Rezonansowy transfer energii Förster (FRET)

Rezonansowy transfer energii (FRET) to nieradiacyjny transfer energii między cząsteczkami emitującymi światło i jest często używany do badania interakcji biochemicznych bliskiego zasięgu. FRET występuje tylko wtedy, gdy cząsteczki fluorescencyjne są oddalone od siebie w odległości 10 nm. Analizę FRET można łączyć z innymi technikami w celu uzyskania szczegółowych informacji strukturalnych. W tym filmie przedstawimy podstawowe zasady FRET, podsumujemy protokół i prezentację danych oraz omówimy niektóre zastosowania biochemiczne.

Cząsteczka fotoluminescencyjna, taka jak fluorofor, jest wzbudzana przez pochłanianie promieniowania elektromagnetycznego o długości fali w swoim widmie absorpcyjnym. Gdy się rozluźnia, emituje światło o długości fali w swoim widmie emisyjnym. Więcej informacji na temat fluorescencji można znaleźć w filmie JoVE na temat mikroskopii fluorescencyjnej. Różne fluorofory pochłaniają i emitują światło o różnych długościach fal, które często nakładają się na siebie. Jeśli widmo emisyjne fluoroforu w znacznym stopniu pokrywa się z widmem absorpcyjnym innego fluoroforu, ?donor? uwolni wirtualny foton, który zostanie wchłonięty przez ?akceptor?. Gdy wzbudzony donor znajduje się w odległości nie większej niż 10 nm od akceptora, energia jest przenoszona z donora do akceptora w wyniku oddziaływań dipol-dipol. Uwalnianie energii poprzez emisję światła od dawcy odpowiednio się zmniejsza. Tymczasem wzbudzony akceptor emituje światło na swojej długości fali emisyjnej. Odpowiedź FRET jest oceniana pod względem wydajności, czyli procentu energii uwolnionej od dawcy przez FRET, a nie przez fluorescencję lub inne procesy radiacyjne. Wydajność zależy w dużym stopniu od odległości między donorem a akceptorem, co pozwala FRET działać jako linijka "molekularna" lub "spektroskopowa".

W biochemii FRET jest często używany jakościowo do obserwacji zmian konformacyjnych w cząsteczkach poprzez monitorowanie fluoroforów, gdy wchodzą i wychodzą z zakresu FRET względem siebie. Podobnie funkcje komórkowe można badać za pomocą cząsteczek zawierających parę FRET. Jeśli znakowana cząsteczka zostanie rozszczepiona przez aktywność enzymu, FRET zatrzymuje się, a obserwowana długość fali fluorescencji zmienia się.

Teraz, gdy już rozumiesz zasady rządzące FRET, przyjrzyjmy się przeglądowi protokołu oraz kilku sposobom prezentowania i interpretowania danych.

Przed eksperymentem interesujące biomolekuły, zazwyczaj DNA lub białka, są modyfikowane za pomocą znaczników fluorescencyjnych, przy użyciu technik biologii molekularnej. Typowymi sposobami wprowadzania zmodyfikowanego materiału genetycznego do komórek są transfekcja i elektroporacja.

Następnie komórki są przygotowywane do wizualizacji FRET pod mikroskopem fluorescencyjnym. Na przykład cząsteczki mogą być unieruchomione na szkiełku w celu uzyskania pojedynczej cząsteczki FRET lub próbki są ładowane do studzienek w celu przeprowadzenia wysokoprzepustowych badań przesiewowych.

Następnie przygotowywane są lasery wzbudzające, mikroskop i związany z nimi sprzęt. (A) Eksperymenty z fretem często obejmują potężne lasery; (B) w związku z tym należy stosować odpowiednie środki ochrony osobistej i procedury bezpieczeństwa.? Próbka jest następnie umieszczana w przyrządzie i oświetlana laserem wzbudzającym.

Do eksperymentów monitorujących zachowanie komórek wykorzystuje się kolorowe obrazy pokazujące różnice lub zmiany w intensywności emisji. Intensywności emisji donorów i akceptorów są wykreślane razem w celu śledzenia odpowiedzi FRET w czasie.

Dane FRET można również dopasować do różnych funkcji w celu uzyskania bardziej złożonych analiz. W zależności od eksperymentu, dane mogą być prezentowane na wiele sposobów, aby jak najlepiej przedstawić wyniki, co sprawia, że FRET jest elastycznym narzędziem eksperymentalnym.

Teraz, gdy znasz już podstawy prowadzenia i analizowania eksperymentu FRET, przyjrzyjmy się niektórym zastosowaniom FRET w badaniach biochemicznych.

FRET może być używany do badania zmian konformacyjnych lub procesów komórkowych poprzez znakowanie części białka lub komórki, które zgodnie z przewidywaniami będą poruszać się w odległości 10 nm od siebie, za pomocą pary FRET. Na przykład czujniki białek są przygotowywane przez znakowanie receptorów parą fluoroforów. Odpowiedź FRET jest monitorowana na żywo za pomocą mikroskopii konfokalnej. Zmienność długości fali i intensywności emisji wskazuje na zmiany konformacyjne.

FRET może być również stosowany poprzez przygotowanie cząsteczek z aktywną parą FRET i obserwację zmian w odpowiedzi. Kiedy substrat jest rozszczepiony, FRET zostaje zakłócony, powodując wzrost emisji donorowej i spadek emisji akceptora. Emisje są analizowane w celu określenia wkładu według darczyńcy, akceptanta i FRET. Po obliczeniu współczynników emisji bezpośredniej dla białek fluorescencyjnych cyjanu i żółtego można określić stężenie i parametry kinetyczne substratu.

Komórki zaprojektowane do ekspresji monomerów zawierających jedną z par FRET działają jako "czujniki" interakcji między tymi monomerami. Jeśli agregacja tych monomerów jest indukowana, obserwuje się odpowiedź FRET. Można to wykorzystać do zbadania agregacji białek wywołanej przez "wysiewanie" nieprawidłowo sfałdowanych białek. W tym przypadku komórki transdukowano agregatami białka będącego przedmiotem zainteresowania, inkubowano i analizowano za pomocą cytometrii przepływowej.

Właśnie obejrzałeś film JoVE na temat F?rster Resonance Energy Transfer lub FRET. Ten film zawierał podstawowe zasady FRET, przygotowanie i analizę eksperymentu FRET oraz kilka zastosowań biochemicznych.

Dzięki za oglądanie!