Obrazowanie genu reporterowego radionuklidowo-fluorescencyjnego w celu śledzenia progresji guza w modelach guzów gryzoni

Opisujemy protokół przedklinicznego śledzenia in vivo przerzutów nowotworowych. Opiera się on na reporterze radionuklidowo-fluorescencyjnym łączącym symporter jodku sodu, wykrywany przez nieinwazyjny [¹⁸F]tetrafluoroboran-PET, oraz białko fluorescencyjne w celu usprawnionego potwierdzenia ex vivo. Metoda ma zastosowanie do przedklinicznego śledzenia komórek in vivo poza biologią guza.

Ogólnym celem tego protokołu jest śledzenie wzrostu guza i przerzutów u żywych gryzoni za pomocą obrazowania. Reporter fuzji fluorescencji radionuklidowej umożliwia nieinwazyjną detekcję in vivo za pomocą pozytonowej tomografii emisyjnej, przy czym fluorofor pomaga potwierdzić wyniki ex vivo. Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania, gdy konieczne jest śledzenie komórek u żywych zwierząt przez dłuższy czas.

Może przyczynić się do zrozumienia przerzutów odległych i wpływu leczenia na progresję nowotworu. Opisana technika polega na śledzeniu komórek nowotworowych za pomocą bardzo czułego i nieinwazyjnego obrazowania in vivo za pomocą znacznika PET wytwarzanego w procesie automatycznej syntezy. Oferuje ona znaczne ograniczenie wykorzystania zwierząt w porównaniu z konwencjonalną metodologią.

Osoby, które dopiero zaczynają korzystać z tej metody, mogą czuć się przytłoczone jej złożonością. W szczególności zautomatyzowana synteza radioznacznika PET znacznie upraszcza ten proces. Wierzymy, że wizualna demonstracja tej metody demonstruje te poglądy na krytyczne etapy związane z obrazowaniem.

Implikacje tej techniki rozciągają się w kierunku badań przedklinicznych nowych środków terapeutycznych, które mogą być również śledzone wraz z komórkami nowotworowymi. Metoda ta może zapewnić wgląd w biologię nowotworów i rozwój metod leczenia. Zawsze, gdy interesująca jest lokalizacja in vivo, relokacja, ekspansja i długoterminowe monitorowanie określonej populacji.

Na początek użyj plazmidów genów reporterowych, wygeneruj cząsteczki lentiwirusa, transdukuj komórki i scharakteryzuj je. Następnie przeanalizuj funkcję genu reporterowego poprzez wychwyt radioznacznika w liniach komórkowych wykazujących ekspresję NISFP. Wysiewaj oczyszczone komórki i pożywkę wzrostową na płytkach sześciodołkowych, upewniając się, że wszystkie próbki są przygotowane w trzech powtórzeniach.

Następnego ranka przemyj komórki pożywką wzrostową wolną od surowicy i inkubuj płytki z 50 kilogramami bekereli tetrafluoroboranu F18 w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut. Następnie zebrać supernatant i przenieść 100 mikrolitrów do wstępnie oznakowanej probówki zbiorczej. Odrzuć pozostały supernatant, a następnie przemyj komórki jednym mililitrem lodowatego PVS zawierającego wapń i magnez na poziomie fizjologicznym.

Zebrać roztwór płuczący i przenieść 100 mikrolitrów roztworu płuczącego do wstępnie oznakowanej probówki zbiorczej. Następnie powtórz proces prania jeszcze raz. Dodaj 500 mikrolitrów PVS zawierających zarówno trypsynę, jak i EDTA, aby podnieść komórki.

Próbki należy inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aż komórki się oderwą, używając mikroskopu w celu sprawdzenia oderwania. Następnie przenieś zawiesinę komórek do oznakowanej probówki zbiorczej. Następnie odwirować próbki komórek o stężeniu 250 G przez cztery minuty w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Użyj automatycznego licznika gamma, aby policzyć próbki z każdego z czterech typów próbek i uzyskać procentowy wychwyt za pomocą równania pierwszego. Aby rozpocząć syntezę tetrafluoroboranu F18, należy skonfigurować zautomatyzowaną platformę syntezy radiowej w odpowiednim kapturze chemicznym i upewnić się, że do komputera sterującego załadowano prawidłowy plik XML. Podczas pracy syntezatora zostanie wyprodukowany tetrafuoroborate F18, który zostanie oczyszczony na wkładzie z anionową wymianą.

Wkład anionowymienny zostanie przepłukany wodą, a następnie wysuszony gazowym azotem. Produkt końcowy jest podawany z wkładu anionowymiennego z jednym mililitrem 0,9% chlorku sodu i przenoszony do szklanej fiolki zbiorczej przez przewód wylotowy. Aby rozpocząć obrazowanie, znieczulij i przygotuj myszy zgodnie z pisemnym protokołem.

Następnie użyj sterylnego 0,9% soli fizjologicznej, aby rozcieńczyć roztwór tetrafluoroboranu F18 do 5 megabekereli na 50 mikrolitrów. Za pomocą strzykawki z igłą podskórną pobrać 100 mikrolitrów roztworu tetrafluoroboranu F18. Zmierzyć radioaktywność w strzykawce i zanotować wartość oraz czas pomiaru.

Na próżno podawać dożylnie 50 mikrolitrów roztworu tetrafluoroboranu F18 do wstępnie ogrzanego ogona. Następnie zmierz pozostałą radioaktywność w strzykawce i zapisz wartość i czas pomiaru. Wstrzyknięcie radioznacznika do żyły ogonowej ma kluczowe znaczenie.

Wykonujemy go w znieczuleniu zwierzęcym, aby zminimalizować ryzyko błędnego wstrzyknięcia i rozlania radioznacznika. Zwierzę pozostaje pod narkozą do momentu rozpoczęcia akwizycji obrazu PET. Dokładnie 45 minut po wstrzyknięciu radioznacznika.

Następnie ustaw minutnik, aby odliczał od 45 minut i upewnij się, że mysz jest ustawiona na stole w pozycji mostkowej. Zainstaluj odpowiednie chirurgiczne instrumenty monitorujące i upewnij się, że instrumenty działają prawidłowo przed przejściem dalej. Następnie ustaw perometry do obrazowania CT i akwizycji obrazu PET.

Gdy zegar odliczający wskaże 15 minut, rozpocznij akwizycję obrazu CT, a gdy zegar wskaże zero minut, rozpocznij akwizycję obrazu PET. Najpierw zmierz radioaktywność całej myszy poddanej eutanazji i zapisz wartość oraz czas pomiaru. Następnie przeprowadź sekcję myszy i zbierz niezbędne tkanki.

Zmierzyć promieniotwórczość pozostałej tuszy z ogonem i bez ogona. Zapisz te wartości i zanotuj czasy pomiaru. Następnie zważ wszystkie pobrane tkanki indywidualnie i zrób zdjęcia narządów nowotworowych w świetle dziennym i w świetle fluorescencyjnym.

Następnie osadź tkanki w OCT w celu dalszej histologii. Zmierzyć promieniotwórczość wszystkich pobranych tkanek, zapisać wartość i zanotować czas pomiaru. Na koniec należy przedstawić dane jako standardowe wartości absorpcji lub SUV zgodnie z opisem w równaniu drugim.

W tym eksperymencie wykorzystano obrazowanie genów rejestratora florescencji radionuklidów do śledzenia progresji guza w modelu guza gryzonia. Konfokalna mikroskopia fluorescencyjna wykazała dokładną lokalizację NISFP w błonie plazmatycznej. Funkcję i swoistość NISFP określono ilościowo przy użyciu NIS zapewniającego wychwyt radioznacznika.

Nie stwierdzono istotnych różnic między liniami komórkowymi wykazującymi ekspresję 4T1NISGFP i 4T1NISRFP o podobnych poziomach ekspresji NIS. Co ważne, blok przedchloranu wykazał we wszystkich liniach komórkowych, że uzyskany wychwyt radioznacznika jest spowodowany specyficzną ekspresją NISFP. Obrazowanie PET całego ciała zwierząt z nowotworem ujawniło informacje na temat progresji guza i rozprzestrzeniania się przerzutów.

Pokazany tutaj przykład pokazuje rozległe długie przerzuty z kilkoma wyraźnymi guzkami w płucach. Procentowe wartości wstrzykniętej dawki i zajęte objętości poszczególnych przerzutów do płuc były różne. Jednak wartości dawki wstrzykniętej z normalizacją objętości mieściły się w podobnym zakresie.

Białko fluorescencyjne w genie reporterowym w dwóch trybach umożliwiło identyfikację tkanki nowotworowej w świetle fluorescencyjnym podczas sekcji zwierząt. Późniejsza biodystrybucja radioznacznika ex vivo ujawniła narządy o wysokim wychwycie radioznacznika, a tym samym tkanki wykazujące ekspresję NIS. Podczas gdy tarczyca i gruczoły ślinowe, a także żołądek, wykazują rdzenną ekspresję NIS (NIS), wszystkie inne pozytywne sygnały wskazują na tkanki rakowe, takie jak guz i przerzuty.

Reporter fluorescencji radionuklidów umożliwia również identyfikację komórek nowotworowych w dalszych skrawkach tkanki. Technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się nowotworami do wizualizacji procesu spontanicznych przerzutów i przetestowania, jak wpływają na niego leki. Próbując wykonać tę procedurę, ważne jest, aby dokładnie zaplanować wszystkie kroki z wyprzedzeniem.

Należy ustalić linie komórkowe, skonfigurować modele nowotworów zwierzęcych, a wszystkie odczynniki i sprzęt do obrazowania muszą być dostępne w wymaganym dniu. Na początek polecamy małe eksperymenty pilotażowe. Po opanowaniu, produkcja radioznacznika i obrazowanie zwierząt in vivo mogą być przeprowadzone na sześciu zwierzętach w ciągu ośmiogodzinnego dnia pracy, jeśli zostaną wykonane prawidłowo.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak podejść do genu reporterowego umożliwiającego śledzenie komórek in vivo za pomocą reportera radionuklidu NIS w połączeniu z białkiem fluorescencyjnym. Powinieneś również być w stanie scharakteryzować linie komórkowe wykazujące ekspresję reporterową NISFP w celu wytworzenia wymaganego radioznacznika PET do obrazowania in vivo oraz do przeprowadzenia eksperymentów in vivo i ex vivo przez dystrybucję. Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak fluorocytometria, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania.

Na przykład, jak profil komórek odpornościowych guza i jego przerzuty są ze sobą powiązane lub zmieniają się w czasie. Nie zapomnij upewnić się, że produkowane przez Ciebie linie komórkowe są wolne od mikroplazmidów, ponieważ te ostatnie mają wpływ na wyniki. Co ważne, nie należy zapominać, że praca z izotopami promieniotwórczymi może być niezwykle niebezpieczna, a ochrona siebie i innych musi być zawsze traktowana priorytetowo podczas wykonywania tej procedury.