Name: Przygotowanie świeżych plastrów siatkówki od dorosłego danio pręgowanego do eksperymentów obrazowania ex vivo (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-09T12:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 1 s
Description: Naucz się przygotowywać świeże plastry siatkówki danio pręgowanego do obrazowania żywych tkanek. Ta metoda umożliwia badanie dynamiki jonów wapnia w komórkach siatkówki z rozdzielczością przestrzenną i czasową.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dziękujemy Ralphowi Nelsonowi i Danielowi Possinowi za przemyślane wskazówki podczas opracowywania tego protokołu, a także Evie Ma, Ashley George i Gail Stanton za stworzenie stabilnych transgenicznych linii danio pręgowanego. Prace były wspierane przez NSF GRFP 2013158531 do M.G., NIH NEI 5T32EY007031 do W.C. i M.G. oraz EY026020 do J.H. i S.B.

<ol><li>Lieschke, G., Currie, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+human+disease%3A+zebrafish+swim+into+view%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Animal models of human disease: zebrafish swim into view.</a> Nat. Rev. Genet. 8 (5), 353-367 (2007).</li>
<li>Ma, E., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3789190/">Loss of Pde6 reduces cell body Ca2+ transients within photoreceptors.</a> Cell Death Dis. 4 (9), e797(2013).</li>
<li>Niethammer, P., Grabher, C., Look, A., Mitchison, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+tissue-scale+gradient+of+hydrogen+peroxide+mediates+rapid+wound+detection+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A tissue-scale gradient of hydrogen peroxide mediates rapid wound detection in zebrafish.</a> Nature. 459 (7249), 996-999 (2009).</li>
<li>Andrews, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualising+apoptosis+in+live+zebrafish+using+fluorescence+lifetime+imaging+with+optical+projection+tomography+to+map+FRET+biosensor+activity+in+space+and+time%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biophotonics%22%5BJournal%5D)">Visualising apoptosis in live zebrafish using fluorescence lifetime imaging with optical projection tomography to map FRET biosensor activity in space and time.</a> J. Biophotonics. 9 (4), 414-424 (2016).</li>
<li>Kioka, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+intramitochondrial+ATP+levels+identifies+G0%2FG1+switch+gene+2+as+a+positive+regulator+of+oxidative+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Evaluation of intramitochondrial ATP levels identifies G0/G1 switch gene 2 as a positive regulator of oxidative phosphorylation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 111 (1), 273-278 (2014).</li>
<li>Muto, A., Ohkura, M., Abe, G., Nakai, J., Kawakami, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-Time+Visualizationof+Neuronal+Activity+during+Perception%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Real-Time Visualizationof Neuronal Activity during Perception.</a> Curr. Biol. 23 (4), 307-311 (2013).</li>
<li>Stewart, A., Braubach, O., Spitsbergen, J., Gerlai, R., Kalueff, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+models+for+translational+neuroscience+research%3A+from+tank+to+bedside%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Zebrafish models for translational neuroscience research: from tank to bedside.</a> Trends Neurosci. 37 (5), 264-278 (2014).</li>
<li>Zou, S. -Q., Yin, W., Zhang, M. -J., Hu, C. -R., Huang, Y. -B., Hu, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+the+optokinetic+response+to+study+visual+function+of+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Using the optokinetic response to study visual function of zebrafish.</a> J. Vis. Exp. (36), e1742(2010).</li>
<li>Neuhauss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavioral+genetic+approaches+to+visual+system+development+and+function+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Behavioral genetic approaches to visual system development and function in zebrafish.</a> J. Neurobiol. 54 (1), 148-160 (2002).</li>
<li>Stearns, G., Evangelista, M., Fadool, J., Brockerhoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Mutation+in+the+Cone-Specific+pde6+Gene+Causes+Rapid+Cone+Photoreceptor+Degeneration+in+Zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A Mutation in the Cone-Specific pde6 Gene Causes Rapid Cone Photoreceptor Degeneration in Zebrafish.</a> J. Neurosci. 27 (50), 13866-13874 (2007).</li>
<li>Gross, J., Perkins, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+mutants+as+models+for+congenital+ocular+disorders+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Reprod.+Dev%22%5BJournal%5D)">Zebrafish mutants as models for congenital ocular disorders in humans.</a> Mol. Reprod. Dev. 75 (3), 547-555 (2007).</li>
<li>Lewis, A., Williams, P., Lawrence, O., Wong, R., Brockerhoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wild-Type+Cone+Photoreceptors+Persist+Despite+Neighboring+Mutant+Cone+Degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Wild-Type Cone Photoreceptors Persist Despite Neighboring Mutant Cone Degeneration.</a> J. Neurosci. 30 (1), 382-389 (2010).</li>
<li>Wang, T. -M., Holzhausen, L., Kramer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+an+optogenetic+pH+sensor+reveals+that+protons+mediate+lateral+inhibition+in+the+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Imaging an optogenetic pH sensor reveals that protons mediate lateral inhibition in the retina.</a> Nat. Neurosci. 17 (2), 262-268 (2014).</li>
<li>Van Hook, M., Thoreson, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+Whole-cell+Recordings+from+Photoreceptors+and+Second-order+Neurons+in+an+Amphibian+Retinal+Slice+Preparation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Simultaneous Whole-cell Recordings from Photoreceptors and Second-order Neurons in an Amphibian Retinal Slice Preparation.</a> J. Vis. Exp. (76), e50007(2013).</li>
<li>Connaughton, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+retinal+slice+preparation%5BTitle%5D)+AND+%22Meth.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Zebrafish retinal slice preparation.</a> Meth. Cell Sci. 25 (1/2), 49-58 (2003).</li>
<li>Kennedy, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+zebrafish+cone+photoreceptor-specific+promoter+and+genetic+rescue+of+achromatopsia+in+the+nof+mutant%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">Identification of a zebrafish cone photoreceptor-specific promoter and genetic rescue of achromatopsia in the nof mutant.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 48 (2), 522-529 (2007).</li>
<li>George, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptojanin+1+is+required+for+endolysosomal+trafficking+of+synaptic+proteins+in+cone+photoreceptor+inner+segments%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Synaptojanin 1 is required for endolysosomal trafficking of synaptic proteins in cone photoreceptor inner segments.</a> PLoS ONE. 9 (1), e84394(2014).</li>
<li>George, A. Synaptojanin1 is involved in endolysosomal trafficking in cone photoreceptors (Doctoral dissertation). , Available from:
 <a target="_blank" href="http://hdl.handle.net/1773/33102">http://hdl.handle.net/1773/33102</a> (2015).</li>
<li>Shin, J., Chen, J., Solnica-Krezel, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+homologous+recombination-mediated+genome+engineering+in+zebrafish+using+TALE+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Efficient homologous recombination-mediated genome engineering in zebrafish using TALE nucleases.</a> Development. 141 (19), 3807-3818 (2014).</li>
<li>Giarmarco, M., Lindsay, K., Du, J., Cleghorn, W., Brockerhoff, S., Hurley, J. Imaging Real-time Glucose Uptake Reveals Distinct Transport Among Cell Types. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. , Poster abstract (2015).</li>
<li>Kanow, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+adaptations+of+the+retina+and+retinal+pigment+epithelium+support+a+metabolic+ecosystem+in+the+vertebrate+eye%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Biochemical adaptations of the retina and retinal pigment epithelium support a metabolic ecosystem in the vertebrate eye.</a> eLife. 6, (2017).</li>
<li>Giarmarco, M., Cleghorn, W., Sloat, S., Hurley, J., Brockerhoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria+Maintain+Distinct+Ca2%2B+Pools+in+Cone+Photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Mitochondria Maintain Distinct Ca2+ Pools in Cone Photoreceptors.</a> J. Neurosci. 37 (8), 2061-2072 (2017).</li>
<li>Uckermann, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+staining+by+vital+dyes+of+M%C3%BCller+glial+cells+in+retinal+wholemounts%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Selective staining by vital dyes of Müller glial cells in retinal wholemounts.</a> Glia. 45 (1), 59-66 (2003).</li>
<li>Johnson, S., Rabinovitch, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+imaging+of+excised+tissue+using+vital+dyes+and+confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Current+protocols+in+cytometry%22%5BJournal%5D)">Ex vivo imaging of excised tissue using vital dyes and confocal microscopy.</a> Current protocols in cytometry. , Chapter 9, Unit 9.39 (2012).</li>
<li>Kulkarni, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+Ca2%2B+Dynamics+in+Cone+Photoreceptor+Axon+Terminals+of+the+Mouse+Retina%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina.</a> J. Vis. Exp. (99), (2015).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Obrazowanie ex vivo świeżych plastrów siatkówki danio pręgowanego okazało się wszechstronnym narzędziem do badania biologii fotoreceptorów 20,21,22 i jest wyjątkowe, ponieważ umożliwia analizę pojedynczych komórek w dojrzałej, w pełni zróżnicowanej siatkówce. Przy odrobinie wprawy możliwe jest przeprowadzenie wielu eksperymentów na tkance pochodzącej z jednej ryby, nawet przy użyciu seryjnych plastrów z tej samej części...

Danio rerio (danio rerio) stał się powszechnie stosowany w medycynie i podstawowych badaniach naukowych1, ze względu na swoje małe rozmiary, szybki rozwój i układy narządów kręgowców. Naturalna przezroczystość larw danio pręgowanego w połączeniu z ustalonymi metodami transgenezy umożliwiła szczegółową wizualizację procesów komórkowych u żywego zwierzęcia. Szereg genetycznie kodowanych biosensorów fluorescencyjnych zostało ukierunkowanych na określone komórki danio pręgowanego w celu wykrycia Ca2+ 2, nadtlenek wodoru3, aktywacja apoptotyczna4 i ATP5.
Obrazowanie in vivo larw danio pręgowanego doprowadziło do przełomowych odkryć w dziedzinie neuronauki, w tym mapowania obwodów mózgu6 i opracowania leków na zaburzenia ośrodkowego układu nerwowego7. Danio pręgowany dobrze nadaje się do badań nad wzrokiem, ponieważ ich siatkówki mają strukturę laminarną i typy neuronów wyższych kręgowców, a także wykazują silne zachowania wizualne8,9. Kilka typów zwyrodnień siatkówki analogicznych do chorób u ludzi zostało z powodzeniem modelowanych i badanych u danio pręgowanego10,11, w tym obrazowanie na żywo poszczególnych fotoreceptorów degenerujących się w siatkówce2,12.
Chociaż obrazowanie larw danio pręgowanego in vivo jest cennym narzędziem, staje się ono coraz trudniejsze w miarę wzrostu ryb i rozwoju pigmentacji, a niektóre zabiegi farmakologiczne nie są w stanie objąć całego zwierzęcia. Co więcej, niektóre procesy komórkowe zmieniają się wraz z rozwojem i wiekiem, co sprawia, że późniejsze punkty czasowe mają kluczowe znaczenie dla zrozumienia funkcji i postępu choroby u dorosłych zwierząt. Metody biochemiczne, takie jak immunoblot, ilościowy PCR, zużycieO2 i analizy metabolomiczne, mogą dostarczyć ważnych wskazówek na temat biologii siatkówki jako całości, ale trudno jest dostrzec udział poszczególnych typów komórek dotkniętych chorobą. Obrazowanie izolowanej tkanki siatkówki ex vivo omija te problemy i chociaż obrazowanie płaskich siatek daje widok na zewnętrzną siatkówkę13, głębsze wewnętrzne cechy siatkówki są zasłonięte. Poprzeczne wycinki siatkówki, takie jak te prezentowane w stałych analizach immunohistochemicznych, umożliwiają wyraźny obraz wszystkich warstw i typów komórek, ale oferują tylko jedną migawkę dynamicznych procesów związanych z normalnym funkcjonowaniem i chorobą.
Tutaj prezentujemy metodę generowania ex vivo poprzecznych wycinków siatkówki od dorosłych ryb pręgowanych do obrazowania. Jest to podobne do metod przygotowania wycinków siatkówki i danio pręgowanego do badań elektrofizjologicznych i morfologicznych14,15, z istotnymi modyfikacjami dla obrazowania poklatkowego ex vivo przy użyciu mikroskopii konfokalnej. Reakcje fluorescencyjne biosensorów lub barwników w plasterkach są monitorowane w czasie rzeczywistym za pomocą mikroskopu konfokalnego podczas dostarczania środków farmakologicznych za pomocą perfuzji. Chociaż metoda została opracowana do obrazowania fotoreceptorów, możliwe jest jej wykorzystanie do wizualizacji komórek Müllera, komórek dwubiegunowych, komórek poziomych, komórek amakrynowych lub komórek zwojowych siatkówki za pomocą odpowiednich markerów fluorescencyjnych. Dodatkowo plastry można ładować fluorescencyjnymi barwnikami przepuszczalnymi dla komórek, aby zgłosić żywotność komórek, transport pęcherzykowy, funkcję mitochondriów lub stan redoks. Ten wszechstronny preparat umożliwia wizualizację szerokiego zakresu procesów subkomórkowych w całej siatkówce, w tym dynamikiCa2+, transdukcji sygnału i stanu metabolicznego.

<table><tbody><tr><td>Ryba pręgowana</td><td>Uniwersytet Waszyngtoński South Lake Union Aquatics Facility</td><td></td><td>Zapasy utrzymywane we własnym zakresie jako stabilne linie transgeniczne</td></tr><tr><td>wazelina</td><td>Fisher Scientific</td><td>19-090-843</td><td>do strzykawki z wazeliną</td></tr><tr><td>3 ml strzykawka z końcówką Fisher</td><td>Scientific</td><td>14-823-436</td><td>do strzykawki z wazeliną</td></tr><tr><td>20g 3,8 cm igła z końcówką poślizgową</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-826-5B</td><td>do strzykawki z wazeliną</td></tr><tr><td>gładkiej 7 cm X 2,5 cm szkiełko mikroskopowe</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-A3</td><td>do wycinki muszli ocznej, komora krojenia</td></tr><tr><td>Bezbarwny lakier do paznokci Seche Vite</td><td>Amazon</td><td>B00150LT40</td><td>do komory krojenia</td></tr><tr><td>18 mm X 18 mm #1 szklane szkiełka nakrywkowe</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-542A</td><td>do drabinek obrazowych</td></tr><tr><td>niearomatyzowany wosk dentystyczny</td><td>Amazon</td><td>B01K8WNL5A</td><td>do drabin obrazowych</td></tr><tr><td>Żyletki z podwójną krawędzią</td><td>Stoelting</td><td>51427</td><td>do krajalnicy do krojenia tkanek</td></tr><tr><td>z mikrometrem cyfrowym</td><td>Stoelting</td><td>51415</td><td>do</td></tr><tr><td>bibułki filtracyjnej do krojenia tkanek - biała celuloza mieszana w kratkę, średnica 13 mm, 0,45 &mikro; m wielkość porów</td> Papier filtracyjny <td>EMD Millipore</td><td>HAWG01300</td><td>do montażu siatek 10</td></tr><tr><td>cm szalka Petriego</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875712</td><td>do eutanazji, sekcji, obrazowania ryb montaż drabiny</td></tr><tr><td>15 cm z gładką drewnianą końcówką</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-400-112</td><td>do drucianej pętli oczkowej</td></tr><tr><td>30g (średnica 0,25 mm) drut wolframowy</td><td>Fisher Scientific</td><td>AA10408G6</td><td>do Pętla oczkowa z drutu</td></tr><tr><td>D-glukoza</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G8270</td><td>składnik roztworu podstawowego suplementu</td></tr><tr><td>L-mleczan sodu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L7022</td><td>składnik roztworu podstawowego suplementu</td></tr><tr><td>pirogronian sodu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P2256</td><td>składnik roztworu podstawowego suplementu</td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G3126</td><td>składnik roztworu podstawowego suplementu</td></tr><tr><td>&nbsp; L-glutation, zredukowany</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G4251</td><td>składnik suplementu roztwór podstawowy</td></tr><tr><td>Kwas L-askorbinowy</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A5960</td><td>składnik roztworu podstawowego suplementu</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S7653</td><td>składnik roztworu Ringera</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9333</td><td>składnik roztworu</td></tr> <tr><td>RingeraCaCl2 &middot; 2H2O</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C3881</td><td>składnik roztworu Ringera</td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S8282</td><td>składnik roztworu Ringera</td></tr><tr><td>MgCl2 &middot; 6H2O</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M0250</td><td>składnik roztworu Ringera</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3375</td><td>składnik roztworu Ringera</td></tr><tr><td>Baza Tris</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152</td><td>składnik Na+ roztwór Ringera</td></tr><tr><td>6 N HCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-003-063</td><td>składnik Na+ wolny od roztworu</td></tr><tr><td>Ringera KH2PO4</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5655</td><td>składnik Na+ bez roztworu Ringera</td></tr><tr><td>50 ml stożkowa probówka wirówkowa</td><td>Denville Scientific</td><td>C1062-P</td><td>na roztwór Ringera</td></tr><tr><td>Nożyczki Vannas - 8 cm, kątowe ostrza 5 mm</td> World <td>Precision Instruments</td><td>501790</td><td>mikronożyczki do rozwarstwiania muszli ocznych</td></tr><tr><td>Pęseta szwajcarska - #5, 11 cm, prosta, końcówki 0,06 X 0,07 mm</td><td>World Precision Instruments</td><td>504510</td><td>Cienkie kleszcze do rozwarstwiania muszli ocznych i manipulacji plastrami</td></tr><tr><td>Jednokrawędziowe żyletki</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-640</td><td>do wycinania muszli ocznych i przycinania bibuły filtracyjnej</td></tr><tr><td>EMD Kleszczyki filtracyjne Millipore</td> Kleszczyki płaskie <td>Fisher Scientific</td><td>XX6200006P</td><td>do pracy z mokrą bibułą filtracyjną</td></tr><tr><td>C12 558/568 BODIPY</td><td>Fisher Scientific</td><td>D3835</td><td>barwi żywe jądra komórkowe; inkubacja 5 & mikro; g/ml przez 15 min w temperaturze pokojowej</td></tr><tr><td>jodek propidyny (PI)</td><td>Fisher Scientific</td><td>P3566</td><td>barwi jądra martwych komórek; inkubować 5 i mikro; g/ml przez 20 min w temperaturze pokojowej</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Fisher Scientific</td><td>62249</td><td>barwi żywe jądra komórkowe; inkubować 5 &mikro; g/ml przez 20 min w temperaturze pokojowej</td></tr><tr><td>Tetrametylodamina, ester metylowy (TMRM)</td><td>Fisher Scientific</td><td>T668</td><td>barwi funkcjonalne, ujemnie naładowane mitochondria; inkubować 1 nM przez 30 minut w temperaturze pokojowej</td></tr><tr><td>komora perfuzyjna tkanek</td><td>Cell MicroControls</td><td>BT-1-18/BT-1-18BV [-SY]</td><td>komora obrazowania do wstrzykiwań lub perfuzji</td></tr><tr><td>2-(N-(7-nitrobenz-2-oksa-1,3-diazol-4-ylo)Amino)-2-Deoksyglukoza (NBDG)</td><td>Fisher Scientific</td><td>N13195</td><td>fluorescencyjny analog glukozy podawany doustnie danio pręgowanemu 30 minut przed eutanazją</td></tr><tr><td>Laserowy skaningowy mikroskop konfokalny Olympus</td><td>Mikroskop</td> konfokalny <td>Olympus FV1000</td><td>do wizualizacji fluorescencji plastrów w rozdzielczości pojedynczej komórki</td></tr><tr><td>3-chlorofenylohydrazon cyjanku karbonylu (CCCP)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C2759</td><td>eksperymentalny odczynnik, który abluje oddychanie mitochondrialne; potraktuj plastry do końcowego stężenia 1 &mikro; Miniaturowy</td></tr><tr><td>pozycjoner aspiratora</td><td>M Cell MicroControls</td><td>FL-1</td><td>do perfuzyjnego</td></tr><tr><td>kolektora perfuzyjnego, kolektora bełkotki gazowej, zaworu przepływowego, uchwytu strzykawki 60cc</td><td>Warner Instruments</td><td>różne</td><td>do perfuzji</td></tr></tbody></table>

przygotowanie świeżych plastrów siatkówki od dorosłego danio pręgowanego do eksperymentów obrazowania ex vivo

Preparing Fresh Retinal Slices from Adult Zebrafish for Ex Vivo Imaging Experiments

Siatkówka to złożona tkanka, która inicjuje i integruje pierwsze etapy widzenia. Dysfunkcja komórek siatkówki jest cechą charakterystyczną wielu chorób powodujących ślepotę, a przyszłe terapie opierają się na fundamentalnym zrozumieniu tego, jak różne komórki siatkówki funkcjonują normalnie. Uzyskanie takich informacji za pomocą metod biochemicznych okazało się trudne, ponieważ udział poszczególnych typów komórek w środowisku komórek siatkówki jest zmniejszony. Obrazowanie siatkówki na żywo może zapewnić wgląd w wiele procesów biologicznych na poziomie subkomórkowym, dzięki rosnącej liczbie genetycznie kodowanych biosensorów fluorescencyjnych. Jednak do tej pory technika ta ograniczała się do kijanek i larw danio pręgowanego, najbardziej zewnętrznych warstw siatkówki izolowanych siatkówk lub obrazowania siatkówk w niższej rozdzielczości u żywych zwierząt. W tym miejscu przedstawiamy metodę generowania żywych wycinków siatkówki ex vivo od dorosłego danio pręgowanego do obrazowania na żywo za pomocą mikroskopii konfokalnej. Preparat ten daje poprzeczne wycinki ze wszystkimi warstwami siatkówki i większością typów komórek widocznych do wykonywania eksperymentów obrazowania konfokalnego z wykorzystaniem perfuzji. Transgeniczne danio pręgowane wykazujące ekspresję białek fluorescencyjnych lub bioczujników w określonych typach komórek siatkówki lub organellach są wykorzystywane do ekstrakcji informacji o pojedynczej komórce z nienaruszonej siatkówki. Dodatkowo plastry siatkówki można obciążyć fluorescencyjnymi barwnikami wskaźnikowymi, co zwiększa wszechstronność tej metody. Protokół ten został opracowany do obrazowania Ca2 + w fotoreceptorach czopków danio pręgowanego, ale przy odpowiednich markerach można go dostosować do pomiaru Ca2 + lub metabolitów w komórkach Müllera, komórkach dwubiegunowych i poziomych, mikrogleju, komórkach amakrynowych lub komórkach zwojowych siatkówki. Nabłonek barwnikowy siatkówki jest usuwany z plastrów, więc ta metoda nie jest odpowiednia do badania tego typu komórek. Wraz z praktyką możliwe jest generowanie seryjnych plasterków z jednego zwierzęcia do wielu eksperymentów. Ta elastyczna technika zapewnia potężne narzędzie do odpowiedzi na wiele pytań dotyczących biologii komórek siatkówki, Ca2+ i homeostazy energetycznej.

Stabilne pozycjonowanie i orientacja poprzeczna skrawków są kluczowe dla pomyślnego obrazowania z zastosowaniem wstrzykiwania lub perfuzji środków farmakologicznych. Przed obrazowaniem konfokalnym należy dokładnie zbadać i w razie potrzeby ponownie ustawić skrawki, aby upewnić się, że wszystkie warstwy siatkówki są widoczne (Rysunek 2A, skrawek ii). Jeśli skrawek jest lekko obrócony do przodu (Rysunek 2A, skrawek iii), widoczne b...

Obrazowanie tkanki siatkówki może dostarczyć informacji o pojedynczej komórce, której nie można uzyskać tradycyjnymi metodami biochemicznymi. Protokół ten opisuje przygotowanie wycinków siatkówki od danio pręgowanego do obrazowania konfokalnego. Fluorescencyjne czujniki kodowane genetycznie lub barwniki wskaźnikowe umożliwiają wizualizację wielu procesów biologicznych w różnych typach komórek siatkówki.

Przygotowanie świeżych plastrów siatkówki od dorosłego danio pręgowanego do eksperymentów obrazowania ex vivo

The retina is a complex tissue that initiates and integrates the first steps of vision. Dysfunction of retinal cells is a hallmark of many blinding ...

Ogólnym celem tej procedury jest przygotowanie świeżych plastrów siatkówki danio pręgowanego do eksperymentów, które wymagają obrazowania na żywo białek fluorescencyjnych lub biosensorów. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie badań nad wzrokiem, takie jak fizjologiczna i metaboliczna rola jonów wapnia w określonych typach komórek i przedziałach komórkowych w siatkówce. Główną zaletą tej techniki jest to, że dostarcza ona przestrzennych i czasowych informacji o kluczowych metabolitach i cząsteczkach sygnałowych w żywych tkankach.Aby umożliwić usunięcie nabłonka barwnikowego siatkówki lub RPE z danio pręgowanego, należy przystosować rybę w ciemności przez godzinę przed wykonaniem plastrów tkanki. W komorze do krojenia pomaluj linie lakieru do paznokci na szkiełku. Używając przezroczystego lakieru do paznokci, pomaluj wąskie linie, aby utworzyć prostokąt.Po wyschnięciu przemaluj lakier raz. Jeśli komora będzie używana do obrazowania statycznego lub eksperymentów iniekcyjnych z minimalnym przepływem roztworu, użyj strzykawki, aby nałożyć dwa równoległe paski wazeliny na szkiełko nakrywkowe, o długości jednego centymetra i oddalone od siebie o 0,5 centymetra

preparing-fresh-retinal-slices-from-adult-zebrafish-for-ex-vivo

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Niniejszy artykuł opisuje metodę mikrodyssekcji siatkówek zebrafish (danio pręgowanego) z dołączonym lub usuniętym nabłonkiem barwnikowym siatkówki, z embrionów od jednego do trzech dni po zapłodnieniu.

Mikrodysekcja tkanek embrionalnego oka rybki zebrafish

W tym filmie przedstawiono techniki wielokolorowego konfokalnego obrazowania time-lapse oraz celowanej ablacji komórek. Obrazowanie time-lapse jest wykorzystywane do monitorowania zachowania wielu wybranych typów komórek in vivo. Celowana ablacja komórek ułatwia badanie funkcji obwodów neuronalnych oraz paradygmatów regeneracji neuronów specyficznych dla danej grupy komórek.

Wielokolorowe obrazowanie poklatkowe transgenicznych rybek zebrafish: wizualizacja komórek macierzystych siatkówki aktywowanych przez ukierunkowaną ablację komórek neuronalnych

Film demonstruje metodę hodowli pierwotnych komórek zwojowych siatkówki z zarodków danio pręgowanego. Zarodki we wczesnym stadium są poddawane sekcji w celu wyizolowania oczu, które są następnie mechanicznie dysocjowane w zawiesinę komórek zwojowych siatkówki. Ta zawiesina komórkowa jest hodowana na szkiełkach nakrywkowych pokrytych białkami adhezyjnymi, aby ułatwić rozwój aksonów.

Wytwarzanie pierwotnych kultur komórek zwojowych siatkówki z zarodków danio pręgowanego

Opisano obrazowanie rozwoju naczyń mózgowych u larw danio pręgowanego. Dostępne są również techniki ułatwiające obrazowanie 3D i modyfikujące rozwój naczyń mózgowych za pomocą zabiegów chemicznych.

Obrazowanie i rekonstrukcja 3D struktur naczyniowo-mózgowych u embrionalnego danio pręgowanego

Wprowadzamy skuteczną metodę wstecznego oznaczania komórek zwojowych siatkówki (RGC) u dorosłych ryb pręgowanych.

Wsteczne znakowanie komórek zwojowych siatkówki u dorosłych danio pręgowanego za pomocą barwników fluorescencyjnych

Opisano wiele protokołów uszkodzeń światłem, które uszkadzają fotoreceptory i w konsekwencji wywołują reakcję regeneracji siatkówki u dorosłych ryb pręgowanych. Protokół ten opisuje ulepszoną metodę, która może być stosowana u zwierząt pigmentowanych i która uszkadza zdecydowaną większość fotoreceptorów pręcików i czopków w całej siatkówce.

Nowy paradygmat uszkodzeń spowodowanych światłem do wykorzystania w badaniach nad regeneracją siatkówki u dorosłych danio pręgowanych

Regeneracja siatkówki danio pręgowanego była głównie badana przy użyciu stałych siatek oka. Jednak dynamiczne procesy, takie jak interkinetyczna migracja jądrowa, zachodzą podczas odpowiedzi regeneracyjnej i wymagają obrazowania żywych komórek w celu zbadania mechanizmów leżących u ich podstaw. W tym miejscu opisujemy warunki hodowli i obrazowania w celu monitorowania międzykinetycznej migracji jądrowej (INM) w czasie rzeczywistym za pomocą mikroskopii wielofotonowej.

Hodowla dorosłych transgenicznych eksplantatów siatkówki danio pręgowanego do obrazowania żywych komórek za pomocą mikroskopii wielofotonowej

Ten protokół opisuje niezbędne kroki do uzyskania wyników lokalizacji białek subkomórkowych na siatkówce danio pręgowanego poprzez korelację obrazów z superrozdzielczej mikroskopii świetlnej i skaningowej mikroskopii elektronowej.

Korelacyjna superrozdzielczość i mikroskopia elektronowa w celu ustalenia lokalizacji białek w siatkówce danio pręgowanego

Tutaj omawiamy protokół metody, który pozwoli na łatwą analizę unaczynienia siatkówki dorosłego dg(fli:EGFP) danio pręgowanego jako szybki odczyt w warunkach długotrwałych patologii naczyniowych związanych z neoangiogenezą i zmianami strukturalnymi.

Badanie cukrzycy oczami ryby: mikrodysekcja, wizualizacja i analiza naczyń naczyniowych siatkówki dorosłego tg(fli:EGFP) danio pręgowanego

Ten protokół opisuje użycie genetycznie kodowanego biosensora nadtlenku wodoru (H2O2) w hodowanych neuronach i larwach zebry do oceny fizjologicznych ról sygnalizacyjnych H2O2 podczas rozwoju układu nerwowego. Może być stosowany do różnych typów komórek i modyfikowany za pomocą eksperymentalnych zabiegów w celu zbadania reaktywnych form tlenu (ROS) w ogólnym rozwoju.

Obrazowanie żywych komórek ROS podczas rozwoju neuronów

Artykuł wyjaśnia, jak chirurgicznie usunąć oczy z żywych larw danio pręgowanego, co jest pierwszym krokiem w kierunku zbadania, jak wejście siatkówki wpływa na wzrost i rozwój tektum nerwu wzrokowego. Ponadto artykuł zawiera informacje na temat znieczulenia, fiksacji i preparacji larw, a następnie immunohistochemii i obrazowania konfokalnego.

Usunięcie oczu u żywych larw danio pręgowanego w celu zbadania zależnego od unerwienia wzrostu i rozwoju układu wzrokowego

Naucz się przygotowywać świeże plastry siatkówki danio pręgowanego do obrazowania żywych tkanek. Ta metoda umożliwia badanie dynamiki jonów wapnia w komórkach siatkówki z rozdzielczością przestrzenną i czasową.

Przygotowanie świeżych plastrów siatkówki od dorosłego danio pręgowanego do eksperymentów obrazowania ex vivo

Przeglądaj więcej filmów