Name: Motiver Capture Hi-C: Profilowanie interakcji promotorów w całej rozdzielczości i całym genomie (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-28T13:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 16 s
Description: Poznaj metodę Promoter Capture Hi-C do profilowania interakcji promotorów w całym genomie. Technika ta pozwala łączyć elementy regulacyjne z genami docelowymi, ujawniając trójwymiarową organizację chromatyny.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Waleriji Małeszewej za krytyczne przeczytanie manuskryptu i fachową pomoc przy rysunku 1. Prace te były wspierane przez Radę ds. Badań Medycznych w Wielkiej Brytanii (MR/L007150/1) oraz Radę ds. Badań nad Biotechnologią i Naukami Biologicznymi w Wielkiej Brytanii (BB/J004480/1).

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Modułowa konstrukcja Promoter Capture Hi-C
Promoter Capture Hi-C został zaprojektowany w celu wzbogacenia bibliotek Hi-C dla interakcji z udziałem promotorów. Interakcje te obejmują tylko podzbiór produktów ligacji obecnych w bibliotece Hi-C.
Capture Hi-C można łatwo zmodyfikować w celu wzbogacenia bibliotek Hi-C dla dowolnego regionu genomowego lub regionów zainteresowania poprzez zmianę systemu przechwytywania. Regiony wychwytywania mogą być ciągłymi segmentami genomu 44,45,46,48, wzmacniaczami, które zostały zidentyfikowane w PCHi-C ("Reverse Capture Hi-C'35") lub miejscach nadwrażliwych na DNazę I49. Rozmiar systemu przechwytywania można dostosować w zależności od zakresu eksperymentalnego. Na przykład Dryden i wsp. Celuj w 519 fragmentów przynęty w trzech pustyniach genowych związanych z rakiem piersi44. System wychwytywania Martina i wsp. jest ukierunkowany zarówno na ciągłe segmenty genomu ("przechwytywanie regionów": łącznie 211 regionów genomu; 2 131 fragmentów restrykcyjnych), jak i wybrane promotory (3 857 promotorów genów)45.
Biblioteki SureSelect są dostępne w różnych zakresach rozmiarów: od 1 kb do 499 kb (5 190–4 806), od 500 kb do 2,9 MB (5 190–4 816) i od 3 Mb do 5,9 Mb (5 190–4 831). Ponieważ każdy pojedynczy biotyna-RNA ma długość 120 nukleotydów, te systemy wychwytywania mieszczą maksymalnie 4 158, 24 166 i 49 166 indywidualnych sond wychwytujących. Odpowiada to odpowiednio 2 079, 12 083 i 24 583 ukierunkowanym fragmentom restrykcyjnym (należy zauważyć, że liczby dla fragmentów ograniczających są dolnymi granicami opartymi na założeniu, że dla każdego fragmentu restrykcji można zaprojektować dwie indywidualne sondy przechwytujące — w rzeczywistości ze względu na powtarzające się sekwencje nie będzie tak w przypadku każdego fragmentu restrykcji (zob. również rysunek 1B, C), co skutkuje większą liczbą możliwych do namierzenia fragmentów ograniczających dla stałej liczby dostępnych sond przechwytujących).
Opisany tutaj protokół opiera się na wykorzystaniu enzymu restrykcyjnego z miejscem rozpoznawania 6 pz w celu odkrycia interakcji dalekiego zasięgu. Możliwe jest również użycie enzymu restrykcyjnego z miejscem rozpoznawania 4 pz w celu uzyskania większej rozdzielczości bardziej proksymalnych interakcji40,49.
Ograniczenia PCHi-C 
Jednym z nieodłącznych ograniczeń wszystkich testów wychwytywania konformacji chromosomów jest to, że ich rozdzielczość jest określana przez enzym restrykcyjny używany do generowania biblioteki. Interakcje zachodzące między elementami DNA znajdującymi się na tym samym fragmencie restrykcyjnym są niewidoczne dla testów typu C. Co więcej, w PCHi-C w niektórych przypadkach więcej niż jedno miejsce rozpoczęcia transkrypcji może znajdować się na tym samym fragmencie restrykcyjnym zawierającym promotor, a PIR w niektórych przypadkach zawierają zarówno aktywne, jak i represyjne znaczniki histonów, co utrudnia określenie, które elementy regulatorowe pośredniczą w interakcjach, oraz przewidywanie regulacyjnego wyniku interakcji promotora. Stosowanie enzymów restrykcyjnych z miejscami rozpoznawania 4 pz łagodzi ten problem, ale odbywa się kosztem znacznie zwiększonej złożoności biblioteki Hi-C (biblioteki Hi-C wygenerowane za pomocą enzymów ograniczających miejsce rozpoznawania 4 pz są co najmniej 100 razy bardziej złożone niż biblioteki Hi-C wygenerowane za pomocą enzymów restrykcyjnych miejsca rozpoznawania 6 pz) i związanych z tym kosztów sekwencjonowania nowej generacji.
Innym ograniczeniem jest to, że obecny protokół PCHi-C wymaga milionów komórek jako materiału wyjściowego, co uniemożliwia analizę interakcji promotorów w rzadkich typach komórek. Zmodyfikowana wersja PCHi-C, umożliwiająca badanie kontaktów promotora w populacjach komórek liczących od 10 000 do 100 000 komórek (na przykład komórek we wczesnym okresie rozwoju embrionalnego lub hematopoetycznych komórek macierzystych), byłaby zatem cennym uzupełnieniem zestawu narzędzi Capture Hi-C.
Wreszcie, podobnie jak wszystkie metody, które opierają się na utrwalaniu formaldehydu, PCHi-C rejestruje tylko te interakcje, które są "zamrożone" w momencie utrwalenia. W związku z tym, aby zbadać kinetykę i dynamikę oddziaływań promotorów, potrzebne są metody takie jak mikroskopia żywych komórek o wysokiej rozdzielczości wraz z PCHi-C.
Metody analizy przestrzennej organizacji chromosomów w wysokiej rozdzielczości
Ogromna złożoność bibliotek interakcji chromosomowych uniemożliwia wiarygodną identyfikację produktów interakcji między dwoma określonymi fragmentami restrykcyjnymi z istotnością statystyczną. Aby obejść ten problem, przechwytywanie sekwencji zostało wykorzystane do wzbogacenia bibliotek Hi-C 33,34,40,44 lub 3C50,51 dla określonych interakcji. Główną zaletą korzystania z bibliotek Hi-C w porównaniu z bibliotekami 3C na etapie wzbogacania jest to, że Hi-C, w przeciwieństwie do 3C, zawiera etap wzbogacania dla oryginalnych produktów ligacji. W konsekwencji odsetek prawidłowych odczytów w bibliotekach PCHi-C jest około 10-krotnie wyższy niż w bibliotekach Capture-C50, które zawierały około 5–8% prawidłowych odczytów po filtrowaniu HiCUP. Sahlen i in. bezpośrednio porównali Capture-C z HiCap, który podobnie jak PCHi-C używa bibliotek Hi-C do wzbogacania przechwytywania, w przeciwieństwie do Capture-C, który używa bibliotek 3C. Zgodnie z naszymi ustaleniami odkryli, że biblioteki Capture-C składają się głównie z nieligowanych fragmentów40. Ponadto biblioteki HiCap miały większą złożoność niż biblioteki Capture-C40.
Wariant Capture-C, zwany Capture-C52 nowej generacji (NG Capture-C) wykorzystuje jeden oligo na koniec fragmentu restrykcyjnego, jak wcześniej ustalono w PCHi-C 33,34, zamiast nakładających się sond używanych w oryginalnym protokole Capture-C50. Zwiększa to nieznacznie odsetek prawidłowych odczytów w porównaniu z Capture-C, ale NG Capture-C wykorzystuje dwie sekwencyjne rundy wzbogacania przechwytywania i stosunkowo dużą liczbę cykli PCR (łącznie od 20 do 24 cykli, w porównaniu do 11 cykli zwykle dla PCHi-C), co nieuchronnie skutkuje większą liczbą duplikatów sekwencji i mniejszą złożonością biblioteki. W eksperymentach próbnych podczas optymalizacji PCHi-C stwierdziliśmy, że odsetek unikalnych (tj. nie zduplikowanych) par odczytu wynosił tylko około 15%, gdy użyliśmy 19 cykli PCR (13 cykli przed wychwytywaniem + 6 cykli po przechwyceniu; dane nie pokazane), jednak optymalizacja do mniejszej liczby cykli PCR zwykle daje 75-90% unikalnych par odczytu. W związku z tym zmniejszenie liczby cykli PCR znacznie zwiększa ilość informacyjnych danych sekwencyjnych.
Najnowsza metoda łączy ChIP z Hi-C, aby skupić się na interakcjach chromosomowych, w których pośredniczy określone białko będące przedmiotem zainteresowania (HiChIP53). W porównaniu z ChIA-PET54, który opiera się na podobnym przesłaniu, dane HiChIP zawierają większą liczbę odczytów sekwencji informacyjnych, co pozwala na wywołanie interakcji o wyższym poziomie ufności53. Bardzo interesujące będzie bezpośrednie porównanie odpowiednich zestawów danych HiChIP i Capture Hi-C, gdy staną się one dostępne (na przykład HiChIP przy użyciu przeciwciała przeciwko jednostce kohezyny Smc1a53 z Capture Hi-C dla wszystkich fragmentów restrykcyjnych związanych z Smc1a) obok siebie. Jedną z nieodłącznych różnic między tymi dwoma podejściami jest to, że Capture Hi-C nie opiera się na immunoprecypitacji chromatyny, a zatem jest zdolny do badania interakcji chromosomowych niezależnie od zajętości białka. Umożliwia to porównanie organizacji genomu 3D w obecności lub braku wiązania określonego czynnika, co zostało wykorzystane do identyfikacji PRC1 jako kluczowego regulatora architektury przestrzennej genomu myszy ESC7.
PCHi-C i GWAS
Badania asocjacyjne całego genomu (GWAS) wykazały, że ponad 95% wariantów sekwencji związanych z chorobą znajduje się w niekodujących regionach genomu, często w dużej odległości od genów kodujących białka55. Warianty GWAS często znajdują się w bliskim sąsiedztwie miejsc nadwrażliwych na DNazę I, co jest cechą charakterystyczną sekwencji o potencjalnej aktywności regulatorowej. PCHi-C i Capture Hi-C były szeroko stosowane do łączenia promotorów z loci ryzyka GWAS związanymi z rakiem piersi44, rakiem jelita grubego48 i chorobą autoimmunologiczną 35,45,46. Badanie PCHi-C na 17 różnych typach ludzkich komórek krwiotwórczych wykazało, że SNP związane z chorobą autoimmunologiczną były wzbogacone w PIR w komórkach limfoidalnych, podczas gdy warianty sekwencji związane z cechami specyficznymi dla płytek krwi i czerwonych krwinek stwierdzono głównie odpowiednio w makrofagach i erytroblastach35,56. W związku z tym specyficzne dla typu tkanki interakcje promotorowe odkryte przez PCHi-C mogą pomóc w zrozumieniu funkcji niekodujących wariantów sekwencji związanych z chorobą i zidentyfikowaniu nowych potencjalnych genów chorobowych do interwencji terapeutycznej.
Charakterystyka regionów oddziałujących na siebie z promotorem
Istnieje kilka linii dowodowych łączących interakcje promotorów z kontrolą ekspresji genów. Po pierwsze, kilka badań PCHi-C wykazało, że regiony genomu oddziałujące z promotorami genów o (wysokiej) ekspresji są wzbogacone w znaczniki związane z aktywnością wzmacniającą, takie jak acetylacja H3K27 i wiązanie p300 33,34,37. Znaleźliśmy pozytywną korelację między poziomem ekspresji genów a liczbą oddziałujących wzmacniaczy, co sugeruje, że addytywne działanie wzmacniaczy powoduje zwiększenie poziomu ekspresji genów34,35. Po drugie, naturalnie występujące loci ilościowych cech ekspresji (eQTL) są wzbogacone w PIR, które są połączone z tymi samymi genami, na których ekspresję wpływają eQTL35. Po trzecie, integrując dane TRIP57 i PCHi-C, Cairns i in. odkryli, że geny reporterowe TRIP mapujące do PIR w mysich ESC wykazują silniejszą ekspresję genów reporterowych niż geny reporterowe w miejscach integracji w regionach nieoddziałujących z promotorem58, co wskazuje, że PIRR posiadają transkrypcyjną aktywność regulacyjną. Łącznie odkrycia te sugerują, że interaktomy promotorowe odkryte przez PCHi-C w różnych typach komórek mysich i ludzkich obejmują kluczowe moduły regulacyjne do kontroli ekspresji genów.
Warto zauważyć, że wzmacniacze stanowią tylko niewielki ułamek (~20%) wszystkich PIR-ów odkrytych przez PCHi-C33,34. Inne PIR mogą pełnić rolę strukturalną lub topologiczną, a nie bezpośrednie transkrypcyjne funkcje regulacyjne. Istnieją jednak również dowody na to, że PCHi-C może odkrywać elementy DNA o funkcji regulacyjnej, które nie zawierają klasycznych znamion wzmacniacza. W ludzkiej linii komórek limfoidalnych stwierdzono, że promotor BRD7 oddziałuje z regionem pozbawionym śladów wzmacniacza, który okazał się mieć aktywność wzmacniającą w testach genów reporterowych33. Elementy regulacyjne o podobnych cechach mogą być liczniejsze niż obecnie się uważa. Na przykład badanie przesiewowe regulatorowe DNA oparte na CRISPR zidentyfikowało nieoznaczone elementy regulatorowe (URE), które kontrolują ekspresję genów, ale są pozbawione znaczników wzmacniających59.
W innych przypadkach wykazano, że PIR zawierają znaczniki chromatyny związane z represją transkrypcji. PIR i oddziałujące promotory związane przez PRC1 w mysich ESC były zaangażowane w rozległą sieć przestrzenną stłumionych genów noszących represyjny znak H3K27me37. W ludzkich komórkach limfoblastoidalnych odległy element oddziałujący z promotorem BCL6 tłumił ekspresję genu reporterowegotransgenu 33, co sugeruje, że może on działać w celu tłumienia transkrypcji BCL6 w swoim natywnym kontekście.
Innąbrację PIR wzbogaconą o obecność białka izolatora chromatyny CTCF w ludzkich ESC i NEC37 mogą reprezentować jeszcze inną klasę PIR. Podsumowując, wyniki te sugerują, że PIR zawierają zbiór czynności regulacyjnych genów, które nie zostały jeszcze scharakteryzowane funkcjonalnie.

Coraz więcej dowodów sugeruje, że trójwymiarowa organizacja genomu odgrywa ważną rolę funkcjonalną w wielu procesach jądrowych, w tym w aktywacji genów1,2,3, repression4,5,6,7,8, recombination9,10, naprawa DNA11, replikacja DNA12,13, oraz starzenie się komórek14. Odległe wzmacniacze znajdują się w bliskiej odległości przestrzennej od promotorów, które regulują15,16,17, co jest niezbędne do prawidłowej czasoprzestrzennej kontroli ekspresji genów. Delecje wzmacniaczy pokazują, że wzmacniacze dystalne są niezbędne do transkrypcji genu docelowego18,19,20,21,22, a "wymuszona pętla chromatyny" pokazuje, że inżynieryjne wiązanie między wzmacniaczem a jego docelowym promotorem w locus Hbb jest wystarczające do napędzania aktywacji transkrypcji23. Co więcej, rearanżacje genomu, które poddają geny kontroli wzmacniaczy ektopowych, mogą skutkować niewłaściwą aktywacją genów i chorobą24,25,26. Razem te przykłady ilustrują, że interakcje promotor-wzmacniacz są niezbędne do kontroli genów i wymagają ścisłej regulacji w celu zapewnienia odpowiedniej ekspresji genów. Szacuje się, że genomy człowieka i myszy zawierają około miliona wzmacniaczy. W przypadku zdecydowanej większości tych wzmacniaczy geny docelowe są nieznane, a "zasady zaangażowania" między promotorami a wzmacniaczami są słabo poznane. Przypisanie wzmacniaczy transkrypcji do ich genów docelowych pozostaje zatem głównym wyzwaniem w rozszyfrowaniu kontroli ekspresji genów u ssaków.
Nasze rozumienie trójwymiarowej architektury genomu zostało zrewolucjonizowane przez wprowadzenie 3C27 (przechwytywanie konformacji chromosomów) i jego wariantów28,29,30,31. Najpotężniejsza z tych technik, Hi-C (wysokoprzepustowe wychwytywanie konformacji chromosomów), ma na celu identyfikację całego zestawu interakcji chromosomowych w populacji komórek. Biblioteki Hi-C, zwykle generowane z milionów komórek, są bardzo złożone z szacunkową liczbą 1011 niezależnych produktów ligacji między ~4 kb fragmentami w ludzkim genomie32. W związku z tym wiarygodna i odtwarzalna identyfikacja interakcji między poszczególnymi fragmentami restrykcyjnymi (takimi jak te zawierające promotor lub wzmacniacz) na podstawie danych Hi-C nie jest możliwa, chyba że biblioteki Hi-C zostaną poddane ultragłębokiemu sekwencjonowaniu, co nie jest ekonomicznie opłacalnym rozwiązaniem dla laboratoriów rutynowo przygotowujących biblioteki Hi-C. Aby obejść tę wadę, opracowaliśmy Promoter Capture Hi-C, aby specjalnie wzbogacić produkty ligacji zawierające promotor z bibliotek Hi-C. Skupiliśmy się na promotorach z dwóch powodów. Po pierwsze, w licznych badaniach wykazano, że kontakty promotor-wzmacniacz mają kluczowe znaczenie dla prawidłowego poziomu ekspresji genów (patrz odniesienia powyżej), a po drugie, ponieważ promotory są w dużej mierze niezmienne między typami komórek, ten sam system przynęty wychwytującej może być używany do badania obwodów regulacyjnych w wielu typach komórek i warunkach. Nasze podejście opiera się na hybrydyzacji w roztworze bibliotek Hi-C z dziesiątkami tysięcy biotynylowanych RNA 120merów komplementarnych do produktów ligacji Hi-C zawierających promotor, a następnie wychwytywaniu na kulkach magnetycznych pokrytych streptawidyną. Powoduje to, że biblioteki PCHi-C mają znacznie mniejszą złożoność w porównaniu z oryginalną biblioteką Hi-C, koncentrując się tylko na identyfikacji fragmentów, które są ligowane do promotorów przy znacznie wysokich częstotliwościach.
Użyliśmy PCHi-C w wielu typach komórek ludzkich i mysich, aby przyczynić się do lepszego zrozumienia kontroli ekspresji genów, odkrywając obszary oddziałujące z promotorem dystalnym dalekiego zasięgu z domniemaną funkcją regulacyjną, a także nielosowe kontakty promotor-promotor w trójwymiarowej przestrzeni jądra. W ramach badań zmapowano setki tysięcy kontaktów promotora-wzmacniacza w wielu typach komórek33,34,35,36,37,38,39, zidentyfikował organizację przestrzennego genomu za pośrednictwem kompleksu represyjnego Polycomb w embrionalnych komórkach macierzystych myszy7, zademonstrował na dużą skalę przebudowę interaktomów promotorów podczas różnicowania komórkowego37,38,39, i połączył niekodujące warianty sekwencji związane z chorobą z promotorami genów35.
PCHi-C to idealnie dopasowana metoda do mapowania całego genomu sekwencji DNA oddziałujących z promotorami. Pokrewne podejścia, takie jak wychwytywanie Hi-C ciągłych regionów genomu (patrz Dyskusja) są metodą z wyboru w celu uzyskania profili interakcji o wysokiej rozdzielczości dla wybranych regionów genomu. PCHi-C i Capture Hi-C są niezwykle podobne z eksperymentalnego punktu widzenia (jedyną różnicą jest wybór systemu przechwytywania), tak więc porady i wytyczne, które dostarczamy, mają zastosowanie do obu podejść. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy opis PCHi-C. Przedstawiamy uzasadnienie i projekt eksperymentu PCHi-C, przedstawiamy krok po kroku protokół generowania bibliotek PCHi-C i ilustrujemy, w jaki sposób jakość bibliotek PCHi-C może być monitorowana na różnych etapach protokołu w celu uzyskania wysokiej jakości danych.

<table><tbody><tr><td>16% (vol/vol) roztwór paraformaldehydu</td><td>Agar Scientific</td><td>R1026</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) 1x</td><td>Life Technologies</td><td>41965-039</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS) sterylna filtrowana</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>F9665</td><td></td></tr><tr><td>Końcówki do filtrów o niskiej retencji&nbsp;</td><td>Starlab</td><td>S1180-3810, S1180-1810, S1180-8810 i S1182-1830</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS pH 7.4</td><td>Life Technologies</td><td>70011-036</td><td></td></tr><tr><td>Woda klasy biologii molekularnej</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W4502</td><td></td></tr><tr><td>1 M Tris-HCl pH 8.0</td><td>Life Technologies</td><td>15568-025</td><td></td></tr><tr><td>IGEPAL CA-630&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I8896</td><td></td></tr><tr><td>5 M NaCl&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>24740-011</td><td></td></tr><tr><td>Koktajl inhibitorów proteazy (bez EDTA)&nbsp;</td><td>Roche Diagnostics</td><td>11873580001</td><td></td></tr><tr><td>Bufor restrykcyjny 2 (10x NEBuffer 2)</td><td>Probówka New England Biolabs</td><td>B7002</td><td></td></tr><tr><td>DNA LoBind, 1,5 ml&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>0030 108.051</td><td></td></tr><tr><td>Probówka DNA LoBind, 2 ml</td><td>Eppendorf</td><td>30108078</td><td></td></tr><tr><td>20% (wt/vol) SDS&nbsp; &nbsp;</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>161-0418</td><td></td></tr><tr><td>20% (obj./obj.) Triton X-100&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>HindIII, 100 U/uL</td><td>New England Biolabs</td><td>R0104</td><td></td></tr><tr><td>10 mM dCTP&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>18253-013</td><td></td></tr><tr><td>10 mM dGTP</td><td>Life Technologies</td><td>18254-011</td><td></td></tr><tr><td>10 mM dTTP&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>18255-018</td><td></td></tr><tr><td>0,4 mM Biotyna-14-dATP</td><td>Life Technologies</td><td>19524-016</td><td></td></tr><tr><td>Polimeraza DNA I duży fragment (Klenow) 5000 jednostek/ml</td><td>New England Biolabs</td><td>M0210</td><td></td></tr><tr><td>10x bufor reakcyjny ligazy DNA T4&nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>B0202</td><td></td></tr><tr><td>100x 10mg/ml Albumina surowicy bydlęcej&nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>B9001</td><td></td></tr><tr><td>Ligaza DNA T4, 1 U/&mu; L&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>15224-025</td><td></td></tr><tr><td>RNase A&nbsp;</td><td>Roche</td><td>10109142001</td><td></td></tr><tr><td>Proteinaza K, rekombinowana, klasa PCR&nbsp;</td><td>Roche</td><td>3115836001</td><td></td></tr><tr><td>20 000 razy; g 50 ml probówka wirówkowa</td><td>VWR</td><td>525-0156</td><td></td></tr><tr><td>0,5 M EDTA pH 8,0&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>15575-020</td><td></td></tr><tr><td>Fenol pH 8,0&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P4557</td><td></td></tr><tr><td>Fenol: Chloroform: Alkohol izoamylowy 25:24:1&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P3803</td><td></td></tr><tr><td>Octan sodu pH 5,2&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>S7899</td><td></td></tr><tr><td>Quant-iT PicoGreen&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>P7589</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick Zestaw do ekstrakcji żelu</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR Zestaw do oczyszczania</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>Bufor restrykcyjny 2.1 (10x NEBuffer 2.1)</td> <td>New England Biolabs</td><td>B7202</td><td></td></tr><tr><td>NheI, 100U/uL</td><td>New England Biolabs</td><td>R0131</td><td></td></tr><tr><td>Micro TUBE AFA Fiber Pre-slit snap cap 6x16mm fiolki i nbsp;</td><td>Covaris</td><td>520045</td><td>Do sonikacji</td></tr><tr><td>Koraliki SPRI (Agencourt AMPure XP)&nbsp;</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63881</td><td></td></tr><tr><td>Koraliki Dynabeads MyOne Streptavidin C1&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>65001</td><td></td></tr><tr><td>tween 20&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P9416</td><td></td></tr><tr><td>10 mM dATP&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>18252-015</td><td></td></tr><tr><td>Polimeraza DNA T4 3000 jednostek/ml</td><td>New England Biolabs</td><td>M0203</td><td></td></tr><tr><td>T4 PNK 10000 jednostek/ml</td><td>New England Biolabs</td><td>M0201</td><td></td></tr><tr><td>Klenow exo minus 5000 jednostek/ml&nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>M0212</td><td></td></tr><tr><td>Bufor reakcyjny do szybkiej ligacji&nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>B6058</td><td></td></tr><tr><td>NEB DNA Szybka ligaza&nbsp;</td><td>Adapter PE New England Biolabs</td><td>M2200</td><td></td></tr><tr><td>1.0 (5'-P-GATCGGAAGAGCGGTTCAGC AGGAATGCCGAG-3')</td><td>Adapter Illumina</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PE 2.0 (5'-ACACTCTTTCCCTACACGACGCT CTTCCGATCT-3')</td><td>Zestaw Illumina</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NEB Phusion PCR&nbsp;</td><td>Starter do PCR PE New England Biolabs</td><td>M0530</td><td></td></tr><tr><td>1.0 (5'-AATGATACGGCGACCACCGA GATCTACACTCTTTCCCTAC ACGACGCTCTTCCGATCT-3')</td><td>Starter Illumina</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PE PCR 2.0 (5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA GATCGGTCTCGGCATTCCT GCTGAACCGCTCTTCCGATCT-3')&nbsp;</td><td>Paski Illumina</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PCR&nbsp;</td><td>Agilent Technologies</td><td>410022 i 401425</td><td></td></tr><tr><td>SureSelect SSEL TE Reagent ILM PE pełny zestaw adapterów&nbsp;</td><td>Agilent Technologies</td><td>931108</td><td></td></tr><tr><td>SureSelect niestandardowa biblioteka 3-5,9 Mb&nbsp;</td><td>Agilent Technologies</td><td>5190-4831</td><td>niestandardowy system myszy lub ludzkiego PCHi-C</td></tr><tr><td>Dynabeads Koraliki MyOne Streptavidin T1&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>65601</td><td></td></tr><tr><td>E220&nbsp; wysokowydajny skoncentrowany ultradźwięki</td><td>Corvaris</td><td>E220</td><td></td></tr></tbody></table>

motiver capture hi-c: profilowanie interakcji promotorów w całej rozdzielczości i całym genomie

Promoter Capture Hi-C: High-resolution, Genome-wide Profiling of Promoter Interactions

Trójwymiarowa organizacja genomu jest powiązana z jego funkcją. Na przykład elementy regulatorowe, takie jak wzmacniacze transkrypcji, kontrolują czasoprzestrzenną ekspresję docelowych genów poprzez kontakt fizyczny, często pokonując znaczne (w niektórych przypadkach setki kilozasad) odległości genomowe i omijając pobliskie geny. Szacuje się, że ludzki genom zawiera około miliona wzmacniaczy, z których zdecydowana większość ma nieznane cele genowe. Przypisanie dystalnych regionów regulatorowych do genów docelowych ma zatem kluczowe znaczenie dla zrozumienia kontroli ekspresji genów. Opracowaliśmy Promoter Capture Hi-C (PCHi-C), aby umożliwić wykrywanie w całym genomie dystalnych regionów oddziałujących z promotorem (PIR) dla wszystkich promotorów w jednym eksperymencie. W PCHi-C wysoce złożone biblioteki Hi-C są specjalnie wzbogacane o sekwencje promotorowe poprzez selekcję hybrydową w roztworze z tysiącami przynęt biotynylowanych RNA komplementarnych do końców wszystkich fragmentów restrykcyjnych zawierających promotor. Celem jest następnie obniżenie sekwencji promotorowych i ich częstych partnerów interakcji, takich jak wzmacniacze i inne potencjalne elementy regulatorowe. Po wysokoprzepustowym sekwencjonowaniu sparowanych końców do każdego fragmentu restrykcyjnego ligowanego promotorem stosuje się test statystyczny w celu zidentyfikowania istotnych PIR na poziomie fragmentu restrykcyjnego. Użyliśmy PCHi-C do wygenerowania atlasu oddziaływań promotorów dalekiego zasięgu w dziesiątkach typów komórek ludzkich i mysich. Te mapy interaktomu promotora przyczyniły się do lepszego zrozumienia kontroli ekspresji genów u ssaków poprzez przypisanie przypuszczalnych regionów regulatorowych do ich genów docelowych i ujawnienie preferencyjnych przestrzennych sieci interakcji promotor-promotor. Informacje te mają również duże znaczenie dla zrozumienia chorób genetycznych człowieka i identyfikacji potencjalnych genów chorobowych poprzez powiązanie niekodujących wariantów sekwencji związanych z chorobą w sekwencjach kontrolnych lub w ich pobliżu z ich genami docelowymi.

Elementy regulatorowe DNA, takie jak wzmacniacze, kontrolują ekspresję genów poprzez fizyczny kontakt z docelowymi promotorami genów, często poprzez interakcje chromosomowe dalekiego zasięgu obejmujące duże odległości genomowe. Promoter Capture Hi-C (PCHi-C) identyfikuje znaczące interakcje między promotorami a regionami dystalnymi, umożliwiając przypisanie potencjalnych sekwencji regulatorowych do ich docelowych genów.

Motiver Capture Hi-C: Profilowanie interakcji promotorów w całej rozdzielczości i całym genomie

The three-dimensional organization of the genome is linked to its function. For example, regulatory elements such as transcriptional enhancers control the ...

Ponieważ elementy regulatorowe, takie jak wzmacniacze transkrypcji, mogą znajdować się w dużych odległościach genomowych od genów docelowych, które regulują poprzez interakcje chromosomowe dalekiego zasięgu, celem Promoter Capture Hi-C jest połączenie elementów regulatorowych genów z ich genami docelowymi. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie struktury i funkcji genomu, takie jak to, w jaki sposób trójwymiarowa architektura genomu wpływa na kontrolę ekspresji genów. Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala ona na wykrycie znaczących oddziaływań promotora, co stanowi pojedyncze ograniczenie od roztworu.Implikacje tej techniki rozciągają się na terapię, ponieważ może ona łączyć niekodujące warianty sekwencji asocjacyjnej choroby w regulacyjnych sekwencjach kontrolnych lub w ich pobliżu z ich docelowymi genami. Zacznij od co najmniej 20 milionów komórek na eksperyment. W przypadku komórek zawiesinowych zbieraj i odwiruj komórki w temperaturze 400 razy g i 20 stopni Celsjusza przez trzy minuty.Usuń supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 30,625 mililitrach pożywki z 10% FBS w temperaturze pokojowej. Następnie dodaj 4,375 mililitra 16% paraformaldehydu bez metanolu do końcowego stężenia 2%Utrwal komórki przez 10 minut w temperaturze pokojowej, delikatnie mieszając na kołysce. Ugasić reakcję, dodając 5 mililitrów świeżo przygotowanej jednomolowej lodowatej glicyny.Mieszaj przez pięć minut, delikatnie kołysząc w temperaturze pokojowej. Następnie inkubować na lodzie przez 15 minut z okazjonalnym odwracaniem. Następnie odwiruj komórki zawiesiny w temperaturze 760 razy g i czterech stopniach Celsjusza przez pięć minut.Usuń supernatant i ponownie zawieś osad komórkowy w 50 mililitrach lodowatego PBS o pH 7,4. Na koniec odwirować komórki w temperaturze 400 razy g i czterech stopniach Celsjusza przez 10 minut i ostrożnie usunąć supernatant. Po procesie lizy komórek zgodnie z opisem w protokole tekstowym należy przepłukać jądra komórkowe 1,25-krotnym buforem restrykcyjnym 2.W tym celu ponownie zawiesić osad w jednym mililitrze lodowatego buforu i przenieść ponownie zawieszone jądra do 1,5-mililitrowej probówki. Obracaj jądra w temperaturze 760 razy g i czterech stopniach Celsjusza przez pięć minut przed usunięciem supernatantu. Ponownie zawiesić granulat w 1790 mikrolitrach 1,25x bufora ograniczającego 2.Następnie podziel zawiesinę na pięć podwielokrotności, z których każda zawiera od pięciu do 10 milionów jąder komórkowych w 358 mikrolitrach. Dodaj 11 mikrolitrów 10% masy na objętość, SDS na podwielokrotność i wstrząsaj z prędkością 950 obrotów na minutę przez 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza w termomikserze. Jeśli pojawią się grudki komórek, rozdziel je przez pipetowanie, unikając tworzenia pęcherzyków.Następnie dodaj 75 mikrolitrów 10% Triton X-100 na podwielokrotność i wstrząsaj z prędkością 950 obr./min i 37 stopni Celsjusza przez 15 minut w termomikserze. Dodać 12 mikrolitrów po 100 jednostek na mikrolitr HindIII na podwielokrotność. Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc, wstrząsając z prędkością 950 obr./min w termomikserze.Po trawieniu należy przeprowadzić ilościową reakcję PCR zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Następnie dodać 60 mikrolitrów głównej mieszanki biotynylacji na podwielokrotność i wymieszać. Inkubować podwielokrotności w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę, wytrząsając z prędkością 700 obr./min przez pięć sekund co 30 sekund.Po godzinie umieścić porcje na lodzie. Wykonaj bibliotekę Hi-C zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Przenieś od 500 nanogramów do jednego mikrograma biblioteki Hi-C do nowej probówki, a następnie odparuj próbkę na koncentratorze próżniowym do wyschnięcia.Ponownie zawieś odparowaną bibliotekę Hi-C, dodając 3,6 mikrolitra wody klasy biologii molekularnej, 2,5 mikrolitra blokera 1, 2,5 mikrolitra blokera 2 i 0,6 mikrolitra niestandardowego blokera. Przenieść próbkę do dołka z nowym paskiem probówki do PCR, zamknąć ją paskiem z nasadką do PCR i umieścić próbkę na lodzie. Oznacz studzienkę jako D dla DNA Hi-C.Przygotuj bufor hybrydyzacyjny zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Inkubować bufor w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez pięć minut w termomikserze. Przenieść bufor do studzienki z nowym paskiem probówki do PCR, zamknąć go paskiem z nasadką do PCR i przechowywać w temperaturze pokojowej.Oznacz studzienkę jako H dla buforu hybrydyzacyjnego. Do studzienki nowej probówki PCR wymieszaj pięć mikrolitrów 100 nanogramów na mikrolitr biotynylowanych sond RNA, 0,5 mikrolitra inhibitora RNazy SRNazy B i 1,5 mikrolitra wody klasy biologii molekularnej. Zamknij pasek probówki do PCR paskiem z nakrętką do PCR i umieść na lodzie.Oznacz probówkę jako R dla RNA. Skonfiguruj maszynę do PCR zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Postępuj tak szybko, jak to możliwe podczas wszystkich procedur, gdy maszyna do PCR jest uruchomiona, aby uniknąć parowania próbki.Umieść pasek probówki D PCR w maszynie do PCR, zamknij pokrywę maszyny do PCR i rozpocznij reakcję PCR. Gdy program PCR osiągnie 65 stopni Celsjusza, otwórz pokrywę maszyny do PCR i umieść pasek probówki H PCR w maszynie do PCR. Zamknij pokrywę maszyny do PCR i inkubuj przez trzy minuty.Następnie otwórz pokrywę maszyny do PCR, umieść pasek probówki R PCR w maszynie do PCR i zamknij maszynę do PCR. Po dwóch minutach otwórz pokrywę maszyny do PCR i wszystkie paski probówki do PCR. Przenieść 13 mikrolitrów studzienki H do studzienki R, a następnie całą objętość studzienki D do studzienki R. Pipetować trzy razy w górę iw dół, aby wymieszać reakcję i zamknąć pasek probówki PCR.Usuń paski probówki H i D do PCR i zamknij pokrywę maszyny do PCR. Inkubować reakcję w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez 24 godziny. Dodaj 60 mikrolitrów kulek magnetycznych sprzężonych ze streptawidyną do nowej probówki.Umieść probówkę na stojaku do separacji magnetycznej na jedną minutę przed wyjęciem supernatantu. Ponownie zawiesić kulki za pomocą 200 mikrolitrów 1x bufora wiążącego i obracać przez trzy minuty w temperaturze pokojowej i 15 obr./min na obracającym się kole. Delikatnie obracaj probówkę w wirówce stołowej przez dwie do trzech sekund, aby pobrać próbkę.Po umieszczeniu probówki na stojaku do separacji magnetycznej na trzy minuty należy usunąć supernatant. Powtórz to pranie dwukrotnie. Następnie ponownie zawiesić kulki w 200 mikrolitrach 1x bufora wiążącego.Otwórz maszynę do PCR i pasek probówki PCR, gdy program PCR jest nadal uruchomiony i przenieś reakcję hybrydyzacji do probówki z kulkami magnetycznymi. Inkubować reakcję i kulki w temperaturze pokojowej przez 30 minut na obracającym się kole przy trzech obr./min. Odzyskaj kulki na stojaku do separacji magnetycznej i usuń przezroczysty supernatant.Po ponownym zawieszeniu kulek w 500 mikrolitrach buforu do płukania 1 inkubować próbkę przez 15 minut w temperaturze 20 stopni Celsjusza, wstrząsając z prędkością 950 obr./min w termomikserze. Ponownie odzyskaj koraliki i usuń przezroczysty supernatant. Teraz ponownie zawieś kulki w 500 mikrolitrach buforu do mycia 2 i wymieszaj.Inkubować próbkę przez 10 minut w temperaturze 65 stopni Celsjusza, wstrząsając z prędkością 950 obr./min w termomikserze. Powtórz to pranie z buforem do płukania 2 jeszcze dwa razy. Następnie umieść próbkę na stojaku do separacji magnetycznej, usuń przezroczysty supernatant i ponownie zawieś kulki w 200 mikrolitrach 1x buforu restrykcyjnego 2.Po odzyskaniu kulek i ponownym usunięciu supernatantu, ponownie zawiesić kulki w 30 mikrolitrach 1x bufora restrykcyjnego 2. Rysunek ten przedstawia profil interakcji Hi-C wychwytu promotora dla promotora IL8 w 17 typach ludzkich komórek krwiotwórczych. Interakcje promotorowe typów komórek limfoidalnych są pokazane jako fioletowe łuki, a przerwy promotorowe typów komórek szpikowych są pokazane jako niebieskie łuki.Interakcje specyficzne dla monocytów są oznaczone zielonymi strzałkami, interakcje specyficzne dla neutrofili są oznaczone czerwonymi strzałkami, a interakcja specyficzna dla megakariocytów jest oznaczona brązową strzałką. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o tym, aby pracować tak precyzyjnie, jak to tylko możliwe. Nie jest to magia, ale jest to długi protokół, więc małe błędy będą się sumować, aby ostatecznie negatywnie wpłynąć na jakość danych.Zgodnie z tą procedurą można zastosować inne metody, takie jak edycja epigenomu genomore CRISPR/Cas9 w celu zbadania biologicznej funkcji regionów oddziałujących z promotorem, odkrytych przez promotor Capture Hi-C. Mamy nadzieję, że po obejrzeniu tego filmu dobrze zrozumiesz, jak wdrożyć promotor Capture Hi-C w swoim laboratorium.

promoter-capture-hi-c-high-resolution-genome-wide-profiling-promoter

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

Metoda Hi-C umożliwia bezstronną, genomową identyfikację oddziaływań chromatyny (1). Hi-C łączy ligację bliskościową z sekwencjonowaniem masowo równoległym. Wynikowe dane mogą być wykorzystane do badania architektury genomowej w wielu skalach: wstępne wyniki pozwoliły zidentyfikować takie cechy jak terytoria chromosomowe, segregacja chromatyny otwartej i zamkniętej oraz struktura chromatyny w skali megabazy.

Hi-C: Metoda badania trójwymiarowej architektury genomów.

Tutaj opisujemy zoptymalizowany protokół sekwencjonowania ChIP o wysokiej przepustowości oraz potok analiz obliczeniowych do określania wzorców stanu chromatyny w całym genomie z zamrożonych tkanek nowotworowych i linii komórkowych.

Zintegrowana platforma do mapowania stanów chromatyny w całym genomie przy użyciu wysokoprzepustowego sekwencjonowania ChIP w tkankach nowotworowych

To jest metoda identyfikacji nowych białek oddziałujących z DNA w określonych docelowych loci, polegająca na specyficznym dla sekwencji wychwytywaniu usieciowanej chromatyny do kolejnych analiz proteomicznych. Nie jest wymagana żadna wcześniejsza wiedza na temat potencjalnych białek wiążących ani modyfikacji komórek. Początkowo opracowana dla drożdży, technologia została obecnie zaadaptowana do komórek ssaków.

Adaptacja wychwytywania hybrydyzacji białek związanych z chromatyną do proteomiki komórek ssaków

Identyfikacja fizycznych interakcji między genami a elementami regulatorowymi jest trudna, ale została ułatwiona dzięki metodom wychwytywania konformacji chromosomów. Ta modyfikacja protokołu 4C-seq łagodzi stronniczość PCR, minimalizując nadmierną amplifikację matryc PCR i maksymalizując mapowalność odczytów poprzez włączenie etapu trawienia enzymu ograniczającego dodawanie.

Wysokoprzepustowa identyfikacja sekwencji regulatorowych genów przy użyciu sekwencjonowania nowej generacji wychwytywania konformacji chromosomów kołowych (4C-seq)

Informujemy o zastosowaniu ilościowego wychwytywania konformacji chromosomów, a następnie sekwencjonowania wysokoprzepustowego w ciałach embrionalnych generowanych z embrionalnych komórek macierzystych. Technika ta pozwala na identyfikację i ilościowe określenie kontaktów między domniemanymi wzmacniaczami a regionami promotorowymi danego genu podczas różnicowania embrionalnych komórek macierzystych.

Identyfikacja kontaktów wzmacniacz-promotor w ciałach embrionalnych poprzez ilościowe wychwytywanie konformacji chromosomów (4C)

Ten protokół opisuje metodę Capture Hi-C używaną do charakteryzowania organizacji 3D docelowych regionów genomowych o rozmiarach mega w wysokiej rozdzielczości, w tym granic topologicznie asojacujących domen (TADs) i interakcji chromatyny dalekiego zasięgu między regulatorowymi i innymi elementami sekwencji DNA.

Rozszyfrowywanie organizacji chromatyny 3D w wysokiej rozdzielczości za pomocą Capture Hi-C

ATAC-seq to metoda sekwencjonowania DNA, która wykorzystuje nadpobudliwą zmutowaną transpozazę, Tn5, do mapowania zmian w dostępności chromatyny, w których pośredniczą czynniki transkrypcyjne. ATAC-seq umożliwia odkrycie mechanizmów molekularnych leżących u podstaw zmian fenotypowych w komórkach nowotworowych. Protokół ten określa procedury optymalizacyjne dla sekwencji ATAC w typach komórek nabłonkowych, w tym komórkach nowotworowych.

Optymalizacja ATAC-Seq do badań epigenetycznych nowotworów

Ekspresja genów jest regulowana przez interakcje promotorów genów z dystalnymi elementami regulatorowymi. W tym miejscu opisujemy, w jaki sposób niski poziom wejściowy Capture Hi-C (liCHi-C) pozwala na identyfikację tych interakcji w rzadkich typach komórek, które wcześniej były niemierzalne.

Zintegrowany proces pracy do badania architektury genomu czasoprzestrzennego skoncentrowanej na promotorze w rzadkich populacjach komórek

Przedstawiamy niewymagający kodowania przepływ pracy dla biologów w celu identyfikacji specyficznych tkankowo wzmacniaczy genów przy użyciu wyłącznie narzędzi opartych na przeglądarce. Nasz protokół wykorzystuje publiczne znaczniki histonowe H3K4me1/H3K27ac i dane Hi-C, umożliwiając naukowcom bez doświadczenia w programowaniu dostęp, analizę i identyfikację potencjalnych elementów regulacyjnych związanych z ich interesującymi genami.

Internetowy przepływ pracy do wyboru wzmacniaczy specyficznych dla genów i tkanek

Protokół ten zapewnia uproszczony proces obliczeniowy do ilościowej identyfikacji początkujących transkrypcji wzmacniaczy. Integrując dostępność chromatyny, cechy chromatyny oraz dane transkrypcyjne, umożliwia dokładne wykrywanie i analizę aktywności wzmacniacza specyficzną dla nici w złożonych regionach intragenowych, pozostając jednocześnie dostępnym dla badaczy bez rozległego szkolenia bioinformatycznego.

Tok obliczeniowy do ilościowej identyfikacji RNA intergenowego/wewnątrzgenowego w embrionalnych komórkach macierzystych myszy

Poznaj metodę Promoter Capture Hi-C do profilowania interakcji promotorów w całym genomie. Technika ta pozwala łączyć elementy regulacyjne z genami docelowymi, ujawniając trójwymiarową organizację chromatyny.

Motiver Capture Hi-C: Profilowanie interakcji promotorów w całej rozdzielczości i całym genomie

Przeglądaj więcej filmów