Wysoce skuteczne rozrywanie genów mysich i ludzkich hematopoetycznych komórek progenitorowych za pomocą CRISPR/Cas9
10 kwietnia 2018
Protokół szybkiego rozerwania genów za pośrednictwem CRISPR/Cas9 w pierwotnych komórkach krwiotwórczych myszy i człowieka jest opisany w tym artykule. Rybonukleoproteiny Cas9-sgRNA są wprowadzane przez elektroporację z sgRNA generowanymi przez transkrypcję in vitro i komercyjny Cas9. Wysoka wydajność edycji jest osiągana przy ograniczonych kosztach czasowych i finansowych.
Ogólnym celem tego protokołu jest osiągnięcie szybkiego i skutecznego rozerwania genów poprzez CRISPR/Cas9 i pierwotne hematopoetyczne komórki progenitorowe przy użyciu podejścia rybonukleoproteinowego. Metoda ta może odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie prawidłowej i złośliwej hematopoezy, takie jak jakie są molekularne i fenotypowe konsekwencje utraty genu X. Główną zaletą tej techniki jest to, że jest niezwykle łatwa, szybka i opłacalna. Szacowany czas potrzebny od koncepcji eksperymentu do jego wykonania jest krótszy niż tydzień.
Chociaż metoda ta została zoptymalizowana pod kątem hematopoetycznych komórek progenitorowych, można ją zastosować do innych typów komórek, takich jak pierwotne limfocyty T, mysie i ludzkie linie komórek krwiotwórczych oraz próbki pierwotnej białaczki. Po raz pierwszy wpadliśmy na pomysł tej metody, gdy zdaliśmy sobie sprawę, że inne metody dostarczania CRISPR/Cas9, w tym plazmidy i wirusy, były albo toksyczne dla naszych komórek, albo miały powolny czas realizacji. Aby zaprojektować interesujące Cię RNA z pojedynczym przewodnikiem, najpierw przejdź do strony internetowej CRISPRscan.
W zależności od interesującej Cię komórki naciśnij przycisk Mysz lub Człowiek, a następnie wprowadź gen zainteresowania w polu wyszukiwania UCSC i kliknij Przejdź. Następnie powiększ ekson, na który chcesz celować. Sprawdź, czy jakieś sekwencje docelowe RNA z pojedynczym przewodnikiem są wymienione pod nagłówkiem Przewidywania skanowania CRISPR dotyczące genów.
Następnie kliknij na docelowy pojedynczy przewodnik RNA oznaczony jako zielony prostokąt i skopiuj pełną sekwencję wyświetlaną pod sekwencją Oligo. Następnie wklej sekwencję do dokumentu tekstowego. Następnie dodaj nukleotydy ATAGC do trzech pierwszych końców sekwencji.
Złóż zamówienie na pełną sekwencję długości. Teraz, aby zsyntetyzować matrycę DNA dla RNA z pojedynczym przewodnikiem, rozpuść, a następnie rozcieńcz startery RNA z pojedynczym przewodnikiem do przodu i uniwersalne startery do tyłu. Następnie dodaj wszystkie odczynniki do probówki PCR, aby wykonać nakładającą się PCR.
Po stworzeniu reakcji PCR umieść probówkę w termocyklerze i uruchom program. Po zakończeniu programu oczyść produkt PCR za pomocą kolumn oczyszczających DNA. Rozcieńczyć DNA w 11,5 mikrolitrze buforu elucyjnego.
Następnie użyj buforu elucyjnego jako ślepej próby na spektrofotometrze. Zmierzyć stężenie DNA próbki na spektrofotometrze. Najpierw wymieszaj wyluzowane DNA, fosforany deoksynukleotydowe, bufor reakcyjny i mieszankę enzymów polimerazy RNA T7 w probówkach paskowych PCR.
Następnie inkubować próbkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez cztery godziny. Następnie nałóż środek czyszczący RNazy, aby usunąć RNazę z używanych rękawic. Następnie dostosuj objętość każdej próbki RNA do 50 mikrolitrów wodą wolną od nukleaz.
Oczyść RNA zgodnie z instrukcjami producenta. Na koniec eluuj RNA w 50 mikrolitrach wody wolnej od nukleaz. Najpierw użyj wody wolnej od nukleaz do wygaszenia spektrofotometru, a następnie zmierz stężenie eluowanego RNA.
Użyj wykluczenia błękitu trypanowego, aby policzyć liczbę komórek. Dla każdej kontrpróby należy zebrać 200 000 żywotnych komórek na powtórzenie, a następnie dodać sól fizjologiczną buforowaną fosforanami, aby umyć komórki. Następnie obracaj probówkę 300 razy g przez siedem minut.
Po odwirowaniu ostrożnie usunąć supernatant. W trakcie wirowania inkubować 1,5 mikrograma Cas9 z jednym mikrogramem całkowitego jednoprowadnicowego RNA w probówce PCR przez 20 do 30 minut. Ma to na celu przygotowanie kompleksów Cas9-sgRNA RNP dla każdej replikaty.
Po obliczeniu wymaganej objętości buforu do respensji T, rozpuść osad komórkowy otrzymany w buforze do resuspensji T. Następnie dodaj 10 mikrolitrów rozpuszczonej zawiesiny komórek w probówce PCR z kompleksami Cas9-sgRNA RNP. Następnie włącz jednostkę do elektroporacji. Wsuń kuwetę do uchwytu na kuwetę.
Następnie dodaj trzy mililitry buforu E. Ustaw warunki na urządzeniu do elektroporacji. Aby wykonać elektroporację, najpierw przytrzymaj pipetę do elektroporacji, następnie wysuń pazur i chwyć krążek wewnątrz końcówki pipety, a następnie mocno dociśnij pipetę, aby zabezpieczyć końcówkę. Następnie wymieszać próbkę, pipetując ją w górę i w dół 10 razy.
Pobrać 10 mikrolitrów próbki i upewnić się, że nie ma pęcherzyków powietrza. Następnie włóż końcówkę bezpośrednio do bufora elektrolitycznego w kuwecie do elektroporacji. Następnie naciśnij Start na ekranie.
Poczekaj, aż na ekranie pojawi się cała wiadomość. Następnie wyjmij pipetę z kuwety. Następnie dozować zawartość z kuwety do studzienki wypełnionej nową pożywką hodowlaną HSPC.
Aby zbadać skuteczność elektroporacji RNP Cas9-sgRNA, HSPC izolowane od myszy są elektroporowane jednoprowadnicową RNazą ukierunkowaną na GFP lub tdTomato. Te HSPC wszechobecnie wyrażały GFP lub tdTomato. Analiza cytometrii przepływowej wykazała około 75 i 74% utratę ekspresji GFP lub tdTomato w HSPC na poziomie białka.
Następnie przeprowadza się test na podstawie endonukleazy T7 na bazie One z amplifikowanym DNA PCR z locus GFP komórek elektroporowanych. Ma to na celu ilościowe określenie skuteczności GFP w zakresie rozerwania genów. Oprogramowanie ImageJ służy do obliczania stosunku intensywności pasm rozszczepionych do nienaruszonych w celu obliczenia procentu rozszczepienia.
Skuteczność trzech różnych jednoprowadnicowych RNA ukierunkowanych na ludzki CD45 jest testowana w linii komórkowej HL-60 AML. Cytometria przepływowa pokazuje, że RNA1 z pojedynczym przewodnikiem jest najbardziej wydajny z 98% skutecznością nokautu w porównaniu z kontrolą. Następnie nokaut CD45 jest również wykonywany w pierwotnych ludzkich krwiach pępowinowych CD34 dodatnich HSPC przy użyciu jednoprowadnicowego RNA1.
Analiza cytometrii przepływowej wykazała prawie 80% komórek z utratą CD45 bez zmian w ekspresji CD34 w porównaniu tylko z Cas9. W celu zbadania wszczepienia ludzkich HSPC z nokautem CD45, komórki szpiku kostnego i śledziony pobiera się od myszy NSG transfekowanych retroorbitalnie CD34 do analizy, pokazując edytowane komórki jako HLA-ABC dodatnie i CD45 ujemne. Po opanowaniu protokół ten można ukończyć w ciągu trzech dni, jeśli zostanie wykonany po poprawie.
Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, aby wszystkie powierzchnie i odczynniki były wolne od RNazy, sprawdzać skuteczne rozerwanie genów za pomocą wielu technik i stosować odpowiednie kontrole eksperymentalne. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak projektować, syntetyzować i transfekować rybonukleoproteiny Cas9-sgRNA do hematopoetycznych komórek progenitorowych, aby uzyskać szybkie i skuteczne rozerwanie genów.
Przegląd
Niniejszy artykuł opisuje protokół szybkiej przerwy genowej za pomocą CRISPR/Cas9 w pierwotnych komórkach krwiotwórczych myszy i człowieka z wykorzystaniem podejścia opartego na rybonukleoproteinach. Metoda ta pozwala na uzyskanie wysokiej wydajności edycji przy minimalnym nakładzie czasu i kosztów.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Edycja genów
- Biologia komórek krwiotwórczych
- Technologia CRISPR/Cas9
Wprowadzenie
- CRISPR/Cas9 jest potężnym narzędziem do disruptywnych modyfikacji genów.
- Pierwotne komórki krwiotwórcze są kluczowe dla badania hematopoezy.
- Tradycyjne metody dostarczania CRISPR mogą być toksyczne lub powolne.
- Niniejszy protokół ma na celu zwiększenie wydajności i obniżenie kosztów.
Cel badania
- Opracowanie szybkiej i wydajnej metody dysrupcji genów.
- Zbadanie skutków utraty genów w komórkach progenitorowych układu krwiotwórczego.
- Przedstawienie protokołu możliwego do zastosowania w różnych typach komórek.
Zastosowane metody
- Projektowanie pojedynczych przewodnich RNA (sgRNA) przy użyciu narzędzia CRISPRscan.
- Synteza RNA i przygotowanie kompleksów rybonukleoproteinowych Cas9-sgRNA.
- Elektroporacja pierwotnych komórek krwiotwórczych kompleksami RNP.
- Ocena wydajności przerwania genu za pomocą cytometrii przepływowej i testów endonukleazy T7.
Główne wyniki
- Osiągnięto około 75% utraty ekspresji genu docelowego w HSPCs.
- Wykazano 98% wydajności knockoutu w linii komórkowej AML HL-60.
- Wykazano skuteczną dysrupcję genu w pierwotnych ludzkich komórkach krwi pępowinowej.
- Potwierdzono przeżycie i rozwój (engraftment) edytowanych komórek w myszach NSG.
Wnioski
- Protokół jest wydajny i można go zrealizować w czasie krótszym niż tydzień.
- Ma on zastosowanie do różnych typów komórek krwiotwórczych.
- Kluczem do sukcesu jest utrzymanie warunków wolnych od RNaz.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Efektywne wyciszanie genów w pierwotnych komórkach krwiotwórczych umożliwia szybką walidację celów oraz redukcję ryzyka mechanistycznego w procesie odkrywania leków hematologicznych. Zastosowanie rybonukleoprotein CRISPR/Cas9 ogranicza niepewność biologiczną poprzez zapewnienie wysokiej wydajności nokautu bez użycia egzogennego DNA, co zwiększa wiarygodność predykcyjną przy wczesnym wyborze celów. Przedstawiony schemat pracy przyspiesza harmonogramy odkryć w programach onkologicznych i immunologicznych, oferując skalowalną i kosztowo efektywną metodę genomiki funkcjonalnej w systemach krwiotwórczych istotnych dla przebiegu chorób.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez szybki knockout genów w pierwotnych mysich i ludzkich komórkach progenitorowych krwiotwórczych.
- Wartość operacyjna: Wspiera biologiczne ograniczanie ryzyka dzięki osiągnięciu wydajności knockoutu do 98% w liniach komórkowych AML oraz 80% w pierwotnych ludzkich HSPC z krwi pępowinowej.
- Wartość strategiczna: Ułatwia potwierdzenie celowości terapeutycznej i selekcję portfolio poprzez umożliwienie szybkiej oceny fenotypów wynikających z utraty genów w systemach istotnych dla danej choroby.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Pozwala na przygotowanie zwalidowanych komórek krwiotwórczych z knockoutem w celu dalszego przesiewu związków i analizy fenotypowej.
- Wartość operacyjna: Zapewnia standaryzowaną, powtarzalną dysrupcję genów poprzez elektroporację RNP z ilościową oceną za pomocą cytometrii przepływowej i testu endonukleazy T7.
- Wartość strategiczna: Umożliwia skalowalne wykorzystanie platformy w przypadku pierwotnych komórek, linii komórkowych oraz pierwotnych próbek białaczki w celu spójnej walidacji celu.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Wykazuje pomyślne zaprawienie zmodyfikowanych ludzkich HSPC u myszy NSG, co wspiera ciągłość translacyjną od etapu odkrycia do walidacji przedklinicznej.
- Wartość operacyjna: Zapewnia usprawniony, trzydniowy schemat pracy, który jest zgodny z harmonogramami przedklinicznymi dla badań walidacyjnych celów terapeutycznych.
- Wartość strategiczna: Redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w przypadku celów hematopoetycznych, umożliwiając podejmowanie decyzji o dalszym rozwoju projektów w onkologii i immunologii w oparciu o analizę ryzyka.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta integruje się z kontinuum odkrywania leków – od identyfikacji celu po optymalizację związku wiodącego – umożliwiając szybką walidację funkcjonalną celów hematopoetycznych przed etapem przesiewania związków.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków sygnałowych poprzez efektywną dysrupcję genów w pierwotnych komórkach krwiotwórczych.
- Przesiewanie: Dostarcza gotowe do analizy modele z nokautem genów o wysokiej powtarzalności i mierzalnych wynikach, co pozwala na wiarygodną ocenę związków.
- Analityka: Pozwala na pomiar wydajności edycji za pomocą cytometrii przepływowej i testów endonukleazy T7, co umożliwia analizę porównawczą różnych warunków.
- Badania translacyjne: Łączy etap odkryć z walidacją przedkliniczną poprzez wykazanie procesu wszczepienia zedytowanych HSPC in vivo.
- Ponowne wykorzystanie w organizacji: Tworzy wielokrotnego użytku platformę CRISPR/Cas9 RNP, którą można zastosować w różnych modelach krwiotwórczych, co ogranicza potrzebę powtarzalnego opracowywania protokołów.
Wpływ operacyjny i organizacyjny
- Wartość naukowa: Pewność prognostyczna w walidacji celu, redukcja niejednoznaczności mechanistycznej oraz wysokowierna dysrupcja genów bez integracji z DNA.
- Wartość operacyjna: Standaryzacja, powtarzalność i skalowalność edycji genów w pierwotnych i transformowanych komórkach krwiotwórczych.
- Wartość strategiczna: Usprawnione podejmowanie decyzji go/no-go, efektywność kapitałowa oraz zredukowane ryzyko biologiczne na późnych etapach programów leków hematologicznych.
- Wpływ na portfolio: Priorytetyzacja skorygowana o ryzyko i decyzje dotyczące rozwoju oparte na szybkich, wysoce efektywnych danych dotyczących nokautu celu.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest biegłość w technikach klonowania molekularnego, pracy z RNA oraz elektroporacji.
- Metoda zależy od dostępu do termocyklera, spektrofotometru, urządzenia do elektroporacji oraz cytometrii przepływowej w celu walidacji.
- Niezbędne jest zapewnienie środowiska wolnego od RNaz oraz standaryzacja obchodzenia się z odczynnikami, aby zagwarantować stabilność kompleksów RNP i wydajność edycji.
- Wymagana jest adaptacja projektu gRNA oraz optymalizacja dla różnych modeli hematopoetycznych i genów docelowych.
- Ograniczenie praktyczne: Wydajność może się różnić w zależności od typu komórek i locus docelowego, co wymaga empirycznej walidacji dla każdego badanego genu.
Częste pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:05
Title
1:05
sgRNA Fwd Primer Design, DNA Template Synthesis, and ln Vitro Transcription of sgRNA
3:38
Cas9-sgRNA Complexing and Electroporation
5:45
Results: Use of Cas9-sgRNA Electroporation Protocol to Study Efficient Knockout of Target Gene
7:48
Conclusion
