Przygotowanie świeżych plastrów siatkówki od dorosłego danio pręgowanego do eksperymentów obrazowania ex vivo
May 9th, 2018
Obrazowanie tkanki siatkówki może dostarczyć informacji o pojedynczej komórce, której nie można uzyskać tradycyjnymi metodami biochemicznymi. Protokół ten opisuje przygotowanie wycinków siatkówki od danio pręgowanego do obrazowania konfokalnego. Fluorescencyjne czujniki kodowane genetycznie lub barwniki wskaźnikowe umożliwiają wizualizację wielu procesów biologicznych w różnych typach komórek siatkówki.
Ogólnym celem tej procedury jest przygotowanie świeżych plastrów siatkówki danio pręgowanego do eksperymentów, które wymagają obrazowania na żywo białek fluorescencyjnych lub biosensorów. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie badań nad wzrokiem, takie jak fizjologiczna i metaboliczna rola jonów wapnia w określonych typach komórek i przedziałach komórkowych w siatkówce. Główną zaletą tej techniki jest to, że dostarcza ona przestrzennych i czasowych informacji o kluczowych metabolitach i cząsteczkach sygnałowych w żywych tkankach.
Aby umożliwić usunięcie nabłonka barwnikowego siatkówki lub RPE z danio pręgowanego, należy przystosować rybę w ciemności przez godzinę przed wykonaniem plastrów tkanki. W komorze do krojenia pomaluj linie lakieru do paznokci na szkiełku. Używając przezroczystego lakieru do paznokci, pomaluj wąskie linie, aby utworzyć prostokąt.
Po wyschnięciu przemaluj lakier raz. Jeśli komora będzie używana do obrazowania statycznego lub eksperymentów iniekcyjnych z minimalnym przepływem roztworu, użyj strzykawki, aby nałożyć dwa równoległe paski wazeliny na szkiełko nakrywkowe, o długości jednego centymetra i oddalone od siebie o 0,5 centymetra. Teraz przygotuj ostrza.
Najpierw wyczyść obosieczną maszynkę do golenia etanolem i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu. Następnie użyj nożyczek, aby pokroić go na około centymetrowe kawałki. Następnie umieść komorę krojenia na stoliku krajalnicy do tkanek, wyśrodkuj ją poziomo na stole montażowym i zaznacz długą krawędź trwałym markerem w celu wyrównania.
Następnie załaduj kawałek ostrza na ramię krajalnicy. Zabezpiecz ostrze tak, aby krawędź znajdowała się nad środkiem zjeżdżalni i biegła równolegle do powierzchni ślizgu, ale nie dotykała lakieru do paznokci. Następnie opuść ramię ostrza za pomocą jednego czwartego obrotu.
Teraz spróbuj pokroić bibułę filtracyjną. W razie potrzeby ponownie zamontuj ostrze. Aby kontynuować, za pomocą strzykawki umieść pojedynczą, małą kropkę galaretki w 10-centymetrowym naczyniu, około 1,5 centymetra od punktu środkowego.
Następnie wciśnij suchą stronę szkiełka nakrywkowego w galaretkę za pomocą kleszczy. Następnie umieść kolejną małą kropkę galaretki około jednego centymetra od krawędzi wlotowej komory obrazowania. Teraz użyj igły o rozmiarze 20, aby zrobić dwa cienkie równoległe paski wazeliny o długości jednego centymetra wzdłuż środka komory krojenia w odległości około jednego centymetra od siebie.
Następnie przenieś danio pręgowanego na naczynie i przemieszcz rybę szyjką macicy bez dekapitacji. Teraz użyj drucianej pętli, aby poluzować tkankę łączną wokół jednego oka, a następnie delikatnie pociągnij oko do przodu. Następnie ostrożnie przeciąć biały nerw wzrokowy pod okiem za pomocą mikronożyczek, ale nie przecinaj tylnej części oka.
Aby kontynuować, przenieś oko do naczynia z zimnym roztworem Ringera na lodzie. Następnie zbierz drugie oko. Kontynuuj pracę przy czerwonym świetle, aż wszystkie RPE zostaną usunięte.
Następnie przenieś jedno oko do kropli zimnego roztworu Ringera na szklanym szkiełku na szalce Petriego. Następnie umieść naczynie pod mikroskopem preparacyjnym o małej mocy, aby przeciąć muszlę oczną w czerwonym świetle. Najpierw przebij rogówkę cienkimi kleszkami.
Następnie za pomocą kleszczy i nożyczek delikatnie usuń kawałki przezroczystej kruchej rogówki i srebrzystej twardówki. Następnie wyjmij i wyrzuć soczewkę i większość twardówki, aby odizolować muszlę oczną. Przy minimalnym obchodzeniu się z nim usuń wszelkie kawałki tłuszczu i twardówki, które pozostają przyczepione do muszli ocznej, bez usuwania siatkówki.
Jeśli siatkówka oddzieli się od RPE, należy postępować ze szczególną ostrożnością, aby uniknąć uszkodzenia delikatnej siatkówki. Teraz ustaw muszlę oczną otwartą stroną do dołu i pokrój ją na trzy lub ćwiartki nowym ostrzem. Wyrzuć kawałki muszli ocznej, które są zbyt zakrzywione, aby się spłaszczyć.
Te kawałki są często zbyt małe, aby mogły być przydatne w każdym przypadku. Aby zamontować sekcje siatkówki, zwilż kawałek bibuły filtracyjnej roztworem Ringera i użyj płaskich kleszczyków, aby umieścić go obok elementów muszli ocznej. Następnie zanurz bibułę filtracyjną i chusteczki w zimnym roztworze Ringera.
Następnie użyj kleszczy, aby umieścić kawałki siatkówki na bibule filtracyjnej z RPE i fotoreceptorami do góry. Delikatnie dotykaj krawędzi kawałków muszli ocznej drobnymi kleszkami, aby ustawić je w jedną linię na środku bibuły filtracyjnej. Teraz spłaszcz siatkówkę, używając kleszczyków, aby podnieść bibułę filtracyjną z dołączoną siatkówką i położyć ją na suchym ręczniku papierowym.
Przez około trzy sekundy pozwól, aby siła płynu przenikającego do ręcznika papierowego spłaszczyła siatkówkę. Przetwarzaj wszystkie kawałki siatkówki w ten sposób, po prostu nie pozwól im wyschnąć. Teraz nałóż kroplę roztworu Ringera i za pomocą cienkich kleszczyków usuń pozostałe czarne arkusze RPE z tkanki.
Delikatnie obierz, a jeśli siatkówka oderwie się od papieru, odsuń więcej roztworu jak poprzednio, a powinien się ponownie spłaszczyć. Teraz przenieś papier z kawałkami siatkówki na szkiełko i przytnij papier do prostokąta, pozostawiając około 0,5 centymetra po każdej stronie rzędu tkanki. Następnie przenieś bibułę filtracyjną do przygotowanej komory krojenia.
Wciśnij długie krawędzie bibuły filtracyjnej w cienkie linie wazeliny za pomocą kleszczy, a następnie zanurz siatkówki w trzech do czterech kroplach zimnego roztworu Ringera. Najpierw przenieś preparat do etapu krajalnicy do tkanek. Ustaw dłuższą krawędź wzdłuż zaznaczonej linii i przymocuj końce komory do stolika taśmą laboratoryjną.
Następnie, zaczynając od jednego końca, przetnij siatkówkę i bibułę filtracyjną, mocno i delikatnie naciskając na ramię krojące. Sprawdź, czy pierwszy plasterek został całkowicie pocięty, a następnie przystąp do krojenia za pomocą mikrometru plastrów o grubości około 400 mikronów. Następnie przenieś komorę z pokrojonymi sekcjami na szalkę Petriego zawierającą przygotowane szkiełko nakrywkowe, które posłuży jako drabina do obrazowania.
Zalej naczynie zimnym roztworem Ringera i umieść je na stoliku mikroskopu preparacyjnego. Teraz, przy małym powiększeniu, użyj kleszczy, aby zabezpieczyć pasek i przesunąć go na drabinę obrazowania, przesuwając leżącą pod spodem szalkę Petriego. Obróć plastry o 90 stopni i zakop krawędzie bibuły filtracyjnej w galarecie.
Ważne jest, aby siatkówka była zanurzona i unikała bezpośredniego kontaktu z siatkówką. Następnie zmień położenie plastrów w drabinkach, tak aby warstwy siatkówki były wyraźnie widoczne. W przypadku plastrów na każdym końcu drabinki należy ustawić siatkówkę skierowaną do wewnątrz, w kierunku innych plastrów, aby zminimalizować ruch podczas wstrzykiwania lub przepływu.
Wyrzuć wszystkie plasterki, które nie przylegają dobrze do papieru. Teraz poplam tkankę. W międzyczasie przygotuj komorę obrazowania i aparat iniekcyjny.
Najpierw przepłucz rurkę roztworem Ringera, aż nie pozostaną żadne pęcherzyki powietrza. Następnie podłącz rurkę do wlotu komory obrazowania i zamknij kurek odcinający. Następnie należy ponownie napełnić strzykawkę roztworem do wstrzykiwań i ponownie podłączyć ją do rurki.
Teraz za pomocą kleszczy przenieś przygotowaną drabinę obrazowania do komory obrazowania. Wciśnij go w kropkę galaretki w pobliżu krawędzi wlotu i napełnij komorę roztworem Ringera, aby przykryć plastry. Następnie przystąp do obrazowania.
Korzystając z opisanych technik, idealnie poprzeczne plastry mogą być obrazowane przez wszystkie warstwy siatkówki. Po lekkim obróceniu widoczne będą wiązki zewnętrznych segmentów. Za pomocą barwienia PI można wyeliminować martwe komórki z analizy.
Zdrowe fotoreceptory PI-ujemne mają stereotypowo spolaryzowaną wydłużoną morfologię. W natlenionym Ringerze można je obrazować do czterech godzin. Jedną ze strategii obrazowania jest wizualizacja dynamiki retikulum endoplazmatycznego fotoreceptora czopka w stosunku do jądra.
Używając tkanek, które wyrażają GFP i stożek ER, jednocześnie przeciwbarwiąc barwnikiem jądrowym. Podobną strategię można zastosować do oglądania cytoszkieletu aktynowego z tkanką wyrażającą aktynę skondensowaną z GFP. Za pomocą obrazowania poklatkowego można zaobserwować dynamikę komórkową, taką jak cytozolowe fluktuacje wapnia w fotoreceptorze czopka.
Na przykład, podczas izotonicznie zubożającego sód w komorze obrazowania, GCaMP może być używany do wizualizacji rosnących stężeń wapnia cytozolowego. Poprzez ilościowe określenie odpowiedzi fluorescencyjnych z zewnętrznych segmentów pojedynczego stożka, ciał komórkowych i synaps, można określić wewnątrzkomórkową dynamikę wapnia podczas manipulacji farmakologicznych i tak dalej. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o użyciu czerwonego światła przed usunięciem RPE.
Ostrożnie spłaszcz muszle oczne przed pokrojeniem i trzymaj plastry zanurzone przez cały czas. Po opanowaniu rozwarstwienie tkanki, krojenie i przygotowanie do obrazowania można wykonać w mniej niż 30 minut. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przygotować plasterki siatkówki od danio pręgowanego do badania metabolizmu i fizjologii w określonych typach komórek w przedziałach komórkowych.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Ten artykuł przedstawia protokół przygotowywania świeżych przekrojów siatkówki ryby labiryntowej do obrazowania na żywo za pomocą fluorescencyjnych biosensorów. Metodologia ma na celu zwiększenie zrozumienia roli jonów wapnia w określonych typach komórek i przedziałach siatkówki, dostarczając kluczowych informacji przestrzennych i czasowych na temat procesów biologicznych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauki
- Biologia siatkówki
- Techniki obrazowania
Tło
- Obrazowanie tkanki siatkówki pozwala na analizę pojedynczych komórek, której nie można osiągnąć za pomocą biochemii.
- Ryby labiryntowe są cennym modelem do zrozumienia funkcji siatkówki kręgowców.
- Technika zapewnia wgląd w dynamikę jonów wapnia w komórkach siatkówki.
Cel badania
- Zbadanie fizjologicznych i metabolicznych ról jonów wapnia w komórkach siatkówki ryby labiryntowej.
- Opracowanie niezawodnej metody uzyskania żywych przekrojów siatkówki do obrazowania.
- Zwiększenie zrozumienia procesów komórkowych w badaniach nad widzeniem.
Zastosowane metody
- Platforma do obrazowania ex vivo wykorzystująca świeże przekroje siatkówki ryby labiryntowej.
- Model biologiczny obejmuje komórki siatkówki i ich przedziały komórkowe.
- Kluczowe kroki obejmują adaptację ryb do ciemności, staranne sekcjonowanie i zanurzenie w zimnym roztworze Ringera.
- Metoda opisuje przygotowanie komór cięcia, techniki cięcia i pozycjonowanie przekrojów siatkówki do obrazowania.
Główne wyniki
- Metoda umożliwiła obserwację dynamiki jonów wapnia w żywych tkankach siatkówki.
- Zdobyto kluczowe informacje na temat sygnalizacji metabolicznej i przetwarzania wzrokowego w różnych typach komórek siatkówki.
- Zwiększono mechanistyczne zrozumienie wpływu jonów wapnia na funkcjonalność siatkówki.
Wnioski
- To badanie ustanawia protokół, który ułatwia obrazowanie na żywo w siatkówce ryby labiryntowej, poszerzając zrozumienie procesów komórkowych związanych z widzeniem.
- Zdobyte informacje mogą przyczynić się do szerszych implikacji dla badań nad mechanizmami neuronowymi w zdrowiu i chorobach siatkówki.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
This method enables live imaging of retinal cell types in adult zebrafish, providing a physiologically relevant system for studying calcium signaling and metabolic processes in vision research. By preserving retinal architecture and cellular diversity, it supports target validation and mechanistic de-risking in preclinical neuroscience programs. The approach bridges discovery biology with translational relevance for retinal disease models.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses in specific retinal cell types using fluorescent biosensors.
- Operational Value: Provides spatially resolved data on calcium dynamics to clarify pathway involvement in retinal function.
- Predictive Value: Supports biological de-risking by linking molecular targets to functional readouts in intact tissue.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates reproducible retinal slices suitable for perfusion-based imaging and compound testing.
- Quantitative Output: Enables fluorescence-based measurements of metabolite fluxes in defined cellular compartments.
- Scalability: Allows serial slice preparation from single animals for multi-condition screening.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Supports study of retinal cell types implicated in blinding diseases through live imaging of biosensors.
- Translational Continuity: Maintains retinal lamination and cell-type specificity from discovery to preclinical validation.
- Risk-Adjusted Decisions: Provides mechanistic insights to inform target prioritization in vision therapeutics.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery-to-preclinical continuum by enabling functional validation of retinal targets prior to lead optimization.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of calcium signaling roles in photoreceptors, bipolar, and microglial cells.
- Screening: Delivers standardized, perfusion-compatible tissue for evaluating compound effects on retinal physiology.
- Analytics: Provides quantitative fluorescence readouts for assessing target engagement and pathway modulation.
- Translational Research: Connects in vitro findings to intact retinal tissue physiology, enhancing predictive confidence.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for longitudinal studies of retinal cell biology and drug response.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in retinal signaling.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized slicing, mounting, and imaging procedures.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by linking target modulation to functional retinal phenotypes.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted advancement of vision therapeutics based on human-relevant retinal data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in zebrafish handling, retinal dissection, and live tissue imaging.
- Dependent on access to vibratory tissue slicers, confocal microscopes, and perfusion systems.
- Necessitates standardization across teams for consistent slice thickness and RPE removal.
- Adaptation to other model systems may require optimization of dissection and slicing parameters.
- Practical limitations include tissue viability duration and sensitivity to mechanical stress during preparation.
