Name: Analizy napływu wapnia w mitochondriach w izolowanych mitochondriach i hodowanych komórkach (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-27T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 29 s
Description: Poznaj metody pomiaru napływu wapnia do mitochondriów w izolowanych mitochondriach i hodowanych komórkach. Wykorzystaj odczynniki fluorescencyjne i mikroskopię konfokalną do badania sygnalizacji wapniowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ta praca została wsparta grantem z American Heart Association (J.Q.K.).

Wszystkie metody opisane w tym protokole zostały zatwierdzone przez Instytucjonalną Komisję ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Emory.
UWAGA: Pierwsza część to eksperymentalna procedura pomiaru napływu mitochondrialnego Ca2+ w izolowanych mitochondriach serca za pomocą czytnika płytek.
1. Odczynniki i roztwory
<ol>
	<li>Przygotować 500 ml buforu MS-EGTA do izolacji mitochondriów: 225 mM mannitol, 75 mM sacharozy, 5 mM kwasu 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowego (HEPES), 1 mM glikolu etylenowo-bis(β-aminoetylowegoeter)-N,N,N',N'-tetraoctowego (EGTA), pH dostosowane do 7,4 za pomocą KOH. Wysterylizuj go przez filtr 0,22 μm i przechowuj w temperaturze 4 °C. Upewnij się, że bufor MS-EGTA jest wstępnie schłodzony do 4 °C przed użyciem.</li>
	<li>Przygotuj 100 ml buforu KCl: 125 mM KCl, 20 mM HEPES, 1 mM KH2PO4, 2 mM MgCl2, 40 μM EGTA i pH dostosowane do 7,2 za pomocą KOH. Przechowuj go w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Przygotować 1 mM bulionu zieleni wapniowej-5N w dimetylosulfotlenku (DMSO). Materiał wyjściowy zieleni wapniowej-5N można poddawać i przechowywać w temperaturze -20 °C.</li>
	<li>Przygotować podłoża do pobierania Ca2+.
	<ol>
		<li>Przygotować 1 M pirogronian sodu o pH 7,4. Przechowywać w porcjach w temperaturze -20 °C.</li>
		<li>Przygotować 500 mM jabłczanu o pH 7,4. Przechowywać w porcjach w temperaturze -20 °C.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Izolacja mitochondriów serca
<ol>
	<li>Poddaj mysz eutanazji zgodnie ze standardami instytucjonalnymi. 
	UWAGA: W przypadku naszej instytucjonalnie zatwierdzonej metody eutanazji, myszy zostały znieczulone przez inhalację izofluoranu i złożone w ofierze przez zwichnięcie szyjki macicy.</li>
	<li>Zbierz serce, otwierając jamę klatki piersiowej, przecinając po obu stronach żeber, flankując serce, odcinając przeponę i wycinając tkankę serca. 
	UWAGA: W tym protokole izolację mitochondriów przeprowadza się z całego serca pobranego od dorosłej myszy (około 120 mg), co powinno wystarczyć na 3-4 eksperymenty. Do izolacji mitochondriów z innych tkanek bogatych w mitochondria, takich jak wątroba, można użyć do 200 mg tkanki zgodnie z opisanym protokołem.</li>
	<li>Dokładnie wypłucz tkankę w 25 ml lodowatego 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS), upewniając się, że cała krew została wyciśnięta z komór. 
	UWAGA: Serce zostanie wystarczająco wypłukane, gdy płyn wyciśnięty z serca będzie klarowny.</li>
	<li>Zmiel serce na małe kawałki w 5 ml lodowatego 1x PBS za pomocą ostrych nożyczek.</li>
	<li>Wyrzucić PBS i przenieść zmieloną tkankę serca do wstępnie schłodzonego homogenizatora szklano-teflonowego o pojemności 7 ml z odstępem od 0,10 do 0,15 mm.</li>
	<li>Dodać 5 ml lodowatego buforu MS-EGTA i homogenizować próbkę, aż fragmenty tkanki przestaną być widoczne (około 11 uderzeń). 
	UWAGA: Nie należy nadmiernie homogenizować tkanki, ponieważ celem jest uzyskanie nienaruszonych i funkcjonalnych mitochondriów.</li>
	<li>Przenieść homogenat do probówki o pojemności 15 ml.</li>
	<li>Odwirować homogenat w temperaturze 600 x g w temperaturze 4 °C przez 5 minut w celu uzyskania osadzaków jąder i nieuszkodzonych komórek.</li>
	<li>Przenieść supernatant do świeżej probówki o pojemności 15 ml i odwirować go w temperaturze 10 000 x g w temperaturze 4 °C przez 10 minut w celu osadzenia mitochondriów.</li>
	<li>Odrzucić supernatant i utrzymać osad mitochondrialny na lodzie.</li>
	<li>Przemyć osad mitochondrialny dwukrotnie za pomocą lodowatego buforu MS-EGTA. Przy każdym przemyciu ponownie zawiesić osad mitochondrialny w 5 ml buforu MS-EGTA, odwirować go przy 10 000 x g w temperaturze 4 °C przez 10 minut i wyrzucić supernatant.</li>
	<li>Po ostatnim płukaniu wyrzucić supernatant i ponownie zawiesić mitochondria w 100 μl lodowatego buforu MS-EGTA. Utrzymuj mitochondria na lodzie. 
	UWAGA: Mitochondria należy wykorzystać do eksperymentów w ciągu 1 godziny.</li>
	<li>Zmierz stężenie białka mitochondrialnego za pomocą testu Bradford Protein Assay26.</li>
</ol>
3. Pomiar mitochondrialnego wchłaniania wapnia oparty na czytniku płytek
UWAGA: Tutaj jest opisany protokół analizy mitochondrialnego wychwytu Ca2+ za pomocą wielomodowego czytnika płytek wyposażonego w wtryskiwacze. Można zastosować dowolny czytnik płytek z możliwością odczytu fluorescencji zieleni wapniowej-5N (wzbudzenie/emisja 506/532 nm) w trybie kinetycznym z automatycznymi wtryskiwaczami odczynników w celu ochrony reakcji przed światłem.
<ol>
	<li>Zaprogramuj czytnik płytek tak, aby wykonywał kinetyczny odczyt fluorescencji zieleni wapniowej-5N z pomiarami wykonywanymi co sekundę dla całkowitego czasu oznaczania 1,000 s. Dodatkowo zaprogramuj wtryskiwacze odczynników tak, aby dozowały 5 μl roztworu CaCl2 w punktach czasowych 30 s, 150 s, 300 s, 480 s i 690 s. 
	UWAGA: Czas wstrzyknięć CaCl2 jest zdefiniowany przez użytkownika i może być dostosowany do potrzeb eksperymentalnych.</li>
	<li>Zalać wtryskiwacze odczynników roztworem CaCl2, który ma być użyty. 
	UWAGA: Stężenie roztworu CaCl2 jest definiowane przez użytkownika i może być regulowane w kolejnych seriach w celu miareczkowania ilości Ca2+ wymaganej do wyzwolenia otwarcia MPTP.</li>
	<li>Dodaj 200 μg mitochondriów do pojedynczego dołka na 96-dołkowej płytce.</li>
	<li>Dodać odpowiednią objętość buforu KCl do studzienki tak, aby całkowita objętość mitochondriów i buforu KCl wyniosła 197 μl.</li>
	<li>Do mieszaniny mitochondriów dodać 1 μl 1 M pirogronianu i 1 μl 500 mM jabłczanu. Delikatnie odpipetować, aby wymieszać i inkubować mitochondria z substratami przez 2 minuty w temperaturze pokojowej, aby mitochondria mogły się pobudzić.</li>
	<li>Dodać 1 μl 1 mM bulionu zieleni wapniowej-5N. Delikatnie wymieszać, pipetując. 
	UWAGA: Chroń reakcję przed światłem po dodaniu barwnika zieleni wapniowej-5N.</li>
	<li>Uruchom wstępnie zaprogramowany protokół kinetyczny i monitoruj fluorescencję zieleni wapniowej-5N.</li>
</ol>
4. Odczynniki i roztwory
UWAGA: Druga część to eksperymentalna procedura obrazowania konfokalnego mitochondrialnego Ca2+ w hodowanych komórkach
<ol>
	<li>Przygotuj roztwór Tyrode'a (130 mM NaCl, 4 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 10 mM glukozy i 10 mM HEPES, pH 7,2 z KOH). Przechowywać w temperaturze 4 °C. Przed użyciem ogrzać go do temperatury pokojowej.</li>
	<li>Przygotuj roztwór do przemywania (100 mM octan potasu, 15 mM KCl, 5 mM KH2PO4, 5 mM Mg-ATP, 0,35 mM EGTA, 0,12 mM CaCl2, 0,75 mM MgCl2, 10 mM fosfokreatyna, 10 mM HEPES, pH 7,2 z KOH). Przechowywać w temperaturze 4 °C. Przed użyciem ogrzać go do temperatury pokojowej.</li>
	<li>Przygotuj roztwór przepuszczalny, który zawiera 0,005% saponin w roztworze do mycia. Codziennie przygotowuj go na świeżo.</li>
	<li>Przygotować 0 Ca2+ roztwór wewnętrzny (100 mM octanu potasu, 15 mM KCl, 0,35 mM EGTA, 0,75 mM MgCl2, 10 mM HEPES, pH dostosowane do 7,2 z KOH). Przechowywać w temperaturze 4 °C. Przed użyciem ogrzać go do temperatury pokojowej.</li>
	<li>Przygotować roztwór wewnętrzny zawierającyCa2+. Dodaj CaCl2 do powyższego roztworu wewnętrznego, aby osiągnąć pożądane stężenie wolnegoCa2+. Ilość CaCl2 do dodania oblicza się za pomocą programu MaxChelator (maxchelator.stanford.edu).</li>
	<li>Przygotuj 1 mM materiału Rhod-2/AM w DMSO i przechowuj go w temperaturze -20 °C do czasu użycia.</li>
	<li>Przygotuj 1 mM zielonego bulionu MitoTracker w DMSO i przechowuj go w temperaturze -20 °C do czasu użycia.</li>
</ol>
5. Komórki poszycia do obrazowania
<ol>
	<li>Szkiełka nakrywkowe o wymiarach 22 x 22 cm umyć 100% etanolem i pozostawić do wyschnięcia na powietrzu.</li>
	<li>Umieść szkiełka nakrywkowe w indywidualnych dołkach 6-dołkowego naczynia do hodowli tkankowych. 
	UWAGA: Szkiełka nakrywkowe mogą być pokryte lamininą, poli-L-lizyną lub podobną matrycą, aby ułatwić przyczepianie komórek.</li>
	<li>Trypsynizuj i ułóż komórki na szkiełkach nakrywkowych, dążąc do około 70% zbiegu w dniu obrazowania.</li>
</ol>
6. Ładowanie komórek za pomocą Rhod-2/AM i MitoTracker Green
<ol>
	<li>Przygotuj zielone rozwiązanie robocze Rhod-2/AM-MitoTracker. Dodać 20 μl rosołu Rhod-2/AM 1 mM, 0,2 μl zielonego materiału MitoTracker 1 mM i 2,5 μl 20% pluronu F-127 do 1 ml roztworu Tyrode'a. Końcowe stężenie Rhod-2 w roztworze roboczym wynosi 20 μM, a końcowe stężenie MitoTracker green wynosi 200 nM.</li>
	<li>Delikatnie usuń podłoże wzrostowe ze szkiełka nakrywkowego. 
	UWAGA: Etap mycia nie jest konieczny przed dodaniem roztworu barwnika.</li>
	<li>Dodawać zielony roztwór Rhod-2/AM-MitoTracker kroplami na szkiełko nakrywkowe, aż szkiełko nakrywkowe zostanie pokryte (około 3-4 krople na szkiełko nakrywkowe).</li>
	<li>Inkubuj go przez 30 minut w temperaturze pokojowej, chroniąc przed światłem, aby komórki mogły załadować się barwnikami.</li>
	<li>Deestryfikacja Rhod-2/AM. Delikatnie usuń zielony roztwór Rhod-2/AM-MitoTracker, zastąp go świeżym roztworem Tyrode o temperaturze pokojowej i inkubuj przez 30 minut w temperaturze pokojowej, chroniąc przed światłem.</li>
</ol>
7. Konfokalne obrazowanie mitochondrialnej Rhod-2/AM i MitoTracker zielonej fluorescencji
<ol>
	<li>Przenieść szkiełko nakrywkowe do komory obrazowania mikroskopu i napełnić komorę roztworem do płukania.</li>
	<li>W ustawieniach obserwacji komórek w kontraście fazowym przy 40-krotnym ustawieniu ostrości dostosuj ostrość, aż komórki będą widoczne i ustawione na ostrości.</li>
	<li>Przepuszczalność błony komórkowej zielonych komórek Rhod-2/AM-MitoTracker w celu usunięcia Rhod-2 zlokalizowanego w cytozolu, zachowując jednocześnie barwnik zlokalizowany w mitochondriach.
	<ol>
		<li>Usuń roztwór do płukania ze szkiełka nakrywkowego.</li>
		<li>Zastąp go roztworem do przepuszczalności na około 1 minutę.</li>
		<li>Wizualnie monitoruj morfologię błony plazmatycznej w całym procesie przepuszczalności. Przepuszczalne komórki rozwiną szorstką powierzchnię.</li>
		<li>Po zakończeniu przepuszczalności natychmiast usuń roztwór do przepuszczalności i zastąp go roztworem wewnętrznym 0 Ca2+.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Równolegle obrazowana jest fluorescencja Rhod-2 (wzbudzenie za pomocą linii laserowej 559 nm i emisja zbierana na długościach fal w zakresie 575-675 nm) oraz zielona fluorescencja MitoTracker (wzbudzenie za pomocą linii lasera 488nm i emisja zbierana na długościach fal w zakresie 505-525 nm). Skoncentruj się na przepuszczalnych komórkach wykazujących wyraźną kolokalizację Rhod-2 i MitoTracker zielonych.</li>
	<li>Zmniejsz laser mikroskopu i wzmocnij ustawienia tak, aby mitochondrialna fluorescencja Rhod-2 była przyciemniona i tylko widoczna.</li>
	<li>Wybierz ustawienia mikroskopu, aby uzyskać skany 2-wymiarowe z odpowiednią liczbą klatek na sekundę i biegiem czasu dla konkretnego zastosowania. Zalecana jest liczba klatek na sekundę wynosząca co najmniej 30 klatek/s, aby dokładnie uchwycić kinetykę zmian w mitochondrialnym Ca2+.</li>
	<li>Usuń roztwór wewnętrzny 0 Ca2+ bez zakłócania komórek lub ostrości mikroskopu.</li>
	<li>Rozpocznij akwizycję obrazu.</li>
	<li>Dodaj roztwór wewnętrzny wypełniony Ca2+ w punkcie czasowym 10 sekund, ręcznie lub za pomocą systemu perfuzyjnego.</li>
	<li>Wybierz obszary zainteresowania (ROI), aby objąć regiony kolokalizacji między mitochondrialnym Rhod-2 a zielonym sygnałem MitoTracker w oprogramowaniu do akwizycji obrazu. 
	UWAGA: Arbitralne wartości fluorescencji (F) dla każdego punktu czasowego nagrania są uzyskiwane dla każdego ROI. Wartości te są odejmowane w tle i normalizowane do początkowej fluorescencji (przed dodaniem Ca2+; F0) i wykreślone jako F/F0 w czasie w celu prezentacji danych i kwantyfikacji amplitudy zmiany mitochondrialnego Ca2+.</li>
</ol>

<ol><li>Deluca, H. F., Engstrom, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+uptake+by+rat+kidney+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22P+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Calcium uptake by rat kidney mitochondria.</a> P Natl Acad Sci USA. 47, 1744-1750 (1961).</li>
<li>Lehninger, A. L., Rossi, C. S., Greenawalt, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Respiration-dependent+accumulation+of+inorganic+phosphate+and+Ca+ions+by+rat+liver+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Co%22%5BJournal%5D)">Respiration-dependent accumulation of inorganic phosphate and Ca ions by rat liver mitochondria.</a> Biochem Biophys Res Co. 10, 444-448 (1963).</li>
<li>Kwong, J. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mitochondrial+calcium+uniporter+in+the+heart%3A+energetics+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">The mitochondrial calcium uniporter in the heart: energetics and beyond.</a> J Physiol. 595 (12), 3743-3751 (2017).</li>
<li>Denton, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+mitochondrial+dehydrogenases+by+calcium+ions%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Regulation of mitochondrial dehydrogenases by calcium ions.</a> Biochim Biophys Acta. 1787 (11), 1309-1316 (2009).</li>
<li>Jouaville, L. S., Pinton, P., Bastianutto, C., Rutter, G. A., Rizzuto, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+mitochondrial+ATP+synthesis+by+calcium%3A+evidence+for+a+long-term+metabolic+priming%5BTitle%5D)+AND+%22P+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Regulation of mitochondrial ATP synthesis by calcium: evidence for a long-term metabolic priming.</a> P Natl Acad Sci USA. 96 (24), 13807-13812 (1999).</li>
<li>Haworth, R. A., Hunter, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Ca2%2B-induced+membrane+transition+in+mitochondria.+II.+Nature+of+the+Ca2%2B+trigger+site%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Biochem+Biophys%22%5BJournal%5D)">The Ca2+-induced membrane transition in mitochondria. II. Nature of the Ca2+ trigger site.</a> Arch Biochem Biophys. 195 (2), 460-467 (1979).</li>
<li>Hunter, D. R., Haworth, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Ca2%2B-induced+membrane+transition+in+mitochondria.+I.+The+protective+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Biochem+Biophys%22%5BJournal%5D)">The Ca2+-induced membrane transition in mitochondria. I. The protective mechanisms.</a> Arch Biochem Biophys. 195 (2), 453-459 (1979).</li>
<li>Kwong, J. Q., Molkentin, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+and+pathological+roles+of+the+mitochondrial+permeability+transition+pore+in+the+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">Physiological and pathological roles of the mitochondrial permeability transition pore in the heart.</a> Cell Metab. 21 (2), 206-214 (2015).</li>
<li>Luongo, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mitochondrial+Na%2B%2FCa2%2B+exchanger+is+essential+for+Ca2%2B+homeostasis+and+viability%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The mitochondrial Na+/Ca2+ exchanger is essential for Ca2+ homeostasis and viability.</a> Nature. 545 (7652), 93-97 (2017).</li>
<li>De Stefani, D., Patron, M., Rizzuto, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+function+of+the+mitochondrial+calcium+uniporter+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Structure and function of the mitochondrial calcium uniporter complex.</a> Biochim Biophys Acta. 1853 (9), 2006-2011 (2015).</li>
<li>Baughman, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+genomics+identifies+MCU+as+an+essential+component+of+the+mitochondrial+calcium+uniporter%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Integrative genomics identifies MCU as an essential component of the mitochondrial calcium uniporter.</a> Nature. 476 (7360), 341-345 (2011).</li>
<li>De Stefani, D., Raffaello, A., Teardo, E., Szabo, I., Rizzuto, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+forty-kilodalton+protein+of+the+inner+membrane+is+the+mitochondrial+calcium+uniporter%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A forty-kilodalton protein of the inner membrane is the mitochondrial calcium uniporter.</a> Nature. 476 (7360), 336-340 (2011).</li>
<li>Pan, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+physiological+role+of+mitochondrial+calcium+revealed+by+mice+lacking+the+mitochondrial+calcium+uniporter%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The physiological role of mitochondrial calcium revealed by mice lacking the mitochondrial calcium uniporter.</a> Nat Cell Biol. 15 (12), 1464-1472 (2013).</li>
<li>Kwong, J. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Mitochondrial+Calcium+Uniporter+Selectively+Matches+Metabolic+Output+to+Acute+Contractile+Stress+in+the+Heart%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">The Mitochondrial Calcium Uniporter Selectively Matches Metabolic Output to Acute Contractile Stress in the Heart.</a> Cell Rep. 12 (1), 15-22 (2015).</li>
<li>Luongo, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Mitochondrial+Calcium+Uniporter+Matches+Energetic+Supply+with+Cardiac+Workload+during+Stress+and+Modulates+Permeability+Transition%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">The Mitochondrial Calcium Uniporter Matches Energetic Supply with Cardiac Workload during Stress and Modulates Permeability Transition.</a> Cell Rep. 12 (1), 23-34 (2015).</li>
<li>Brown, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expert+consensus+document%3A+Mitochondrial+function+as+a+therapeutic+target+in+heart+failure%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Expert consensus document: Mitochondrial function as a therapeutic target in heart failure.</a> Nat Rev Cardiol. 14 (4), 238-250 (2017).</li>
<li>Logan, C. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss-of-function+mutations+in+MICU1+cause+a+brain+and+muscle+disorder+linked+to+primary+alterations+in+mitochondrial+calcium+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Loss-of-function mutations in MICU1 cause a brain and muscle disorder linked to primary alterations in mitochondrial calcium signaling.</a> Nat Genet. 46 (2), 188-193 (2014).</li>
<li>Lewis-Smith, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homozygous+deletion+in+MICU1+presenting+with+fatigue+and+lethargy+in+childhood%5BTitle%5D)+AND+%22Neurol+Genet%22%5BJournal%5D)">Homozygous deletion in MICU1 presenting with fatigue and lethargy in childhood.</a> Neurol Genet. 2 (2), e59(2016).</li>
<li>Tosatto, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mitochondrial+calcium+uniporter+regulates+breast+cancer+progression+via+HIF-1alpha%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">The mitochondrial calcium uniporter regulates breast cancer progression via HIF-1alpha.</a> EMBO Mol Med. 8 (5), 569-585 (2016).</li>
<li>Cardenas, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+Vulnerability+of+Cancer+Cells+by+Inhibition+of+Ca%282%2B%29+Transfer+from+Endoplasmic+Reticulum+to+Mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Selective Vulnerability of Cancer Cells by Inhibition of Ca(2+) Transfer from Endoplasmic Reticulum to Mitochondria.</a> Cell Rep. 15 (1), 219-220 (2016).</li>
<li>Dedkova, E. N., Blatter, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+signaling+in+cardiac+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Cell+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Calcium signaling in cardiac mitochondria.</a> J Mol Cell Cardiol. 58, 125-133 (2013).</li>
<li>Florea, S. M., Blatter, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+mitochondria+for+the+regulation+of+cardiac+alternans%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Physiol%22%5BJournal%5D)">The role of mitochondria for the regulation of cardiac alternans.</a> Front Physiol. 1, 141(2010).</li>
<li>Palmer, A. E., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+calcium+signaling+using+genetically+targetable+fluorescent+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Measuring calcium signaling using genetically targetable fluorescent indicators.</a> Nat Protoc. 1 (3), 1057-1065 (2006).</li>
<li>Bonora, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular+calcium+measurements+in+mammalian+cells+using+jellyfish+photoprotein+aequorin-based+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Subcellular calcium measurements in mammalian cells using jellyfish photoprotein aequorin-based probes.</a> Nat Protoc. 8 (11), 2105-2118 (2013).</li>
<li>Zima, A. V., Kockskamper, J., Mejia-Alvarez, R., Blatter, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyruvate+modulates+cardiac+sarcoplasmic+reticulum+Ca2%2B+release+in+rats+via+mitochondria-dependent+and+-independent+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Pyruvate modulates cardiac sarcoplasmic reticulum Ca2+ release in rats via mitochondria-dependent and -independent mechanisms.</a> J Physiol. 550 (Pt 3), 765-783 (2003).</li>
<li>Kruger, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Bradford+method+for+protein+quantitation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">The Bradford method for protein quantitation.</a> Methods Mol Biol. 32, 9-15 (1994).</li>
<li>Zazueta, C., Sosa-Torres, M. E., Correa, F., Garza-Ortiz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibitory+properties+of+ruthenium+amine+complexes+on+mitochondrial+calcium+uptake%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bioenerg+Biomembr%22%5BJournal%5D)">Inhibitory properties of ruthenium amine complexes on mitochondrial calcium uptake.</a> J Bioenerg Biomembr. 31 (6), 551-557 (1999).</li>
<li>Davidson, S. M., Duchen, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+mitochondrial+calcium+signalling+with+fluorescent+probes+and+single+or+two+photon+confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Imaging mitochondrial calcium signalling with fluorescent probes and single or two photon confocal microscopy.</a> Methods Mol Biol. 810, 219-234 (2012).</li>
<li>Matlib, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxygen-bridged+dinuclear+ruthenium+amine+complex+specifically+inhibits+Ca2%2B+uptake+into+mitochondria+in+vitro+and+in+situ+in+single+cardiac+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Oxygen-bridged dinuclear ruthenium amine complex specifically inhibits Ca2+ uptake into mitochondria in vitro and in situ in single cardiac myocytes.</a> J Biol Chem. 273 (17), 10223-10231 (1998).</li>
<li>Chamberlain, B. K., Volpe, P., Fleischer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+calcium-induced+calcium+release+from+purified+cardiac+sarcoplasmic+reticulum+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Inhibition of calcium-induced calcium release from purified cardiac sarcoplasmic reticulum vesicles.</a> J Biol Chem. 259 (12), 7547-7553 (1984).</li>
</ol>

Autorzy nie mają żadnych ujawnień do przekazania.

Tutaj opisujemy dwa różne podejścia do pomiaru napływu mitochondrialnego Ca2+ . Metoda oparta na czytniku płytek zieleń wapniowa-5N monitoruje pozamitochondrialne poziomy Ca2 + i jest testem wychwytu Ca2 + , który dobrze nadaje się do pomiarów w izolowanych mitochondriach. Chociaż pokazaliśmy reprezentatywne wyniki z izolowanych mitochondriów serca myszy, test ten można łatwo dostosować do mitochondriów wyizolowanych z tkanek o dużej obfitości mitochondriów, w tym wątroby, mięśni szkielet...

Mitochondria są krytycznymi miejscami wewnątrzkomórkowego przechowywania i sygnalizacji Ca2+. Dziesięciolecia badań wykazały, że mitochondria mają zdolność importowania i sekwestrowania Ca2+ 1,2. Mitochondria nie są jednak jedynie pasywnymi miejscami magazynowania Ca2+. Ca2+ w przedziale mitochondrialnym pełni podstawowe funkcje sygnalizacyjne, w tym regulację produkcji metabolicznej i aktywację szlaków śmierci komórek za pośrednictwem mitochondriów, co zostało omówione wcześniej3. W celu regulacji metabolicznej Ca2+ zwiększa aktywność trzech zlokalizowanych w macierzy dehydrogenaz cyklu kwasów trikarboksylowych, a także kompleksów łańcuchów oddechowych, w celu zwiększenia produkcji energii mitochondrialnej4,5. Przy mitochondrialnym przeciążeniu Ca2 + i rozregulowanym mitochondrialnym Ca2 +, Ca2 + wyzwala otwieranie porów przejściowych przepuszczalności mitochondriów (MPTP), co prowadzi do przepuszczalności wewnętrznej błony mitochondrialnej, utraty potencjału błonowego, dysfunkcji mitochondriów, obrzęku, pęknięcia i ostatecznie śmierci komórki6,7,8,9. Tak więc mitochondrialna sygnalizacja Ca2 + bezpośrednio wpływa zarówno na szlaki życia i śmierci komórkowej poprzez kontrolę metaboliczną i oś śmierci MPTP.
W ostatnich latach gwałtownie wzrosło zainteresowanie badaniem dynamiki mitochondrialnegoCa2++, w dużej mierze dzięki identyfikacji składników molekularnych mitochondrialnego kompleksu Ca2+, mitochondrialnego transportera błony wewnętrznej, który jest podstawowym sposobem importu Ca2+ do macierzy mitochondrialnej 10,11,12. Identyfikacja tych strukturalnych i regulacyjnych podjednostek uniportera ujawniła możliwość genetycznego ukierunkowania na napływ mitochondrialnego Ca2+ w celu modulowania funkcji i dysfunkcji mitochondriów oraz ułatwiła badanie wpływu kompleksu uniporter i napływu mitochondrialnego Ca2+ na chorobę13,14,15. Rzeczywiście, mitochondrialna sygnalizacja Ca2 + jest zaangażowana w patologie różnych chorób, od chorób serca po neurodegenerację i raka16,17,18,19,20.
Biorąc pod uwagę fundamentalne znaczenie mitochondrialnej sygnalizacji Ca2+ w metabolizmie i śmierci komórki, a także w połączeniu z szerokim zasięgiem systemów biologicznych, które wpływają na sygnalizację mitochondrialnego Ca2+, metody oceny napływu mitochondrialnego Ca2+ są bardzo interesujące. Nic dziwnego, że opracowano różnorodne techniki i narzędzia do pomiaru mitochondrialnego Ca2+. Należą do nich metody, które wykorzystują narzędzia, takie jak fluorescencyjne barwniki wrażliwe na Ca2+21,22 oraz genetycznie kodowane czujniki Ca2+ ukierunkowane na mitochondria, takie jak cameleon i aequorin23,24. Celem tego artykułu jest zwrócenie uwagi na różne metody i systemy modelowe, w których można mierzyć mitochondrialny wychwyt Ca2+. Przedstawiamy dwie eksperymentalne metody oceny zdolności napływu mitochondrialnegoCa2+. Używając mitochondriów serca jako przykładu, szczegółowo opisujemy platformę opartą na czytniku płytek do pomiaru mitochondrialnego wychwytu Ca2 + przy użyciu wrażliwego barwnika Ca2 + zieleni wapniowej-5N, który idealnie nadaje się do mitochondriów izolowanych tkanek 14. Korzystając z hodowanych komórek NIH 3T3, opisujemy również test obrazowania oparty na mikroskopii konfokalnej do pomiaru mitochondrialnego Ca2 + w komórkach permeabilizowanych przy użyciu wrażliwego barwnika Ca2 + Rhod-2 / AM25.

<table><tbody><tr><td>Olympus FV1000 Laserowy skaningowy mikroskop konfokalny</td><td>Olympus</td><td>FV1000</td><td></td></tr><tr><td>Synergy Neo2 Wielomodowy czytnik mikropłytek z wtryskiwaczami</td> Homogenizator <td>tkankowy Biotek</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Kimble</td><td>886000-0022</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe 22 x 22 mm</td><td>Płytka dołkowa Corning</td><td>2850-22</td><td></td></tr><tr><td>96 Corning</td><td></td><td>3628</td><td></td></tr><tr><td>6 Talerz studzienkowy</td><td>Corning</td><td>3506</td><td></td></tr><tr><td>Calcium Green-5N</td><td>Invitrogen</td><td>C3737</td><td></td></tr><tr><td>MitoTracker zielony FM</td><td>Invitrogen</td><td>M7514</td><td></td></tr><tr><td>Rhod-2, AM</td><td>Invitrogen</td><td>R1244</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Invitrogen</td><td>D12345</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127</td><td>Invitrogen</td><td>P3000MP</td><td></td></tr><tr><td>D-Mannitol</td><td>Sigma</td><td>M9546</td><td></td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>EMD Millipore</td><td>8510</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>E8145</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek potasu</td><td>Fisher</td><td>BP366-500</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan potasu jednozasadowy</td><td>Sigma</td><td>P0662</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek magnezu</td><td>Sigma</td><td>M2670</td><td></td></tr><tr><td>Pirogronian sodu</td><td>Sigma</td><td>P2256</td><td></td></tr><tr><td>Kwas L-jabłkowy</td><td>Sigma</td><td>M1125</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek wapnia</td><td>Sigma</td><td>C4901</td><td></td></tr><tr><td>Octan potasu</td><td>Fisher</td><td>BP364-500</td><td></td></tr><tr><td>Sól magnezowa adenozyno-5&trifosforanu</td><td>Sigma</td><td>A9187</td><td></td></tr><tr><td>Sól disodowa fosfokreatyny</td><td>Sigma</td><td>P7936</td><td></td></tr><tr><td>Saponin</td><td>Sigma</td><td>S7900</td><td></td></tr><tr><td>Ru360</td><td>Calbiochem</td><td>557440</td><td></td></tr></tbody></table>

analizy napływu wapnia w mitochondriach w izolowanych mitochondriach i hodowanych komórkach

Analyses of Mitochondrial Calcium Influx in Isolated Mitochondria and Cultured Cells

Ca2+ obsługa przez mitochondria jest krytyczną funkcją regulującą zarówno procesy fizjologiczne, jak i patofizjologiczne w szerokim spektrum komórek. Zdolność do dokładnego pomiaru napływu i odpływu Ca2+ z mitochondriów jest ważna dla określenia roli mitochondrialnego obchodzenia się z Ca2 + w tych procesach. W niniejszym raporcie przedstawiamy dwie metody pomiaru obchodzenia się z mitochondrialnym Ca2+ zarówno w izolowanych mitochondriach, jak i hodowanych komórkach. Najpierw szczegółowo opisujemy platformę opartą na czytniku płytek do pomiaru mitochondrialnego wychwytu Ca2 + przy użyciu wrażliwego barwnika Ca2 + zieleni wapniowej-5N. Format oparty na czytniku płytek pozwala obejść potrzebę stosowania specjalistycznego sprzętu, a barwnik zieleni wapniowej-5N idealnie nadaje się do pomiaru Ca2+ z izolowanych mitochondriów tkankowych. W naszej aplikacji opisujemy pomiar mitochondrialnego wychwytu Ca2 + w mitochondriach wyizolowanych z tkanki serca myszy; jednak procedura ta może być stosowana do pomiaru mitochondrialnego wychwytu Ca2 + w mitochondriach wyizolowanych z innych tkanek, takich jak wątroba, mięśnie szkieletowe i mózg. Po drugie, opisujemy test oparty na mikroskopii konfokalnej do pomiaru mitochondrialnego Ca2 + w komórkach przepuszczalnych przy użyciu wrażliwego barwnika Ca2 + Rhod-2 / AM i obrazowania za pomocą 2-wymiarowej laserowej mikroskopii skaningowej. Ten protokół przepuszczalności eliminuje zanieczyszczenie barwnikiem cytozolowym, umożliwiając specyficzne rejestrowanie zmian w mitochondrialnym Ca2+. Co więcej, laserowa mikroskopia skaningowa pozwala na uchwycenie szybkich zmian w mitochondrialnymCa2+ w odpowiedzi na różne leki lub odczynniki zastosowane w roztworze zewnętrznym. Protokół ten można zastosować do pomiaru mitochondrialnego wychwytu Ca2 + w wielu typach komórek, w tym w komórkach pierwotnych, takich jak miocyty serca i neurony, oraz unieśmiertelnionych liniach komórkowych.

Rycina 1 wykazuje mitochondrialne Ca2+ pomiary wychwytu w izolowanych mitochondriach serca z wykorzystaniem platformy opartej na czytniku płytek i Ca2+ barwnik calcium green-5N. W warunkach kontrolnych (Rysunek 1A), mitochondria sercowe zawieszono w buforze KCl zawierającym barwnik calcium green-5N, a następnie poddano je sekwencyjnym impulsom CaCl22 (5 μL 0,6 mM CaCl22 roztwór) dodawan...

Tutaj prezentujemy dwa protokoły pomiaru napływu mitochondrialnego Ca2+ w izolowanych mitochondriach i hodowanych komórkach. W przypadku izolowanych mitochondriów szczegółowo opisujemy test importu Ca2 + oparty na czytniku płytek przy użyciu wrażliwego barwnika Ca2 + zieleni wapniowej-5N. W przypadku hodowanych komórek opisujemy metodę mikroskopii konfokalnej z użyciem barwnika Ca2+ Rhod-2/AM.

Analizy napływu wapnia w mitochondriach w izolowanych mitochondriach i hodowanych komórkach

Ca2+ handling by mitochondria is a critical function regulating both physiological and pathophysiological processes in a broad spectrum of cells. The ...

Ogólnym celem tej procedury jest pomiar napływu wapnia w mitochondriach do izolowanych mitochondriów i hodowanych komórek. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie sygnalizacji wapniowej, takie jak to, w jaki sposób mitochondria pomagają kształtować cytozolowy krajobraz wapnia oraz rolę dynamiki mitochondrialnego wapnia w stanach chorobowych. Główną zaletą tej techniki jest to, że nasze protokoły można dostosować do różnych systemów modelowych w celu oceny zdolności napływu wapnia do mitochondriów.Będę demonstrował procedurę mitochondrialnego wychwytu wapnia opartą na czytniku płytek. Dr Joshua Maxwell, instruktor na Wydziale Pediatrii, zademonstruje procedurę opartą na mikroskopie konfokalnym do pomiaru napływu wapnia w mitochondriach. Rozpocznij ten eksperyment od dokładnego przepłukania wcześniej wyizolowanego serca w 25 mililitrach lodowatego jednego X PBS, upewniając się, że krew została całkowicie wyciśnięta z komór.W pięciu mililitrach lodowatego one-X PBS, za pomocą ostrych nożyczek, zmiel tkankę serca na małe kawałki. Ostrożnie wyrzuć PBS i przenieś tkankę do wstępnie schłodzonego siedmiomililitrowego szklanego homogenizatora teflonowego Dounce. N

analyses-mitochondrial-calcium-influx-isolated-mitochondria-cultured

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Niniejszy protokół opisuje metodę pomiaru przepływów wapnia w mitochondriach w czasie rzeczywistym za pomocą obrazowania fluorescencyjnego. Metoda ta wykorzystuje ratiometryczny sensor wapnia oparty na cyklicznie permutowanej białku YFP z podwójnym wzbudzeniem (ratiometryczny pericam-mt), który jest selektywnie ekspresowany w mitochondriach.

Monitorowanie dynamicznych zmian poziomu wapnia w mitochondriach podczas apoptozy z wykorzystaniem genetycznie kodowanego sensora wapnia

W niniejszym opracowaniu przedstawiono protokół spektrofluorometryczny do pomiaru otwarcia mitochondrialnego poru przejścia przepuszczalności w izolowanych mitochondriach serca myszy. Analiza obejmuje jednoczesny pomiar gospodarki Ca2+ w mitochondriach, potencjału błony mitochondrialnej oraz objętości mitochondriów. Opisano również procedurę pozyskiwania wysokiej jakości funkcjonalnych mitochondriów serca.

Wieloparametryczny pomiar otwierania poru przejścia przepuszczalności w izolowanych mitochondriach serca myszy

Ten film opisuje test oparty na czytniku płytek do pomiaru mitochondrialnego wychwytu wapnia w izolowanych mitochondriach. Test analizuje sygnał fluorescencyjny wrażliwego na wapń barwnika fluorescencyjnego w celu zbadania kinetyki mitochondrialnego wychwytu wapnia i przeciążenia wapniem.

Mitochondrialny test wychwytu wapnia: metoda pomiaru wychwytu wapnia w izolowanych mitochondriach oparta na czytniku płytkowym

Ten film opisuje test oparty na obrazowaniu opartym na mikroskopii konfokalnej, mierzący pobieranie wapnia przez mitochondria w hodowanych komórkach. Test wykorzystuje wrażliwy na wapń barwnik fluorescencyjny Rhod-2/AM do pomiaru mitochondrialnego wapnia w permeabilizowanych komórkach hodowlanych.

Test napływu wapnia w celu pomiaru mitochondrialnego wychwytu wapnia w hodowanych komórkach

Ten film przedstawia procedurę oceny zdolności mitochondriów do zatrzymywania wapnia poprzez monitorowanie zmian fluorescencji w czasie rzeczywistym w miarę wychwytu wapnia przez mitochondria. Ten test jest przydatny do badania funkcji mitochondriów i procesów związanych z wapniem, w tym apoptozy i chorób neurodegeneracyjnych.

Oznaczanie zdolności zatrzymywania wapnia w izolowanych mitochondriach

Ten artykuł opisuje zastosowanie krioanalitycznej mikroskopii elektronowej do ilościowego pomiaru całkowitej zawartości i dystrybucji wapnia w rozdzielczości subkomórkowej w fizjologicznie zdefiniowanych próbkach biologicznych.

Pomiar całkowitego wapnia w neuronach za pomocą mikroanalizy rentgenowskiej sondy elektronowej

Porównanie potencjału błony mitochondrialnej między próbkami dostarcza cennych informacji o stanie komórek. Opisano szczegółowe etapy izolacji mitochondriów i oceny odpowiedzi na inhibitory i rozprzęgacze za pomocą fluorescencji. Metoda i użyteczność tego protokołu są zilustrowane przez zastosowanie hodowli komórkowej i zwierzęcego modelu stresu komórkowego.

Izolacja i analiza funkcjonalna mitochondriów z hodowanych komórek i tkanek myszy

Mitochondria mogą wykorzystywać potencjał elektrochemiczny w swojej wewnętrznej błonie (ΔΨm) do sekwestracji wapnia (Ca2+), co pozwala im kształtować cytozolową sygnalizację Ca2+ w komórce. Opisano metodę jednoczesnego pomiaru wychwytu Ca2+ i ΔΨm w mitochondriach w żywych komórkach za pomocą barwników fluorescencyjnych i mikroskopii konfokalnej.

Jednoczesny pomiar mitochondrialnego wapnia i potencjału błony mitochondrialnej w żywych komórkach za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej

Ten protokół ma na celu opisanie metody badania krok po kroku zdolności zatrzymywania Ca2+ i wywołanego przez Ca2+ obrzęku mitochondriów izolowanych mitochondriów komórek SH-SY5Y.

Test zdolności retencyjnej mitochondriów Ca2+ i test obrzęku mitochondriów wywołany Ca2+

Ten proctocol ma na celu dostarczenie metody obrazowania in vitro i in vivo mitochondrialnego Ca2+ w astrocytach i neuronach.

Obrazowanie mitochondrialnego wychwytu Ca2+ w astrocytach i neuronach przy użyciu genetycznie kodowanych wskaźników Ca2+ (GECI)

Poznaj metody pomiaru napływu wapnia do mitochondriów w izolowanych mitochondriach i hodowanych komórkach. Wykorzystaj odczynniki fluorescencyjne i mikroskopię konfokalną do badania sygnalizacji wapniowej.

Analizy napływu wapnia w mitochondriach w izolowanych mitochondriach i hodowanych komórkach

Przeglądaj więcej filmów