten może być stosowany do wprowadzania komórek, wektorów wirusowych i innych substancji do unikalnego środowiska płodu tolerancyjnego na odporność.

Przeszczepienie dożylne i owodniowe w macicy w modelu mysim

W tej metodzie, embrionalne tkanki serca są chirurgicznie mikropreparowane, dysocjowane, znakowane fluorescencyjnie i wszczepiane do tkanek embrionalnych gospodarza. Stanowi to platformę do badania indywidualnej lub tkankowej organizacji rozwoju w ektopowych warunkach hemodynamicznych i/lub zmienionym środowisku parakrynnym/juktakrynowym.

System mikroiniekcji do implantacji in vivo kardiomiocytów zarodkowych w zarodku ptaków

Ogólnym celem tego artykułu jest opisanie, jak przeprowadzić wewnątrzkomórkową iniekcję in ovo materiałów egzogennych do zarodków kurcząt. Takie podejście jest bardzo przydatne do badania biologii rozwoju zarodków kurczaków.

In Ovo Iniekcja donaczyniowa w zarodkach kurczaka

Tutaj prezentujemy protokół rozwoju genetycznie modyfikowanych modeli myszy przy użyciu embrionalnych komórek macierzystych, szczególnie dla dużych DNA knock-in (KI). Protokół ten jest dostrojony przy użyciu edycji genomu CRISPR/Cas9, co skutkuje znacznie lepszą wydajnością KI w porównaniu z konwencjonalną metodą celowania w linearyzowane DNA za pośrednictwem rekombinacji homologicznej.

Wysoce skuteczne celowanie genów za pośrednictwem CRISPR/Cas9 w embrionalnych komórkach macierzystych w celu opracowania modeli myszy zmanipulowanych genami

Poznaj zmodyfikowaną metodę wstrzyknięcia komórek macierzystych ES do blastocyst, która zwiększa chimeryzm bez dodatkowego sprzętu. Prosta zmiana orientacji embriona poprawia wydajność produkcji chimer.

Wstrzyknięcie masy komórkowej trans-wewnętrznej embrionalnych komórek macierzystych prowadzi do wyższych wskaźników chimeryzmu

Przeglądaj więcej filmów