Name: Obrazowanie genu reporterowego radionuklidowo-fluorescencyjnego w celu śledzenia progresji guza w modelach guzów gryzoni (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 4 s
Description: Poznaj metodę obrazowania PET z reporterem radionuklidowo-fluorescencyjnym do śledzenia progresji guza i przerzutów w modelach gryzoni. Technika umożliwia nieinwazyjną obserwację w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Badania były wspierane przez King's College London i UCL Comprehensive Cancer Imaging Centre, finansowane przez Cancer Research UK i EPSRC we współpracy z MRC i DoH (Anglia); National Institute for Health Research (NIHR) Biomedical Research Centre z siedzibą w Guy's and St Thomas' NHS Foundation Trust i King's College London; Centre of Excellence in Medical Engineering finansowane przez Wellcome Trust i EPSRC w ramach numer grantu WT 088641/Z/09/Z; Nagroda Cancer Research UK Multidisciplinary Project Award dla GOF i PJB oraz grant King's Health Partners dla GOF. Skanery nanoPET/CT i nanoSPECT/CT zostały zakupione i utrzymane dzięki dotacji na sprzęt od Wellcome Trust. Wyrażone poglądy są poglądami autorów, a niekoniecznie poglądami NHS, NIHR lub DoH.

<ol><li>Chaffer, C. L., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+perspective+on+cancer+cell+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A perspective on cancer cell metastasis.</a> Science. 331 (6024), 1559-1564 (2011).</li>
<li>Brader, P., Serganova, I., Blasberg, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninvasive+molecular+imaging+using+reporter+genes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Nucl+Med%22%5BJournal%5D)">Noninvasive molecular imaging using reporter genes.</a> J Nucl Med. 54 (2), 167-172 (2013).</li>
<li>Fruhwirth, G. O., Diocou, S., Blower, P. J., Ng, T., Mullen, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+whole-body+dual-modality+radionuclide+optical+strategy+for+preclinical+imaging+of+metastasis+and+heterogeneous+treatment+response+in+different+microenvironments%5BTitle%5D)+AND+%22J+Nucl+Med%22%5BJournal%5D)">A whole-body dual-modality radionuclide optical strategy for preclinical imaging of metastasis and heterogeneous treatment response in different microenvironments.</a> J Nucl Med. 55 (4), 686-694 (2014).</li>
<li>Terrovitis, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ectopic+expression+of+the+sodium-iodide+symporter+enables+imaging+of+transplanted+cardiac+stem+cells+in+vivo+by+single-photon+emission+computed+tomography+or+positron+emission+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Coll+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Ectopic expression of the sodium-iodide symporter enables imaging of transplanted cardiac stem cells in vivo by single-photon emission computed tomography or positron emission tomography.</a> J Am Coll Cardiol. 52 (20), 1652-1660 (2008).</li>
<li>Seo, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trafficking+Macrophage+Migration+Using+Reporter+Gene+Imaging+with+Human+Sodium+Iodide+Symporter+in+Animal+Models+of+Inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Nucl+Med%22%5BJournal%5D)">Trafficking Macrophage Migration Using Reporter Gene Imaging with Human Sodium Iodide Symporter in Animal Models of Inflammation.</a> J Nucl Med. 51 (10), 1637-1643 (2010).</li>
<li>Diocou, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%5B18F%5Dtetrafluoroborate-PET%2FCT+enables+sensitive+tumor+and+metastasis+in+vivo+imaging+in+a+sodium+iodide+symporter-expressing+tumor+model%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">[18F]tetrafluoroborate-PET/CT enables sensitive tumor and metastasis in vivo imaging in a sodium iodide symporter-expressing tumor model.</a> Scientific Reports. 7 (1), 946(2017).</li>
<li>Lajtos, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cold+wall+effect+eliminating+method+to+determine+the+contrast+recovery+coefficient+for+small+animal+PET+scanners+using+the+NEMA+NU-4+image+quality+phantom%5BTitle%5D)+AND+%22Phys+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">Cold wall effect eliminating method to determine the contrast recovery coefficient for small animal PET scanners using the NEMA NU-4 image quality phantom.</a> Phys Med Biol. 59 (11), 2727-2746 (2014).</li>
<li>Nagy, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Performance+evaluation+of+the+small-animal+nanoScan+PET%2FMRI+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Nucl+Med%22%5BJournal%5D)">Performance evaluation of the small-animal nanoScan PET/MRI system.</a> J Nucl Med. 54 (10), 1825-1832 (2013).</li>
<li>Deleye, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Performance+evaluation+of+small-animal+multipinhole+muSPECT+scanners+for+mouse+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Nucl+Med+Mol+Imaging%22%5BJournal%5D)">Performance evaluation of small-animal multipinhole muSPECT scanners for mouse imaging.</a> Eur J Nucl Med Mol Imaging. 40 (5), 744-758 (2013).</li>
<li>Portulano, C., Paroder-Belenitsky, M., Carrasco, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Na%2B%2FI-+symporter+%28NIS%29%3A+mechanism+and+medical+impact%5BTitle%5D)+AND+%22Endocr+Rev%22%5BJournal%5D)">The Na+/I- symporter (NIS): mechanism and medical impact.</a> Endocr Rev. 35 (1), 106-149 (2014).</li>
<li>Dohan, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+sodium%2Fiodide+Symporter+%28NIS%29%3A+characterization%2C+regulation%2C+and+medical+significance%5BTitle%5D)+AND+%22Endocr+Rev%22%5BJournal%5D)">The sodium/iodide Symporter (NIS): characterization, regulation, and medical significance.</a> Endocr Rev. 24 (1), 48-77 (2003).</li>
<li>Jauregui-Osoro, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+and+biological+evaluation+of+%5BF-18%5Dtetrafluoroborate%3A+a+PET+imaging+agent+for+thyroid+disease+and+reporter+gene+imaging+of+the+sodium%2Fiodide+symporter%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Nucl+Med+Mol+Imaging%22%5BJournal%5D)">Synthesis and biological evaluation of [F-18]tetrafluoroborate: a PET imaging agent for thyroid disease and reporter gene imaging of the sodium/iodide symporter.</a> Eur J Nucl Med Mol Imaging. 37 (11), 2108-2116 (2010).</li>
<li>Weeks, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+%5B18F%5D-tetrafluoroborate+as+a+potential+PET+imaging+agent+for+the+human+sodium%2Fiodide+symporter+in+a+new+colon+carcinoma+cell+line%2C+HCT116%2C+expressing+hNIS%5BTitle%5D)+AND+%22Nucl+Med+Commun%22%5BJournal%5D)">Evaluation of [18F]-tetrafluoroborate as a potential PET imaging agent for the human sodium/iodide symporter in a new colon carcinoma cell line, HCT116, expressing hNIS.</a> Nucl Med Commun. 32 (2), 98-105 (2011).</li>
<li>Khoshnevisan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%5B%2818%29F%5Dtetrafluoroborate+as+a+PET+tracer+for+the+sodium%2Fiodide+symporter%3A+the+importance+of+specific+activity%5BTitle%5D)+AND+%22EJNMMI+Res%22%5BJournal%5D)">[(18)F]tetrafluoroborate as a PET tracer for the sodium/iodide symporter: the importance of specific activity.</a> EJNMMI Res. 6 (1), 34(2016).</li>
<li>Groot-Wassink, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninvasive+imaging+of+the+transcriptional+activities+of+human+telomerase+promoter+fragments+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Noninvasive imaging of the transcriptional activities of human telomerase promoter fragments in mice.</a> Cancer Res. 64 (14), 4906-4911 (2004).</li>
<li>Chen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radioiodine+therapy+of+hepatoma+using+targeted+transfer+of+the+human+sodium%2Fiodide+symporter+gene%5BTitle%5D)+AND+%22J+Nucl+Med%22%5BJournal%5D)">Radioiodine therapy of hepatoma using targeted transfer of the human sodium/iodide symporter gene.</a> J Nucl Med. 47 (5), 854-862 (2006).</li>
<li>Sieger, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumour-specific+activation+of+the+sodium%2Fiodide+symporter+gene+under+control+of+the+glucose+transporter+gene+1+promoter+%28GTI-1.3%29%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Nucl+Med+Mol+Imaging%22%5BJournal%5D)">Tumour-specific activation of the sodium/iodide symporter gene under control of the glucose transporter gene 1 promoter (GTI-1.3).</a> Eur J Nucl Med Mol Imaging. 30 (5), 748-756 (2003).</li>
<li>Chisholm, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer-specific+transgene+expression+mediated+by+systemic+injection+of+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Cancer-specific transgene expression mediated by systemic injection of nanoparticles.</a> Cancer Res. 69 (6), 2655-2662 (2009).</li>
<li>Klutz, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+radioiodine+therapy+of+neuroblastoma+tumors+following+systemic+nonviral+delivery+of+the+sodium+iodide+symporter+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Targeted radioiodine therapy of neuroblastoma tumors following systemic nonviral delivery of the sodium iodide symporter gene.</a> Clin Cancer Res. 15 (19), 6079-6086 (2009).</li>
<li>Merron, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+the+Na%2FI+symporter+as+a+reporter+gene+to+visualize+oncolytic+adenovirus+propagation+in+peritoneal+tumours%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Nucl+Med+Mol+Imaging%22%5BJournal%5D)">Assessment of the Na/I symporter as a reporter gene to visualize oncolytic adenovirus propagation in peritoneal tumours.</a> Eur J Nucl Med Mol Imaging. 37 (7), 1377-1385 (2010).</li>
<li>Merron, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SPECT%2FCT+imaging+of+oncolytic+adenovirus+propagation+in+tumours+in+vivo+using+the+Na%2FI+symporter+as+a+reporter+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">SPECT/CT imaging of oncolytic adenovirus propagation in tumours in vivo using the Na/I symporter as a reporter gene.</a> Gene Ther. 14 (24), 1731-1738 (2007).</li>
<li>Dingli, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+I-124+positron+emission+tomography%2Fcomputed+tomography+imaging+of+NIS+gene+expression+in+animal+models+of+stably+transfected+and+intravenously+transfected+tumor%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Imaging+Biol%22%5BJournal%5D)">Combined I-124 positron emission tomography/computed tomography imaging of NIS gene expression in animal models of stably transfected and intravenously transfected tumor.</a> Mol Imaging Biol. 8 (1), 16-23 (2006).</li>
<li>Carlson, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+molecular+imaging+of+viral+therapy+for+pancreatic+cancer+using+an+engineered+measles+virus+expressing+the+sodium-iodide+symporter+reporter+gene%5BTitle%5D)+AND+%22AJR+Am+J+Roentgenol%22%5BJournal%5D)">Quantitative molecular imaging of viral therapy for pancreatic cancer using an engineered measles virus expressing the sodium-iodide symporter reporter gene.</a> AJR Am J Roentgenol. 192 (1), 279-287 (2009).</li>
<li>Barton, K. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GENIS%3A+gene+expression+of+sodium+iodide+symporter+for+noninvasive+imaging+of+gene+therapy+vectors+and+quantification+of+gene+expression+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">GENIS: gene expression of sodium iodide symporter for noninvasive imaging of gene therapy vectors and quantification of gene expression in vivo.</a> Mol Ther. 8 (3), 508-518 (2003).</li>
<li>Siddiqui, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+considerations+for+incorporating+sodium+iodide+symporter+reporter+gene+imaging+into+prostate+cancer+gene+therapy+trials%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Design considerations for incorporating sodium iodide symporter reporter gene imaging into prostate cancer gene therapy trials.</a> Hum Gene Ther. 18 (4), 312-322 (2007).</li>
<li>Rad, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AC133%2B+progenitor+cells+as+gene+delivery+vehicle+and+cellular+probe+in+subcutaneous+tumor+models%3A+a+preliminary+study%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">AC133+ progenitor cells as gene delivery vehicle and cellular probe in subcutaneous tumor models: a preliminary study.</a> BMC Biotechnol. 9, 28(2009).</li>
<li>Hwang do, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninvasive+in+vivo+monitoring+of+neuronal+differentiation+using+reporter+driven+by+a+neuronal+promoter%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Nucl+Med+Mol+Imaging%22%5BJournal%5D)">Noninvasive in vivo monitoring of neuronal differentiation using reporter driven by a neuronal promoter.</a> Eur J Nucl Med Mol Imaging. 35 (1), 135-145 (2008).</li>
<li>Edmonds, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploiting+the+Metal-Chelating+Properties+of+the+Drug+Cargo+for+In+Vivo+Positron+Emission+Tomography+Imaging+of+Liposomal+Nanomedicines%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Exploiting the Metal-Chelating Properties of the Drug Cargo for In Vivo Positron Emission Tomography Imaging of Liposomal Nanomedicines.</a> ACS Nano. 10 (11), 10294-10307 (2016).</li>
<li>Zhang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+the+Heterogeneity+of+Protein+Kinase+Activation+in+Cells+by+Super-resolution+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Probing the Heterogeneity of Protein Kinase Activation in Cells by Super-resolution Microscopy.</a> ACS Nano. 11 (1), 249-257 (2017).</li>
<li>Dunn, K. W., Kamocka, M. M., McDonald, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+practical+guide+to+evaluating+colocalization+in+biological+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">A practical guide to evaluating colocalization in biological microscopy.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 300 (4), C723-C742 (2011).</li>
<li>Pulaski, B. A., Ostrand-Rosenberg, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+4T1+breast+tumor+model%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Immunol%22%5BJournal%5D)">Mouse 4T1 breast tumor model.</a> Curr Protoc Immunol. , Chapter 20 Unit 20.22 (2001).</li>
<li>Workman, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+for+the+welfare+and+use+of+animals+in+cancer+research%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Guidelines for the welfare and use of animals in cancer research.</a> Br J Cancer. 102 (11), 1555-1577 (2010).</li>
<li>Foster, B., Bagci, U., Mansoor, A., Xu, Z., Mollura, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+on+segmentation+of+positron+emission+tomography+images%5BTitle%5D)+AND+%22Comput+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">A review on segmentation of positron emission tomography images.</a> Comput Biol Med. 50, 76-96 (2014).</li>
<li>Otsu, N. <a target="_blank" href="http://ieeexplore.ieee.org/document/4310076/">A Threshold Selection Method from Gray-Level Histograms.</a> IEEE Transactions on Systems, Man, and Cybernetics. 9 (1), 62-66 (1979).</li>
<li>Kinahan, P. E., Fletcher, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Positron+emission+tomography-computed+tomography+standardized+uptake+values+in+clinical+practice+and+assessing+response+to+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Ultrasound+CT+MR%22%5BJournal%5D)">Positron emission tomography-computed tomography standardized uptake values in clinical practice and assessing response to therapy.</a> Semin Ultrasound CT MR. 31 (6), 496-505 (2010).</li>
<li>Zacharias, D. A., Violin, J. D., Newton, A. C., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Partitioning+of+lipid-modified+monomeric+GFPs+into+membrane+microdomains+of+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Partitioning of lipid-modified monomeric GFPs into membrane microdomains of live cells.</a> Science. 296 (5569), 913-916 (2002).</li>
<li>Snapp, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+stacked+ER+cisternae+by+low+affinity+protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Formation of stacked ER cisternae by low affinity protein interactions.</a> J Cell Biol. 163 (2), 257-269 (2003).</li>
<li>Yang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-step+generation+of+mice+carrying+reporter+and+conditional+alleles+by+CRISPR%2FCas-mediated+genome+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">One-step generation of mice carrying reporter and conditional alleles by CRISPR/Cas-mediated genome engineering.</a> Cell. 154 (6), 1370-1379 (2013).</li>
<li>Hume, S. P., Gunn, R. N., Jones, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacological+constraints+associated+with+positron+emission+tomographic+scanning+of+small+laboratory+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Nucl+Med%22%5BJournal%5D)">Pharmacological constraints associated with positron emission tomographic scanning of small laboratory animals.</a> Eur J Nucl Med. 25 (2), 173-176 (1998).</li>
<li>O'Doherty, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((18F-Tetrafluoroborate%2C+a+PET+Probe+for+Imaging+Sodium%2FIodide+Symporter+Expression%3A+Whole-Body+Biodistribution%2C+Safety%2C+and+Radiation+Dosimetry+in+Thyroid+Cancer+Patients%5BTitle%5D)+AND+%22J+Nucl+Med%22%5BJournal%5D)">18F-Tetrafluoroborate, a PET Probe for Imaging Sodium/Iodide Symporter Expression: Whole-Body Biodistribution, Safety, and Radiation Dosimetry in Thyroid Cancer Patients.</a> J Nucl Med. 58 (10), 1666-1671 (2017).</li>
<li>Couzin-Frankel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breakthrough+of+the+year+2013.+Cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Breakthrough of the year 2013. Cancer immunotherapy.</a> Science. 342 (6165), 1432-1433 (2013).</li>
<li>Boardman, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+a+Chimeric+Antigen+Receptor+Specific+for+Donor+HLA+Class+I+Enhances+the+Potency+of+Human+Regulatory+T+Cells+in+Preventing+Human+Skin+Transplant+Rejection%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Expression of a Chimeric Antigen Receptor Specific for Donor HLA Class I Enhances the Potency of Human Regulatory T Cells in Preventing Human Skin Transplant Rejection.</a> American Journal of Transplantation. , (2017).</li>
<li>Rashid, T., Takebe, T., Nakauchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+strategies+for+liver+therapy+using+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Novel strategies for liver therapy using stem cells.</a> Gut. 64 (1), 1-4 (2015).</li>
<li>Ellison, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+c-kit%28pos%29+cardiac+stem+cells+are+necessary+and+sufficient+for+functional+cardiac+regeneration+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Adult c-kit(pos) cardiac stem cells are necessary and sufficient for functional cardiac regeneration and repair.</a> Cell. 154 (4), 827-842 (2013).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Pierwszym krokiem do umożliwienia śledzenia komórek nowotworowych in vivo za pomocą tej metody jest zaprojektowanie ich w taki sposób, aby wykazywały ekspresję reportera fuzyjnego NIS-FP. Wybór białka fluorescencyjnego w reporterze fuzyjnym ma kluczowe znaczenie, ponieważ oligomeryzacja białek fluorescencyjnych może prowadzić do sztucznego grupowania reporterowego, wpływając w ten sposób negatywnie na jego funkcję. Odnieśliśmy sukces ze sprawdzonymi monomerycznymi białkami fluorescencyjnymi, takimi jak mEGFP (z mutacją monomeryzującą A206K36,37), mTagRFP czy mCherry. NIS może być pochodzenia ludzkiego lub mysiego (hNIS lub msNIS) w zależności od celu eksperymentu i modelu nowotworu. Skuteczność transdukcji na ogół różni się między różnymi liniami komórek rakowych. Jednak wygenerowane linie komórek nowotworowych są następnie oczyszczane przez FACS w tym protokole, zmniejszając w ten sposób potrzebę optymalizacji warunków transdukcji. Transdukcja z dużą liczbą infekcji nie zawsze jest wskazana, ponieważ integracja wielu konstruktów z genomem może skutkować nie tylko wyższą ekspresją konstruktu, ale także bardziej niepożądaną/nieuregulowaną modyfikacją genomu. Dlatego ważne jest, aby pozwolić komórkom transdukowanym poliklonalnie rosnąć do stabilności ekspresji (monitorowanej przez cytometrię przepływową) i unikać sortowania najjaśniejszych klonów tylko za pomocą FACS. Sprawia to również, że walidacja funkcjonalna cech niereporterowych ma kluczowe znaczenie przed wykorzystaniem tych komórek do eksperymentów in vivo. Niedawno opracowaną alternatywą dla dostarczania genów wirusowych jest technologia edycji genów38, która oferuje bardziej szczegółową kontrolę nad miejscami integracji wirusa. Ważna jest analiza ekspresji za pomocą cytometrii przepływowej i immunoblottingu. Cytometria przepływowa umożliwia pozyskiwanie danych populacyjnych z pojedynczych komórek, na przykład w celu zbadania, czy w czasie występuje dryf w poziomach ekspresji reporterowej. Opiera się tylko na ugrupowaniu FP, chyba że komórki są również barwione przeciwciałem skierowanym przeciwko powierzchniowemu lub całkowitemu NIS. Cytometria przepływowa nie informuje o integralności reportera fuzyjnego. W przeciwieństwie do tego, immunoblotting informuje o integralności reportera fuzyjnego. Należy dodać masę cząsteczkową NIS i FP w celu określenia oczekiwanej masy cząsteczkowej wybranego NIS-FP. Konfokalna mikroskopia fluorescencyjna wykazała kolokalizację reporterową fuzji ze znacznikiem błony plazmatycznej, aglutyniną z kiełków pszenicy, we wszystkich nowo powstałych liniach komórkowych. Była to oczekiwana lokalizacja komórkowa dla większości białka i wskazała kamień milowy na późniejszą walidację funkcjonalną. Jeśli na błonie komórkowej stwierdzono minimalną ilość NIS-FP lub nie stwierdzono jej wcale (np. tylko w wewnętrznych przedziałach komórkowych), wskazywałoby to na biologiczny problem komórki z reporterem fuzyjnym w tej linii komórkowej lub potencjalną mutację reportera fuzyjnego wpływającą na jej transport wewnątrzkomórkowy. Warto zauważyć, że nie zaobserwowaliśmy takiego przypadku w żadnej z badanych przez nas do tej pory komórek nowotworowych, do których należały: A375P, A375M2, SK-Mel28, WM983A/B (czerniak ludzki); MCF-7, MDA-MB-231, MDA-MB-436 (rak piersi u ludzi); NCI-H1975 (rak płuc u ludzi); SK-Hep1 (ludzki rak wątroby); 4T1, 4T1.2, 66cl4, 67NR, FARN168 (mysi zapalny rak piersi); B16F0, B16F3, B16F10 (czerniak mysi); MTLn3 (gruczolakorak piersi szczura).
Funkcja NIS musi być mierzona za pomocą testów wychwytu z radioaktywnymi substratami NIS. Ze względu na to, że radioznacznik SPECT 99mTcO4- jest produkowany w generatorze, a zatem szeroko dostępny w szpitalach bez konieczności syntezy radioznacznika, a także ma wygodniejszy dłuższy okres półtrwania (6,01 h dla 99 mTc w porównaniu do 110 min dla 18F), użyliśmy tego substratu NIS do rutynowej walidacji funkcjonalnej nowych linii komórkowych wykazujących ekspresję NIS-FP. Wstępne zablokowanie komórek wykazujących ekspresję NIS za pomocą kosubstratu NIS nadchloranu sodu spowodowało oczekiwane zmniejszenie/zniesienie wychwytu radioznacznika, wykazując w ten sposób swoistość wychwytu radioznacznika. Ten test swoistości NIS jest krytycznym etapem walidacji. Jeżeli eksperyment dotyczący swoistości NIS nie doprowadziłby do zmniejszenia wychwytu radioznacznika porównywalnego z odpowiednimi komórkami rodzicielskimi, oznacza to, że albo wystąpił błąd techniczny podczas eksperymentu, albo wychwyt radioznacznika nie był spowodowany NIS. Możliwe jest również, że wstępne blokowanie nadchloranu sodu zmniejsza wychwyt radioznacznika w rodzicielskiej linii komórkowej; pozwoliłoby to zidentyfikować linie komórkowe z endogenną funkcjonalną ekspresją NIS (np. stymulowane komórki tarczycy6).
Kluczową zaletą tego protokołu obrazowania jest to, że informacje są gromadzone w 3D i w czasie. Pozwala to na porównywanie obrazów tego samego zwierzęcia w czasie, dostarczając w ten sposób sparowanych danych, a tym samym przezwyciężając problemy spowodowane zmiennością między zwierzętami. Kontrastuje to z większością metod oceny przerzutów niezwiązanych z obrazowaniem, które opierają się na składaniu ofiar z różnych zwierząt w różnych punktach czasowych. Na rycinie 3B widać, jak rozprzestrzenianie się i rozrost przerzutów postępowały w czasie u pojedynczego zwierzęcia. Sygnały wykrywane przez obrazowanie PET/CT są zasadniczo spowodowane ekspresją NIS. Obejmuje to wszystkie sygnały z egzogennych komórek nowotworowych wykazujących ekspresję NIS, a także wszystkich narządów wykazujących endogenną ekspresję NIS. Typowe endogenne sygnały NIS znajdują się w tarczycy i gruczołach ślinowych, żołądku oraz, przy niskich stężeniach, w niektórych częściach gruczołów sutkowych i łzowych. Oprócz endogennej ekspresji NIS, radioznacznik NIS [18F]BF4- jest również wydalany przez nerki, co wyjaśnia wychwyt radioznacznika w pęcherzach wypełnionych moczem. Wychwyt nerkowy nie jest już wykrywalny w punkcie czasowym obrazowania zalecanym w tym protokole (45 minut po wstrzyknięciu radioznacznika6). Jeśli sygnały z pęcherzy wypełnionych moczem mogą prowadzić do problemów z sygnałem do tła, pęcherz może zostać mechanicznie opróżniony w znieczuleniu przed obrazowaniem. Co ważne, sygnały endogenne mogą się różnić w zależności od szczepu zwierzęcego. Warto również zauważyć, że endogenna ekspresja NIS w gruczołach sutkowych może być wyższa w warunkach laktacji10. W przedstawionym przypadku oraz w przypadkach tych przerzutowych linii komórkowych, które udało się scharakteryzować wcześniej (por. lista powyżej), nie stwierdziliśmy, aby endogenna ekspresja NIS istotnie ingerowała w wykrywanie przerzutów. Warto zauważyć, że [18F]BF4- pozostaje bardziej dostępny do wychwytu do tkanek nowotworowych w porównaniu z jodkiem, ponieważ jodek jest metabolizowany do hormonów tarczycy6. Zjawisko to może również przyczyniać się do powstawania większych ilości jodku promieniotwórczego w krwiobiegu w porównaniu z [18F]BF 4-6. W przypadku różnych zastosowań (śledzenie komórek rakowych w innych nowotworach lub aplikacje do śledzenia komórek nienowotworowych) może się to różnić, dlatego zaleca się ocenę, czy endogenna ekspresja NIS może powodować problemy z sygnałem do tła poprzez wstępne eksperymenty. Ważnym aspektem w obrazowaniu przedklinicznym jest aktywność molowa radioznacznika. Opisana tutaj metoda wykorzystuje ~1,5 GBq 18F- jako materiał wyjściowy14 i wykazano, że wytwarza aktywność molową znacznie powyżej wcześniej zgłoszonej metody substytucji12. [18plików]BF4- wytwarzany przy aktywności molowej ≤1 GBq/μmol12 może prowadzić do zmniejszonego wychwytu w tkankach wykazujących ekspresję NIS. Ma to szczególne znaczenie, gdy wstrzykiwana ilość promieniotwórczości na kilogram jest wysoka, tj. gdy obrazuje się małe zwierzęta, takie jak myszy39; Jest to mniej ważne w otoczeniu ludzkim40. Aktywność wysokotrzonowa jest zatem niezbędna do uzyskania wysokiej jakości przedklinicznego obrazowania PET. Aktywność molowa uzyskana metodą dodawania trifluorku boru14, która jest pokazana w postaci zautomatyzowanej w niniejszym protokole, rozwiązuje ten problem. Ponadto warto zauważyć, że przedstawiony protokół syntezy [18F]BF4- nie jest zgodny z dobrą praktyką wytwarzania (GMP) i w związku z tym nie nadaje się do stosowania w badaniach klinicznych na ludziach w tej formie. Protokół GMP (poprzez metodę substytucji 18F do znakowania radioizotopem BF4-) jest dostępny w innych miejscach40.
Obrazowanie PET/CT umożliwia wizualizację wychwytu radioznacznika, który wskazuje na wychwyt radioznacznika za pośrednictwem NIS, pochodzący z ekspresji komórek nowotworowych NIS-FP. Co ważniejsze, powiązane sygnały PET można określić ilościowo. Konieczne jest stosowanie wiarygodnych procedur określania progów w celu zapewnienia spójnego i bezstronnego rozróżniania istotnych sygnałów z dowolnego potencjalnego tła. Ponieważ tło różni się w różnych lokalizacjach in vivo, ważne jest, aby wziąć pod uwagę lokalne/regionalne progi i segmentację. Jedna z takich metod została opracowana i nazwana na cześć Otsu34, a jej implementacja 3D jest wykorzystywana do renderowania 3D guza pierwotnego i przerzutów w tym protokole. Ogólnie rzecz biorąc, obraz widziany przez obserwatora wizualnie najlepiej odpowiada ilościowym wartościom %wstrzykniętej dawki (%ID). Jeśli chodzi o kwantyfikację opartą na obrazie, ważne jest również znormalizowanie zmierzonych wartości radioaktywności różnych tkanek do ich objętości. Istnieją dwa najczęściej stosowane sposoby wyrażania znormalizowanych wyników: (i) %ID na objętość (np. %ID/ml) i (ii) standardowa wartość absorpcji (SUV35). Różnią się one tym, że %ID/ml bierze pod uwagę tylko pojedynczą objętość, podczas gdy SUV jest miarą względną w stosunku do średniej radioaktywności całego zwierzęcia. Ważne jest również, aby pamiętać, że obrazowanie NIS umożliwia dostęp do żywej objętości guza (LTV), ponieważ martwe/umierające komórki, które nie syntetyzują ATP, nie mogą już importować radioznacznika10. Wyjaśnia to duży obszar o niskim sygnale w obrębie guza pierwotnego (guz w kształcie pączka) wskazujący na obszary śmierci/martwicy komórek nowotworowych. Co ważne, LTV było znacznie bardziej wiarygodną miarą masy guza w porównaniu z surową objętością guza dostępną za pomocą pomiarów suwmiarkowych (które nie uwzględniają żywotności i oceniają tylko powierzchowne obszary guza).
Główna zaleta tej dwutrybowej strategii śledzenia jest widoczna podczas pobierania tkanek po uboju zwierząt. Na podstawie obrazów in vivo i wspomaganych fluorescencyjnymi komórkami rakowymi podczas sekcji zwierząt, można również niezawodnie pobierać małe i głęboko osadzone narządy/przerzuty. Metodologia konserwacji/cięcia tkanek mrożonych umożliwia bezpośrednie obrazowanie fluorescencyjne GFP bez konieczności barwienia przeciwciałem anty-GFP, ale kosztem zmniejszonego zachowania tkanki strukturalnej w porównaniu z metodologią zatopioną w parafinie utrwalonej w formalinie (FFPE). To ostatnie wymaga również barwienia anty-FP, ponieważ metoda FFPE jest niekompatybilna z nienaruszonym zachowaniem białek fluorescencyjnych (z powodu utrwalenia/odwodnienia/ponownego uwodnienia). Chociaż sygnał fluorescencyjny wskazuje na obecność komórek nowotworowych, ważne jest, aby upewnić się, że klasyfikacja ta została potwierdzona przez pomiary radioaktywności ex vivo pobranych tkanek ("biodystrybucja"). Pomiary radioaktywności ex vivo są bardziej czułe niż wizualne wykrywanie fluorescencji, dlatego mogą pozwolić na identyfikację sygnałów zależnych od komórek rakowych, które w przeciwnym razie pozostałyby niewykryte. W przypadku sesji obrazowania terminalnego bardzo ważne jest dokładne zanotowanie ilości wstrzykniętego radioznacznika, a także czasu pomiarów radioaktywności radioznacznika, wstrzyknięcia zwierząt, uboju zwierząt i skalibrowanych pomiarów licznika scyntylacyjnego pobranych tkanek. Ma to kluczowe znaczenie dla zapewnienia korekcji rozpadu radioznacznika, a tym samym umożliwienia wiarygodnej analizy biodystrybucji.
Obrazowanie PET/CT umożliwia wielokrotną, nieinwazyjną kwantyfikację 3D progresji guza, w tym ocenę rozprzestrzeniania się przerzutów na poziomie całego ciała. Ta cecha jest znaczącą przewagą nad konwencjonalnymi metodami, które często opierają się na dużych kohortach zwierząt, które są poddawane eutanazji w celu oceny progresji guza w różnych punktach czasowych. Zaletami tego podejścia opartego na obrazowaniu są: (i) wysoce czuła nieinwazyjna kwantyfikacja 3D in vivo , (ii) znaczne zmniejszenie liczby zwierząt dzięki możliwości powtórzenia obrazowania, (iii) pozyskiwanie par podłużnych danych z kolejnych sesji obrazowania, poprawiające statystyki poprzez wykluczenie zmienności między zwierzętami, co z kolei jeszcze bardziej zmniejsza liczbę zwierząt, (iv) zautomatyzowana produkcja [18F]BF4- przy wysokich aktywnościach specyficznych oraz (v) wewnętrzna opcja potwierdzenia ex vivo w tkankach za pomocą metodologii fluorescencji, takich jak mikroskopia lub cytometria.
Śledzenie komórek in vivo to rozwijająca się dziedzina. Jest on napędzany przez ostatnie postępy w technologii obrazowania, które zaowocowały zwiększoną rozdzielczością, granicami wykrywalności i możliwościami multipleksowania (poprzez obrazowanie multimodalne). W tym protokole stosujemy tę koncepcję do śledzenia progresji guza, w tym spontanicznych przerzutów do komórek rakowych w 3D poprzez powtórzenie obrazowania. Zastosowania obejmują badania mające na celu rozwikłanie mechanizmów spontanicznych przerzutów do komórek nowotworowych. Na przykład identyfikowalne komórki nowotworowe można wykorzystać do zbadania wpływu różnych składników komórek odpornościowych (obecnych/funkcjonalnych w szczepach zwierzęcych o różnym poziomie immunokompromizacji) na proces przerzutowy. Podobnie, wpływ poszczególnych genów, zarówno w szczepie zwierzęcym, jak i w linii komórek rakowych, może być badany. Co więcej, przedstawiony protokół może być wykorzystany do oceny/walidacji skuteczności określonych leków lub koncepcji terapeutycznych w zakresie progresji nowotworu. Co ważne, ta para gen reporterowy:radioznacznik do obrazowania PET (NIS:[18F]BF4-) może być również wykorzystywana do różnych zastosowań związanych ze śledzeniem komórek. Na przykład kilka terapii komórkowych staje się obecnie obiecującymi podejściami terapeutycznymi. Obejmuje to terapie komórkowe w leczeniu nowotworów41, ale także w transplantologii42 i medycynie regeneracyjnej43,44. Śledzenie komórek in vivo w całym ciele staje się coraz ważniejsze dla rozwoju i klinicznego przełożenia terapii komórkowych, na przykład do oceny bezpieczeństwa i monitorowania terapii.

Choroba przerzutowa jest przyczyną większości zgonów związanych z rakiem 1. Pomimo szeroko zakrojonych badań nad procesami przerzutowymi, trudno jest osiągnąć wiarygodne monitorowanie przerzutów nowotworowych w modelach zwierzęcych. Najnowsze postępy w technologiach obrazowania całego ciała i podejściach do obrazowania multimodalnego umożliwiły nieinwazyjne śledzenie komórek in vivo2,3,4,5. Ten ostatni może być używany jako narzędzie do monitorowania obecności, dystrybucji, ilości i żywotności komórek, nieinwazyjnie i wielokrotnie u żywego zwierzęcia lub człowieka.
Celem opisanej tutaj metody jest długotrwałe i nieinwazyjne śledzenie komórek nowotworowych w 3D w żywych modelach nowotworów gryzoni. Korzystając z tej metody, naukowcy będą w stanie dokładnie określić ilościowo progresję guza, w tym rozprzestrzenianie się przerzutów w 3D. W porównaniu z tradycyjnymi technikami nieopartymi na obrazowaniu, metoda ta oferuje pozyskiwanie danych ilościowych przy znacznie zmniejszonej liczbie zwierząt. Inną cechą tej metody jest to, że umożliwia ona korelację obrazowania in vivo z usprawnioną analizą ex vivo śledzonych komórek w pobranych tkankach za pomocą histologii lub cytometrii3,6.
Uzasadnieniem dla rozwoju tej metody było dostarczenie narzędzia in vivo do monitorowania i kwantyfikacji całego procesu przerzutowego w modelach guzów gryzoni. Co ważne, został on zaprojektowany tak, aby zminimalizować wykorzystanie zwierząt przy jednoczesnym zmniejszeniu zmienności między zwierzętami. Nieinwazyjne obrazowanie podłużne całego ciała doskonale nadaje się do informowania o przerostach przerzutowych, dla których samo w sobie trudno jest dokładnie przewidzieć czas i miejsce ich wystąpienia. Obrazowanie 3D całego ciała znalazło się zatem w centrum rozwoju metody. Aby wypełnić lukę między obrazowaniem in vivo całego ciała a potencjalnym potwierdzeniem histologicznym ex vivo, przyjęto podejście do obrazowania wieloskalowego oparte na dwutrybowym reporterze radionuklidowo-fluorescencyjnym3,6.
Pozytonowa tomografia emisyjna (PET) to obecnie najbardziej czuła technologia obrazowania 3D całego ciała, oferująca doskonałą penetrację głębokości i absolutną kwantyfikację7 o rozdzielczości <1 mm8,9. Obecnie przedkliniczne śledzenie komórek na poziomie całego ciała za pomocą obrazowania radionuklidów może niezawodnie wykrywać komórki o gęstości ~1,000 komórek na objętość miliona komórek3,6 z rozdzielczościami w zakresie submilimetrowym. W przeciwieństwie do mikroskopii przyżyciowej nie jest w stanie wykryć pojedynczych rozprzestrzeniających się komórek nowotworowych, ale nie wymaga zabiegów chirurgicznych (np. komór okiennych), nie jest ograniczona do małego pola widzenia, a także nie jest ograniczona niską penetracją i rozproszeniem tkanek. Obrazowanie bioluminescencyjne stanowi niedrogą alternatywę, ale wiąże się z problemami z rozpraszaniem i absorpcją światła, a także słabą penetracją głębokości, a w konsekwencji poważnie ograniczoną w kwantyfikacji2. Fluorescencyjne obrazowanie całego ciała zostało wykorzystane do pozyskiwania obrazów 3D, ale jest znacznie mniej czułe w porównaniu z technologiami bioluminescencji lub radionuklidów2. Niemniej jednak fluorescencja daje możliwość przeprowadzenia dalszej analizy tkanek ex vivo za pomocą cytometrii lub mikroskopii. Ta ostatnia wypełnia lukę między makroskopowym obrazowaniem całego ciała (rozdzielczość mm) a mikroskopową analizą tkanek pod mikroskopem fluorescencyjnym (rozdzielczość μm)3. W związku z tym metody radionuklidów i fluorescencji wzajemnie się uzupełniają, począwszy od poziomu całego ciała, a skończywszy na skali (sub)komórkowej.
Obrazowanie genów reporterowych idealnie nadaje się do długotrwałego śledzenia komórek, co jest wymagane w badaniach nad przerzutami. W tym zastosowaniu jest lepsza niż bezpośrednie znakowanie komórek, ponieważ (i) nie ma wpływu na rozcieńczenie etykiety, a tym samym nie jest ograniczona w czasie śledzenia, oraz (ii) lepiej odzwierciedla liczbę żywych komórek. W związku z tym śledzenie komórek całego ciała jest szczególnie przydatne w zastosowaniach, w których identyfikowalne komórki namnażają się lub rozszerzają in vivo, na przykład w badaniach nad rakiem3,6, do wykrywania powstawania potworniaków w badaniach nad komórkami macierzystymi lub do ilościowego określania ekspansji komórek odpornościowych5.
Dostępne są różne geny reporterowe oparte na radionuklidach2. Należą do nich enzymy, takie jak kinaza tymidynowa wirusa opryszczki pospolitej HSV11 (HSV1-tk), transportery, takie jak symporter jodku sodu (NIS) lub transporter noradrenaliny (NET), a także receptory powierzchniowe komórek, takie jak receptor dopaminy D2 (D2R). NIS jest glikozylowanym białkiem transbłonowym, które aktywnie pośredniczy w wychwytywaniu jodku, na przykład w komórkach pęcherzykowych tarczycy w celu późniejszej syntezy hormonów tarczycy10. Proces ten jest napędzany przez symport Na+ i opiera się na komórkowym gradiście sodu, który jest utrzymywany przez Na+/K+-ATPase11. W związku z tym NIS lepiej odzwierciedla liczbę żywych komórek niż inne reportery, ponieważ wychwyt jodku/radioznacznika jest związany z aktywnym gradientem Na+/K+, a nie samą obecnością transportera. Tradycyjnie, jodek promieniotwórczy był używany do obrazowania NIS. Do śledzenia komórek stwierdzono, że alternatywne radioznaczniki NIS, które nie są metabolicznie uwięzione w tarczycy, są superior6. Ten niedawno opracowany radioznacznik PET [18F]tetrafluoroboran ([18F]BF4-)12,13 wykazuje lepszą farmakokinetykę w porównaniu do radiojodku6, a jednocześnie jest dostępny przy wysokich specyficznych działaniach14 bez potrzeby stosowania skomplikowanych urządzeń radiochemicznych. [18plików]BF4- może być syntetyzowany na dwa różne sposoby. Pierwsza metoda opiera się na wymianie izotopowej nieradioaktywnego 19F w BF4- z radioaktywnym 18F12. Druga metoda polega na dodaniu 18F do nieradioaktywnego trifluorku boru14. Stwierdzono, że ta ostatnia metoda daje wyższe specyficzne działania14 i jest metodą z wyboru do obrazowania przedklinicznego.
NIS jest wysoce ekspresyjny w tkankach tarczycy. Ulega również ekspresji w gruczołach sutkowych śliny, łzowych i laktacyjnych, a także w żołądku, ale na niższych poziomach w porównaniu z tarczycą10. Dzięki temu za pomocą NIS można uzyskać doskonałe obrazowanie kontrastowe w innych obszarach ciała. Jest również wysoce homologiczny między człowiekiem, szczurem i myszą10. Ponadto nie ma doniesień o toksyczności dla ektopowej ekspresji NIS w komórkach nietarczycowych. Co ważne, NIS nie jest również związany z odpowiedzią immunologiczną gospodarza, ani u ludzi, ani u gryzoni. NIS został wykorzystany jako gen reporterowy do pomiaru aktywności promotora15,16,17 i ekspresja genów18,19,20,21,22,23 w kilku różnych kontekstach. Został również wykorzystany do nieinwazyjnego obrazowania wektorów terapii genowej24,25, oraz do śledzenia komórek w kardiologu4, hematopoietic26, inflammation5 i neurowe studies27. Ostatnio NIS jest również używany jako gen reporterowy do śledzenia przerzutów raka in vivo3,6.
Podsumowując, główne zalety tej metody w porównaniu z poprzednimi technikami to: (i) wysoce czuła nieinwazyjna lokalizacja 3D in vivo i kwantyfikacja rozprzestrzeniania się przerzutów, (ii) zautomatyzowana produkcja [18F]BF4- przy wysokiej aktywności molowej, (iii) znaczna redukcja wymaganych zwierząt poprzez obrazowanie podłużne, (iv) pozyskiwanie sparowanych danych z kolejnych sesji obrazowania, co skutkuje lepszymi danymi statystycznymi, co z kolei jeszcze bardziej ogranicza wykorzystanie zwierząt oraz (v) wewnętrzną opcję potwierdzania ex vivo komórek rakowych w tkankach za pomocą cytometrii lub mikroskopii fluorescencyjnej.

<table><tbody><tr><td>Krok 1) Inżynieria i charakterystyka&nbsp; komórek nowotworowych w celu ekspresji reportera fuzji radionuklidowo-fluorescencyjnej NIS-FP.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2'-(4-etoksyfenylo)-5-(4-metylo-1-piperazynylo)-2,5'-Bi-1H-benzimidazol</td><td>Thermo Scientific</td><td>H3570</td><td>Banalna nazwa: Hoechst 33342; Numer CAS: 23491-52-3; Hoechst 33342, trichlorowodorek, trójwodzian - 10 mg/ml roztwór w wodzie.</td></tr><tr><td>Linia komórkowa mysiego raka piersi 4T1</td><td>ATCC</td><td>CRl-2539</td><td>Szczegółowe informacje można znaleźć na stronie internetowej ATCC</td></tr><tr><td>Automatyczny licznik komórek, np. CASYCounter</td><td>Roche Diagnostics GmbH</td><td>5651697001</td><td>CASY Model TT Licznik i analizator komórek</td></tr><tr><td>CASYclean Odczynnik czyszczący Sedna</td><td>Scientific</td><td>2501036</td><td></td></tr><tr><td>CASYton Isotonic Diluent</td><td>Sedna Scientific</td><td>2501037</td><td></td></tr><tr><td>Konfokalny mikroskop fluorescencyjny, np. Leica TCS SP5</td><td>Leica, Wetzlar, Niemcy</td><td></td><td>Wyposażony w Plan-Neofluor 25 razy; 0,5NA i planapochromatyczny 63 razy; Obiektywy UV z olejem 1,4NA i lasery diodowe (405 nm), argonowo-jonowe (458, 477, 488, 496, 514 nm) i HeNe (543 i 633 nm); Oprogramowanie Leica LAS AF Lite 4.0.11706 (Leica Microsystems CMS GmbH) zostało użyte do akwizycji obrazów i analizy</td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe nr 1,5 grubości</td><td>VWR International</td><td>631-0150</td><td></td></tr><tr><td>Dabco</td><td>Sigma</td><td>290734</td><td>Stock 125 mg/ml</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Sigma</td><td>D5546</td><td>Suplement z 10% (v/v) FBS i L-glutaminą (2 mM) w celu stworzenia optymalnej pożywki dla komórek MDA-MB-231.</td></tr><tr><td>Sorter FACS, np. BD FACSAria III&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>Wyposażony w oprogramowanie BD FACS DIVA, system 6 laserów (lasery 375/405/488/561/633 nm) - komórki posortowane za pomocą 100 &mu; M Dysza pod ciśnieniem przepływu 20 psi, przedłużenie okna 2,0 &mu; m, filtr o neutralnej gęstości 2,0 i napięcie płytowe 3 kV</td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>Sigma</td><td>F9665</td><td>Ciepło inaktywowane w temperaturze 56 & stopni; C przez 30 min</td></tr><tr><td>Automatyczny licznik gamma, np. 1282 Compugamma</td><td>LKB Wallac Laboratory</td><td></td><td>99mTc-pertechnetate okno energetyczne 110-155 keV&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; Okno energetyczne 18F 175-220 keV</td></tr><tr><td>Hoechst 33342 rozwiązanie</td><td>Life Technologies</td><td>H1399</td><td>1-3 &micro; g/ml; Zamiast tego można użyć DAPI (od różnych dostawców).</td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Sigma</td><td>G7513</td><td>Roztwór 200 mM skoncentrowany, sterylnie filtrowany</td></tr><tr><td>Liniowy polietyleninin (PEI)</td><td>Polyscience</td><td>23966-2</td><td>Liniowy, 25 kDa; odczynnik do transfekcji dla linii komórkowej 293T.</td></tr><tr><td>MDA-MB-231 ludzkie komórki raka piersi</td><td>ATCC</td><td>HTB-26</td>, <td>szczegółowe informacje można znaleźć na stronie internetowej ATCC</td></tr><tr><td>Mowiol 4-88</td><td>Sigma</td><td>81381</td><td></td></tr><tr><td>pLNT SFFV NIS-mEGFP</td><td>wniosek z naszego laboratorium</td><td>n/a</td><td>Szczegółowe informacje (generowanie i mapy) można znaleźć w informacjach uzupełniających</td></tr><tr><td>pLNT SFFV NIS-mCherry</td><td>wniosek z naszego laboratorium</td><td>n/a</td><td>Szczegółowe informacje (generowanie i mapy) znajdują się w informacjach uzupełniających</td></tr><tr><td>pMD2.G</td><td>Addgene</td><td>#12259</td><td>plazmidy kodujące dla otoczki VSV-G</td></tr><tr><td>pRRE</td><td>Addgene</td><td>#12251</td><td>plazmid pakujący</td></tr><tr><td>pRSV-Rev</td><td>Addgene</td><td>#12253</td><td>plazmid pakujący roztwór</td></tr><tr><td>paraformaldehydu 4 % (w/v) w PBS</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-281692</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna</td><td>Sigma</td><td>P43330</td><td>Zawierający penicylinę (10 000 jednostek/ml) i streptomycynę (10 mg/ml), sterylnie filtrowaną</td></tr><tr><td>sól fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS)</td><td>Sigma</td><td>D8537</td><td>pH 7,4, sterylnie filtrowany i bez chlorku wapnia i chlorku magnezu</td></tr><tr><td>Poli(alkohol winylowy - octan winylu)</td><td>Polysciences</td><td>17951</td><td>Nazwa trywialna: Mowiol 4-88; Numer CAS: 9002-89-5</td></tr><tr><td>Dichlorowodorek puromycyny</td><td>Sigma</td><td>P8833</td><td>Z Streptomyces alboniger, rozpuszczony w sterylnej wodzie&nbsp;</td></tr><tr><td>Wirówka stołowa, np. Rotina 380 R Wirówka stołowa</td><td>Hettich Lab Technology</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Sigma</td><td>R0883</td><td>Suplement zawierający 10% (v/v) FBS i L-glutaminę (2mM) w celu uzupełnienia optymalnej pożywki dla komórek 4T1.</td></tr><tr><td>SFCA Filtr strzykawkowy 0,45 &mu; m</td><td>Strzykawki Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 mL</td><td>BD Emerald</td><td></td><td>Jednorazowe niesterylne strzykawki</td></tr><tr><td>Mikroskop fluorescencyjny do hodowli tkankowych, np. EVOS-FL&nbsp;</td>System obrazowania komórek <td>Life Technologies</td><td></td><td>wyposażony w 10-krotny obiektyw (PlanFL PH2, 10&times;/0,25, &infin;/1,2) oraz kolorową kamerę</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA, roztwór 10X&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>59418C</td><td>(0,5 % (w/v) trypsyna, 0,2 % (w/v) EDTA) promieniowanie gamma napromieniowane metodą SER-TAIN i bez czerwieni fenolowej.</td></tr><tr><td>Koniugat z kiełków pszenicy Alexa Fluor 633&nbsp;</td><td>Technologie życiowe&nbsp;</td><td>W21404</td><td>Używany w skali 1:1000 (2 &micro; g/mL) dla immunofluorescencji komórkowej</td></tr><tr><td>Krok 2) Ustanowienie modeli nowotworów in vivo.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Suwmiarka cyfrowa</td><td>World Precision Instruments</td><td>501601</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane 1000 mg/g</td><td>Isocare</td><td></td><td>Do inhalacji</td></tr><tr><td>Palnik fluorescencyjny, np. NightSea Palnik fluorescencyjny DFP-1</td><td>Mikroskopia elektronowa Nauki</td><td>SFA-LFS-RBS / GR</td><td>Wyposażony w filtry emisji GFP i RFP oraz gogle filtrujące NightSea (DFP-1)</td></tr><tr><td>Strzykawki 0,3 ml insuliny U-100</td><td>Terumo</td><td></td><td>29G & razy; 1/2'' - 0,33 & razy; 12 mm</td></tr><tr><td>Standardowe materiały/sprzęt do techniki aseptycznej i utrzymania</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>zwierzątKrok 3) Produkcja [18F]BF4- przy użyciu zautomatyzowanej platformy syntezy radioznaczników.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>15-crown-5</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>188832</td><td>CAS 33100-27-5</td></tr><tr><td>Acetonitryl (bezwodny)</td><td>Acros Organics</td><td>326811000</td><td></td></tr><tr><td>Trifluorek boru eterian dietylu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>216607</td><td>BF3. OEt2, oczyszczone przez redestylację, &ge; 46,5 % podstawy BF3. CAS 109-63-7</td></tr><tr><td>Platforma automatycznej syntezy radioznaczników (ARS), np. FASTLab</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kasety jednorazowe dla platformy ARS, np. Kasety FASTLab</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td>FASTlab Pakiet deweloperski</td></tr><tr><td>Arkusze poliestrowe Polygram Alox N/UV254</td> Płytki <td>Macherey-Nagel</td><td>802021</td><td>RadioTLC, 40 i razy; 80 mm</td></tr><tr><td>Silny wkład anionowymienny, np. Sep-Pak Accell Plus QMA Plus Lekkie</td><td>wody</td><td>WAT023525</td><td>stan z 1M NaCl (10 mL) i H2O (10 mL)</td></tr> <tr><td>Neutralny wkład z tlenku glinu, np. Sep-Pak Tlenek glinu N Plus Lekkie</td><td>wody</td><td>WAT023561</td><td>stan z H2O (10 mL), acetonem (10 mL) i powietrzem (20 mL)</td></tr><tr><td>Woda do wstrzykiwań USP</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Azot filtr</td><td>Millipore</td><td>SE2M049I05</td><td>Sterylny 0,2 i mikro; m FG Millex 13 mm</td></tr><tr><td>Krok 4) In vivo obrazowanie komórek wykazujących ekspresję NIS-FP metodą nanoPET/CT.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane 1000 mg/g</td><td>Isocare</td><td></td><td>Do inhalacji</td></tr><tr><td>Przedkliniczny multimodalny instrument do obrazowania PET/CT, np. nanoScan PET/CT</td><td>Mediso Medical Imaging System, Budapeszt, Węgry</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Palnik fluorescencyjny, np. Palnik fluorescencyjny NightSea DFP-1</td><td>Mikroskopia elektronowa Nauki</td><td>SFA-LFS-RBS/GR</td><td>Wyposażony w filtry emisji GFP i RFP oraz gogle filtracyjne NightSea (DFP-1)</td></tr><tr><td>Komora indukcyjna do znieczulenia gryzoni</td><td>Vet-Tech</td><td>AN010R</td><td>Z zaworami trójdrogowymi (x2), łącznikiem do montażu na rurze do wlotu, rurką PVC do wlotu gazu (2 m) i rurką do oczyszczania 22 mm (2 m)</td></tr><tr><td>System znieczulenia gryzoni</td><td>Vet-Tech</td><td>AN001B</td><td>W zestawie maska na twarz dla zwierząt o rozmiarach odpowiednich dla zwierząt będących przedmiotem zainteresowania oraz waporyzator z izolfluranem</td></tr><tr><td>Sterylna sól fizjologiczna</td><td>Thermo Scientific Oxoid</td><td>BO0334B</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawki 0,3 ml insuliny U-100</td><td>Terumo</td><td></td><td>29G i razy; 1/2'' - 0,33 & razy; 12 mm, do dożylnego wstrzykiwania radioznacznika</td></tr><tr><td>Weterynaryjny wymiatacz</td><td>Vet-Tech</td><td>AN200</td><td>Mechanizm ważenia filtra VetScav - 240 V z automatyczną kompensacją temperatury i systemem LED</td></tr><tr><td>5) Analiza danych in vivo.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tera-Tomo Monte Carlo oparty na pełnym iteracyjnym algorytmie 3D</td><td>Mediso Medical Imaging System, Budapeszt, Węgry</td><td></td><td></td></tr><tr><td>VivoQuant Software</td><td>Invicro LLC., Boston, USA</td><td></td><td></td></tr><<tr><td>strong>6) Ex vivo analizy</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2- Metylobutan&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>59070-1L-D Wstępnie</td><td>schłodzony nad ciekłym azotem do zamrażania tkanek osadzonych w OCT</td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej (BSA)</td><td>Sigma</td><td>85040C</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe 22 i razy; Kriostat 50 mm</td><td>VWR International</td><td>SMITMCQ211022X50</td><td></td></tr><tr><td>, np. Cryostat MNT</td><td>SLEE Medical</td><td></td><td>dwuczęściowa modułowa maszyna do zatapiania histologii wyposażona w moduł zatapiania, komorę do przechowywania tkanek i zimną płytę</td></tr><tr><td>Cy5 AffiniPure Goat anti-Rabbit IgG (H+L)</td><td>Jackson/Stratech</td><td>111-175-144</td><td>Używany w 1:500 (2 &micro; g/mL)</td></tr><tr><td>Dabco</td><td>Sigma</td><td>290734</td><td>Stock 125 mg/ml</td></tr><tr><td>Mikrotomy Blades, np. Feather S35&nbsp;</td>Mikroskop fluorescencyjny <td>CellPath</td><td></td><td></td></tr><tr><td>(szerokokątny lub konfokalny), np. Nikon Eclipse Ti-E Odwrócony mikroskop fluorescencyjny</td><td>Nikon</td><td></td><td>Wyposażony w 10&, 20& razy; (powietrze), a najlepiej 40 razy; (olejowe) obiektywy i lasery/filtry lub kostki filtracyjne, odpowiednio, które są odpowiednie dla Hoechst 33342, GFP i Cy5</td></tr><tr><td>Automatyczny licznik gamma, np. 1282 Compugamma</td><td>LKB Wallac Laboratory</td><td></td><td>99mTc-pertechnetate okno energetyczne 110-155 keV, okno energetyczne 18F 175-220 keV</td></tr><tr><td>rozwiązanie Hoechst 33342 Life</td><td>Technologies</td><td>H1399</td><td></td></tr><tr><td>Adapter fluorescencyjny do mikroskopu preparacyjnego, np. NightSea Adapter</td><td>Mikroskopia elektronowa Sciences</td><td>SFA-LFS-RBS/GR</td><td>Wyposażony w filtry emisji GFP i RFP</td></tr><tr><td>Związek O.C.T.</td><td>VWR international</td><td>361603E</td><td></td></tr><tr><td>Długopis woskowy, np. PAP-PEN</td><td>Dako UK Ltd</td><td></td><td>Długopis woskowy do rysowania wokół sekcji tkanki w celu zmniejszenia wymaganych objętości roztworu barwiącego/myjącego</td></tr><tr><td>Roztwór paraformaldehydu 4 % (w/v) w PBS</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-281692</td><td></td></tr><tr><td>Królik anty-CD31</td><td>Abcam</td><td>ab28364</td><td>Poliklonalny anty-mysz używany 1:50 (20 &mikro; g/mL) do immunofluorescencyjnych</td></tr><tr><td>szkiełek mikroskopowych tkanek, np. Szkiełka Superfrost</td><td>VWR, Lutterworth, UK</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana Tris (TBS)</td> <td>dostępne u różnych dostawców.</td><td></td><td>sól fizjologiczna buforowana trisem; 150 mM NaCl, 25 mM Tris/HCl przy pH 7,4</td></tr></tbody></table>

obrazowanie genu reporterowego radionuklidowo-fluorescencyjnego w celu śledzenia progresji guza w modelach guzów gryzoni

Radionuclide-fluorescence Reporter Gene Imaging to Track Tumor Progression in Rodent Tumor Models

Przerzuty są odpowiedzialne za większość zgonów z powodu raka. Pomimo szeroko zakrojonych badań, mechanistyczne zrozumienie złożonych procesów rządzących przerzutami pozostaje niepełne. Modele in vivo mają zasadnicze znaczenie dla badań nad przerzutami, ale wymagają udoskonalenia. Śledzenie spontanicznych przerzutów za pomocą nieinwazyjnego obrazowania in vivo jest obecnie możliwe, ale pozostaje trudne, ponieważ wymaga długotrwałej obserwacji i wysokiej czułości. Opisujemy podłużne połączone podejście do obrazowania całego ciała metodą radionuklidów i fluorescencji in vivo w celu śledzenia progresji guza i spontanicznych przerzutów. Ta metodologia genu reporterowego wykorzystuje symporter jodku sodu (NIS) połączony z białkiem fluorescencyjnym (FP). Komórki nowotworowe są modyfikowane tak, aby stabilnie wyrażać NIS-FP, a następnie selekcja oparta na sortowaniu komórek aktywowanym fluorescencją. Odpowiednie modele nowotworów ustala się u myszy. Komórki nowotworowe wykazujące ekspresję NIS-FP są śledzone nieinwazyjnie in vivo na poziomie całego ciała za pomocą pozytonowej tomografii emisyjnej (PET) przy użyciu radioznacznika NIS [18F]BF4-. PET jest obecnie najbardziej czułą technologią obrazowania in vivo dostępną w tej skali i umożliwia wiarygodną i bezwzględną ocenę ilościową. Obecne metody opierają się albo na dużych kohortach zwierząt, które są poddawane eutanazji w celu oceny przerzutów w różnych punktach czasowych, albo opierają się na ledwo mierzalnym obrazowaniu 2D. Zaletami opisanej metody są: (i) wysoce czułe nieinwazyjne obrazowanie i kwantyfikacja 3D PET in vivo, (ii) zautomatyzowana produkcja znaczników PET, (iii) znaczne zmniejszenie wymaganej liczby zwierząt dzięki opcjom wielokrotnego obrazowania, (iv) pozyskiwanie sparowanych danych z kolejnych sesji obrazowania zapewniających lepsze dane statystyczne oraz (v) wewnętrzna opcja dla ex vivo potwierdzenie obecności komórek nowotworowych w tkankach za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej lub cytometrii. W tym protokole opisujemy wszystkie kroki wymagane do rutynowego, nieinwazyjnego śledzenia komórek rakowych in vivo za pomocą PET/CT i potwierdzenia ex vivo wyników in vivo. Protokół ten ma zastosowanie poza badaniami nad rakiem, gdy interesująca jest lokalizacja, ekspansja i długotrwałe monitorowanie populacji komórek in vivo.

Opisujemy protokół przedklinicznego śledzenia in vivo przerzutów nowotworowych. Opiera się on na reporterze radionuklidowo-fluorescencyjnym łączącym symporter jodku sodu, wykrywany przez nieinwazyjny [18F]tetrafluoroboran-PET, oraz białko fluorescencyjne w celu usprawnionego potwierdzenia ex vivo. Metoda ma zastosowanie do przedklinicznego śledzenia komórek in vivo poza biologią guza.

Obrazowanie genu reporterowego radionuklidowo-fluorescencyjnego w celu śledzenia progresji guza w modelach guzów gryzoni

Metastasis is responsible for most cancer deaths. Despite extensive research, the mechanistic understanding of the complex processes governing metastasis ...

Ogólnym celem niniejszego protokołu jest monitorowanie wzrostu guza oraz przerzutów u żywych gryzoni za pomocą obrazowania. Reporter fuzyjny radionuklid-fluorescencja umożliwia nieinwazyjną detekcję in vivo za pomocą tomografii pozytonowej, natomiast fluorofor wspomaga potwierdzenie wyników ex vivo. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w sytuacjach, gdy konieczne jest śledzenie komórek w żywych zwierzętach przez dłuższy okres czasu.Może to przyczynić się do zrozumienia odległych przerzutów oraz wpływu terapii na progresję nowotworu. Opisana technika to śledzenie komórek nowotworowych za pomocą wysokoczułego i nieinwazyjnego obrazowania in vivo z użyciem znacznika PET wytworzonego w procesie syntezy automatycznej. Oferuje ona znaczną redukcję liczby wykorzystywanych zwierząt w porównaniu z konwencjonalną metodologią.Osoby rozpoczynające pracę z tą metodą mogą poczuć się przytłoczone jej złożonością. W szczególności zautomatyzowana synteza radiotracerów PET znacząco upraszcza ten proces. Wierzymy, że wizualna demonstracja tej metody obrazuje krytyczne etapy związane z obrazowaniem.Zastosowania tej techniki obejmują badania przedkliniczne nowych środków terapeutycznych, które mogą być śledzone równolegle z komórkami nowotworowymi. Metoda ta może dostarczyć cennych informacji na temat biologii raka oraz opracowywania metod leczenia, szczególnie w sytuacjach, gdy istotna jest lokalizacja in vivo, relokacja, ekspansja oraz długoterminowy monitoring określonej populacji.W pierwszej kolejności należy wykorzystać plazmidy z genem reporterowym, wytworzyć cząsteczki Lentiwirusa, przeprowadzić transdukcję komórek i je scharakteryzować. Następnie należy przeanalizować funkcję genu reporterowego poprzez pomiar wychwytu radiotracerów w liniach komórkowych wykazujących ekspresję NISFP. Wysiać oczyszczone komórki wraz z pożywką wzrostową na płytki sześciodołkowe, upewniając się, że wszystkie próbki przygotowano w trzech powtórzeniach.Następnego dnia rano przemyj komórki pożywką wzrostową bez surowicy i inkubuj płytki z 50 kBq tetrafluoroboranu F18 w temperaturze 37 °C przez 30 minut. Następnie zbierz nadsącz i przenieś 100 µL do wcześniej oznakowanej probówki zbiorczej. Odrzuć pozostały nadsącz, a następnie przemyj komórki 1 mL lodowatego roztworu PVS zawierającego wapń i magnez w stężeniach fizjologicznych.Zebrać roztwór płuczący i przenieść 100 µL roztworu płuczącego do wcześniej oznakowanej probówki zbiorczej. Następnie powtórzyć proces płukania jeszcze raz. Dodać 500 µL PVS zawierającego trypsynę oraz EDTA w celu odzyskania komórek.Inkubuj próbki w temperaturze 37 °C aż do odklejenia się komórek, kontrolując stopień odklejenia za pomocą mikroskopu. Następnie przenieś zawiesinę komórkową do oznakowanej probówki zbiorczej. W kolejnym kroku odwiruj próbki komórkowe przy 250 G przez cztery minuty w temperaturze 4 °C.Użyj automatycznego licznika gamma do pomiaru próbek z każdego z czterech typów próbek i oblicz procentowy wychwyt, korzystając z równania pierwszego. Aby rozpocząć syntezę tetrafluoroborku F18, ustaw automatyczną platformę do radiosyntezy w odpowiednim dygestorium chemicznym i upewnij się, że na komputerze sterującym wczytano właściwy plik XML. Podczas pracy syntezatora tetrafluoroborek F18 zostanie wytworzony, a następnie oczyszczony na kartridżu do wymiany anionowej.Wkład anionowymienny należy przepłukać wodą, a następnie osuszyć strumieniem azotu. Produkt końcowy jest eluowany z wkładu anionowymiennego za pomocą 1 mL 0,9% NaCl i przenoszony do szklanej fiolki zbiorczej przez linię odpływową. Przed rozpoczęciem obrazowania należy znieczulić i przygotować myszy zgodnie z protokołem pisemnym.Następnie użyj sterylnego 0,9% roztworu soli fizjologicznej, aby rozcieńczyć roztwór tetrafluoroboranu F18 do stężenia 5 MBq na 50 µl. Za pomocą strzykawki z igłą hipodermiczną pobierz 100 µl roztworu tetrafluoroboranu F18. Zmierz radioaktywność w strzykawce, a następnie zapisz uzyskaną wartość oraz czas pomiaru.Podaj dożylnie 50 µL roztworu tetrafluoroborku F18 do uprzednio ogrzanej żyły ogonowej. Następnie zmierz pozostałą radioaktywność w strzykawce i zapisz wartość oraz czas pomiaru. Iniekcja radioznacznika do żyły ogonowej jest krytycznym etapem.Procedurę tę wykonujemy w znieczuleniu ogólnym zwierzęcia, aby zminimalizować ryzyko błędnego wstrzyknięcia oraz wycieku radioznacznika. Zwierzę pozostaje pod wpływem znieczulenia aż do rozpoczęcia akwizycji obrazów PET, dokładnie 45 minut po wstrzyknięciu radioznacznika.Następnie ustaw timer na 45 minut i upewnij się, że mysz znajduje się na stole w pozycji grzbietowej. Zainstaluj odpowiednie instrumenty do monitorowania chirurgicznego i upewnij się, że działają one prawidłowo przed przejściem do kolejnego kroku. Następnie ustaw parametry obrazowania CT oraz akwizycji obrazów PET.Gdy licznik czasu odliczający czas do rozpoczęcia procedury wskaże 15 minut, rozpocznij akwizycję obrazów CT, a gdy licznik wskaże zero minut, rozpocznij akwizycję obrazów PET. Najpierw zmierz radioaktywność całego uśpionego myszy, a następnie zapisz wartość oraz czas pomiaru. Następnie dokonaj sekcji myszy i pobierz niezbędne tkanki.Zmierz radioaktywność pozostałej części tułowia z i bez ogona. Zapisz te wartości oraz odnotuj czas pomiaru. Następnie zważ pojedynczo wszystkie pobrane tkanki i wykonaj zdjęcia organów nowotworowych w świetle dziennym oraz w świetle fluorescencyjnym.Następnie zatopić tkanki w OCT w celu przeprowadzenia dalszych badań histologicznych. Zmierzyć radioaktywność wszystkich pobranych tkanek, zapisać wartość i odnotować czas pomiaru. Na koniec przedstawić dane jako standardowe wartości pobrania (SUV), zgodnie z opisem w równaniu 2.W tym eksperymencie wykorzystano obrazowanie genu reporterowego fluorescencji radionuklidowej do monitorowania progresji guza w modelu nowotworowym u gryzoni. Konfokalna mikroskopia fluorescencyjna wykazała dokładną lokalizację NISFP w błonie plazmatycznej. Funkcję i swoistość NISFP ilościowo określono za pomocą wychwytu radiotracerów za pośrednictwem NIS.Nie odnotowano istotnych różnic między liniami komórkowymi wykazującymi ekspresję 4T1NISGFP oraz 4T1NISRFP o podobnych poziomach ekspresji NIS. Co istotne, blokada nadchloranem w przypadku wszystkich linii komórkowych wykazała, że uzyskane pobieranie radiotraceru wynika ze specyficznej ekspresji NISFP. Obrazowanie PET całego ciała zwierząt z nowotworem dostarczyło informacji o progresji guza i szerzeniu się przerzutów.Przykład przedstawiony tutaj wykazuje rozległe przerzuty odległe z kilkoma wyraźnymi guzkami w płucach. Wartości procentowej dawki wstrzykniętej oraz objętości zajmowanej przez poszczególne przerzuty w płucach były zróżnicowane. Jednak wartości procentowej dawki wstrzykniętej znormalizowane względem objętości mieściły się w podobnym zakresie.Białko fluorescencyjne w dwufunkcyjnym genie reporterowym umożliwiło identyfikację tkanki nowotworowej w świetle fluorescencyjnym podczas sekcji zwierząt. Następnie analiza biodystrybucji radiotracera ex vivo ujawniła organy o wysokim poborze radiotracera, a tym samym tkanki wykazujące ekspresję NIS. Podczas gdy tarczyca, ślinianki oraz żołądek wykazują endogenną ekspresję NIS, wszystkie pozostałe sygnały dodatnie wskazują na tkanki nowotworowe, takie jak guz i przerzuty.Radionukleotydowy reporter fluorescencyjny umożliwia również identyfikację komórek nowotworowych w późniejszych przekrojach tkankowych. Technika ta utorowała drogę badaczom zajmującym się nowotworami do wizualizacji procesu spontanicznej przerzutowości oraz testowania wpływu leków na ten proces. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest dokładne zaplanowanie wszystkich etapów z wyprzedzeniem.Należy przygotować linie komórkowe, opracować zwierzęce modele nowotworowe oraz zapewnić dostępność wszystkich odczynników i sprzętu do obrazowania w wyznaczonym dniu. Zalecamy rozpoczęcie od niewielkich eksperymentów pilotażowych. Po opanowaniu techniki, przy odpowiedniej organizacji pracy, produkcja radiotracerów oraz obrazowanie zwierząt in vivo może być przeprowadzona u sześciu zwierząt w ciągu ośmiogodzinnego dnia pracy.Po obejrzeniu tego filmu powinieneś posiadać gruntowną wiedzę na temat podejścia do wykorzystania genu reporterowego w badaniach śledzenia komórek in vivo z użyciem radionukleotydowego reportera NIS w połączeniu z białkiem fluorescencyjnym. Powinieneś być również w stanie scharakteryzować linie komórkowe wykazujące ekspresję reportera NISFP w celu przygotowania wymaganego radiopharmaceutyku PET do obrazowania in vivo oraz przeprowadzić eksperymenty dotyczące dystrybucji in vivo i ex vivo. Po zastosowaniu tej procedury można przeprowadzić inne metody, takie jak fluorocytometria, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania.Na przykład, w jaki sposób profil komórek odpornościowych guza i jego przerzutów wiąże się ze sobą lub zmienia w czasie. Należy pamiętać o upewnieniu się, że wytworzone linie komórkowe są wolne od mikoplazm, ponieważ wykazano, że te ostatnie wpływają na wyniki. Co ważne, należy pamiętać, że praca z radioizotopami może być niezwykle niebezpieczna, dlatego podczas wykonywania tej procedury zawsze należy priorytetowo traktować ochronę własną oraz innych osób.

radionuclide-fluorescence-reporter-gene-imaging-to-track-tumor

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Dyfuzyjna tomografia fluorescencyjna oferuje stosunkowo niskokosztowe i potencjalnie wysokoprzepustowe podejście do przedklinowego obrazowania guzów in vivo. Przedstawiono metodologię zbierania danych optycznych, kalibracji i rekonstrukcji obrazu dla bezkontaktowego systemu w dziedzinie czasu sterowanego tomografią komputerową, z wykorzystaniem fluorescencyjnego celowania w biomarker nowotworowy – receptor Epidermal Growth Factor Receptor w modelu glejaka u myszy.

Tomografia dyfuzyjna fluorescencji w dziedzinie czasu sterowana tomografią komputerową u małych zwierząt w celu lokalizacji biomarkerów nowotworowych

Ten film demonstruje protokół ortotopowego wszczepiania komórek raka trzustki z ekspresją białka zielonej fluorescencji do trzustki myszy. Ortotopowy model myszy pomaga w badaniu skuteczności nowych terapii w przypadku guzów pierwotnych i przerzutowych.

Fluorescencyjny ortotopowy model myszy: wszczepianie GFP z ekspresją komórek rakowych do myszy w celu oceny progresji guza in vivo

Źródło:Marina Arantes Radicchi1, Victor Carlos Mello1,Victória Paz Machado1, Márcia Cristina Oliveira da Rocha1, Jaqueline Vaz de Oliveira1, Luana Cristina Camargo1,2, Luís Alexandre Muehlmann1, Ricardo Bentes Azevedo1, Sônia Nair Bao1, João Paulo Figueiró Longo11Instytut Nauk Biologicznych, Uniwersytet w Brasílii, 2Zakład Podstawowych Procesów Psychologicznych, Instytut Psychologii, Uniwersytet w BrasíliiTen film przedstawia procedurę śledzenia progresji guza in vivo poprzez wstrzyknięcie...

Obrazowanie bioluminescencyjne progresji guza piersi w modelu mysim płci żeńskiej

W tym filmie opisujemy fluorescencyjną tomografię molekularną lub FMT do obrazowania in vivo fluorescencyjnych ksenoprzeszczepów glejaka znakowanego białkiem w modelach mysich. Technika ta jest przydatna do wyjaśnienia efektów terapii przeciwnowotworowych na poziomie molekularnym.

Fluorescencyjna tomografia molekularna: technika obrazowania in vivo ksenoprzeszczepów glejaka znakowanego białkiem fluorescencyjnym w modelu mysim

Opisujemy system wielokątowego rotacyjnego obrazowania optycznego (MAROI) do ilościowego oznaczania in vivo markera fluorescencyjnego dostarczanego przez nanopęcherzyki saposyny C (SapC)-dioleoilofosfatydyloseryny (DOPS). Wykorzystując mysie modele raka i zapalenia stawów, pokazujemy, w jaki sposób analiza krzywej sygnału MAROI może być wykorzystana do precyzyjnego mapowania i biologicznej charakterystyki procesów chorobowych.

In vivo (in vivo) Obrazowanie optyczne guzów mózgu i zapalenia stawów za pomocą fluorescencyjnych nanopęcherzyków SapC-DOPS

Procedura ortotopowego wszczepienia komórek raka trzustki z ekspresją białka zielonej fluorescencji (PANC-1 GFP) do trzustki myszy Balb-c Ola Hsd-Fox1nu w celu oceny progresji guza i przerzutów jest przedstawiona tutaj.

Fluorescencyjny ortotopowy model raka trzustki u myszy

Opisujemy metodę stabilnego znakowania ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów (PDX) cząstkami lentiwirusowymi wyrażającymi białko zielonej fluorescencji i reportery lucyferazy. Metoda ta pozwala na śledzenie wzrostu PDX w miejscu pierwotnym, a także wykrywanie spontanicznych i eksperymentalnych przerzutów za pomocą systemów obrazowania in vivo.

Znakowanie ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów z rakiem piersi za pomocą identyfikowalnych reporterów do badań wzrostu guza i przerzutów

Fluorescencyjna tomografia molekularna do obrazowania in vivo ksenoprzeszczepów glejaka

Ten protokół opisuje stworzenie mysiego modelu z guzem do monitorowania progresji guza i angiogenezy w czasie rzeczywistym za pomocą podwójnego obrazowania bioluminescencyjnego.

Podwójne obrazowanie bioluminescencyjne progresji guza i angiogenezy

Tutaj opisujemy nieinwazyjną metodę monitorowania obejmującą lucyferazy i ekspresję białka zielonej fluorescencji w różnych liniach komórkowych raka piersi. Protokół ten zapewnia technikę monitorowania powstawania guza i kolonizacji przerzutów w czasie rzeczywistym u myszy.

Monitorowanie wzrostu raka piersi i tworzenia kolonii przerzutowych u myszy za pomocą bioluminescencji

Manuskrypt opisuje metodologię ustalania oraz monitorowania wzrostu podłużnego spontanicznych przerzutów do płuc z ortotopowo wstrzykiwanych guzów piersi, które mogą być interwencyjne na wszystkich etapach kaskady przerzutowej.

In vivo (in vivo) Obrazowanie w celu pomiaru spontanicznych przerzutów do płuc komórek guza piersi wstrzykniętych ortotopowo

Poznaj metodę obrazowania PET z reporterem radionuklidowo-fluorescencyjnym do śledzenia progresji guza i przerzutów w modelach gryzoni. Technika umożliwia nieinwazyjną obserwację w czasie rzeczywistym.

Obrazowanie genu reporterowego radionuklidowo-fluorescencyjnego w celu śledzenia progresji guza w modelach guzów gryzoni

Przeglądaj więcej filmów