Name: Izolacja pierwotnych ludzkich komórek liściastych z błon płodowych łożysk donoszonych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-30T14:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 37 s
Description: Poznaj metodę izolacji pierwotnych ludzkich komórek liściastych z błon płodowych łożysk donoszonych. Technika ta umożliwia badania nad implantacją blastocysty i patologiami ciąży.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować darczyńcom, RCWIH BioBank oraz Mount Sinai Hospital/UHN Department of Obstetrics and Gynaecology za próbki ludzkie użyte w tym badaniu. Chcielibyśmy podziękować członkom laboratorium Lye, a w szczególności dr Caroline Dunk za pomoc w opracowaniu metody. Praca ta jest wspierana przez Burroughs Welcome Fund (grant #1013759).

Łożek pobrano od zdrowych kobiet w pełnym terminie ciąży, niebędących w fazie akcji porodowej, poddawanych planowemu cięciu cesarskiemu. Pobieranie, przetwarzanie i utylizacja próbek ludzkich odbywają się zgodnie z wytycznymi komisji etycznej Mount Sinai Hospital. Od każdej pacjentki uzyskano pisemną zgodę. Badanie zostało zatwierdzone przez Komisję Etyki Badań w Mount Sinai Hospital.
1. Przygotowania
UWAGA: Wszystkie etapy muszą być przeprowadzane w dygestorium, a cały sprzęt chirurgiczny musi zostać wysterylizowany w autoklawie przed umieszczeniem w dygestorium. Wszystkie pozostałe materiały (butelki, probówki 50 mL itp.) muszą być wysterylizowane 70% roztworem etanolu. Podczas pracy z odpadami biologicznymi należy przez cały czas używać środków ochrony osobistej (fartucha laboratoryjnego, rękawiczek, związanych długich włosów itp.).
<ol>
	<li>Roztwór do trawienia enzymatycznego (Roztwór końcowy: 200 mL)
	<ol>
		<li>Odmierz pipetą 180 mL HBSS-/- do zlewki o pojemności 500 mL, dodaj sterylny magnes mieszający i ustaw na mieszadle w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Odważ i dodaj powoli oraz sekwencyjnie do roztworu HBSS-/- następujące składniki: 20 mL FBS, 400 mg kolagenazy 2 ([stężenie końcowe] = 2 mg/mL), 20 mg inhibitora trypsyny z soi ([stężenie końcowe] = 0,1 mg/mL), 30 mg DNazy 1 ([stężenie końcowe] = 0,15 mg/mL) oraz 200 mg BSA ([stężenie końcowe] = 1 mg/mL).</li>
		<li>Ustaw mieszanie na średnią prędkość i pozostaw mieszaninę do mieszania przez 10-20 min (podczas mieszania przykryć folią aluminiową lub folią parafinową).</li>
		<li>Przelej wymieszany roztwór do szklanej butelki o pojemności 250 mL za pomocą plastikowego lejka i umieść w dygestorium.</li>
		<li>Przefiltruj roztwór przez jednostkę filtracyjną z plastikową górną częścią (filtr membranowy 0,22 μm, 500 mL), rozlej po 20 mL do probówek o pojemności 50 mL (łącznie 10 probówek) i przechowuj w temperaturze -20 °C do momentu użycia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pożywka RPMI 1640 (2% roztwór do płukania i 10% kompletna pożywka wzrostowa)
	<ol>
		<li>Połącz RPMI 1640 i FBS w szklanej butelce w dygestorium.</li>
		<li>W przypadku roztworu 2% FBS połącz 490 mL RPMI 1640 i 10 mL FBS.</li>
		<li>W przypadku roztworu 10% FBS połącz 450 mL RPMI 1640 i 50 mL FBS.</li>
		<li>Odmierz pipetą 500 μL normocyny do szklanej butelki o pojemności 500 mL z poprzedniego kroku zawierającej pożywkę RPMI i FBS (stok 50 mg/mL, stężenie robocze 0,05 mg/mL).</li>
		<li>Przefiltruj pożywkę przez filtr membranowy 0,22 μm i przechowuj w szklanej butelce o pojemności 500 mL w temperaturze 4 °C do momentu użycia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Na 30 min przed rozpoczęciem eksperymentu umieść 20 mL zamrożonego roztworu do trawienia enzymatycznego w łaźni z kuleczkami w temperaturze 37 °C, umieść pożywki RPMI 1640 z 2% FBS i 10% FBS w łaźni z kuleczkami w temperaturze 37 °C, włącz kołyszącą łaźnię wodną i ustaw ją na 37 °C, 2 g, a wirówkę z kontrolą temperatury ustaw na 4 °C.</li>
</ol>
2. Pobieranie tkanki decydualnej z błon płodowych w terminie porodu
<ol>
	<li>Umieścić butelki z HBSS+/+, HBSS-/- oraz pięć probówek 50 mL w statywie pod dygestorium. Do jednej probówki pipetować 25 mL HBSS+/+.</li>
	<li>Używając dłoni w rękawiczkach, wyjąć łożysko dojrzałe z pojemnika użytego do jego transportu z bloku operacyjnego. Położyć łożysko na podkładzie chłonnym (stroną maciczną do góry) i rozłożyć błony płodowe za pomocą nożyczek i pęsety.
	<ol>
		<li>Rozłożyć na dygestorium kilka nakładających się na siebie podkładów chłonnych.</li>
		<li>Użyć osobnego podkładu, aby obrócić łożysko tak, aby strona maciczna była skierowana do góry.</li>
		<li>Zlokalizować miejsce pęknięcia błon i wykonać nacięcia, aby umożliwić rozłożenie błony i jej płaskie ułożenie na powierzchni dygestorium. 
		UWAGA: Po odciągnięciu błony od łożyska, decidua będzie skierowana stroną górną, spoczywając na warstwie chorionu, z warstwą amnionu z tyłu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Używając plastikowej skrobaczki do komórek, ostrożnie zeskrobać tkankę deciduy z chorionu i umieścić ją w probówce 50 mL zawierającej 25 mL HBSS+/+.</li>
	<li>Szkrobać błonę z umiarkowanym naciskiem. Nie należy stosować zbyt silnego nacisku, ponieważ może to doprowadzić do zanieczyszczenia chorionem. Należy zebrać również małe skrzepy krwi, ponieważ zawierają one komórki deciduy. 
	Uwaga: Po pobraniu deciduy, łożysko należy zapakować do plastikowego pojemnika na odpady biologiczne i zamrozić w zamrażarce -20 °C przed odpowiednią utylizacją (zgodnie z zasadami instytucjonalnymi). Zakrwawione podkłady chłonne należy zawinąć w szczelny worek plastikowy i wyrzucić do pojemnika na odpady niebezpieczne biologicznie.</li>
</ol>
3. Płukanie i trawienie enzymatyczne tkanki decydualnej
<ol>
	<li>Przemyj zebrane tkanki, delikatnie potrząsając ręcznie probówką 50 mL i przepuszczając zawartość przez metalowe sito o oczkach 250 μm (250 μm, rozmiar 60 mesh) umieszczone nad sterylnym pojemnikiem na próbki (na mocz).</li>
	<li>Powtórz płukanie dwukrotnie za pomocą HBSS+/+ oraz dwukrotnie za pomocą HBSS-/-, używając nowych probówek do każdego płukania. (końcowe płukanie HBSS-/- umożliwia usunięcie wapnia i magnezu obecnych w HBSS+/+, które w przeciwnym razie zakłócałyby następujący proces trawienia enzymatycznego). 
	UWAGA: Podczas etapów płukania zanieczyszczenie tkanką błony kosmicznej będzie widoczne, ponieważ tkanka decydualna ma jasnoróżowy kolor i strukturę amorficzną, podczas gdy błona kosmiczna jest biała, gęsta i włóknista. W związku z tym zanieczyszczenia błoną kosmiczną można łatwo usunąć pęsetą.</li>
	<li>Opcjonalnie, jeśli tkanka decydualna jest gruba, przenieś ją do sterylnej szalki Petriego o średnicy 10 cm i przystąp do posiekania tkanki w szalce za pomocą dwóch przeciwstawnych skalpeli.</li>
	<li>Umieść przemyte tkanki w sterylnej probówce 50 mL zawierającej 100 mg tkanki/mL roztworu do trawienia enzymatycznego (patrz: Preparaty).
	<ol>
		<li>Jako punkt odniesienia upewnij się, że poziom tkanki decydualnej sięga oznaczenia 5-10 mL na probówce 50 mL.</li>
		<li>Użyj około 20 mL roztworu do trawienia enzymatycznego (przygotowanego w kroku 1.1), aby strawić całą decyduę zebraną z pełnej błony płodowej w terminie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Uszczelnij korek probówki folią parafinową (szczelnie zamknij probówkę i owiń folią parafinową korek oraz górną część probówki) pod dygestorium i inkubuj tkankę decydualną w temperaturze 37 °C przez 20 min w wytrząsającej kąpieli wodnej (145 rpm, 2 g).</li>
	<li>Po inkubacji usuń folię parafinową, zdezynfekuj powierzchnię probówki z strawioną tkanką 70% etanolem i przenieś ją pod wyciąg. Krótko potrząśnij probówką ręcznie.</li>
	<li>Zbierz zawiesinę komórkową przez metalowe sito (250 μm, rozmiar 60 mesh) do nowego sterylnego pojemnika na próbki. Rozcieńcz równą objętością (20 mL) pożywki RPMI + 10% FBS zawierającej 0,1% normocyny, aby zatrzymać reakcję enzymatyczną. Przejdź bezpośrednio do etapu centryfugacji 4.1.</li>
	<li>W razie potrzeby umieść pozostałą niestrawioną tkankę z powrotem w nowej probówce 50 mL z 20 mL świeżego roztworu do trawienia enzymatycznego i powtórz trawienie (20 min, 37 °C, wytrząsająca kąpiel wodna).</li>
	<li>Jeśli drugie trawienie jest konieczne, umieść pierwszą probówkę z zawiesiną komórkową na lodzie (przykryj folią parafinową, aby zachować sterylność). Powtórz kroki 3.5-3.6 i połącz obie zawiesiny komórkowe.</li>
</ol>
4. Przygotowanie zawiesiny pojedynczych komórek
<ol>
	<li>Odwirować zawiesinę komórkową (420 g, 4 °C, 11 min).</li>
	<li>Usunąć nadsącz i zawiesić komórki ponownie w 40 mL pożywki RPMI + 2% FBS zawierającej 0,1% normocyny („bufor piorący”). 
	UWAGA: Osad komórkowy będzie luźny i galaretowaty z powodu zanieczyszczenia erytrocytami; nadsącz należy aspirować ostrożnie. Może być konieczne usunięcie górnej fazy za pomocą pipety manualnej.</li>
	<li>Powtórzyć wirowanie przy 420 g w temperaturze 4 °C przez 11 min.</li>
	<li>Ostrożnie usunąć nadsącz (zgodnie z uwagą do kroku 4.2) i zawiesić osad komórkowy ponownie w 5 mL buforu piorącego, a następnie dodać do tej samej probówki 35 mL buforu do lizy erytrocytów. 
	UWAGA: Jeśli osad jest duży lub silnie zanieczyszczony krwią, można go rozdzielić do dwóch probówek na etap lizy erytrocytów, dodając 10 mL buforu piorącego i dzieląc zawiesinę równo pomiędzy dwie probówki, a następnie dodając do każdej z nich 35 mL buforu do lizy erytrocytów.</li>
	<li>Inkubować na lodzie przez 20 min. Krótko wymieszać zawartość probówki(wek) w vorteksie na początku i na końcu inkubacji w celu lizy erytrocytów.</li>
	<li>Odwirować przy 420 g przez 11 min w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Ostrożnie usunąć nadsącz i zawiesić osad ponownie w 40 mL buforu piorącego.</li>
	<li>Przepuścić komórki przez filtr nylonowy 70 μm w celu usunięcia agregatów komórkowych.</li>
	<li>Odwirować przy 420 g przez 11 min w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Usunąć nadsącz i zawiesić osad komórkowy ponownie w 10 mL pożywki kompletnej (RPMI 10% + FBS zawierającej 0,1% normocyny).</li>
	<li>Policzyć komórki przy użyciu hemocytometru i metody wykluczania barwnika trypan blue, zgodnie z poniższym opisem:
	<ol>
		<li>W komorze z laminarem ostrożnie pipetować zawiesinę komórkową w górę i w dół 3 razy w celu dokładnego wymieszania przed połączeniem z trypan blue. W probówce 1,5 mL przygotować zawiesinę komórkową rozcieńczoną 1:2 (połączyć 20 μL roztworu trypan blue i 20 μL zawiesiny komórek błony śluzowej macicy). Ostrożnie wymieszać roztwór trypan blue z komórkami, pipetując w górę i w dół kilka razy (roztwór ten nie jest sterylny).</li>
		<li>Umieścić hemocytometr na stoliku mikroskopu z nałożonym szkiełkiem nakrywkowym. 
		UWAGA: Hemocytometr to szkiełko mikroskopowe z naniesioną siatką tworzącą dziewięć dużych kwadratów oddzielonych potrójnymi liniami. Każdy duży kwadrat ma powierzchnię 1 mm2, a głębokość komory wynosi 0,1 mm. Zatem objętość cieczy, która może wypełnić każdy duży kwadrat, to 1 mm*1 mm*0,1 mm = 0,1 mm3 = 10-4 mL.</li>
		<li>Powoli dodać 10 μL mieszaniny trypan blue i komórek do szczeliny hemocytometru, pozwalając siłom kapilarnym rozprzestrzenić mieszaninę komórkową na całe szkiełko (zatrzymać przed całkowitym wypełnieniem wgłębienia).</li>
		<li>Obejrzeć komórki pod mikroskopem (powiększenie 10X) i policzyć wszystkie białe/zielone komórki, które wykluczają trypan blue (są to komórki żywe), w czterech dużych zewnętrznych kwadratach hemocytometru. Podczas liczenia komórek dotykających linii, liczyć tylko te, które dotykają prawej i górnej linii, pomijając te dotykające lewej i dolnej linii. Nie liczyć komórek ciemnoniebieskich; niebieski kolor wskazuje, że komórka jest martwa, ponieważ barwnik trypan blue może łatwo przenikać przez błonę plazmatyczną do cytoplazmy.</li>
		<li>Aby obliczyć liczbę żywych komórek w 1 mL zawiesiny komórkowej (X): 
		<img alt="Wzór na liczenie komórek, X = (całkowita liczba komórek/4) × 2 × 10 000; równanie matematyczne." src="/files/ftp_upload/57443/57443eq1v2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie"> 
		2 = czynnik rozcieńczenia 
		10 000 = współczynnik konwersji (1 mL = 1 cm3 = 10 000*0,1 mm3)</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Rozcieńczyć komórki błony śluzowej macicy do pożądanego stężenia końcowego w pożywce RPMI + 10% FBS (pożywka wzrostowa). 
	UWAGA: W przypadku wysiewu do hodowli tkankowej, nanieść do plastikowej płytki 6-dołkowej 2*106 komórek/dołek, do plastikowej płytki 10-cm 10*106 komórek lub na szkiełko nakrywkowe 75 000 komórek.</li>
</ol>

<ol><li>Brosens, N., Hayashi, N., White, J. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progesterone+receptor+regulates+decidual+prolactin+expression+in+differentiating+human+endometrial+stromal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Progesterone receptor regulates decidual prolactin expression in differentiating human endometrial stromal cells.</a> Endocrinology. 140, 4809-4820 (1999).</li>
<li>Bell, S. C., D'Arcangues, C., Frase, I. S., Newton, J. R., Odlind, V. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBell%2C+SC+%22Decidualization+and+relevance+to+menstruation%22">Decidualization and relevance to menstruation</a>. , Cambridge University press. 187-212 (1990).</li>
<li>Kariya, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-1+inhibits+in+vitro+decidualization+of+human+endometrial+stromal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Endocrinology+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Interleukin-1 inhibits in vitro decidualization of human endometrial stromal cells.</a> Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 73, 1170-1174 (1991).</li>
<li>Dimitriadis, E., Robb, L., Salamonsen, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin+11+advances+progesterone-induced+decidualization+of+human+endometrial+stromal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Interleukin 11 advances progesterone-induced decidualization of human endometrial stromal cells.</a> Molecular and Human Reproduction. 8, 636-643 (2002).</li>
<li>Wu, W. -X., Brooks, J., Glasier, A. F., McNeilly, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+relationship+between+decidualization+and+prolactin+mRNA+and+production+at+different+stages+of+human+pregnancy%5BTitle%5D)+AND+%22Society+for+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">The relationship between decidualization and prolactin mRNA and production at different stages of human pregnancy.</a> Society for Endocrinology. 14, 255-261 (1995).</li>
<li>Bell, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+and+secretion+of+protein+by+the+endometrium+and+decidua%5BTitle%5D)+AND+%22Implantation%3A+Biology+and+Clinical+Aspects%22%5BJournal%5D)">Synthesis and secretion of protein by the endometrium and decidua.</a> Implantation: Biology and Clinical Aspects. , 95-118 (1988).</li>
<li>Croy, B. A., Chantakru, S., Esadeg, S., Ashkar, A. A., Wei, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decidual+natural+killer+cells%3A+key+regulators+of+placental+development%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Reproductive+Immunology%22%5BJournal%5D)">Decidual natural killer cells: key regulators of placental development.</a> Journal of Reproductive Immunology. 57, 151-168 (2002).</li>
<li>Smarason, A. K., Gunnarsson, A., Alfredsson, J. H., Valdimarsson, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monocytosis+and+monocytic+infiltration+of+decidua+in+early+pregnancy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+and+Laboratory+Immunology%22%5BJournal%5D)">Monocytosis and monocytic infiltration of decidua in early pregnancy.</a> Journal of Clinical and Laboratory Immunology. 21, 1-5 (1986).</li>
<li>Daiter, E., Pampfer, S., Yeung, Y. G., Barad, D., Stanley, E. R., Pollard, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+colony-+stimulating+factor-1+in+the+human+uterus+and+placenta%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Endocrinology+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Expression of colony- stimulating factor-1 in the human uterus and placenta.</a> Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 74, 850-858 (1992).</li>
<li>Casey, M. L., Cox, S. M., Beutler, B., Milewich, L., MacDonald, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cachectin%2Ftumor+necrosis+factor-alpha+formation+in+human+decidua.+Potential+role+of+cytokines+in+infection-induced+preterm+labor%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Cachectin/tumor necrosis factor-alpha formation in human decidua. Potential role of cytokines in infection-induced preterm labor.</a> Journal of Clinical Investigation. 83, 430-436 (1989).</li>
<li>Lala, P. K., Kennedy, T. G., Parhar, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+of+lymphocyte+alloreactivity+by+early+gestational+human+decidua.+II.+Characterization+of+the+suppressor+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Immunology%22%5BJournal%5D)">Suppression of lymphocyte alloreactivity by early gestational human decidua. II. Characterization of the suppressor mechanisms.</a> Cellular Immunology. 127, 368-381 (1988).</li>
<li>Shynlova, O., Nedd-Roderique, T., Li, Y., Dorogin, A., Nguyen, T., Lye, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infiltration+of+myeloid+cells+into+decidua+is+a+critical+early+event+in+the+labour+cascade+and+post-partum+uterine+remodelling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+and+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Infiltration of myeloid cells into decidua is a critical early event in the labour cascade and post-partum uterine remodelling.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 17, 311-324 (2013).</li>
<li>Osman, I., Young, A., Ledingham, M. A., Thomson, A. J., Jordan, F., Greer, I. A., Norman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukocyte+density+and+pro-inflammatory+cytokine+expression+in+human+fetal+membranes%2C+decidua%2C+cervix+and+myometrium+before+and+during+labour+at+term%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Leukocyte density and pro-inflammatory cytokine expression in human fetal membranes, decidua, cervix and myometrium before and during labour at term.</a> Molecular Human Reproduction. 9, 41-45 (2003).</li>
<li>Farine, T., Lye, S. J., Shynlova, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+maternal+leukocytes+are+activated+in+response+to+cytokines+secreted+by+uterine+tissues+of+pregnant+women%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+and+Molecular+Immunology%22%5BJournal%5D)">Peripheral maternal leukocytes are activated in response to cytokines secreted by uterine tissues of pregnant women.</a> Journal of Cellular and Molecular Immunology. 14, 635-638 (2017).</li>
<li>Hamilton, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophages+infiltrate+the+human+and+rat+decidua+during+term+and+preterm+labor%3A+evidence+that+decidual+inflammation+precedes+labor%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Macrophages infiltrate the human and rat decidua during term and preterm labor: evidence that decidual inflammation precedes labor.</a> Biology of Reproduction. 86, 39(2011).</li>
<li>Casey, M. L., Cox, S. M., Word, A., Macdonald, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokines+and+infection-induced+preterm+labour%5BTitle%5D)+AND+%22Reprodution+Fertility+and+Development%22%5BJournal%5D)">Cytokines and infection-induced preterm labour.</a> Reprodution Fertility and Development. 2, 499-510 (1990).</li>
<li>Yellon, S. M., Mackler, A. M., Kirby, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+leukocyte+traffic+and+activation+in+parturition%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Society+for+Gynecologic+Investigation%22%5BJournal%5D)">The role of leukocyte traffic and activation in parturition.</a> Journal of the Society for Gynecologic Investigation. 10, 323-338 (2003).</li>
<li>Gomez-Lopez, N., StLouis, D., Lehr, M. S., Sanchez-Rodriguez, E. N., Arenas-Hernandez, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+cells+in+term+and+preterm+labor%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+%26+Molecular+Immunology%22%5BJournal%5D)">Immune cells in term and preterm labor.</a> Cellular & Molecular Immunology. 11, 571-581 (2014).</li>
<li>Xu, Y., Plazyo, O., Romero, R., Hassan, S. S., Gomez-Lopez, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+leukocytes+from+the+human+maternal-fetal+interface%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation of leukocytes from the human maternal-fetal interface.</a> Journal of Visualized Experiments. 99, (2015).</li>
<li>Trundley, T., Gardner, L., Northfield, J., Moffett, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+isolation+of+cells+from+the+human+fetal-maternal+interface%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Methods for isolation of cells from the human fetal-maternal interface.</a> Methods in Molecular Medicine. 122, 109-122 (2006).</li>
<li>Jividen, K., Movassagh, M. J., Jazaeri, A., Li, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+methods+for+establishing+primary+human+endometrial+stromal+cells+from+hysterectomy+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+experiments%22%5BJournal%5D)">Two methods for establishing primary human endometrial stromal cells from hysterectomy specimens.</a> Journal of Visualized experiments. 87, (2014).</li>
<li>Pelekanos, R. A., Sardesai, V. S., Futrega, K., Lott, W. B., Kuhn, M., Doran, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+expansion+of+mesenchymal+stem%2Fstromal+cells+derived+from+human+placenta+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation and expansion of mesenchymal stem/stromal cells derived from human placenta tissue.</a> Journal of Visualized experiments. 112, (2016).</li>
<li>De Clercq, K., Hennes, A., Vrien, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+mouse+endometrial+epithelial+and+stromal+cells+for+in+vitro+decidualization%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation of mouse endometrial epithelial and stromal cells for in vitro decidualization.</a> Journal of Visualized Experiments. 121, (2017).</li>
<li>Zhang, J., Shynlova, O., Sabras, S., Bang, A., Briollais, L., Lye, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunophenotyping+and+activation+status+of+maternal+and+peripheral+blood+leukocytes+during+pregnancy+and+labour%2C+both+term+and+preterm%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+and+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Immunophenotyping and activation status of maternal and peripheral blood leukocytes during pregnancy and labour, both term and preterm.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 10, 2386-2402 (2017).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia

Opisany tutaj protokół demonstruje efektywną kosztowo i czasowo metodę izolowania pierwotnych komórek liściastych pobranych z błon płodowych całych ludzkich łożysk donoszonych, która jest wysoce dostępna i prosta. Powodzenie tego protokołu zależy od dwóch krytycznych czynników: (1) skuteczności zeskrobywania dziesiętnych z warstwy kosmówkowej błon płodowych oraz (2) staranności, z jaką komórki dziesiętne są traktowane przez cały protokół. Ważne jest, aby zanieczyszczenie tkanki kosmówki było kontrolowane poprzez zapewnie...

Endometrium, jedna z najbardziej aktywnych tkanek dorosłej kobiety, ulega dramatycznej przebudowie każdego cyklu menstruacyjnego w odpowiedzi na stymulację przez hormony jajnikowe, estrogen (E2) i progesteron (P4). Decidua, znana również jako endometrium w ciąży, jest krytycznie ważną tkanką rozrodczą, która powstaje pod koniec fazy poowulacyjnej w wyniku różnicowania napędzanego przez P4 po fazie proliferacyjnej z dominacją E2. Komórki dziesiętne są odpowiedzialne za wydzielanie czynników hormonalnych za pomyślne zagnieżdżenie się blastocysty oraz za rozwój interfejsu maciczno-łożyskowego w celu utrzymania matczynej tolerancji na alloprzeszczep płodu.
Dziesiętna jest wymagana do implantacji i późniejszej przebudowy dziesiętnych tętnic spiralnych. Komórki zrębu endometrium ulegają decydualizacji, pod kontrolą P4 i cAMP, w późnej fazie lutealnej cyklu miesiączkowego1. Proces ten jest inicjowany wokół naczyń krwionośnych i rozprzestrzenia się po całym zrębie, co sugeruje jego rolę w przebudowie naczyń krwionośnych i regulacji transportu leukocytów. Ta transformacja komórkowa charakteryzuje się kolistą morfologią, zwiększonym rozmiarem jądra i ekspansją szorstkiej retikulum endoplazmatycznego i aparatu Golgiego2. Dziesiętne komórki zrębu są zdolne do wytwarzania czynników parakrynnych wspomagających zagnieżdżanie się blastocyst i charakteryzują się wydzielaniem licznych hormonów (tj. prolaktyny), angiogennych czynników wzrostu, białka wiążącego insulinowy czynnik wzrostu-1 (IGFBP-1), prostaglandyn (PG) E (stymulatora wewnątrzkomórkowego cAMP), cytokin, składników macierzy zewnątrzkomórkowej i składników odżywczych niezbędnych do implantacji i rozwoju łożyska3,4, 5,6.
Populacja komórek dziesiętnych nie składa się wyłącznie z dziesiętnych komórek zrębu, ale zawiera również duże, specyficzne dla ciąży populacje leukocytów dziesiętnych. Dziesiątkowanie obejmuje przemijający miejscowy obrzęk i napływ komórek NK (Natural Killer), limfocytów T, komórek dendrytycznych i makrofagów. Największą subpopulacją leukocytów są komórki NK macicy, stanowiące około 50-70% wszystkich leukocytów matczynych naciekających decidua, które są źródłem cytokin i czynników angiogennych, które mogą pomóc w procesie decydualizacji i wzroście liczby w czasie ciąży7. Makrofagi, będące drugą co do wielkości subpopulacją komórek odpornościowych, znajdują się wokół miejsca implantacji i zwiększają się w czasie ciąży8. Są źródłem cytokin i czynników wzrostu, takich jak czynnik stymulujący tworzenie kolonii (CSF-1)9, czynnik martwicy nowotworu α (TNFα)10 i prostaglandyna (PG) E11.
Przez cały okres ciąży i przed porodem, decidua jest głównym źródłem cytokin i chemokin odpowiedzialnych za aktywację obwodowych leukocytów matki i późniejszą migrację do tkanek macicy w celu zainicjowania porodu. Badania na zwierzętach wykazały, że liczne cytokin prozapalnych są regulowane w górę w decidua myszy podczas porodu, takich jak TNF-a, IL-6, IL-12 i IL-1b12. W ludzkim decidua cytokiny prozapalne IL-1b, IL-6 i IL-8 (główny chemoatraktant neutrofili) wykazują wyższą ekspresję podczas porodu w porównaniu do nieuprawiania porodu13. Te wydzielane cytokiny powodują aktywację i napływ leukocytów do tkanek dziesiętnych14; Wzrost liczby dziesiętnych makrofagów i nacieków neutrofili zarówno u człowieka, jak i szczura obserwuje się podczas porodu, przy czym naciek dziesiętny poprzedzający mięśniówkę macicy jest 4-krotnie większy, co wskazuje na kaskadę aktywacji między tymi dwiema sąsiadującymi tkankami macicy<klasa SUP = "xref">15. Te naciekające leukocyty wytwarzają PG zdolne do aktywacji synchronicznych skurczów mięśniówki macicy 16, metaloproteinaz macierzy (MMP) w celu zainicjowania pęknięcia błony 17,18, a także cytokin prozapalnych w celu wzmocnienia procesu aktywacji macicy ("burza cytokinowa").
Ze względu na wiele ważnych funkcji komórek dziesiętnych, takich jak odgrywanie kluczowej roli w procesie implantacji, utrzymywanie tolerancji matki i płodu we wczesnej ciąży oraz udział w aktywacji porodu w terminie, podczas ciąży mogą powstać różne patologie. Na przykład: (1) niepłodność spowodowana nawracającym niepowodzeniem implantacji i nawracającą utratą ciąży może wynikać z niepowodzenia dojrzewania dziesiętnego; (2) wewnątrzmaciczne ograniczenie wzrostu (IUGR) i stan przedrzucawkowy spowodowane nieprawidłowym rozwojem i dysfunkcją decidua/łożyska lub upośledzoną transformacją naczyniową w połączeniu dziesiętno-mięśniowym; a także (3) przedwczesny poród, który może wynikać z przedwczesnej aktywacji dziesiętnej.
W świetle tych poważnych zaburzeń, w połączeniu z etycznymi i praktycznymi ograniczeniami badań in vivo na ludziach, ustalenie pierwotnych ludzkich linii komórek dziesiętnych jest niezbędne do analizy in vitro w celu lepszego zrozumienia i poprawy klinicznego zarządzania powikłaniami ciąży. W związku z tym celem naszych badań było opracowanie protokołu, który pozwala na izolację ludzkich pierwotnych komórek liściastych o wysokiej wydajności i żywotności komórek, pobranych z błon płodowych łożysk donoszonych. Obecny protokół jasno opisuje efektywną czasowo i kosztowo metodę izolowania określonych podtypów komórek dziesiętnych, które mogą być wykorzystywane do różnych analiz in vitro. Charakterystyka liczebności i fenotypu subpopulacji dziesiętnych w terminie i porównanie z pierwszym lub drugim trymestrem ciąży ma kluczowe znaczenie dla określenia ich ról w czasie ciąży.

<table><tbody><tr><td>Hank' s zbilansowany roztwór soli z wapniem i magnezem</td><td>Przygotowany w zakładzie (LTRI)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hank' s zbilansowany roztwór soli bez wapnia i magnezu</td><td>Przygotowany w placówce (LTRI)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wkładki na pieluchy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>Duże nożyczki chirurgiczne</td><td>AL Medical</td><td>2018-12-20.</td><td></td></tr><tr><td>Duże kleszcze chirurgiczne</td><td>Fine Science Tools</td><td>11000-18</td><td></td></tr><tr><td>Plastikowy jednorazowy skrobak do komórek (25 cm)</td><td>Sarstedt</td><td>83.183</td><td></td></tr><tr><td>250 mm (rozmiar 60 oczek) sito metalowe</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S1020-5EA</td><td></td></tr><tr><td>Jednorazowy skalpel z plastikową rączką (#21)</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-927-5D</td><td></td></tr><tr><td>Sterylna plastikowa szalka Petriego (średnica 10 cm)</td><td>Sarstedt</td><td>82.1473.001</td><td></td></tr><tr><td>Sterylny pojemnik na próbki (kubek na mocz, 4.5 uncji)</td><td>VWR</td><td>25384-146</td><td></td></tr><tr><td>Filtr nylonowy (70 mm)</td><td>VWR/Corning</td><td>21008-952</td><td></td></tr><tr><td>Bufor do lizy erytrocytów</td><td>Qiagen</td><td>79217</td><td></td></tr><tr><td>Błękit trypanowy, roztwór 0,4%</td><td>Lonza</td><td>17-942E</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-374-10</td><td></td></tr><tr><td>Hemocytometr</td><td>Reichert</td><td>1490</td><td></td></tr><tr><td>Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 pożywka hodowlana</td><td>Invitrogen</td><td>11835-055</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>Żubr</td><td>080-150</td><td></td></tr><tr><td>Normocin (50mg/ mL)</td><td>Invivogen</td><td>ant-nr-1</td><td></td></tr><tr><td>Plastikowa górna jednostka filtracyjna (membrana 0,22 mm, 500 mL)</td><td>Milipore</td><td>SCGPT05RE</td><td></td></tr><tr><td>Kolagenaza 2, liofilizowany proszek</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6885</td><td></td></tr><tr><td>Inhibitor trypsyny sojowej, proszek</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9003-250mg</td><td></td></tr><tr><td>DNaza w proszku</td><td>Roche</td><td>10104159001</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej (proszek BSA)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1600-100</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop konfokalny z wirującym dyskiem - Leica DMI 6000B</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Obrazowanie Cytometr przepływowy - Strumień obrazu MK2</td><td>Oprogramowanie Amnis</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IDEA</td><td>Millipore Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało wimentyny sprzężone z APC</td><td>R& Systemy D</td><td>IC2105A</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało CD45 sprzężone z APC H7</td><td>BD</td><td>641399</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało cytokeratynowe sprzężone z FITC</td><td>MAC Miltenyi Biotec</td><td>130-080-101</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało cytokeratyny 7 skoniugowane PerCP</td><td>Novus</td><td>NBP2-47941PCP</td><td></td></tr><tr><td>eFluor450 Utrwalany barwnik żywotności</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>65-0863-14</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało pierwszorzędowe Vimentin</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-7558</td><td></td></tr><tr><td>CD45 przeciwciało pierwszorzędowe</td><td>Dako</td><td>M0701</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało pierwszorzędowe cytokeratyny</td><td>Dako</td><td>M0821</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało pierwszorzędowe cytokeratyny 7</td><td>Dako</td><td>M7018</td><td></td></tr><tr><td>Mysz IgG</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-2025</td><td></td></tr><tr><td>Koza IgG</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-2028</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało drugorzędowe Alexa Fluor 546</td><td>Invitrogen</td><td>A10036</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało drugorzędowe Alexa Fluor 594</td><td>Fisher Scientific</td><td>A-11058</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td></td></tr></tbody></table>

izolacja pierwotnych ludzkich komórek liściastych z błon płodowych łożysk donoszonych

Isolation of Primary Human Decidual Cells from the Fetal Membranes of Term Placentae

Decidua, znana również jako endometrium w ciąży, jest niezwykle ważną tkanką rozrodczą. Komórki dziesiętne, składające się głównie z liściastych komórek zrębu i komórek odpornościowych, są odpowiedzialne za wydzielanie czynników hormonalnych i zapalnych, które mają kluczowe znaczenie dla pomyślnej implantacji blastocysty, rozwoju łożyska i odgrywają rolę w inicjacji porodu w terminie i wcześniaku. Wiele powikłań ciąży może wynikać z zaburzeń równowagi między różnymi populacjami komórek składającymi się na decidua. Zmiany w proporcji określonych typów komórek dziesiętnych mogą zakłócić te kluczowe procesy i zwiększyć ryzyko wystąpienia poważnych powikłań ciąży, takich jak niepowodzenie implantacji zarodka, wewnątrzmaciczne ograniczenie wzrostu, stan przedrzucawkowy i przedwczesny poród. Przedstawiony tutaj protokół demonstruje efektywną kosztowo i czasowo metodę izolacji pierwotnych ludzkich komórek dziesiętnych pobranych z błon płodowych łożysk donoszonych. Łącząc trawienie enzymatyczne i delikatne mechaniczne rozerwanie tkanki dziesiętnej, uzyskano wysoką wydajność komórek dziesiętnych praktycznie bez zanieczyszczenia kosmówki. Co ważne, scharakteryzowano izolowane komórki dziesiętne (komórki zrębu (55-60%), leukocyty (35%), komórki nabłonkowe (1%) lub trofoblast (0,01%) i utrzymano wysoką żywotność (80%), co potwierdzono testem wielobarwnej obrazowania metodą cytometrii przepływowej. Protokół ten jest specyficzny dla decidua parietalis i może być dostosowany do łożysk w pierwszym i drugim trymestrze ciąży. Po wyizolowaniu komórki dziesiętne mogą być wykorzystywane do wielu zastosowań eksperymentalnych mających na celu zrozumienie roli różnych subpopulacji komórek dziesiętnych w powikłaniach ciąży.

Aby zweryfikować wydajność i żywotność wyizolowanych komórek, poddano je charakterystyce za pomocą dwóch metod: cytometrii przepływowej oraz immunocytochemii (ICC). Analizie poddano 4 populacje komórek; komórki zrębu w stanie decydualizacji wykryto za pomocą przeciwciała przeciwko wimentyną, markeru pan-leukocytowego CD45 użyto do identyfikacji komórek odpornościowych błony podstawnej, cytokeratyny użyto do wykrycia komórek nabłonkowych/śródbłonkowych, a na koniec cytokeratyny 7 użyto do ...

Ten protokół demonstruje metodę izolacji pierwotnych ludzkich komórek dziesiętnych pobranych z błon płodowych łożysk terminowych, które mogą być używane do różnych zastosowań (np. immunocytochemia, cytometria przepływowa, itp.), mając na celu zbadanie roli różnych populacji komórek w komplikacjach ciąży.

Izolacja pierwotnych ludzkich komórek liściastych z błon płodowych łożysk donoszonych

The decidua, also known as the pregnant endometrium, is a critically important reproductive tissue. Decidual cells, comprised mainly of decidualized ...

Ogólnym celem tego protokołu izolacji komórek jest opracowanie metody izolowania pierwotnych komórek dziesiętnych o wysokiej wydajności żywotności komórek końcowych. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie rozrodu człowieka, takie jak rola liściasta w implantacji blastocyst i inicjacji porodu. Może również zapewnić wgląd w różne patologie związane z ciążą.Główną zaletą tej techniki jest to, że zapewnia ona efektywną czasowo i kosztowo metodę izolacji pierwotnych komórek dziesiętnych o wysokiej żywotności końcowej. Na początek zostaw pięć 50-mililitrowych probówek na stojaku i dwie butelki HBSS i HBSS w okapie. Następnie odpipetować 25 mililitrów HBSS do odpowiednio oznakowanej probówki.Następnie połóż nachodzące na siebie pieluchy w dygestorium. Następnie wyjmij termin placenta z pojemnika i umieść go w dygestorium. Umieść łożysko na podkładce pod pieluchę stroną matczyną do góry.Jeśli łożysko jest skierowane stroną matczyną do dołu, użyj dodatkowej pieluszki, aby obrócić łożysko. Poszukaj miejsca pęknięcia membrany i wykonaj nacięcia za pomocą nożyczek i kleszczy, aby membrana mogła się rozłożyć i położyć płasko na powierzchni dygestoria. Następnie użyj skrobaka do komórek, aby delikatnie zeskrobać tkankę dziesiętną z kosmówki.Przenieś tkankę do 50-mililitrowej probówki zawierającej 25 mililitrów HBSS Pamiętaj również, aby zebrać małe skrzepy krwi, ponieważ zawierają one również niektóre komórki dziesiętne. Delikatnie potrząśnij 50-mililitrową probówką, aby umyć zebraną tkankę, a następnie przepuść tkankę przez metalowe sito o średnicy 250 mikrometrów. Powtórz proces mycia dwukrotnie z HBSS, a następnie dwa prania z HBSS w świeżych tubkach.Zanieczyszczenie kosmówką jest łatwo widoczne ze względu na nitkowaty kształt i jaśniejszy kolor i można je usunąć po umyciu. Po umyciu umieść tkankę w sterylnej 50-mililitrowej probówce zawierającej 20 mililitrów roztworu do trawienia enzymatycznego, aby strawić całe decidua uzyskane z całej błony płodowej. Użyj folii parafinowej, aby uszczelnić nakrętkę tuby.Następnie inkubuj probówkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza w wstrząsającej łaźni wodnej. Ustaw minutnik na 20 minut. Po zakończeniu inkubacji usuń folię parafinową.Użyj 70% etanolu do wysterylizowania powierzchni rurki zawierającej strawioną tkankę i umieść ją pod wyciągiem. Krótko potrząśnij tubką. Następnie przepuścić zawiesinę komórkową przez metalowe sito do nowego sterylnego pojemnika na próbkę.Rozcieńczyć zawiesinę komórkową równą objętością pożywki hodowlanej, aby zatrzymać reakcję enzymatyczną. Przenieś zawiesinę komórek do nowej 50-mililitrowej probówki. Następnie odwirować komórki w temperaturze 420 G przez 11 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.W razie potrzeby umieść pozostałą niestrawioną tkankę w nowej 50-mililitrowej probówce zawierającej 20 mililitrów świeżego roztworu do trawienia enzymatycznego i powtórz proces trawienia. Jeśli trawienie jest wykonywane po raz drugi, pozostaw pierwszą probówkę z zawiesiną komórek na lodzie. Po zakończeniu drugiego trawienia połącz obie zawiesiny komórkowe.Po odwirowaniu ostrożnie zassać supernatant. Do usunięcia supernatantu może być wymagana pipeta ręczna. Następnie ponownie zawiesić osad komórkowy w buforze do mycia.Po umyciu komórek powtórz proces wirowania. Pod koniec procesu wirowania odessać supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w pięciu mililitrach buforu do przemywania i 35 mililitrach buforu do lizy erytrocytów. W celu lizy czerwonych krwinek należy krótko przetrząsnąć probówkę na początku i na końcu inkubacji.Następnie inkubować zawiesinę komórkową na lodzie przez 20 minut. Po inkubacji powtórzyć proces wirowania. Po odwirowaniu odessać supernatant i ponownie zawiesić osad w 40 mililitrach buforu do płukania, a następnie przepuścić komórki przez nylonowy filtr o grubości 70 mikrometrów, aby wykluczyć grudki komórek.Powtórz proces wirowania. Odessać supernatant po zakończeniu wirowania. Następnie ponownie zawiesić osad komórkowy w 10 mililitrach pożywki hodowlanej.Policz liczbę komórek za pomocą hemocytometru przy użyciu metody wykluczania niebieskiego barwnika Trypana. W celu określenia składu typu komórki populacji komórek dziesiętnych opracowano strategię bramkowania metodą wielokolorowej cytometrii przepływowej do obrazowania. Analiza wykazała wykluczenie dubletów komórkowych i szczątków komórek za pomocą bramkowania szeregowego.Po uzyskaniu wolnej od zanieczyszczeń populacji pojedynczych komórek, żywotność komórek określa się za pomocą utrwalanego barwnika żywotności. Analiza wykazała 80% żywotność całkowitej populacji komórek dziesiętnych, na co wskazuje niebieskie bramkowanie. Następnie wyizolowane komórki dziesiętne są barwione mysimi przeciwciałami monoklonalnymi sprzężonymi z fluoroforem.Ma to na celu analizę obecności markerów komórek zrębu, immunologicznych, nabłonkowych i trofoblastów oraz barwnika żywotności. Markery te określą typy komórek dziesiętnych. Obrazy fluorescencyjne cytometrii przepływowej pokazują dodatnio zabarwioną komórkę dla wszystkich czterech markerów i barwnika żywotności.Markery te są następnie wykorzystywane do określenia procentu każdego typu komórki w populacji komórek dziesiętnych. Co ciekawe, największą populację komórek stanowią komórki zrębu wimentynowo-dodatnie, podczas gdy komórek trofoblastu praktycznie nie ma. Wyniki te wskazują na czystość i wysoką żywotność izolowanych pierwotnych ludzkich komórek dziesiętnych.W tym przypadku uzyskane wykresy kropkowe pokazują bramkowanie dla dodatnich populacji typów komórek. Fluorescencyjne minus jeden kontrole są używane do dokładnego bramkowania prawdziwie dodatnich populacji komórek dziesiętnych. Następnie przechwycone obrazy mikroskopii konfokalnej z wirującym dyskiem są wykorzystywane do walidacji wyników cytometrii przepływowej, pokazując, że populacja komórek dziesiętnych składa się głównie z komórek zrębu wimentyno-dodatnich bez zanieczyszczenia komórek trofoblastu.Po opanowaniu tej techniki można ją ukończyć w ciągu trzech godzin. Zgodnie z tą procedurą, komórki dziesiętne mogą być analizowane na różne sposoby w celu zbadania ekspresji genów i białek, co może pomóc nam lepiej zrozumieć zmiany komórkowe zachodzące w powikłaniach ciąży.

isolation-primary-human-decidual-cells-from-fetal-membranes-term

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Zidentyfikowaliśmy łożysko jako główny organ krwiotwórczy podczas rozwoju. Stwierdziliśmy, że macierzyste komórki krwiotwórcze (HSCs) są zarówno generowane, jak i powielane w łożysku w unikalnych niszach mikrośrodowiskowych. W niniejszej pracy opisujemy techniki eksperymentalne niezbędne do izolacji i wizualizacji HSCs w łożysku myszy.

Izolacja i analiza hematopoetycznych komórek macierzystych z łożyska

W niniejszym protokole opisujemy sekcję łożysk myszy w 10,5 dniu ciąży, a następnie izolację komórek trofoblastycznych z wykorzystaniem gradientu Percoll. Następnie demonstrujemy zastosowanie wyizolowanych komórek w teście inwazji na Matrigelu.

Izolacja pierwotnych komórek trofoblastów myszy oraz test inwazji trofoblastów

Opisujemy protokół izolacji i hodowli ludzkich komórek nabłonka owodni (hAEC) przy użyciu odczynników wolnych od produktów zwierzęcych, zgodnie z aktualnymi wytycznymi dobrej praktyki produkcyjnej (cGMP).

Izolacja, kriokonserwacja i hodowla ludzkich komórek nabłonka owodni do zastosowań klinicznych

Opisany tutaj jest protokół do izolacji i dalszego badania naciekających leukocytów decidua basalis i decidua parietalis - ludzkiego interfejsu matczyno-płodowego. Protokół ten utrzymuje integralność markerów powierzchniowych komórek i daje wystarczającą ilość żywotnych komórek do dalszych zastosowań, co udowodniono w analizie cytometrii przepływowej.

Izolacja leukocytów z ludzkiego interfejsu matka-płód

Opisany tutaj jest protokół do izolowania i analizy naciekających leukocytów tkanek na styku matki i płodu (macica, decidua i łożysko) myszy. Protokół ten zachowuje integralność większości markerów powierzchniowych komórek i zapewnia wystarczającą liczbę żywotnych komórek do dalszych zastosowań, w tym analizy cytometrii przepływowej.

Izolacja leukocytów z tkanek myszy na granicy matczyno-płodowej

Ten protokół opisuje metodę efektywnej transfekcji siRNA w świeżo wyizolowanych ludzkich cytotrofoblastach kosmkowych za pomocą mikroporacji i identyfikacji kompleksów DNA-białko w tych komórkach. Transfekowane komórki mogą być monitorowane za pomocą analiz Western blot i EMSA podczas 4-dniowego czasu hodowli.

Transfekcja siRNA i analizy EMSA na świeżo wyizolowanych ludzkich cytotrofoblastach kosmkowych

Tutaj opisujemy metody preparowania tkanek płodowych i matczynych z ludzkiego łożyska, a następnie izolacji i ekspansji mezenchymalnych komórek macierzystych/zrębowych (MSC) z tych tkanek.

Izolacja i ekspansja mezenchymalnych komórek macierzystych/zrębowych pochodzących z ludzkiej tkanki łożyska

Opisana jest prosta metoda ustalania pierwotnych ludzkich hodowli łożyskowych (kosmków) i narządów dziesiętnych. Hodowle kosmków i narządów dziesiętnych są nieocenionymi narzędziami do badania patogenezy na styku człowieka z matką i płodem. Wykazano zakażenie fakultatywną bakterią wewnątrzkomórkową Listeria monocytogenes.

Ludzkie posiewy łożyska i narządów dziesiętnych w celu zbadania zakażeń na granicy matczyno-płodowej

To badanie przedstawia standaryzowaną i zweryfikowaną metodę izolacji i hodowli pierwotnych komórek zrębu i nabłonka endometrium myszy, które mogą być używane w systemie kokultury do badania decydualizacji in vitro.

Izolacja komórek nabłonka endometrium i zrębu myszy w celu dencdualizacji in vitro

To badanie przedstawia zweryfikowaną i zoptymalizowaną procedurę izolacji i hodowli ludzkich komórek zrębu endometrium do przeprowadzenia testu decydualizacji in vitro. Co więcej, badanie to dostarcza szczegółowej metody skutecznego knockdown określonego genu za pomocą siRNA w ludzkich komórkach zrębu endometrium.

Izolacja ludzkich komórek zrębu endometrium do dendualizacji in vitro

Ten protokół umożliwia oczyszczanie, charakteryzację i hodowlę pierwotnych trophoblastów pozabłonowych HLA-G+ (EVT) z łożyska podstawnego i błony kosmówkowej ludzkich łożysk końcowych. Pierwotne kultury EVT utrzymują żywotność przez 96 h, co pozwala na współhodowlę z dopasowanymi do próbek komórkami układu odpornościowego matki oraz następcze analizy przepływowe cytometryczne i molekularne ich interakcji.

Oczyszczanie pozabłonkowych trofoblastów HLA-G+ z ludzkich tkanek łożyska w okresie ciąży do fenotypowań i analizy funkcjonalnej

Poznaj metodę izolacji pierwotnych ludzkich komórek liściastych z błon płodowych łożysk donoszonych. Technika ta umożliwia badania nad implantacją blastocysty i patologiami ciąży.

Izolacja pierwotnych ludzkich komórek liściastych z błon płodowych łożysk donoszonych

Przeglądaj więcej filmów