Name: Mysie modele zakażenia Helicobacter i patologii żołądka (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 43 s
Description: Poznaj metody zakażenia myszy Helicobacter pylori i analizy histopatologicznej żołądka. Technika ta pozwala badać kolonizację bakteryjną oraz zmiany zapalne i nowotworowe w modelu in vivo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować Pani A. De Paoli i Pani Georgie Wray-McCann za pomoc techniczną. Autorzy potwierdzają korzystanie z udogodnień i pomocy technicznej Monash Histology Platform, Department of Anatomy and Developmental Biology, Monash University. Laboratorium jest finansowane przez Narodową Radę Zdrowia i Badań Medycznych (NHMRC) dla RLF (APP1079930, APP1107930). RLF jest wspierany przez Senior Research Fellowship od NHMRC (APP1079904). KD i MC są wspierane przez stypendia dla absolwentów Monash. KD jest również wspierany przez Centrum Odporności Wrodzonej i Chorób Zakaźnych, Hudson Institute of Medical Research, podczas gdy MC ma międzynarodowe stypendium podyplomowe na Wydziale Medycyny, Pielęgniarstwa i Nauk o Zdrowiu Uniwersytetu Monash. Badania w Hudson Institute of Medical Research są wspierane przez Program Wsparcia Infrastruktury Operacyjnej rządu stanu Wiktoria.

<ol><li>Goh, K. L., Chan, W. K., Shiota, S., Yamaoka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidemiology+of+Helicobacter+pylori+infection+and+public+health+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Helicobacter%22%5BJournal%5D)">Epidemiology of Helicobacter pylori infection and public health implications.</a> Helicobacter. 16, Suppl 1. 1-9 (2011).</li>
<li>Montecucco, C., Rappuoli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Living+dangerously%3A+how+Helicobacter+pylori+survives+in+the+human+stomach%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Living dangerously: how Helicobacter pylori survives in the human stomach.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 2 (6), 457-466 (2001).</li>
<li>Akopyants, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyses+of+the+cag+pathogenicity+island+of+Helicobacter+pylori%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Analyses of the cag pathogenicity island of Helicobacter pylori.</a> Molecular Microbiology. 28 (1), 37-53 (1998).</li>
<li>Censini, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((cag%2C+a+pathogenicity+island+of+Helicobacter+pylori%2C+encodes+type+I-specific+and+disease-associated+virulence+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">cag, a pathogenicity island of Helicobacter pylori, encodes type I-specific and disease-associated virulence factors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (25), 14648-14653 (1996).</li>
<li>Peek, R. M., Fiske, C., Wilson, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+innate+immunity+in+Helicobacter+pylori-induced+gastric+malignancy%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Role of innate immunity in Helicobacter pylori-induced gastric malignancy.</a> Physiological Reviews. 90 (3), 831-858 (2010).</li>
<li>O'Rourke, J. L., Lee, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+Helicobacter+pylori+infection+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Microbes+and+Infection%22%5BJournal%5D)">Animal models of Helicobacter pylori infection and disease.</a> Microbes and Infection. 5 (8), 741-748 (2003).</li>
<li>Sakagami, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atrophic+gastric+changes+in+both+Helicobacter+felis+and+Helicobacter+pylori+infected+mice+are+host+dependent+and+separate+from+antral+gastritis%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Atrophic gastric changes in both Helicobacter felis and Helicobacter pylori infected mice are host dependent and separate from antral gastritis.</a> Gut. 39 (5), 639-648 (1996).</li>
<li>Correa, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Helicobacter+pylori+and+gastric+carcinogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Surgical+Pathology%22%5BJournal%5D)">Helicobacter pylori and gastric carcinogenesis.</a> The American Journal of Surgical Pathology. 19, S37-S43 (1995).</li>
<li>Enno, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MALToma-like+lesions+in+the+murine+gastric+mucosa+after+long-term+infection+with+Helicobacter+felis.+A+mouse+model+of+Helicobacter+pylori-induced+gastric+lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">MALToma-like lesions in the murine gastric mucosa after long-term infection with Helicobacter felis. A mouse model of Helicobacter pylori-induced gastric lymphoma.</a> The American Journal of Pathology. 147 (1), 217-222 (1995).</li>
<li>Lee, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+standardized+mouse+model+of+Helicobacter+pylori+infection%3A+introducing+the+Sydney+strain%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">A standardized mouse model of Helicobacter pylori infection: introducing the Sydney strain.</a> Gastroenterology. 112 (4), 1386-1397 (1997).</li>
<li>Crabtree, J. E., Ferrero, R. L., Kusters, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mouse+colonizing+Helicobacter+pylori+strain+SS1+may+lack+a+functional+cag+pathogenicity+island%5BTitle%5D)+AND+%22Helicobacter%22%5BJournal%5D)">The mouse colonizing Helicobacter pylori strain SS1 may lack a functional cag pathogenicity island.</a> Helicobacter. 7 (2), 139-140 (2002).</li>
<li>Israel, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Helicobacter+pylori+strain-specific+differences+in+genetic+content%2C+identified+by+microarray%2C+influence+host+inflammatory+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Helicobacter pylori strain-specific differences in genetic content, identified by microarray, influence host inflammatory responses.</a> Journal of Clinical Investigation. 107 (5), 611-620 (2001).</li>
<li>Fox, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Helicobacter+pylori-induced+gastritis+in+the+domestic+cat%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Helicobacter pylori-induced gastritis in the domestic cat.</a> Infection and Immunity. 63 (7), 2674-2681 (1995).</li>
<li>Lee, A., Hazell, S. L., O'Rourke, J., Kouprach, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+a+spiral-shaped+bacterium+from+the+cat+stomach%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Isolation of a spiral-shaped bacterium from the cat stomach.</a> Infection and Immunity. 56 (11), 2843-2850 (1988).</li>
<li>Ferrero, R. L., Wilson, J. E., Sutton, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+of+Helicobacter-induced+gastric+cancer%3A+use+of+cocarcinogens%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Mouse models of Helicobacter-induced gastric cancer: use of cocarcinogens.</a> Methods in Molecular Biology. 921, 157-173 (2012).</li>
<li>Ferrero, R. L., Thiberge, J. M., Huerre, M., Labigne, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+responses+of+specific-pathogen-free+mice+to+chronic+Helicobacter+pylori+%28strain+SS1%29+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Immune responses of specific-pathogen-free mice to chronic Helicobacter pylori (strain SS1) infection.</a> Infection and Immunity. 66 (4), 1349-1355 (1998).</li>
<li>Blanchard, T. G., Nedrud, J. G. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18770594">Laboratory maintenance of Helicobacter species.</a> Current Protocols in Microbiology. , Chapter 8, Unit8B 1 (2012).</li>
<li>Kim, J. S., Chang, J. H., Chung, S. I., Yum, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Importance+of+the+host+genetic+background+on+immune+responses+to+Helicobacter+pylori+infection+and+therapeutic+vaccine+efficacy%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Immunology+and+Medical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Importance of the host genetic background on immune responses to Helicobacter pylori infection and therapeutic vaccine efficacy.</a> FEMS Immunology and Medical Microbiology. 31 (1), 41-46 (2001).</li>
<li>Nedrud, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lack+of+genetic+influence+on+the+innate+inflammatory+response+to+helicobacter+infection+of+the+gastric+mucosa%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Lack of genetic influence on the innate inflammatory response to helicobacter infection of the gastric mucosa.</a> Frontiers in Immunology. 3, 181(2012).</li>
<li>Cai, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Helicobacter+felis+eradication+restores+normal+architecture+and+inhibits+gastric+cancer+progression+in+C57BL%2F6+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Helicobacter felis eradication restores normal architecture and inhibits gastric cancer progression in C57BL/6 mice.</a> Gastroenterology. 128 (7), 1937-1952 (2005).</li>
<li>Ferrero, R. L., Labigne, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning%2C+expression+and+sequencing+of+Helicobacter+felis+urease+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Cloning, expression and sequencing of Helicobacter felis urease genes.</a> Molecular Microbiology. 9 (2), 323-333 (1993).</li>
<li>Stevenson, T. H., Castillo, A., Lucia, L. M., Acuff, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+of+Helicobacter+pylori+in+various+liquid+and+plating+media%5BTitle%5D)+AND+%22Letters+in+Applied+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Growth of Helicobacter pylori in various liquid and plating media.</a> Letters in Applied Microbiology. 30 (3), 192-196 (2000).</li>
<li>Uotani, T., Graham, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnosis+of+Helicobacter+pylori+using+the+rapid+urease+test%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Diagnosis of Helicobacter pylori using the rapid urease test.</a> Annals of Translational Medicine. 3 (1), 9(2015).</li>
<li>Riley, L. K., Franklin, C. L., Hook, R. R., Besch-Williford, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+murine+helicobacters+by+PCR+and+restriction+enzyme+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Identification of murine helicobacters by PCR and restriction enzyme analyses.</a> Journal of Clinical Microbiology. 34 (4), 942-946 (1996).</li>
<li>Chaouche-Drider, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+commensal+Helicobacter+sp.+of+the+rodent+intestinal+flora+activates+TLR2+and+NOD1+responses+in+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A commensal Helicobacter sp. of the rodent intestinal flora activates TLR2 and NOD1 responses in epithelial cells.</a> PLoS One. 4 (4), e5396(2009).</li>
<li>Fox, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Helicobacter+bilis%3A+bacterial+provocateur+orchestrates+host+immune+responses+to+commensal+flora+in+a+model+of+inflammatory+bowel+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Helicobacter bilis: bacterial provocateur orchestrates host immune responses to commensal flora in a model of inflammatory bowel disease.</a> Gut. 56 (7), 898-900 (2007).</li>
<li>McGee, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cholesterol+enhances+Helicobacter+pylori+resistance+to+antibiotics+and+LL-37%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Cholesterol enhances Helicobacter pylori resistance to antibiotics and LL-37.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 55 (6), 2897-2904 (2011).</li>
<li>Viala, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nod1+responds+to+peptidoglycan+delivered+by+the+Helicobacter+pylori+cag+pathogenicity+island%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Nod1 responds to peptidoglycan delivered by the Helicobacter pylori cag pathogenicity island.</a> Nature Immunology. 5 (11), 1166-1174 (2004).</li>
<li>Kong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sensitive+and+specific+PCR+method+to+detect+Helicobacter+felis+in+a+conventional+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Vaccine+Immunology%22%5BJournal%5D)">A sensitive and specific PCR method to detect Helicobacter felis in a conventional mouse model.</a> Clinical and Vaccine Immunology. 3 (1), 73-78 (1996).</li>
<li>Ng, G., Every, A., McGuckin, M., Sutton, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+Helicobacter+felis+colonization+in+male+129%2FSv+mice+fails+to+suppress+gastritis%5BTitle%5D)+AND+%22Gut+Microbes%22%5BJournal%5D)">Increased Helicobacter felis colonization in male 129/Sv mice fails to suppress gastritis.</a> Gut Microbes. 2 (6), 358-360 (2011).</li>
<li>Ferrero, R. L., Ave, P., Radcliff, F. J., Labigne, A., Huerre, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Outbred+mice+with+long-term+Helicobacter+felis+infection+develop+both+gastric+lymphoid+tissue+and+glandular+hyperplastic+lesions%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Outbred mice with long-term Helicobacter felis infection develop both gastric lymphoid tissue and glandular hyperplastic lesions.</a> The Journal of Pathology. 191 (3), 333-340 (2000).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Protokół ten opisuje zastosowanie mysiego modelu in vivo w przypadku zakażenia Helicobacter . Krytycznymi etapami procedury są: 1) przygotowanie inokuli Helicobacter zawierającej żywe i ruchliwe bakterie; 2) dostarczenie myszi odpowiedniej ilości bakterii przez zgłębnik żołądkowy; 3) wykrywanie infekcji bakteryjnej poprzez zliczanie kolonii i/lub PCR; oraz 4) przetwarzanie tkanek żołądka w celu umożliwienia oceny histopatologii w zakażonych żołądkach. Dalsze sugestie dotyczące modyfikacji, rozw...

Helicobacter pylori to spiralny, Gram-ujemny, ludzki patogen żołądka, obecny we wszystkich populacjach na całym świecie, z wskaźnikami infekcji w krajach rozwijających się szacowanymi na rzędu 80%1. Chociaż większość osób zakażonych H. pylori przechodzi chorobę bezobjawowo, u niektórych rozwijają się poważniejsze choroby, od wrzodów trawiennych po raka żołądka2. Nowotwory związane z H. pylori charakteryzują się głównie złośliwymi zmianami w komórkach nabłonka (GEC) lub tworzeniem pozawęzłowych tkanek limfatycznych w żołądku, co prowadzi odpowiednio do gruczolakoraka żołądka lub chłoniaka tkanki limfatycznej związanej z błoną śluzową (MALT). H. pylori jest wysoce przystosowany do przetrwania w surowej niszy ekologicznej żołądka ze względu na obecność różnych czynników wirulencji i mechanizmów ułatwiających jego przyleganie, wzrost i metabolizm w tej niszy. W szczególności zjadliwe szczepy H. pylori posiadają 40 kb cag Wyspę Patogenicity (cagPAI), która koduje około 30 genów wymaganych do produkcji systemu wydzielania typu 4 (T4SS)3,4. CagSzczepy H. pylori PAI-dodatnie są związane z indukcją wyższych poziomów przewlekłego stanu zapalnego u gospodarza, który został uznany za niezbędny prekursor gruczolakoraka żołądka5.
Modele zwierzęce in vivo, szczególnie myszy, dostarczyły wielu informacji, umożliwiając badaczom zbadanie względnego wpływu czynników gospodarza, bakterii i środowiska na infekcję H. pylori i wynik choroby6. Badania wykazały wcześniej, że przedłużające się zakażenie H. pylori u myszy na tle genetycznym C57BL/6 powoduje rozwój przewlekłego zapalenia żołądka i atrofii gruczołów, które są cechami charakterystycznymi infekcji H. pylori7. Ponadto wykazano, że zakażenie pokrewnym gatunkiem bakterii kotów/psów, H. felis, indukuje tworzenie MALT u myszy z podobną patologią i progresją choroby, jak obserwowano w ludzkim chłoniaku MALT8,9. Najczęściej stosowanym izolatem H. pylori w badaniach kolonizacji myszy jest szczep "Sydney Strain 1" (SS1) sup class<="xref">10, który jest cagPAI+, ale ma niefunkcjonalny T4SS (T4SS−)11. Inne szeroko stosowane szczepy to H. pylori B128 7.13 (cagPAI+/T4SS+)12 i X47-2AL (cagPAI-/T4SS−)13. W przypadku zakażeń H. felis zwykle stosuje się szczep CS1 ("Cat Spiral 1", cagPAI-/T4SS−) 14.
Niniejszym udostępniamy protokół opisujący przygotowanie inokuli Helicobacter do infekcji in vivo, procedurę wewnątrzżołądkowego głębnika myszy, a także metody przetwarzania tkanek do badania zmian histopatologicznych w żołądku. W szczególności w artykule skupimy się na metodach histologicznych stosowanych do wizualizacji kolonizacji bakteryjnej i oceny zmian histopatologicznych, w tym tworzenia MALT, w błonie śluzowej żołądka zakażonych myszy. Niektóre z opisanych tutaj metod mogą być zaadaptowane do badania innych patogenów jelitowych, takich jak S. Typhimurium lub C. rodentium.

<table><tbody><tr><td>Odczynniki bakteriologiczne</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oxoid Blood Agar Base No.2</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>CM0271B</td><td>Rozpuścić w deinonizowanej wodzie przed sterylizacją Premium Defibrynowana</td></tr><tr><td>krew końska</td><td>Australijskie etyczne środki biologiczne</td><td>PDHB100</td><td></td></tr><tr><td>Bulion naparowy z mózgu Bacto Brain BD</td><td>Bioscience</td><td>237500</td><td>Rozpuścić w wodzie deinonizowanej przed sterylizacją</td></tr><tr><td>Pakiety gazowe CampyGen</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>CN0035A/CN0025A</td><td></td></tr><tr><td>Odczynniki histologiczne</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Formalin, neutralnie buforowane, 10%</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>HT501128</td><td></td></tr><tr><td>Alkohol absolutny, 100% denaturat</td><td>ChemSupply</td><td>AL048-20L-P</td><td></td></tr><tr><td>Izopropanol (2-propanol)</td><td>Merck</td><td>100995</td><td></td></tr><tr><td>Ksylen (bez siarki)</td><td>ChemSupply</td><td>XT003-20L</td><td></td></tr><tr><td>Mayer's Haematoxylin</td><td>Amber Scientific</td><td>MH-1L</td><td>Filtr przed użyciem</td></tr><tr><td>Eozyna, Barwnik wodny</td><td>Amber Scientific</td><td>EOCA-1L</td><td>Filtr przed użyciem</td></tr><tr><td>Wright-Giemsa Stain, modyfikowany</td><td>Sigma Aldrich</td><td>WG80-2.5L</td><td>Rozcieńczyć przed użyciem (20% Giemsa, 80% woda dejonizowana)</td></tr><tr><td>Histolene</td><td>Grale Scientific</td><td>11031/5</td><td></td></tr><tr><td>DPX podłoże montażowe</td><td>VWR</td><td>1.00579.0500</td><td></td></tr><tr><td>Odczynniki do biologii molekularnej</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA BR Assay Kit</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>Q32850</td><td></td></tr><tr><td>Oligonukleotydy</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td>Temperatura wyżarzania ureB starterów użytych w tym badaniu wynosi 61 &deg; C</td></tr><tr><td>GoTaq Flexi DNA Polymerase</td><td>Promega</td><td>M8291</td><td>Zestaw zawiera 10x bufor PCR i chlorek magnezu</td></tr><tr><td>dNTP</td><td>Bioline</td><td>BIO-39028</td><td>Rozcieńczyć do 10 mM w sterylnej wodzie wolnej od nukleaz przed użyciem</td></tr><tr><td>Agaroza klasy cząsteczkowej</td><td>Bioline</td><td>BIO-41025</td><td></td></tr><tr><td>Wodorowęglan sodu</td><td>Univar (Ajax Fine Chemicals)</td><td>A475-500G</td><td></td></tr><tr><td>Magnez Siarczan Heptahydrat</td><td>Chem-Supply</td><td>MA048-500G</td><td></td></tr><tr><td>Antybiotyki</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vancomycin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>V2002-1G</td><td>Rozpuścić w wodzie dejonizowanej</td></tr><tr><td>Polimyksyna B</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4932-5MU</td><td>Rozpuścić w wodzie dejonizowanej</td></tr><tr><td>Trimetoprim (&ge; 98% HPLC)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T7883</td><td>Rozpuszcza się w 100% (absolutnym)</td></tr> etanolu <tr><td>Amfoterycyna</td><td>Amresco (Astral Scientific)</td><td>E437-100MG</td><td>Rozpuszcza się w wodzie dejonizowanej</td></tr><tr><td>Bacytracyna z Bacillus licheniformis</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B0125</td><td>Rozpuszcza się w wodzie dejonizowanej</td></tr><tr><td>Kwas naladiksowy</td><td>Sigma Aldrich</td><td>N8878</td><td>Rozpuszcza się w wodzie dejonizowanej</td></tr><tr><td>Inne odczynniki</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Methoxyfluran (Pentrhox)</td><td>Medical Developments International</td><td>Nie dotyczy</td><td></td></tr><tr><td>Wosk parafinowy</td><td>Paraplast Plus, Leica Biosystems</td><td>39601006</td><td></td></tr><tr><td>Sprzęt i wyroby z tworzyw sztucznych</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oxoid Słoiki anaerobowe</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>HP0011/HP0031</td><td></td></tr><tr><td>Pipety Pasteura COPAN</td><td>Usługi Interpath</td><td>200CS01</td><td></td></tr><tr>Wirówka <td></td><td></td><td>Eppendorf 5810R</td><td>Zbieraj granulki bakteryjne przez wirowanie przy 2,200 obr./min przez 10 minut przy 4 stopniach; C</td></tr><tr><td>23 g precyzyjna igła ślizgowa</td><td>BD Bioscience</td><td>301805</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm M</td><td>Bemis, VWR</td><td>PM996</td><td></td></tr><tr><td>Rurki polietylenowe o drobnych otworach Portex</td><td>Smiths Medical</td><td>800/100/200</td><td></td></tr><tr><td>Plastikowe cewniki do karmienia</td><td>Instech&nbsp; Laboratoria</td><td>FTP20-30</td><td></td></tr><tr><td>1 ml tuberkulina luer slip jednorazowe strzykawki</td><td>BD Bioscience</td><td>302100</td><td></td></tr><tr><td>Mikrotłuczek Eppendorf do probówek 1,2 - 2 ml</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z317314</td><td>Autoklawowalne tłuczki polipropylenowe używane do homogenizacji</td></tr><tr><td>żołądka GentleMACs Disocjator</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-235</td><td>Użyj wstępnie ustawionych programów gentleMACS dla tkanki żołądka myszy</td></tr><tr><td>Rurki M (pomarańczowa nasadka)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>30-093-236</td><td></td></tr><tr><td>Fluorometr kubitowy</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>Q33216</td><td></td></tr><tr><td>Sterylna plastikowa pętla</td><td>LabServ</td><td>LBSLP7202</td><td></td></tr><tr><td>Zimna płyta, system osadzania Leica EG1160</td><td>Leica Biosystems</td><td>Nie dotyczy</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek Base Mold System, Base Mold 38 x 25 x 6</td><td>Sakura, Alphen aan den Rijn</td><td>4124</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek III Uni-Casette System</td><td>Sakura, Alphen aan den Rijn</td><td>4170</td><td></td></tr><tr><td>Microtome, Leica RM2235</td><td>Leica Biosystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Charged SuperFrost Plus Szkiełka</td><td>podstawowe Menzel Glaser, Thermo Fischer Scientific</td><td>4951PLUS4</td><td></td></tr></tbody></table>

mysie modele zakażenia helicobacter i patologii żołądka

Mouse Models Of Helicobacter Infection And Gastric Pathologies

Helicobacter pylori to patogen żołądkowy, który występuje u połowy światowej populacji i jest istotną przyczyną zachorowalności i śmiertelności u ludzi. Opracowano kilka mysich modeli zakażenia Helicobacter żołądka w celu zbadania molekularnych i komórkowych mechanizmów, za pomocą których bakterie H. pylori kolonizują żołądek ludzkiego gospodarza i powodują chorobę. W niniejszym artykule opisujemy protokoły mające na celu: 1) przygotowanie zawiesin bakteryjnych do zakażenia in vivo myszy przez zgłębnik dożołądkowy; 2) określić poziomy kolonizacji bakteryjnej w tkankach żołądka myszy za pomocą reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) i liczenia żywotnego; oraz 3) ocenić zmiany patologiczne za pomocą histologii. Aby ustalić zakażenie Helicobacteru myszy, zwierzęta wolne od specyficznych patogenów (SPF) są najpierw inokulowane zawiesinami (zawierającymi ≥105 jednostek tworzących kolonie, CFU) kolonizujących myszy szczepów Helicobacter pylori lub innych żołądkowych Helicobacter spp. od zwierząt, takich jak Helicobacter felis. W odpowiednich punktach czasowych po zakażeniu żołądki są wycinane i cięte strzałkowo na dwa równe fragmenty tkanki, z których każdy składa się z antrum i obszarów ciała. Jeden z tych fragmentów jest następnie wykorzystywany do liczenia żywotnych lub ekstrakcji DNA, podczas gdy drugi jest poddawany obróbce histologicznej. Kolonizacja bakteryjna i zmiany histopatologiczne w żołądku mogą być oceniane rutynowo w skrawkach tkanki żołądka barwionych barwnikami Warthin-Starry, Giemsa lub Hematoksylina i Eozyna (H&E), w zależności od przypadku. Dodatkowe analizy immunologiczne można również przeprowadzić za pomocą immunohistochemii lub immunofluorescencji na wycinkach tkanki żołądka myszy. Opisane poniżej protokoły zostały specjalnie zaprojektowane, aby umożliwić ocenę u myszy patologii żołądka przypominających te w chorobach H. pylori związanych z ludźmi, w tym zapaleniu, zaniku gruczołów i tworzeniu się pęcherzyków limfatycznych. Przygotowanie inokulum i protokoły dongastric gaveline mogą być również dostosowane do badania patogenezy innych jelitowych patogenów ludzkich, które kolonizują myszy, takich jak Salmonella Typhimurium lub Citrobacter rodentium.

Niniejszy protokół opisuje technikę gavage'u doustnego w celu wywołania zakażenia wewnątrzżołądkowego H. pylori lub H. felis w mysich modelach zwierzęcych (Rycina 1). Po eutanazji żołądki są usuwane, ważone i dzielone na 2 równe połowy obejmujące antrum, trzon oraz obszary niegruczołowe tkanek żołądka (Rycina 2). Przed przystąpieniem do jakichkolwiek analiz usuwa się obszar niegruczołowy.
Pomyślną kolonizację zwierzą...

Myszy stanowią nieoceniony model in vivo do badania infekcji i chorób wywoływanych przez mikroorganizmy żołądkowo-jelitowe. W tym miejscu opisano metody stosowane do badania kolonizacji bakteryjnej i zmian histopatologicznych w mysich modelach choroby związanej z Helicobacter pylori.

Mysie modele zakażenia Helicobacter i patologii żołądka

Helicobacter pylori is a gastric pathogen that is present in half of the global population and is a significant cause of morbidity and mortality in ...

Metoda ta może pomóc w znalezieniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie gastroenterologii dotyczące wpływu członków mikrobioty, w szczególności tych z rodzaju Helicobacter, na stan zapalny i raka. Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala na badanie zakażenia Helicobacter i jego wpływu na żołądek w warunkach fizjologicznych. Implikacje tej techniki rozciągają się w kierunku opracowania terapii mających na celu zapobieganie lub eliminację zakażenia Helicobacter lub jego konsekwencji, w tym antybiotyków, leków lub szczepionek.Metody te dostarczają informacji na temat patogenezy zakażenia Helicobacter. Jednak kilka z tych technik można zaadaptować do badania innych patogenów przewodu pokarmowego. Ogólnie rzecz biorąc, osoby nowe w tej metodzie będą miały trudności z przygotowaniem inokulum bakteryjnego zdolnego do wywołania infekcji u myszy.Konieczne jest, aby izolaty Helicobacter były znanymi szczepami kolonizującymi myszy, które nie zostały poddane ekstensywnej subkulturze in vitro. Ponadto należy odnotować liczbę subkultur in vitro dla tych szczepów. Dodaj zawiesiny bakteryjne do 15-mililitrowych probówek polistyrenowych i użyj plastikowej pętli, aby przenieść jedną 10-20-mikrolitrową kroplę z każdej kultury na indywidualne szklane szkiełka mikroskopowe.Następnie oceń żywotność i ruchliwość bakterii pod mikroskopią z kontrastem fazowym w 100-krotnym powiększeniu. Inokula H. pylori należy stosować tylko wtedy, gdy większość bakterii ma kształt pałeczkowy. Szczepionka H.felis powinna zawierać przede wszystkim bakterie o spiralnym kształcie.I załaduj szczepionkę do indywidualnych, jednorazowych strzykawek o pojemności jednego mililitra. Wyposaż każdą strzykawkę w igłę o rozmiarze 23 i użyj plastikowej folii parafinowej, aby przymocować jednorazowy cewnik polietylenowy do każdej igły. Następnie ręcznie przytrzymuj sześcio- do ośmiotygodniową mysz wolną od specyficznych patogenów i Helicobacter za kark szyi i ogona, a następnie wprowadź jeden cewnik do środka otwartej szczęki.Prowadź cewnik w ogonie w kierunku przełyku, przedłużając szyję myszy, aby umożliwić łatwy dostęp do żołądka przez przełyk i z dala od tchawicy, aż większość lub całość cewnika przestanie być widoczna i wyczuwalny będzie opór. Następnie dostarcz co najmniej jedną razy 10 do piątej bakterii, aby zapewnić optymalną kolonizację i patologię choroby. Pod koniec eksperymentu użyj cienkich, zakrzywionych nożyczek, aby otworzyć jamę brzuszną w celu wycięcia żołądka.Przetnij żołądek wzdłuż większej krzywizny i delikatnie umyj narząd dwa razy w jednej 50-mililitrowej tubce świeżego PBS na pranie, aby usunąć resztki jedzenia. Po drugim umyciu umieść chusteczkę na wytarowanej, sześciocentymetrowej, plastikowej szalce Petriego, aby zapisać mokrą masę. Po spłaszczeniu żołądka przeciąć próbkę strzałkowo na dwa równe fragmenty tkanki obejmujące antrum, ciało i niegruczołowe obszary przedżołądka.Usunąć obszar niegruczołowy i zważyć po połowie każdego żołądka przed przechowywaniem kawałka tkanki w odpowiednim roztworze do planowanej dalszej analizy. Dodaj drugą połowę tkanki żołądka do 15-mililitrowej stożkowej rurki zawierającej 10% formaliny, spłaszczając tkanki na górnych bokach probówek po 10 sekundach. Gdy tkanki zostaną przytwierdzone do ścianek probówki, należy ponownie zanurzyć próbki w formalinie na co najmniej 24 godziny.Aby policzyć liczbę żywotnych H. pylori w żołądku po zakażeniu, homogenizuj próbki żołądka przechowywane w BHI i wykonaj zduplikowane seryjne rozcieńczenia powstałych homogenatów żołądkowych w świeżym, sterylnym bulionie. Podzielić wstępnie wysuszone płytki agaru z krwią końską lub HBA uzupełnione dodatkowymi antybiotykami na trzy lub cztery segmenty i, stosując adaptację techniki Milesa i Misry, dodać od 10 do 100 mikrolitrów rozcieńczenia homogenatu z każdego żołądka na segment każdej płytki agarowej. Rozprowadź homogenaty za pomocą sterylnych, plastikowych pętelek i pozostaw płytki do wyschnięcia.Następnie umieść płytki w pozycji odwróconej w beztlenowych słoikach na gaz zawierających szalkę Petriego z wodą i pakiet gazowy. Następnie inkubuj słoiki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez cztery do siedmiu dni. Gdy można zaobserwować kolonie, wylicz segmenty zawierające od 10 do 100 izolowanych kolonii.Po eutanazji żołądek jest pobierany od zwierząt i ważony. Obszar niegruczołowy jest usuwany, a żołądek jest dzielony na dwie równe połówki składające się z antrum i ciała. Udana kolonizacja jest zwykle potwierdzana przez wykonanie żywotnego liczenia, a następnie wyliczanie poszczególnych rodzin z homogenatów żołądkowych naniesionych na płytki HBA.Należy pamiętać, że obecność bakterii zanieczyszczających z mikrobioty żołądka myszy lub dużej liczby kolonii H. pylori może skomplikować liczenie jtk H. pylori. Alternatywnie, PCR można zastosować do weryfikacji infekcji przy użyciu specyficznych zwalidowanych starterów skierowanych na region 325 par zasad genów H.felis i H.pylori ureB. W tym reprezentatywnym eksperymencie myszy C57 Black-6 typu dzikiego wykazywały umiarkowane objawy stanu zapalnego, w tym przerost i atrofię gruczołów po sześciu miesiącach od zakażenia H. felis, a także naciek komórkowy błony podśluzowej.Cięższy stan zapalny obserwuje się u myszy z nokautem w tym samym punkcie czasowym, z dodatkową obecnością pęcherzyków limfoidalnych obserwowanych w bliskiej odległości od nacieków komórkowych. Bakterie H.felis można również uwidocznić w barwionych Giemsą odcinkach zakażonej tkanki żołądka myszy. Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak ilościowy PCR, immunohistochemia lub immunofluorescencja, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące rodzajów odpowiedzi gospodarza wywołanych podczas infekcji Helicobacter.Po jej opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom z dziedziny mikrobiologii i gastroenterologii do zbadania przyczynowej roli Helicobacter pylori w chorobach żołądka u ludzi. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak powtarzalnie zarażać myszy gatunkami Helicobacter i badać patologię związaną z infekcją. Nie zapominaj, że szczepy Helicobacter użyte w tym protokole są zakaźne, dlatego podczas pracy z tymi bakteriami należy zawsze przestrzegać standardowych procedur bezpieczeństwa biologicznego.

mouse-models-of-helicobacter-infection-and-gastric-pathologies

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Ten film pokazuje proces zakażenia Helicobacter pylori poprzez technikę podawania przez zgłębnik w modelu mysim. Zawiesina bakteryjna jest podawana przez cewnik wprowadzany przez usta do żołądka. Zaszczepione bakterie kolonizują i tworzą infekcję w żołądku, którą można wykorzystać do badania interakcji gospodarz-patogen.

Technika zgłębnika dożołądkowego w kontrolowanym zakażeniu Helicobacter u myszy

W tym filmie opisujemy protokół ilościowego oznaczania obciążenia Helicobacter pylori w tkankach żołądka myszy po zakażeniu, aby potwierdzić jego kolonizację.

Kwantyfikacja obciążenia Helicobacter pylori w zakażonym żołądku myszy

Ten film demonstruje metodę tworzenia modelu infekcji organoidów żołądkowych poprzez mikrowstrzykiwanie patogenu żołądkowego Helicobacter pylori do światła organoidów. Model ten pomaga w badaniu zmian w komórkach żołądka wywołanych infekcją.

Ustalenie modelu infekcji poprzez mikroiniekcję organoidów żołądkowych z bakteriami chorobotwórczymi

Tutaj opisujemy metodę wizualizacji onkogennych organelli bakteryjnych znanych jako System Wydzielania Cag Typu IV (Cag-T4SS).  Odkryliśmy, że Cag-T4SS jest wytwarzany w różny sposób na powierzchni H. pylori w odpowiedzi na różne warunki dostępności żelaza.

Mikroskopia elektronowa wysokiej rozdzielczości systemu wydzielania Helicobacter pylori Cag typu IV pili wytwarzanego w różnych warunkach dostępności żelaza

Ten artykuł demonstruje zabiegi chirurgiczne refluksu żołądkowo-przełykowego u myszy. Modele te są przydatnymi narzędziami do badań nad mechanizmami i leczeniem choroby refluksowej przełyku, a potencjalnie również choroby Barretta i raka przełyku.

Modele chirurgiczne refluksu gastroezofagoidalnego z użyciem myszy

Kultury pochodzące z komórek macierzystych kryją w sobie ogromny potencjał do modelowania chorób zakaźnych. W tym miejscu opisano hodowlę mysich i ludzkich organoidów żołądkowych pochodzących z dorosłych komórek macierzystych. Organoidy są mikrowstrzykiwane z patogenem żołądkowym Helicobacter pylori.

Organoidy jako model chorób zakaźnych: hodowla organoidów żołądka ludzkiego i mysiego oraz mikroiniekcja Helicobacter pylori

Tutaj opisujemy protokół tworzenia i hodowli trójwymiarowych (3D) organoidów żołądkowych pochodzących od ludzi i myszy oraz metodę transferu organoidów 3D do jednowarstwowej 2-wymiarowej. Opisano również zastosowanie monowarstwy nabłonka żołądka jako nowatorskiego testu na ranę drapaną do badań nad regeneracją.

Pierwotna jednowarstwowa hodowla nabłonka żołądka pochodząca od myszy i człowieka do badania regeneracji

Tutaj przeprowadziliśmy systematyczną ocenę pacjentów, u których zdiagnozowano śródnabłonkową neoplazję żołądka o niskim stopniu złośliwości na podstawie poprzedniej biopsji endoskopowej i uzyskaliśmy diagnozę patologiczną poprzez całkowitą resekcję zmiany za pomocą endoskopowej dyssekcji podśluzówkowej (ESD), analizując czynniki, które potencjalnie zwiększają ryzyko patologicznej eskalacji.

Opracowanie i ocena modelu predykcji ryzyka patologicznej eskalacji śródnabłonkowej neoplazji żołądka o niskim stopniu złośliwości

Protokół ten określa metodę immunobarwienia całego żołądka, zmodyfikowaną na podstawie techniki "Swiss roll" pierwotnie opracowanej dla jelita myszy.

Ulepszone mapowanie przestrzenne warstw mięśni żołądka myszy z wykorzystaniem zmodyfikowanej techniki Swiss Roll

W tym filmie zostaną zaprezentowane metody transuretralnego indukowania zakażeń dróg moczowych u myszy oraz sposoby ilościowego określania zakresu powstałych infekcji.

Transuretralna indukcja infekcji dróg moczowych u myszy

Poznaj metody zakażenia myszy Helicobacter pylori i analizy histopatologicznej żołądka. Technika ta pozwala badać kolonizację bakteryjną oraz zmiany zapalne i nowotworowe w modelu in vivo.

Mysie modele zakażenia Helicobacter i patologii żołądka

Przeglądaj więcej filmów