Name: Wysoce skuteczne rozrywanie genów mysich i ludzkich hematopoetycznych komórek progenitorowych za pomocą CRISPR/Cas9 (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-10T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 27 s
Description: Naucz się szybkiej edycji genów CRISPR/Cas9 w mysich i ludzkich hematopoetycznych komórkach progenitorowych przy użyciu kompleksów rybonukleoproteinowych. Ta metoda osiąga około 75% efektywność nokautu w krótszym czasie niż tydzień.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Cancer Prevention and Research Institute of Texas (RP160283, RP140001, and R1201), Gabrielle's Angel Foundation for Cancer Research, Fundację Edwarda P. Evansa oraz NIH (DK092883, CA183252, CA125123, P50CA126752, CA193235 i DK107413). M.C.G. jest wspierany przez Baylor Research Advocates for Student Scientists. Cytometria przepływowa była częściowo wspierana przez NIH (National Center for Research Resources grant S10RR024574, National Institute of Allergy and Infectious Diseases AI036211 oraz National Cancer Institute P30CA125123) dla Baylor College of Medicine Cytometry and Cell Sorting Core.

Protokół jest zgodny z wytycznymi komisji etyki człowieka Baylor College of Medicine. Wszystkie procedury eksperymentalne wykonywane na myszach są zatwierdzone przez Baylor College of Medicine Institutional Animal Care and Use Committee.
1. Projekt sgRNA Fwd
<ol>
	<li>Przejdź do http://www.crisprscan.org/?page=track8, aby rozpocząć projektowanie interesujących Cię sgRNA.</li>
	<li>Kliknij przycisk "Mysz" lub "Człowiek" w zależności od typu interesującej Cię komórki.</li>
	<li>Wprowadź interesujący Cię gen w polu wyszukiwania UCSC i naciśnij go.</li>
	<li>Powiększ i przejdź do regionu genu (tj. określonego eksonu), który jest interesujący dla celu. 
	nuta: Aby osiągnąć skuteczne rozerwanie genów, zaleca się celowanie w najwcześniejszy ekson (eksony) obecny we wszystkich transkrybowanych izoformach w określonym typie komórki.</li>
	<li>Upewnij się, że potencjalne sekwencje docelowe sgRNA są wymienione pod nagłówkiem "Przewidywania CRISPRscan dotyczące genów (CDS)".</li>
	<li>Znajdź i kliknij sekwencję docelową ze stosunkowo wysokim wynikiem i niewielką liczbą nietrafionych celów (podświetloną na jasnozielono). Skopiuj pełną sekwencję wyświetlaną w sekcji "Sekwencja oligo" i wklej ją do dokumentu tekstowego. Dodaj "ATAGC" na końcu 3' sekwencji. Po zakończeniu złóż zamówienie na sekwencję o pełnej długości. 
	nuta: Dla każdej sekwencji docelowej CRISPRscan8 dostarcza "zintegrowany" starter forward sgRNA, który zawiera promotor T7, sekwencję protospacer (docelową) i uniwersalną sekwencję nakładania się rusztowania (patrz <silna klasa="xfig">Rysunek 1A). Sekwencja o pełnej długości składa się z 56 lub 57 nukleotydów w zależności od długości protospaceru.</li>
</ol>
2. Synteza matrycy DNA sgRNA
<ol>
	<li>Rozpuścić i rozcieńczyć sgRNA Fwd i uniwersalny starter Rev (patrz Tabela 1 dla pełnej sekwencji). W celu uzyskania stężenia końcowego 10 μM należy postępować zgodnie z instrukcją producenta, jak rozcieńczyć startery do 100 μM, a następnie rozcieńczyć w stosunku 1:10 wodą wolną od nukleaz.</li>
	<li>Aby przeprowadzić nakładającą się PCR (patrz <silna klasa = "xfig" >Rysunek 1B), wymieszaj następujące elementy w probówkach paskowych do PCR: 2 μl startera sgRNA do przodu (10 μM), 2 μl uniwersalnego startera do rusztowań Rev (oczyszczonego HPLC) (10 μM), 10 μl głównej mieszanki polimerazy DNA o wysokiej wierności (2x) i 6 μl wody wolnej od nukleaz.</li>
	<li>Uruchom PCR z następującym programem: 95 °C przez 3 min, 98 °C przez 5 s, 60 °C przez 5 s, 72 °C przez 10 s, Przejdź do 2 na 6 cykli, 72 °C na 1 min, 4 °C na zawsze.</li>
	<li>Oczyść produkt PCR za pomocą kolumn oczyszczających DNA (patrz tabela materiałów). Postępuj zgodnie z instrukcjami producenta i eluuj za pomocą 11,5 μl buforu elucyjnego.</li>
	<li>Zmierzyć stężenie produktów PCR na spektrofotometrze. Odślepić przyrząd buforem elucyjnym. 
	nuta: Stężenie DNA powinno wynosić od ~50 do ~120 ng/μL.</li>
</ol>
3. Transkrypcja in vitro sgRNA
<ol>
	<li>Wymieszaj następujące składniki w probówkach paskowych do PCR (odczynniki znajdują się w zestawie do syntezy RNA): 4 μl eluowanego DNA, 4 μl dNTP, 1 μl 10x buforu reakcyjnego i 1 μl mieszaniny enzymów polimerazy T7 RNA.</li>
	<li>Próbki należy inkubować w temperaturze 37 °C przez co najmniej 4 godziny.</li>
	<li>Zastosuj środek czyszczący RNaza, aby usunąć RNazę z rąk w rękawiczkach.</li>
	<li>Doprowadzić każdą próbkę RNA do całkowitej objętości 50 μl wodą wolną od nukleaz (pierwszy etap oczyszczania RNA zgodnie z instrukcjami producenta).</li>
	<li>Kontynuuj oczyszczanie RNA zgodnie z instrukcjami producenta i eluuj w 50 μl dostarczonej przez zestaw wody wolnej od nukleaz</li>.
	<li>Zmierzyć stężenie eluowanego sgRNA na spektrofotometrze. Napełnij instrument wodą wolną od nukleaz. 
	nuta: Przewidywany plon po oczyszczeniu to 50 - 80 μg RNA (tj. stężenie 1,0 - 1,5 μg/μL).</li>
	<li>Oczyszczone sgRNA należy zużyć natychmiast lub przechowywać w porcjach 2 - 4 μl w temperaturze -80 °C przez długi czas.</li>
</ol>
4. Izolacja i kultura HSPC
<ol>
	<li>Izolacja i hodowla mysich HSPC 
	nuta: W celu uzyskania poniższych wyników wykorzystano samce i samice myszy Ubc-GFP (JAX004353) oraz Rosa26-LSL-tdTomato (JAX007914) skrzyżowane z Vav-iCre (JAX008610) w wieku 2-6 miesięcy.
	<ol>
		<li>Eutanazja znieczulonych myszy przez zwichnięcie szyjki macicy. 
		nuta: Dwie przeszkolone osoby powinny niezależnie zweryfikować powodzenie eutanazji, zauważając brak oddechu i bicia serca przez co najmniej 5 minut. Usuń skórę ze zwierząt.</li>
		<li>Wypreparuj piszczele, kości udowe i grzebienie biodrowe myszy i usuń wszystkie mięśnie i tkankę łączną wokół wypreparowanych kości. Umieść nienaruszone kości w naczyniu do hodowli tkankowej na lodzie z HBSS uzupełnionym 2% FBS (HBSS+). Przenieś do okapu z przepływem laminarnym, gdy tylko wszystkie kości zostaną oczyszczone i przeniesione do naczynia do hodowli tkankowej.</li>
		<li>Przenieść oczyszczone kości do sterylnej zaprawy, zawierającej 2 ml lodowatego HBSS+ na 3 kości. Za pomocą tłuczka zmiażdż kości na fragmenty kości, uwalniając szpik od środka. Kontynuuj tłuczkowanie, aż kości przestaną pękać pod tłuczkiem.</li>
		<li>Zebrać supernatant z zaprawy i przefiltrować do stożkowej probówki o pojemności 50 ml za pomocą sitka o wielkości 40 μm. Przepłucz pozostałe fragmenty kości za pomocą 5 ml lodowatego HBSS+ i przefiltruj do tej samej stożkowej probówki o pojemności 50 ml za pomocą tego samego sitka o pojemności 40 μm.</li>
		<li>Umyć komórki dwukrotnie, uzupełniając probówkę lodowatym HBSS+ i odwirowując przy 400 x g przez 7 minut. Wyrzucić supernatant.</li>
		<li>Po drugim przemyciu ponownie zawiesić osad komórkowy w 20 ml lodowatego PBS. Policz żywe komórki przez wykluczenie trypan-niebieski9.</li>
		<li>Inkubować 1 x 108 żywotnych komórek na 1 ml lodowatego HBSS+ z przeciwciałem c-kit sprzężonym z biotyną w rozcieńczeniu 1:100 przez 45 minut na lodzie.</li>
		<li>Przemyć komórki lodowatym HBSS+, odwirowując przy 400 x g przez 7 minut i odrzucając supernatant.</li>
		<li>Inkubuj komórki za pomocą kulek magnetycznych antybiotyny zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
		<li>Odizoluj dodatnie ogniwa c-kit za pomocą kolumn magnetycznych lub aktywowanych magnetycznie sortowników komórek zgodnie z instrukcjami producenta. Zebrać dodatnie komórki c-kit w stożkowych probówkach o pojemności 15 ml.</li>
		<li>Przemyć komórki dwukrotnie PBS, uzupełniając stożkową probówkę o pojemności 15 ml i odwirowując przy 400 x g przez 7 minut. Wyrzucić supernatant. Pomiędzy dwoma płukaniami oblicz całkowitą liczbę żywotnych komórek przez wykluczenie błękitu trypanowego9.</li>
		<li>Zawiesić komórki c-kit+ w stężeniu do 106 żywotnych komórek na 100 μl pożywki dla mysich HSPC uzupełnionych 2% FBS, 50 ng / ml mysiego czynnika komórek macierzystych (SCF), 50 ng / ml mysiej trombopoetyny (TPO), 10 ng / ml myszy IL-3 i 10 ng / ml myszy IL-6.</li>
		<li>Inkubować komórki w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez co najmniej 1 godzinę do maksymalnie 24 godzin przed elektroporacją.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Izolacja i hodowla HSPC u ludzi 
	nuta: Czynności te należy wykonać w okapie z przepływem laminarnym.
	<ol>
		<li>Przefiltruj szpik kostny/komórki krwi pępowinowej przez sitko komórkowe 40 μm.</li>
		<li>Rozcieńczyć w stosunku 1:2 przefiltrowane komórki szpiku kostnego/krwi pępowinowej PBS uzupełnionym 1 mM EDTA (PBS/EDTA).</li>
		<li>Dozować 15 ml pożywki o gradiencie gęstości do stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Delikatnie wylać 30 ml rozcieńczonego szpiku kostnego/krwi pępowinowej na powierzchnię podłoża o gradiencie gęstości. Jeśli objętość zawiesiny komórek jest większa niż 30 ml, należy przygotować wiele probówek. 
		nuta: Upewnij się, że granica między krwią a ośrodkiem gradientu gęstości jest tak ostra, jak to możliwe.</li>
		<li>Obracaj probówki z prędkością 750 x g przez 30 minut bez zwalniania.</li>
		<li>Zebrać jednojądrzastą warstwę komórek wykrywalną na granicy faz pożywki i przenieść do czystej stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Napełnij probówkę PBS/EDTA i wiruj komórki z masą 280 g przez 15 minut. Odrzucić supernatant.</li>
		<li>Przemyć komórki dwukrotnie w PBS/EDTA, wirując w czasie 400 x g przez 7 minut i odrzucając supernatant.</li>
		<li>Inkubować komórki jednojądrzaste za pomocą kulek magnetycznych anty-CD34 zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
		<li>Odizoluj komórki CD34+ za pomocą kolumn magnetycznych lub aktywowanych magnetycznie sortowników komórek zgodnie z instrukcjami producenta. Zbierz komórki CD34+ w stożkowych probówkach o pojemności 15 ml.</li>
		<li>Zebrane komórki CD34+ należy przemyć dwukrotnie, uzupełniając probówkę PBS i wirując z prędkością 400 x g przez 7 minut, odrzucając supernatant. Pomiędzy dwoma płukaniami oblicz całkowitą liczbę żywotnych komórek przez wykluczenie błękitu trypanowego9.</li>
		<li>Zawiesić komórki w pożywce hodowlanej uzupełnionej 100 ng/ml ludzkiego SCF, 100 ng/ml ludzkiego liganda FLT3 (FLT3L), 100 ng/ml ludzkiego TPO w stężeniu ~2,5 x 105 żywotnych komórek/ml. Hodowla izolowanych komórek CD34+ w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez 24 godziny do maksymalnie 48 godzin przed elektroporacją. 
		nuta: Przed elektroporacją należy sprawdzić czystość wzbogaconej populacji CD34+ za pomocą cytometrii przepływowej.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Elektroporacja
Uwaga: Poniższy protokół jest zoptymalizowany dla końcówek do elektroporacji 10 μL. Wszystkie czynności należy wykonywać w okapie z przepływem laminarnym.
<ol>
	<li>Policz komórki według wykluczenia błękitu trypanowego9. Zbierz 2 x 105 żywotnych komórek na replikę (np. zbierz 6 x 105 komórek na 3 elektroporacje).</li>
	<li>Przemyć komórki dwukrotnie PBS, wirując w tempie 300 x g przez 7 minut i ostrożnie usunąć supernatant.</li>
	<li>Równolegle przygotuj kompleksy RNP Cas9-sgRNA, inkubując w probówkach PCR przez 20 - 30 minut w RT 1,5 μg Cas9 z 1 μg całkowitego sgRNA dla każdej replikaty, z wyjątkiem kontroli tylko Cas9. 
	nuta: Białko Cas9 dostarczane jest w stężeniu 10 μg/μl. Aby zapewnić dokładne pipetowanie, rozcieńczyć w stosunku 1:10 całkowitą ilość potrzebnego białka Cas9 wodą bez nukleaz (np. w przypadku 10 elektroporacji należy wziąć 1 μl białka Cas9 i rozcieńczyć je 9 μl wody wolnej od nukleaz i inkubować 1 μl rozcieńczonego Cas9 na powtórzenie. W zależności od stężenia sgRNA, całkowita objętość Cas9 i sgRNA powinna wynosić od 1,7 do 2 μl na replikat. W przypadku stosowania dwóch sgRNA inkubuj 500 ng każdego sgRNA na replikę; jeśli używasz 3 sgRNA, inkubuj 330 ng każdego sgRNA na replikat i tak dalej.</li>
	<li>Obliczyć całkowitą objętość potrzebnego buforu T do ponownego zawieszenia, mnożąc 10 μl przez całkowitą liczbę potrzebnych kontrprób (np. 30 μl dla 3 powtórzeń). Zawiesić granulowane komórki z obliczoną objętością buforu T. Upewnij się, że końcowe stężenie zawiesiny komórek wynosi 2 x 107 komórek/ml.</li>
	<li>Podwielokrotność 10 μl ponownie zawieszonych komórek/replikacji do każdej probówki PCR zawierającej wstępnie skompleksowany sgRNA/Cas9 RNP (np. w celu trzykrotnego podwielokrotnia 30 μl zawiesiny komórkowej do probówki PCR zawierającej wstępnie skompleksowany Cas9-sgRNA).</li>
	<li>Aby skonfigurować system elektroporacji, włącz przyrząd i dodaj 3 ml buforu E do kuwety do elektroporacji, a następnie wsuń kuwetę do uchwytu kuwety.</li>
	<li>Ustaw żądane warunki elektroporacji na urządzeniu: ludzkie HSPC (1600 V, 10 ms, 3 impulsy) lub mysie HSPC (1700 V, 20 ms, 1 impuls). 
	nuta: W razie potrzeby, przed przeprowadzeniem eksperymentów na HSPC CD34+, skuteczność sgRNA można przetestować na liniach komórkowych ostrej białaczki szpikowej (AML) (np. HL60) przy użyciu tej samej strategii (użyj pożywki wolnej od antybiotyków dla linii komórkowych AML) w następujących warunkach elektroporacji: Bufor R, 1350 V, 35 ms, 1 impuls.</li>
	<li>Elektroporacja jest wykonywana za pomocą specjalnej pipety do elektroporacji, która posiada pazur, który zatrzaskuje się na końcówce pipety do elektroporacji. Chwyć pipetę do elektroporacji, wysuń pazur, chwyć krążek wewnątrz końcówki pipety, a następnie mocno dociśnij pipetę, aby zabezpieczyć końcówkę.</li>
	<li>Odpipetować próbkę w górę i w dół 10 razy, aby wymieszać. Wyjmij 10 μl, upewniając się, że nie ma pęcherzyków powietrza, i włóż końcówkę pipety bezpośrednio do bufora elektrolitycznego w kuwecie do elektroporacji. Staraj się nie dotykać ścianek kuwety. Naciśnij "start" na ekranie. Po wyświetleniu komunikatu "kompletny" wyjmij pipetę i dozuj zawartość do studzienki za pomocą nowej pożywki hodowlanej HSPC.</li>
	<li>Powtórzyć te czynności dla wszystkich próbek. Końcówki pipet należy wymieniać między próbkami, tylko w razie potrzeby.</li>
</ol>

<ol><li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+programmable+dual-RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337, 816-821 (2012).</li>
<li>Hsu, P. D., Lander, E. S., Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+applications+of+CRISPR-Cas9+for+genome+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering.</a> Cell. 157, 1262-1278 (2014).</li>
<li>Sternberg, S. H., Doudna, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanding+the+Biologist%27s+Toolkit+with+CRISPR-Cas9%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Expanding the Biologist's Toolkit with CRISPR-Cas9.</a> Mol Cell. 58, 568-574 (2015).</li>
<li>Heckl, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+mouse+models+of+myeloid+malignancy+with+combinatorial+genetic+lesions+using+CRISPR-Cas9+genome+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Generation of mouse models of myeloid malignancy with combinatorial genetic lesions using CRISPR-Cas9 genome editing.</a> Nat Biotechnol. 32, 941-946 (2014).</li>
<li>Mandal, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+ablation+of+genes+in+human+hematopoietic+stem+and+effector+cells+using+CRISPR%2FCas9%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+stem+cell%22%5BJournal%5D)">Efficient ablation of genes in human hematopoietic stem and effector cells using CRISPR/Cas9.</a> Cell stem cell. 15, 643-652 (2014).</li>
<li>Gundry, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+Efficient+Genome+Editing+of+Murine+and+Human+Hematopoietic+Progenitor+Cells+by+CRISPR%2FCas9%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Highly Efficient Genome Editing of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9.</a> Cell Rep. 17, 1453-1461 (2016).</li>
<li>Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+RNA-guided+genome+editing+in+human+cells+via+delivery+of+purified+Cas9+ribonucleoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins.</a> Genome Res. 24, 1012-1019 (2014).</li>
<li>Moreno-Mateos, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPRscan%3A+designing+highly+efficient+sgRNAs+for+CRISPR-Cas9+targeting+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+methods%22%5BJournal%5D)">CRISPRscan: designing highly efficient sgRNAs for CRISPR-Cas9 targeting in vivo.</a> Nature methods. 12, 982-988 (2015).</li>
<li>Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trypan+Blue+Exclusion+Test+of+Cell+Viability%5BTitle%5D)+AND+%22Current+protocols+in+immunology%22%5BJournal%5D)">Trypan Blue Exclusion Test of Cell Viability.</a> Current protocols in immunology. 111, A3 B 1-3 (2015).</li>
<li>Lykke-Andersen, S., Jensen, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonsense-mediated+mRNA+decay%3A+an+intricate+machinery+that+shapes+transcriptomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Nonsense-mediated mRNA decay: an intricate machinery that shapes transcriptomes.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 16, 665-677 (2015).</li>
<li>Brinkman, E. K., Chen, T., Amendola, M., van Steensel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Easy+quantitative+assessment+of+genome+editing+by+sequence+trace+decomposition%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition.</a> Nucleic Acids Res. 42, e168(2014).</li>
<li>Dever, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9+beta-globin+gene+targeting+in+human+haematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9 beta-globin gene targeting in human haematopoietic stem cells.</a> Nature. 539, 384-389 (2016).</li>
<li>DeWitt, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection-free+genome+editing+of+the+sickle+mutation+in+human+adult+hematopoietic+stem%2Fprogenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Selection-free genome editing of the sickle mutation in human adult hematopoietic stem/progenitor cells.</a> Sci Transl Med. 8, 360ra134(2016).</li>
<li>Aguirre, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+Copy+Number+Dictates+a+Gene-Independent+Cell+Response+to+CRISPR%2FCas9+Targeting%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discov%22%5BJournal%5D)">Genomic Copy Number Dictates a Gene-Independent Cell Response to CRISPR/Cas9 Targeting.</a> Cancer Discov. 6, 914-929 (2016).</li>
</ol>

Brak konfliktu interesów do ujawnienia

Podejście RNP opisane w tym szczegółowym protokole umożliwia skuteczny nokaut genów zarówno w mysich, jak i ludzkich pierwotnych komórkach krwiotwórczych, a także w liniach komórek zawiesinowych. Chociaż często uzyskuje się bardzo wysoką sprawność KO, należy wziąć pod uwagę kilka krytycznych zmiennych. Po pierwsze, właściwy wybór eksonów jest kluczem do zagwarantowania, że efektywna inkorporacja indela odpowiada nokautowi genu. Dwa ważne czynniki związane z wyborem eksonów to zachowanie izoform i pozycja eksonów w transkryptach. Wzorce ekspresji izoform są zmienne w zależności od typu komórek, więc jeśli pożądany jest gen KO między typami komórek, należy celować w eksony, które są niezmienne między typami komórek. Wzorce izoform można zweryfikować za pomocą danych z sekwencjonowania q-PCR lub RNA. W przypadku pozycji eksonów w transkryptach najlepiej jest celować we wczesne eksony, ponieważ mutacje przesunięcia ramki odczytu w końcowym lub przedostatnim eksonie mogą uciec przed rozpadem za pośrednictwem nonsensu10, wytwarzając białka o nowych lub nieznanych funkcjach, a nie prawdziwych zerach.
Określenie częstości występowania indel jest kluczowym krokiem do oszacowania wydajności KO i prawidłowej interpretacji biologicznego wyniku eksperymentu. Testy endonukleaz (np. test geodezyjny) mają tę zaletę, że są stosunkowo szybkie i łatwe do wykonania. Jednak zwykle są one niedokładne ze względu na znaczne sygnały tła, a wyniki są często trudne do odtworzenia. Co więcej, nie dostarczają one informacji na temat jakości wytworzonych indeli (np. długości insercji i delecji) w eksperymencie. Sekwencjonowanie Sangera stanowi cenną alternatywę dla testów endonukleazy. Platformy takie jak TIDE11 (https://tide.nki.nl/) pomagają w dekompozycji śladów Sangera i dostarczają dokładnych szacunków skuteczności rozerwania alleli, zapewniając jednocześnie częstość występowania poszczególnych indeli. Główną wadą jest absolutna zależność od wysokiej jakości ścieżek sekwencjonowania Sangera. Sekwencjonowanie amplikonów o wysokiej przepustowości rozwiązuje większość tych problemów. Biblioteki amplikonów można przygotowywać przy bardzo niskich danych wejściowych DNA, a wysokie pokrycie zapewnia wiarygodne wyniki. Aby obniżyć koszty sekwencjonowania amplikonów, zwykle zwiększamy biblioteki amplikonów do większych serii sekwencjonowania (np. sekwencjonowania RNA), używając tylko 1 - 1,5% całkowitych odczytów. Wreszcie, aby potwierdzić udany nokaut, zdecydowanie zalecamy ocenę poziomu białka za pomocą western blot lub cytometrii przepływowej, jeśli to możliwe.
Jak opisano wcześniej, przedstawiona tutaj metoda jest szybka i prosta oraz stanowi nowe narzędzie do badania nokautu genów u myszy i ludzi. Podczas gdy nasz protokół zawiera instrukcje dotyczące nokautu genów za pomocą systemu elektroporacji opartego na końcówce, inne systemy okazały się bardzo skuteczne12,13.
W odniesieniu do podejścia opartego na RNP należy zwrócić uwagę na dwa zasadnicze ograniczenia. Po pierwsze, jak opisała nasza grupa, żywotność HSPC elektroporowanych transkrybowanymi in vitro sgRNA może być znacznie zagrożona przez elektroporację, zwłaszcza gdy warunki niesą optymalne6. W razie potrzeby komercyjnie syntetyzowane sgRNA (tj. eliminujące transkrypcję in vitro ) mogą rozwiązać ten problem. Z czasem stają się one coraz tańsze i można je kupić u kilku dostawców. W tym scenariuszu transkrypcja in vitro może być wykorzystana do wygenerowania puli sgRNA do badania przesiewowego pod kątem skuteczności, a następnie można wybrać najbardziej wydajne sgRNA (s) do syntezy. Drugim poważnym ograniczeniem podejścia RNP jest brak możliwości śledzenia pomyślnie transfekowanych komórek, jak w przypadku podejść opartych na wirusach. Jednak wysoka wydajność KO i szybka edycja uzyskana za pomocą RNP Cas9-sgRNA może przeważyć nad tymi wadami w wielu scenariuszach eksperymentalnych. Zalecamy korzystanie z sekwencjonowania amplikonów o wysokiej przepustowości w celu dokładnego określenia skuteczności zakłóceń w każdym eksperymencie. Jeśli oczekuje się, że nokaut genu będącego przedmiotem zainteresowania nada fenotyp proliferacyjny (tj. zmniejszoną lub zwiększoną proliferację w porównaniu z komórkami typu dzikiego), określenie częstości indel w wielu punktach czasowych pozwala ocenić, czy komórki KO ulegają wzbogaceniu (tj. częstotliwość indel wzrasta w czasie), czy też są konkurencyjne (tj. częstotliwość indel zmniejsza się w czasie).
Przeprowadzanie eksperymentów in vivo lub in vitro w celu zrozumienia biologicznych skutków utraty funkcji genów wymaga odpowiednich kontroli. Jak wspomniano wcześniej, transkrybowane in vitro sgRNA mogą być toksyczne dla komórek, zwłaszcza pierwotnych komórek progenitorowych6. Dodatkowo, pęknięcia dwuniciowej DNA spowodowane białkiem Cas9 mogą powodować niezależną od genów odpowiedź antyproliferacyjną14. Dlatego w eksperymentach CRISPR często używamy wielu kontrolnych sgRNA i zalecamy marker powierzchni komórki wyrażony na typie komórki, a także drugi gen docelowy, który nie ulega ekspresji.
Krótkotrwała hodowla ludzkich HSPC w obecności cytokin zwiększa skuteczność rozerwaniagenów6 i jest niezbędna do osiągnięcia wysokiej wydajności KO. Odkryliśmy, że 36 - 48 godzin to idealny okres posiewu przed elektroporacją6. Po elektroporacji komórki mogą być dalej hodowane, mając na uwadze, że im dłuższa hodowla, tym większe ryzyko utraty zdolności do wszczepienia wieloliniowego. Dlatego przeszczepy wykonujemy zazwyczaj 6 godzin po elektroporacji i nigdy nie później niż 24 godziny po elektroporacji.
CRISPR/Cas9 znacznie poprawił zdolność naukowców do skutecznej edycji genomu komórek ssaków. Przewiduje się, że zwiększenie możliwości rozerwania genów w pierwotnych hematopoetycznych komórkach progenitorowych szybko poszerzy wiedzę naukową w dziedzinie HSPC i chorób hematologicznych. Co ważne, opisany tutaj protokół umożliwia również jednoczesne generowanie wielu nokautów z wysoką wydajnością, co pozwala na modelowanie złożonych krajobrazów genetycznych, często obserwowanych w chorobach białaczkowych.
Chociaż opisane tutaj protokoły koncentrują się na zaburzeniach genów, można je łatwo zaadaptować do eksperymentów z wykorzystaniem genów. Można to osiągnąć poprzez jednoczesne dostarczanie jednoniciowych matryc oligonukleotydowych do naprawy 6,13 kierowanej homologią (HDR) lub poprzez transdukcję komórek po elektroporacji wektorami AAV6 zawierającymi matrycę homologii12. Zdolność do naprawy lub wprowadzania określonych mutacji w HSPC ułatwi nowe strategie terapeutyczne w terapii genowej i rozszerzone badania nad mutacjami powodującymi raka w AML i innych chorobach hematologicznych. Podczas gdy HDR w ludzkich HSPC był udany 6,12,13, mysie HSPC były trudne do edycji przy użyciu tej strategii6. Optymalizacja protokołów HDR u ludzi, a w szczególności u myszy HSPC, umożliwi bardziej szczegółową edycję i opracowanie narzędzi do śledzenia edytowanych komórek za pomocą endogennego znakowania.
Wreszcie, przewiduje się również, że zakłócenie zmutowanych alleli wzmocnienia funkcji może stanowić potencjalne podejście terapeutyczne w przypadku wrodzonych i nabytych zaburzeń krwiotwórczych. W tym scenariuszu zaleca się podejście bez DNA, aby uniknąć możliwych integracji, które mogłyby sprzyjać transformacji. Co więcej, podejście "uderz i uciekaj" zmniejsza możliwość wystąpienia niepożądanych efektów niepożądanych. Konieczne są dalsze wysiłki w celu opracowania specjalnych systemów dostarczania, które otworzyłyby nowe możliwości leczenia złośliwych i niezłośliwych chorób hematologicznych.

Pojawienie się CRISPR/Cas9 radykalnie uprościło edycję genów w komórkach ssaków. Wczesne protokoły CRISPR/Cas9 wykorzystywały plazmidowe lub wirusowe dostarczanie białka Cas9 i sgRNA1,2,3. Podejścia te okazały się rewolucyjne w rozwoju modeli komórkowych i zwierzęcych, a także zostały z powodzeniem zastosowane do pierwotnych hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych (HSPC)4,5. Metody te mają jednak szereg wad. Po pierwsze, skuteczność rozerwania genów utrzymuje się często poniżej 50%4,5. Chociaż jest to wystarczające do wygenerowania klonów z nokautem (KO) w liniach komórkowych, konieczność krótkoterminowej hodowli sprawia, że HSPC nie są podatne na taką strategię. Po drugie, wymóg klonowania ogranicza ilość sgRNA, które można przetestować w pojedynczych eksperymentach i generuje duże, trudne do transfekcji konstrukty. Po trzecie, podejścia te zmuszają naukowców do spowolnienia czasu realizacji.
Aby przezwyciężyć te ograniczenia, nasza grupa opracowała i niedawno opublikowała alternatywne podejście CRISPR/Cas9 w HSPC przy użyciu dostarczania opartego na rybonukleoproteinach Cas9-sgRNA (RNP)6. W tej strategii surowe składniki CRISPR (białko Cas9 i transkrybowane in vitro sgRNA) są wstępnie skompleksowane i bezpośrednio dostarczane do komórek docelowych za pomocą elektroporacji (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1). Ponieważ okres półtrwania kompleksu RNP Cas9-sgRNA jest krótszy niż czas transkrypcji plazmidu lub wirusowego kwasu nukleinowego, wskaźnik off-target jest niższy w porównaniu z wczesnymi podejściami7. Co więcej, podejście RNP przynosi dodatkową korzyść w postaci wyeliminowania wszelkich źródeł egzogennego DNA, które może losowo integrować się z genomem komórki docelowej, prowadząc do transformacji komórkowej.
Ten protokół opiera się na usprawnionym przepływie pracy dla eksperymentów z zakłóceniami genów opartymi na RNP, jak przedstawiono w Rysunek 1. Pierwszym krokiem jest zaprojektowanie i zamówienie starterów dla każdego sgRNA. Te startery są wykorzystywane do tworzenia matryc DNA sgRNA, które są używane do transkrypcji in vitro (IVT) w celu uzyskania sgRNA. Oczyszczone sgRNA są następnie inkubowane z wcześniej zakupionym białkiem Cas9, tworząc kompleksy Cas9-sgRNA RNP. Na koniec wstępnie skompleksowane RNP Cas9-sgRNA są elektroporowane do komórek. Po elektroporacji można przetestować wydajność edycji i rozpocząć eksperymenty in vitro/in vivo, w zależności od potrzeb. Poniżej znajduje się szczegółowy opis tego innowacyjnego podejścia eksperymentalnego.

<table><tbody><tr><td>Płytki do hodowli tkankowych według numerów</td><td></td><td></td><td></td>komórek</tr><tr><td>1,5 ml Mikroprobówki Eppendorf</td><td>Sigma</td><td>Z606340-1000EA</td><td></td></tr><tr><td>50ml Probówki Falcon</td><td>Corning</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>Woda bez nukleaz - z powłoką DEPC</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AM9915G</td><td></td></tr><tr><td>KAPA HiFi HotStart ReadyMix (2X)</td><td>KAPA Biosystems</td><td>KK2600</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do oczyszczania MinElute PCR</td><td>Qiagen</td><td>28004</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór do dekontaminacji RNAzy</td><td>Zap ThermoFisher Scientific</td><td>AM9780</td><td></td></tr><tr><td>RNA Clean and Concentrator-25</td><td>Zymo</td><td>R1017</td><td></td></tr><tr><td>HiScribe T7 Wysokowydajny zestaw do syntezy RNA</td><td>New England Biolabs</td><td>E2040S</td><td></td></tr><tr><td>Alt-R S.p. Nukleaza Cas9 3NLS, 100 i mikro; g</td><td>IDT</td><td>1074181</td><td></td></tr><tr><td>40 mm Sitka komórkowe</td><td>VWR</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanem Dulbecco (PBS)</td><td>GenDEPOT</td><td>CA008-050</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca płodu (FBS), regularny</td> separator <td>Corning</td><td>35010CV</td><td></td></tr><tr><td>AutoMACS Pro lub ręczne kolumny do separacji komórek MACS</td> System transfekcji <td>neonowej Miltenyi</td><td></td><td></td></tr><tr><td> Urządzenie</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Neon Transfektion System 10 ml zestaw</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>MPK1025</td><td>W przypadku większej liczby komórek (patrz protokół) Można użyć zestawu Neon Transfektion System 100 ml (# MPK10025)</td></tr> <tr><td>Nazwa</td><td>Company</td><td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>UltraPure 0,5M EDTA, pH 8,0</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15575020</td><td>Tylko do eksperymentów na ludziach</td></tr><tr><td>Technologie komórek macierzystych</td><td>Lymphoprep</td><td>7851</td><td>Tylko do eksperymentów na ludziach</td></tr><tr><td>Zestaw mikrokulek CD34 UltraPure human</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-100-453</td><td>Tylko do eksperymentów na ludziach</td></tr><tr><td>Span macierzysty SFEM II</td><td>Technologie komórek macierzystych</td><td>9605</td><td>Tylko do eksperymentów na ludziach</td></tr><tr><td>Rekombinowany ludzki SCF</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-695</td><td>Tylko do eksperymentów na ludziach</td></tr><tr><td>Rekombinowany ludzki TPO</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-094-013</td><td>Tylko do eksperymentów na ludziach</td></tr><tr><td>Rekombinowany ludzki FLT3L</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-479</td><td>Tylko do eksperymentów</td></tr> <tr><td>na ludziachNazwa</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>Narzędzia</td><td></td><td></td> do preparowania myszy <td>Tylko do eksperymentów na myszach</td></tr><tr><td>Moździerz i tłuczek</td><td></td><td></td><td>Tylko do eksperymentów na myszach</td></tr><tr><td>Zbilansowany roztwór soli Hanka (HBSS)</td><td>Gibco</td><td>14170112</td><td>Tylko do eksperymentów na myszach</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty c-kit sprzężone z biotyną</td><td>eBioscience</td><td>13-1171-82</td><td>Tylko do eksperymentów na myszach</td></tr><tr><td>Mikrogranulki antybiotyny</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-485</td><td>Tylko do eksperymentów na myszach</td></tr><tr><td>X VIVO-15, z L-glutaminą, genatmycyną i fenolem Red</td><td>Lonza</td><td>04-418Q</td><td>Tylko do eksperymentów na myszach</td></tr><tr><td>Mysz IL-6</td><td>Peprotech</td><td>216-16</td><td>Tylko do eksperymentów na myszach</td></tr><tr><td>TPO dla myszy</td><td>Peprotech</td><td>315-14</td><td>Dla Tylko eksperymenty na myszach</td></tr><tr><td>Mysz IL-3</td><td>Peprotech</td><td>213-13</td><td>Tylko do eksperymentów na myszach</td></tr><tr><td>Mysz SCF</td><td>Peprotech</td><td>250-03</td><td>Tylko do eksperymentów na myszach</td></tr></tbody></table>

wysoce skuteczne rozrywanie genów mysich i ludzkich hematopoetycznych komórek progenitorowych za pomocą crispr/cas9

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

Postępy w dziedzinie hematopoetycznych komórek macierzystych (HSC) zostały wsparte metodami inżynierii genetycznej pierwotnych komórek progenitorowych, jak również modeli zwierzęcych. Całkowita ablacja genów w HSC wymagała wygenerowania myszy z nokautem, od których można było wyizolować HSC, a ablacja genów w pierwotnych ludzkich HSC nie była możliwa. Transdukcja wirusa może być stosowana do metod knock-down, ale mają one zmienną skuteczność. Ogólnie rzecz biorąc, manipulacja genetyczna ludzkich i mysich komórek krwiotwórczych była utrudniona ze względu na niską wydajność oraz znaczne zaangażowanie czasowe i kosztowe. Ostatnio CRISPR/Cas9 znacznie rozszerzył możliwości inżynierii DNA komórek ssaków. Jednak zastosowanie CRISPR/Cas9 do komórek krwiotwórczych było wyzwaniem, głównie ze względu na ich niską skuteczność transfekcji, toksyczność podejść opartych na plazmidach i powolny czas realizacji protokołów opartych na wirusach.
W tym artykule przedstawiono szybką metodę edycji genów za pośrednictwem CRISPR/Cas9 w mysich i ludzkich hematopoetycznych komórkach macierzystych i progenitorowych z wydajnością nokautu do 90%. Podejście to wykorzystuje strategię dostarczania rybonukleoprotein (RNP) z usprawnionym trzydniowym przepływem pracy. Zastosowanie Cas9-sgRNA RNP pozwala na podejście typu "uderz i uciekaj", nie wprowadzając żadnych egzogennych sekwencji DNA do genomu edytowanych komórek i redukując efekty off-target. Metoda oparta na RNP jest szybka i prosta: nie wymaga klonowania sgRNA, preparatyki wirusa ani specyficznej modyfikacji chemicznej sgRNA. Dzięki temu protokołowi naukowcy powinni być w stanie z powodzeniem wygenerować nokaut interesującego genu w pierwotnych komórkach krwiotwórczych w ciągu tygodnia, wliczając w to przestoje w syntezie oligonukleotydów. Takie podejście pozwoli znacznie szerszej grupie użytkowników na dostosowanie tego protokołu do swoich potrzeb.

Celem niniejszego protokołu jest przeprowadzenie nokautu genu (KO) w mysich i ludzkich HSPC z wykorzystaniem RNP Cas9-sgRNA. Przepływ pracy jest prosty i szybki, co pozwala na ukończenie eksperymentów w czasie krótszym niż tydzień, od etapu projektowania doświadczenia po ocenę wydajności KO.
W porównaniu do metod opartych na plazmidach lub wirusach, sukces naszego protokołu opiera się na połączeniu kompleksów RNP sgRNA i elektroporacji. Ta strategia bezklonowa znacząco skraca czas potrzebny na uzyskanie komponentów do transfekcji. Ponadto elektroporacja umożliwia transfekcję do 95% komórek, co maksymalizuje dostarczanie RNP. sgRNA mogą być syntetyzowane w laboratorium poprzez transkrypcję in vitro (IVT), natomiast oczyszczone białko Cas9 można nabyć od kilku dostawców (patrz protokół). Matryce DNA sgRNA do IVT uzyskuje się przeprowadzając krótką reakcję PCR z użyciem przedniego primera sgRNA (Rycina 1A, B) oraz uniwersalnego odwrotnego primera rusztowania (scaffold Rev primer) (Rycina 1B – patrz Protokół). Produkt PCR służy następnie jako matryca do IVT (Rycina 1C). Kompleksy RNP Cas9-sgRNA są generowane poprzez inkubację sgRNA i białka Cas9 przez 15 – 30 minut (Rycina 1C). Na koniec RNP sgRNA są wprowadzane do komórek metodą elektroporacji. Zmodyfikowane HSPC mogą być następnie wykorzystane do przeprowadzania eksperymentów zarówno in vitro, jak i in vivo.
Zakłócenie genu w komórkach myszy
Aby zademonstrować skuteczność strategii elektroporacji RNP Cas9-sgRNA, komórki HSPC c-kit+ wyizolowane z myszy powszechnie eksponujących GFP lub tdTomato poddano elektroporacji sgRNA skierowanym przeciwko GFP lub tdTomato. spośród trzech sgRNA zaprojektowanych przeciwko GFP, najskuteczniejszy okazał się GFP sg1, wykazując około 70 - 75% zaburzenia ekspresji GFP w analizie cytometrycznej (Rysunek 2A, B). Aby określić częstotliwość zaburzeń genu na poziomie genomicznym, wyizolowano DNA genomiczne z elektroporowanych komórek i przeprowadzono test oparty na endonukleazie T7 I (T7EI). Jak pokazano na Rysunku 2C, test T7EI wykrył do 60% tworzenia indeli. Należy zauważyć, że testy T7EI mają tendencję do niedoszacowania częstotliwości występowania indeli. Wygenerowano również sgRNA przeciwko tdTomato i przeprowadzono elektroporację komórek HSPC eksponujących tdTomato z locus Rosa26. Jak pokazano na Rysunku 2D, tdTomato sg1 skutecznie zniosło ekspresję tdTomato.
Zakłócenie genu w komórkach ludzkich
Tutaj przedstawiono wydajną dysrupcję uzyskaną za pomocą podejścia z pojedynczym sgRNA celującym w CD45, marker powierzchni komórkowej eksprymowany na komórkach krwiotwórczych. Zaprojektowano trzy sgRNA celujące w różne eksony CD45 (CD45 sg1, sg2 i sg3). Wydajność sgRNA przetestowano w linii komórkowej AML HL60 (Rysunek 3A). KO białka oceniono za pomocą cytometrii przepływowej 5 dni po elektroporacji. CD45 sg1 okazało się najwydajniejsze (wydajność KO 98% - Rysunek 3A) i zostało wykorzystane w dalszych eksperymentach. Rysunek 3B przedstawia KO CD45 w pierwotnych ludzkich komórkach progenitorowych CD34+ z użyciem CD45 sg1, ocenione za pomocą cytometrii przepływowej 5 dni po elektroporacji. Podczas gdy ekspresja CD34 nie uległa zmianie, ekspresja CD45 zanikła w około 80% komórek. 200 000 zmodyfikowanych pierwotnych komórek CD34+ przeszczepiono retroorbitalnie myszom NSG 6 godzin po elektroporacji. Komórki szpiku kostnego i śledziony pobrano 3 miesiące po przeszczepie. Zmodyfikowane komórki (HLA-ABC dodatnie, CD45 ujemne, zaznaczone na czerwono) są wykrywalne tylko w próbkach traktowanych sgRNA, a nie w kontrolach z samym Cas9 (Rysunek 3C).
W razie potrzeby można użyć dwóch sgRNA celujących w sąsiednie sekwencje w celu wywołania delecji. Podejście to pozwala na szybką ocenę wydajności edycji za pomocą PCR i często zapewnia wyższą wydajność disruptywną. Rycina 3D przedstawia efektywne wygenerowanie delecji o długości 58 bp w eksonie 10 genu DNMT3A. 200 000 edytowanych komórek CD34+ przeszczepiono myszom NSG 6 godzin po elektroporacji. Delecja 58 bp została wyraźnie wykryta we krwi obwodowej zaszczepionych myszy NSG 5 miesięcy po iniekcjach (Rycina 3E), co potwierdza edycję komórek CD34+ o zdolności do długoterminowego zagnieżdżenia.
<img alt="Proces syntezy sgRNA, projektowanie starterów, konfiguracja PCR, schemat tworzenia kompleksu Cas9 dla badań nad edycją genów." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57278/57278fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Szybka i łatwa metoda generowania RNP sgRNA. A) Przedstawienie startera sgRNA Fwd. Starter sgRNA Fwd to oligonukleotyd DNA zawierający promotor T7, sekwencję protospacera oraz sekwencję overlapującą z rusztowaniem (scaffold) sgRNA. Na końcu 3', zaznaczonym na czerwono, znajduje się sekwencja „ATAGC”, którą należy dodać do sekwencji startera sgRNA Fwd uzyskanej w programie CRISPRscan. B) Schematyczne przedstawienie PCR z nakładaniem (overlap PCR) przeprowadzonego w celu uzyskania matrycy do IVT. Nakładanie się startera sgRNA Fwd i uniwersalnego startera Scaffold Rev umożliwia elongację i amplifikację za pomocą PCR. C) Schemat opisujący reakcję IVT i wstępne tworzenie kompleksów RNP sgRNA. Produkt PCR jest oczyszczany i wykorzystywany jako matryca do IVT. IVT generuje dużą ilość sgRNA, które mogą być wykorzystane w wielu powtórzeniach (patrz protokół). RNP sgRNA powstają poprzez inkubację sgRNA oczyszczonego z IVT oraz wcześniej zakupionego białka Cas9. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57278/57278fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Analiza cytometrii przepływowej, ekspresja GFP, procentowy wykres słupkowy, elektroforeza żelowa, wyniki edycji genów." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57278/57278fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Efektywna dysrupcja genu w mysich komórkach progenitorowych układu krwiotwórczego. A) sgRNA celujące w GFP (GFP sg1) wraz z białkiem Cas9 wprowadzono metodą elektroporacji do mysich HSPC c-kit+ wykazujących ekspresję GFP, a następnie przeanalizowano za pomocą cytometrii przepływowej 24 godziny po elektroporacji. B) Różne ilości GFP sg1 tworzyły kompleksy z 1 µg białka Cas9 i zostały wprowadzone drogą elektroporacji. Już 200 ng GFP sg1 skutecznie zniosło ekspresję GFP. C) Test T7EI przeprowadzony na DNA genomicznym wyizolowanym z komórek użytych w punktach A-B. Amplikon PCR obejmujący miejsce cięcia Cas9-sgRNA rozcieńczono w stosunku 1:4 w 1x Buffer 2 i powoli hybrydyzowano w termocyklerze. Zhybrydyzowane fragmenty trawiono następnie 1,25 U endonukleazy T7 I przez 10 minut w 37 °C. Strawione fragmenty rozdzielono za pomocą elektroforezy w żelu poliakryloamidowym. Intensywność prążków przeanalizowano za pomocą oprogramowania ImageJ, wykreślając intensywność prążków dla każdej ścieżki. Procent cięcia (% cleavage) obliczono jako stosunek intensywności prążków przeciętych do nieprzeciętych. D) HSPC c-kit+ wyizolowane z myszy wykazujących ekspresję tdTomato poddano elektroporacji białkiem Cas9 w kompleksie z sgRNA przeciwko tdTomato. Cytometria przepływowa wykonana 24 godziny po elektroporacji wykazała, że w około 74% komórek usunięto tdTomato. R26 = Rosa26. * p &lt;0.05, ** p &lt;0.01, *** p &lt; 0.001. Rycina została zaadaptowana z Gundry et al.6 <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57278/57278fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wyniki cytometrii przepływowej i PCR; wpływ edycji genu CD45; analiza Cas9 i sgRNA; dane dotyczące komórek krwi." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57278/57278fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Efektywna dysrupcja genu w ludzkich komórkach krwiotwórczych. A) Zaprojektowano i przetestowano trzy sgRNA celujące w CD45 (CD45 sg1, sg2 i sg3) w linii komórkowej HL60 AML (warunki elektroporacji opisano w protokole). Cytometrię przepływową wykonano 5 dni po elektroporacji. CD45 sg1 wybrano jako najskuteczniejszą spośród trzech sgRNA (wydajność KO 98%). B) KO CD45 w pierwotnych ludzkich HSPC CD34+ z krwi pępowinowej przy użyciu CD45 sg1. Utratę CD45 można wykryć w około 80% komórek. Należy zauważyć, że ekspresja CD34 nie uległa zmianie po edycji. C) Edytowane ludzkie HSPC mogą zostać efektywnie przeszczepione do myszy NSG. Ludzkie komórki jądrzaste wykazują prawidłowy fenotyp HLA+/CD45+ u myszy z przeszczepem wyłącznie Cas9, natomiast u myszy z przeszczepem komórek CD34+ traktowanych CD45-sg1 obserwuje się populacje HLA+/CD45+ oraz HLA+/CD45-, co wskazuje na przyjęcie ludzkich komórek CD45 KO. D) Żel agarozowy 2% wykazujący delecję 58 bp wygenerowaną przez 2 sgRNA (podejście z podwójnym przewodnikiem) w eksonie 10 genu DNMT3A w ludzkich HSPC z 3 różnych próbek krwi pępowinowej (CB1, CB2 i CB3). PCR wykonano 3 dni po elektroporacji. E) Żel agarozowy 2% demonstrujący utrzymywanie się delecji 58 bp 5 miesięcy po przeszczepieniu do myszy NSG. Rysunek został zaadaptowany z pracy Gundry et al.6 <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57278/57278fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Oligonukleotyd</td>
			<td colspan="3">Sekwencja</td>
			<td>Uwaga</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uniwersalny starter odwrotny do rusztowania </td>
			<td colspan="3">agcaccgactcggtgccactttttcaagttgataacggactagccttattttaacttgctatttctagctctaaaac</td>
			<td>Uniwersalny primer odwrotny do PCR z nakładaniem (overlap PCR)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hCD45 sgRNA 1</td>
			<td colspan="3">taatacgactcactataGGTGCTGGTGTTGGGCGCACgttttagagctagaaatagc</td>
			<td>Sekwencja primera Fwd dla sgRNA do PCR z nakładaniem (overlap PCR)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hCD45 sgRNA 2</td>
			<td colspan="3">taatacgactcactataGGGAGCAAGTGAGGATCCTCgttttagagctagaaatagc</td>
			<td>Sekwencja prawego primera sgRNA do PCR z nakładaniem (overlap PCR)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hCD45 sgRNA 3</td>
			<td colspan="3">taatacgactcactataGGGATGCTTGTTCCCTTCAGgttttagagctagaaatagc</td>
			<td>Sekwencja forwardowego primera sgRNA do PCR z nakładaniem (overlap PCR)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hDNMT3A Ex10 sg1</td>
			<td colspan="3">taatacgactcactataGGACACTGCCAAGGCCGTGGgttttagagctagaaatagc</td>
			<td>Sekwencja przedniego primera sgRNA do PCR z nakładaniem (overlap PCR)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hDNMT3A Ex10 sg2</td>
			<td colspan="3">taatacgactcactataGGGTGGCCAGCAGCCGCGCGgttttagagctagaaatagc</td>
			<td>Sekwencja forwardowego primera sgRNA do PCR z zakładkami (overlap PCR)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sgRNA Rosa26</td>
			<td colspan="3">taatacgactcactataGGACACTGCCAAGGCCGTGGgttttagagctagaaatagc</td>
			<td>Sekwencja primera forward sgRNA do PCR z nakładaniem (overlap PCR)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP sg1</td>
			<td colspan="3">taatacgactcactataGGGCGAGGAGCTGTTCACCGgttttagagctagaaatagc</td>
			<td>Sekwencja primera forward sgRNA do PCR z nakładaniem (overlap PCR)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tdTomato sg1</td>
			<td colspan="3">taatacgactcactataGGGGTACAGGCGCTCGGTGGgtttaagagctagaaatagc</td>
			<td>Sekwencja primera forward sgRNA do PCR z nakładaniem (overlap PCR)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Pełne sekwencje starterów sgRNA Fwd użytych w eksperymentach oraz uniwersalnego startera Rev.

Protokół szybkiego rozerwania genów za pośrednictwem CRISPR/Cas9 w pierwotnych komórkach krwiotwórczych myszy i człowieka jest opisany w tym artykule. Rybonukleoproteiny Cas9-sgRNA są wprowadzane przez elektroporację z sgRNA generowanymi przez transkrypcję in vitro i komercyjny Cas9. Wysoka wydajność edycji jest osiągana przy ograniczonych kosztach czasowych i finansowych.

Wysoce skuteczne rozrywanie genów mysich i ludzkich hematopoetycznych komórek progenitorowych za pomocą CRISPR/Cas9

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

Ogólnym celem tego protokołu jest osiągnięcie szybkiego i skutecznego rozerwania genów poprzez CRISPR/Cas9 i pierwotne hematopoetyczne komórki progenitorowe przy użyciu podejścia rybonukleoproteinowego. Metoda ta może odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie prawidłowej i złośliwej hematopoezy, takie jak jakie są molekularne i fenotypowe konsekwencje utraty genu X. Główną zaletą tej techniki jest to, że jest niezwykle łatwa, szybka i opłacalna. Szacowany czas potrzebny od koncepcji eksperymentu do jego wykonania jest krótszy niż tydzień.Chociaż metoda ta została zoptymalizowana pod kątem hematopoetycznych komórek progenitorowych, można ją zastosować do innych typów komórek, takich jak pierwotne limfocyty T, mysie i ludzkie linie komórek krwiotwórczych oraz próbki pierwotnej białaczki. Po raz pierwszy wpadliśmy na pomysł tej metody, gdy zdaliśmy sobie sprawę, że inne metody dostarczania CRISPR/Cas9, w tym plazmidy i wirusy, były albo toksyczne dla naszych komórek, albo miały powolny czas realizacji. Aby zaprojektować interesujące Cię RNA z pojedynczym przewodnikiem, najpierw przejdź do strony internetowej CRISPRscan.W zależności od interesującej Cię komórki naciśnij przycisk Mysz lub Człowiek, a następnie wprowadź gen zainteresowania w polu wyszukiwania UCSC i kliknij Przejdź. Następnie powiększ ekson, na który chcesz celować. Sprawdź, czy jakieś sekwencje docelowe RNA z pojedynczym przewodnikiem są wymienione pod nagłówkiem Przewidywania skanowania CRISPR dotyczące genów.Następnie kliknij na docelowy pojedynczy przewodnik RNA oznaczony jako zielony prostokąt i skopiuj pełną sekwencję wyświetlaną pod sekwencją Oligo. Następnie wklej sekwencję do dokumentu tekstowego. Następnie dodaj nukleotydy ATAGC do trzech pierwszych końców sekwencji.Złóż zamówienie na pełną sekwencję długości. Teraz, aby zsyntetyzować matrycę DNA dla RNA z pojedynczym przewodnikiem, rozpuść, a następnie rozcieńcz startery RNA z pojedynczym przewodnikiem do przodu i uniwersalne startery do tyłu. Następnie dodaj wszystkie odczynniki do probówki PCR, aby wykonać nakładającą się PCR.Po stworzeniu reakcji PCR umieść probówkę w termocyklerze i uruchom program. Po zakończeniu programu oczyść produkt PCR za pomocą kolumn oczyszczających DNA. Rozcieńczyć DNA w 11,5 mikrolitrze buforu elucyjnego.Następnie użyj buforu elucyjnego jako ślepej próby na spektrofotometrze. Zmierzyć stężenie DNA próbki na spektrofotometrze. Najpierw wymieszaj wyluzowane DNA, fosforany deoksynukleotydowe, bufor reakcyjny i mieszankę enzymów polimerazy RNA T7 w probówkach paskowych PCR.Następnie inkubować próbkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez cztery godziny. Następnie nałóż środek czyszczący RNazy, aby usunąć RNazę z używanych rękawic. Następnie dostosuj objętość każdej próbki RNA do 50 mikrolitrów wodą wolną od nukleaz.Oczyść RNA zgodnie z instrukcjami producenta. Na koniec eluuj RNA w 50 mikrolitrach wody wolnej od nukleaz. Najpierw użyj wody wolnej od nukleaz do wygaszenia spektrofotometru, a następnie zmierz stężenie eluowanego RNA.Użyj wykluczenia błękitu trypanowego, aby policzyć liczbę komórek. Dla każdej kontrpróby należy zebrać 200 000 żywotnych komórek na powtórzenie, a następnie dodać sól fizjologiczną buforowaną fosforanami, aby umyć komórki. Następnie obracaj probówkę 300 razy g przez siedem minut.Po odwirowaniu ostrożnie usunąć supernatant. W trakcie wirowania inkubować 1,5 mikrograma Cas9 z jednym mikrogramem całkowitego jednoprowadnicowego RNA w probówce PCR przez 20 do 30 minut. Ma to na celu przygotowanie kompleksów Cas9-sgRNA RNP dla każdej replikaty.Po obliczeniu wymaganej objętości buforu do respensji T, rozpuść osad komórkowy otrzymany w buforze do resuspensji T. Następnie dodaj 10 mikrolitrów rozpuszczonej zawiesiny komórek w probówce PCR z kompleksami Cas9-sgRNA RNP. Następnie włącz jednostkę do elektroporacji. Wsuń kuwetę do uchwytu na kuwetę.Następnie dodaj trzy mililitry buforu E. Ustaw warunki na urządzeniu do elektroporacji. Aby wykonać elektroporację, najpierw przytrzymaj pipetę do elektroporacji, następnie wysuń pazur i chwyć krążek wewnątrz końcówki pipety, a następnie mocno dociśnij pipetę, aby zabezpieczyć końcówkę. Następnie wymieszać próbkę, pipetując ją w górę i w dół 10 razy.Pobrać 10 mikrolitrów próbki i upewnić się, że nie ma pęcherzyków powietrza. Następnie włóż końcówkę bezpośrednio do bufora elektrolitycznego w kuwecie do elektroporacji. Następnie naciśnij Start na ekranie.Poczekaj, aż na ekranie pojawi się cała wiadomość. Następnie wyjmij pipetę z kuwety. Następnie dozować zawartość z kuwety do studzienki wypełnionej nową pożywką hodowlaną HSPC.Aby zbadać skuteczność elektroporacji RNP Cas9-sgRNA, HSPC izolowane od myszy są elektroporowane jednoprowadnicową RNazą ukierunkowaną na GFP lub tdTomato. Te HSPC wszechobecnie wyrażały GFP lub tdTomato. Analiza cytometrii przepływowej wykazała około 75 i 74% utratę ekspresji GFP lub tdTomato w HSPC na poziomie białka.Następnie przeprowadza się test na podstawie endonukleazy T7 na bazie One z amplifikowanym DNA PCR z locus GFP komórek elektroporowanych. Ma to na celu ilościowe określenie skuteczności GFP w zakresie rozerwania genów. Oprogramowanie ImageJ służy do obliczania stosunku intensywności pasm rozszczepionych do nienaruszonych w celu obliczenia procentu rozszczepienia.Skuteczność trzech różnych jednoprowadnicowych RNA ukierunkowanych na ludzki CD45 jest testowana w linii komórkowej HL-60 AML. Cytometria przepływowa pokazuje, że RNA1 z pojedynczym przewodnikiem jest najbardziej wydajny z 98% skutecznością nokautu w porównaniu z kontrolą. Następnie nokaut CD45 jest również wykonywany w pierwotnych ludzkich krwiach pępowinowych CD34 dodatnich HSPC przy użyciu jednoprowadnicowego RNA1.Analiza cytometrii przepływowej wykazała prawie 80% komórek z utratą CD45 bez zmian w ekspresji CD34 w porównaniu tylko z Cas9. W celu zbadania wszczepienia ludzkich HSPC z nokautem CD45, komórki szpiku kostnego i śledziony pobiera się od myszy NSG transfekowanych retroorbitalnie CD34 do analizy, pokazując edytowane komórki jako HLA-ABC dodatnie i CD45 ujemne. Po opanowaniu protokół ten można ukończyć w ciągu trzech dni, jeśli zostanie wykonany po poprawie.Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, aby wszystkie powierzchnie i odczynniki były wolne od RNazy, sprawdzać skuteczne rozerwanie genów za pomocą wielu technik i stosować odpowiednie kontrole eksperymentalne. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak projektować, syntetyzować i transfekować rybonukleoproteiny Cas9-sgRNA do hematopoetycznych komórek progenitorowych, aby uzyskać szybkie i skuteczne rozerwanie genów.

highly-efficient-gene-disruption-murine-human-hematopoietic

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

Narzędzia do edycji genomu, takie jak system CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas (związany z CRISPR), znacznie poprawiły skuteczność celowania w geny w ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórkach macierzystych (hiPSC). Niniejszy manuskrypt opisuje protokół generowania specyficznego dla linii reportera hiPSC przy użyciu rekombinacji homologicznej wspomaganej systemem CRISPR/Cas.

Wydajne generowanie reporterów knockin specyficznych dla linii neuronowej hiPSC przy użyciu systemu podwójnej nickazy CRISPR/Cas9 i Cas9

Ostatnie osiągnięcia w zakresie genetycznego manipulowania liniami komórek somatycznych mają ogromny potencjał dla badań podstawowych i stosowanych. W tym miejscu przedstawiamy dwa podejścia do produkcji nokautu generowanego przez CRISPR/Cas9 i badań przesiewowych w liniach komórkowych ssaków, z użyciem i bez użycia selektywnych markerów.

Zależne od selekcji i niezależne generowanie nokautów genów za pośrednictwem CRISPR/Cas9 w komórkach ssaków

Ukierunkowana edycja genów za pomocą CRISPR/Cas9 znacznie ułatwiła zrozumienie biologicznych funkcji genów. W tym przypadku wykorzystujemy metodologię CRISPR/Cas9 do modelowania mutacji kalretykuliny w komórkach krwiotwórczych zależnych od cytokin w celu zbadania ich aktywności onkogennej.

Wykorzystanie edycji genów CRISPR/Cas9 do zbadania onkogennej aktywności zmutowanej kalretykuliny w komórkach krwiotwórczych zależnych od cytokin

Prezentowany jest tutaj protokół do efektywnej edycji genów za pośrednictwem rybonukleoproteiny CRISPR/Cas9 w komórkach ssaków za pomocą elektroporacji rurkowej.

CRISPR/Cas9 Precyzyjna edycja genów za pośrednictwem rybonukleoprotein za pomocą elektroporacji rurkowej

Opisane są protokoły wysoce efektywnej edycji genomu mysich hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych (HSPC) przez system CRISPR/Cas9 w celu szybkiego rozwoju mysich systemów modelowych z modyfikacjami genów specyficznymi dla układu krwiotwórczego.

Edycja genomu za pośrednictwem lentiwirusowego CRISPR/Cas9 w celu badania komórek krwiotwórczych w modelach chorobowych

Tutaj opisujemy szczegółową metodę bezproblemowej edycji genów w ludzkich pluripotencjalnych komórkach macierzystych przy użyciu plazmidu dawcy opartego na piggyBac i mutanta nickazy Cas9. Do eksonu 8 locus czynnika jądrowego hepatocytów 4 alfa (HNF4α) w ludzkich embrionalnych komórkach macierzystych (hESC) wprowadzono dwie mutacje punktowe.

Wprowadzenie mutacji punktowych do ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych przy użyciu płynnej edycji genomu

Obecny protokół opisuje zoptymalizowaną procedurę hodowli hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych (HSPC) w celu solidnego wszczepienia komórek z edytowanymi genami in vivo.

Edycja genów CRISPR/Cas9 hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych do zastosowań w terapii genowej

Ten protokół opisuje procedurę edycji genomu w makrofagach pochodzących ze szpiku kostnego myszy przy użyciu kompleksów rybonukleoprotein Cas9-sgRNA składanych in vitro i dostarczanych przez elektroporację.

Wysokowydajne rozrywanie genów w pierwotnych makrofagach pochodzących ze szpiku kostnego przy użyciu elektroporowanych kompleksów Cas9-sgRNA

Przedstawiona metoda opisuje generowanie nokautu genu za pośrednictwem CRISPR w linii H9 ludzkiej embrionalnej komórki macierzystej (hESC), która stabilnie wyraża sgRNA ukierunkowane na gen L2HGDH za pomocą wysoce wydajnego systemu dostarczania genów za pośrednictwem lentiwirusa.

Delecja genu za pośrednictwem CRISPR-Cas9 w ludzkich pluripotencjalnych komórkach macierzystych hodowanych w warunkach wolnych od karmowego

Linia komórkowa THP-1 jest szeroko stosowana jako model do badania funkcji ludzkich monocytów/makrofagów w różnych obszarach badawczych związanych z biologią. W tym artykule opisano protokół wydajnej inżynierii opartej na CRISPR-Cas9 i izolacji klonów pojedynczych komórek, umożliwiający uzyskanie solidnych i powtarzalnych danych fenotypowych.

Nokaut genów za pośrednictwem CRISPR-Cas9 oparty na elektroporacji w komórkach THP-1 i izolacja klonów pojedynczych komórek

Tutaj prezentujemy protokół, który integruje technologię CRISPR/Cas9 z testem Cell Counting Kit-8 (CCK-8) w celu identyfikacji genów kandydujących, które są kluczowe dla nieprawidłowej zdolności proliferacyjnej hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych.

Ocena nieprawidłowych genów związanych ze wzrostem hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych poprzez połączenie technologii CRISPR/Cas9 ze zliczaniem komórek

Naucz się szybkiej edycji genów CRISPR/Cas9 w mysich i ludzkich hematopoetycznych komórkach progenitorowych przy użyciu kompleksów rybonukleoproteinowych. Ta metoda osiąga około 75% efektywność nokautu w krótszym czasie niż tydzień.

Wysoce skuteczne rozrywanie genów mysich i ludzkich hematopoetycznych komórek progenitorowych za pomocą CRISPR/Cas9

Przeglądaj więcej filmów