Name: Izolacja pierwotnych ludzkich komórek liściastych z błon płodowych łożysk donoszonych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-30T14:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 37 s
Description: Poznaj metodę izolacji pierwotnych ludzkich komórek liściastych z błon płodowych łożysk donoszonych. Technika ta umożliwia badania nad implantacją blastocysty i patologiami ciąży.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować darczyńcom, RCWIH BioBank oraz Mount Sinai Hospital/UHN Department of Obstetrics and Gynaecology za próbki ludzkie użyte w tym badaniu. Chcielibyśmy podziękować członkom laboratorium Lye, a w szczególności dr Caroline Dunk za pomoc w opracowaniu metody. Praca ta jest wspierana przez Burroughs Welcome Fund (grant #1013759).

Łożek pobrano od zdrowych kobiet w pełnym terminie ciąży, niebędących w fazie akcji porodowej, poddawanych planowemu cięciu cesarskiemu. Pobieranie, przetwarzanie i utylizacja próbek ludzkich odbywają się zgodnie z wytycznymi komisji etycznej Mount Sinai Hospital. Od każdej pacjentki uzyskano pisemną zgodę. Badanie zostało zatwierdzone przez Komisję Etyki Badań w Mount Sinai Hospital.
1. Przygotowania
UWAGA: Wszystkie etapy muszą być przeprowadzane w dygestorium, a cały sprzęt chirurgiczny musi zostać wysterylizowany w autoklawie przed umieszczeniem w dygestorium. Wszystkie pozostałe materiały (butelki, probówki 50 mL itp.) muszą być wysterylizowane 70% roztworem etanolu. Podczas pracy z odpadami biologicznymi należy przez cały czas używać środków ochrony osobistej (fartucha laboratoryjnego, rękawiczek, związanych długich włosów itp.).
<ol>
	<li>Roztwór do trawienia enzymatycznego (Roztwór końcowy: 200 mL)
	<ol>
		<li>Odmierz pipetą 180 mL HBSS-/- do zlewki o pojemności 500 mL, dodaj sterylny magnes mieszający i ustaw na mieszadle w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Odważ i dodaj powoli oraz sekwencyjnie do roztworu HBSS-/- następujące składniki: 20 mL FBS, 400 mg kolagenazy 2 ([stężenie końcowe] = 2 mg/mL), 20 mg inhibitora trypsyny z soi ([stężenie końcowe] = 0,1 mg/mL), 30 mg DNazy 1 ([stężenie końcowe] = 0,15 mg/mL) oraz 200 mg BSA ([stężenie końcowe] = 1 mg/mL).</li>
		<li>Ustaw mieszanie na średnią prędkość i pozostaw mieszaninę do mieszania przez 10-20 min (podczas mieszania przykryć folią aluminiową lub folią parafinową).</li>
		<li>Przelej wymieszany roztwór do szklanej butelki o pojemności 250 mL za pomocą plastikowego lejka i umieść w dygestorium.</li>
		<li>Przefiltruj roztwór przez jednostkę filtracyjną z plastikową górną częścią (filtr membranowy 0,22 μm, 500 mL), rozlej po 20 mL do probówek o pojemności 50 mL (łącznie 10 probówek) i przechowuj w temperaturze -20 °C do momentu użycia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pożywka RPMI 1640 (2% roztwór do płukania i 10% kompletna pożywka wzrostowa)
	<ol>
		<li>Połącz RPMI 1640 i FBS w szklanej butelce w dygestorium.</li>
		<li>W przypadku roztworu 2% FBS połącz 490 mL RPMI 1640 i 10 mL FBS.</li>
		<li>W przypadku roztworu 10% FBS połącz 450 mL RPMI 1640 i 50 mL FBS.</li>
		<li>Odmierz pipetą 500 μL normocyny do szklanej butelki o pojemności 500 mL z poprzedniego kroku zawierającej pożywkę RPMI i FBS (stok 50 mg/mL, stężenie robocze 0,05 mg/mL).</li>
		<li>Przefiltruj pożywkę przez filtr membranowy 0,22 μm i przechowuj w szklanej butelce o pojemności 500 mL w temperaturze 4 °C do momentu użycia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Na 30 min przed rozpoczęciem eksperymentu umieść 20 mL zamrożonego roztworu do trawienia enzymatycznego w łaźni z kuleczkami w temperaturze 37 °C, umieść pożywki RPMI 1640 z 2% FBS i 10% FBS w łaźni z kuleczkami w temperaturze 37 °C, włącz kołyszącą łaźnię wodną i ustaw ją na 37 °C, 2 g, a wirówkę z kontrolą temperatury ustaw na 4 °C.</li>
</ol>
2. Pobieranie tkanki decydualnej z błon płodowych w terminie porodu
<ol>
	<li>Umieścić butelki z HBSS+/+, HBSS-/- oraz pięć probówek 50 mL w statywie pod dygestorium. Do jednej probówki pipetować 25 mL HBSS+/+.</li>
	<li>Używając dłoni w rękawiczkach, wyjąć łożysko dojrzałe z pojemnika użytego do jego transportu z bloku operacyjnego. Położyć łożysko na podkładzie chłonnym (stroną maciczną do góry) i rozłożyć błony płodowe za pomocą nożyczek i pęsety.
	<ol>
		<li>Rozłożyć na dygestorium kilka nakładających się na siebie podkładów chłonnych.</li>
		<li>Użyć osobnego podkładu, aby obrócić łożysko tak, aby strona maciczna była skierowana do góry.</li>
		<li>Zlokalizować miejsce pęknięcia błon i wykonać nacięcia, aby umożliwić rozłożenie błony i jej płaskie ułożenie na powierzchni dygestorium. 
		UWAGA: Po odciągnięciu błony od łożyska, decidua będzie skierowana stroną górną, spoczywając na warstwie chorionu, z warstwą amnionu z tyłu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Używając plastikowej skrobaczki do komórek, ostrożnie zeskrobać tkankę deciduy z chorionu i umieścić ją w probówce 50 mL zawierającej 25 mL HBSS+/+.</li>
	<li>Szkrobać błonę z umiarkowanym naciskiem. Nie należy stosować zbyt silnego nacisku, ponieważ może to doprowadzić do zanieczyszczenia chorionem. Należy zebrać również małe skrzepy krwi, ponieważ zawierają one komórki deciduy. 
	Uwaga: Po pobraniu deciduy, łożysko należy zapakować do plastikowego pojemnika na odpady biologiczne i zamrozić w zamrażarce -20 °C przed odpowiednią utylizacją (zgodnie z zasadami instytucjonalnymi). Zakrwawione podkłady chłonne należy zawinąć w szczelny worek plastikowy i wyrzucić do pojemnika na odpady niebezpieczne biologicznie.</li>
</ol>
3. Płukanie i trawienie enzymatyczne tkanki decydualnej
<ol>
	<li>Przemyj zebrane tkanki, delikatnie potrząsając ręcznie probówką 50 mL i przepuszczając zawartość przez metalowe sito o oczkach 250 μm (250 μm, rozmiar 60 mesh) umieszczone nad sterylnym pojemnikiem na próbki (na mocz).</li>
	<li>Powtórz płukanie dwukrotnie za pomocą HBSS+/+ oraz dwukrotnie za pomocą HBSS-/-, używając nowych probówek do każdego płukania. (końcowe płukanie HBSS-/- umożliwia usunięcie wapnia i magnezu obecnych w HBSS+/+, które w przeciwnym razie zakłócałyby następujący proces trawienia enzymatycznego). 
	UWAGA: Podczas etapów płukania zanieczyszczenie tkanką błony kosmicznej będzie widoczne, ponieważ tkanka decydualna ma jasnoróżowy kolor i strukturę amorficzną, podczas gdy błona kosmiczna jest biała, gęsta i włóknista. W związku z tym zanieczyszczenia błoną kosmiczną można łatwo usunąć pęsetą.</li>
	<li>Opcjonalnie, jeśli tkanka decydualna jest gruba, przenieś ją do sterylnej szalki Petriego o średnicy 10 cm i przystąp do posiekania tkanki w szalce za pomocą dwóch przeciwstawnych skalpeli.</li>
	<li>Umieść przemyte tkanki w sterylnej probówce 50 mL zawierającej 100 mg tkanki/mL roztworu do trawienia enzymatycznego (patrz: Preparaty).
	<ol>
		<li>Jako punkt odniesienia upewnij się, że poziom tkanki decydualnej sięga oznaczenia 5-10 mL na probówce 50 mL.</li>
		<li>Użyj około 20 mL roztworu do trawienia enzymatycznego (przygotowanego w kroku 1.1), aby strawić całą decyduę zebraną z pełnej błony płodowej w terminie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Uszczelnij korek probówki folią parafinową (szczelnie zamknij probówkę i owiń folią parafinową korek oraz górną część probówki) pod dygestorium i inkubuj tkankę decydualną w temperaturze 37 °C przez 20 min w wytrząsającej kąpieli wodnej (145 rpm, 2 g).</li>
	<li>Po inkubacji usuń folię parafinową, zdezynfekuj powierzchnię probówki z strawioną tkanką 70% etanolem i przenieś ją pod wyciąg. Krótko potrząśnij probówką ręcznie.</li>
	<li>Zbierz zawiesinę komórkową przez metalowe sito (250 μm, rozmiar 60 mesh) do nowego sterylnego pojemnika na próbki. Rozcieńcz równą objętością (20 mL) pożywki RPMI + 10% FBS zawierającej 0,1% normocyny, aby zatrzymać reakcję enzymatyczną. Przejdź bezpośrednio do etapu centryfugacji 4.1.</li>
	<li>W razie potrzeby umieść pozostałą niestrawioną tkankę z powrotem w nowej probówce 50 mL z 20 mL świeżego roztworu do trawienia enzymatycznego i powtórz trawienie (20 min, 37 °C, wytrząsająca kąpiel wodna).</li>
	<li>Jeśli drugie trawienie jest konieczne, umieść pierwszą probówkę z zawiesiną komórkową na lodzie (przykryj folią parafinową, aby zachować sterylność). Powtórz kroki 3.5-3.6 i połącz obie zawiesiny komórkowe.</li>
</ol>
4. Przygotowanie zawiesiny pojedynczych komórek
<ol>
	<li>Odwirować zawiesinę komórkową (420 g, 4 °C, 11 min).</li>
	<li>Usunąć nadsącz i zawiesić komórki ponownie w 40 mL pożywki RPMI + 2% FBS zawierającej 0,1% normocyny („bufor piorący”). 
	UWAGA: Osad komórkowy będzie luźny i galaretowaty z powodu zanieczyszczenia erytrocytami; nadsącz należy aspirować ostrożnie. Może być konieczne usunięcie górnej fazy za pomocą pipety manualnej.</li>
	<li>Powtórzyć wirowanie przy 420 g w temperaturze 4 °C przez 11 min.</li>
	<li>Ostrożnie usunąć nadsącz (zgodnie z uwagą do kroku 4.2) i zawiesić osad komórkowy ponownie w 5 mL buforu piorącego, a następnie dodać do tej samej probówki 35 mL buforu do lizy erytrocytów. 
	UWAGA: Jeśli osad jest duży lub silnie zanieczyszczony krwią, można go rozdzielić do dwóch probówek na etap lizy erytrocytów, dodając 10 mL buforu piorącego i dzieląc zawiesinę równo pomiędzy dwie probówki, a następnie dodając do każdej z nich 35 mL buforu do lizy erytrocytów.</li>
	<li>Inkubować na lodzie przez 20 min. Krótko wymieszać zawartość probówki(wek) w vorteksie na początku i na końcu inkubacji w celu lizy erytrocytów.</li>
	<li>Odwirować przy 420 g przez 11 min w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Ostrożnie usunąć nadsącz i zawiesić osad ponownie w 40 mL buforu piorącego.</li>
	<li>Przepuścić komórki przez filtr nylonowy 70 μm w celu usunięcia agregatów komórkowych.</li>
	<li>Odwirować przy 420 g przez 11 min w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Usunąć nadsącz i zawiesić osad komórkowy ponownie w 10 mL pożywki kompletnej (RPMI 10% + FBS zawierającej 0,1% normocyny).</li>
	<li>Policzyć komórki przy użyciu hemocytometru i metody wykluczania barwnika trypan blue, zgodnie z poniższym opisem:
	<ol>
		<li>W komorze z laminarem ostrożnie pipetować zawiesinę komórkową w górę i w dół 3 razy w celu dokładnego wymieszania przed połączeniem z trypan blue. W probówce 1,5 mL przygotować zawiesinę komórkową rozcieńczoną 1:2 (połączyć 20 μL roztworu trypan blue i 20 μL zawiesiny komórek błony śluzowej macicy). Ostrożnie wymieszać roztwór trypan blue z komórkami, pipetując w górę i w dół kilka razy (roztwór ten nie jest sterylny).</li>
		<li>Umieścić hemocytometr na stoliku mikroskopu z nałożonym szkiełkiem nakrywkowym. 
		UWAGA: Hemocytometr to szkiełko mikroskopowe z naniesioną siatką tworzącą dziewięć dużych kwadratów oddzielonych potrójnymi liniami. Każdy duży kwadrat ma powierzchnię 1 mm2, a głębokość komory wynosi 0,1 mm. Zatem objętość cieczy, która może wypełnić każdy duży kwadrat, to 1 mm*1 mm*0,1 mm = 0,1 mm3 = 10-4 mL.</li>
		<li>Powoli dodać 10 μL mieszaniny trypan blue i komórek do szczeliny hemocytometru, pozwalając siłom kapilarnym rozprzestrzenić mieszaninę komórkową na całe szkiełko (zatrzymać przed całkowitym wypełnieniem wgłębienia).</li>
		<li>Obejrzeć komórki pod mikroskopem (powiększenie 10X) i policzyć wszystkie białe/zielone komórki, które wykluczają trypan blue (są to komórki żywe), w czterech dużych zewnętrznych kwadratach hemocytometru. Podczas liczenia komórek dotykających linii, liczyć tylko te, które dotykają prawej i górnej linii, pomijając te dotykające lewej i dolnej linii. Nie liczyć komórek ciemnoniebieskich; niebieski kolor wskazuje, że komórka jest martwa, ponieważ barwnik trypan blue może łatwo przenikać przez błonę plazmatyczną do cytoplazmy.</li>
		<li>Aby obliczyć liczbę żywych komórek w 1 mL zawiesiny komórkowej (X): 
		<img alt="Wzór na liczenie komórek, X = (całkowita liczba komórek/4) × 2 × 10 000; równanie matematyczne." src="/files/ftp_upload/57443/57443eq1v2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie"> 
		2 = czynnik rozcieńczenia 
		10 000 = współczynnik konwersji (1 mL = 1 cm3 = 10 000*0,1 mm3)</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Rozcieńczyć komórki błony śluzowej macicy do pożądanego stężenia końcowego w pożywce RPMI + 10% FBS (pożywka wzrostowa). 
	UWAGA: W przypadku wysiewu do hodowli tkankowej, nanieść do plastikowej płytki 6-dołkowej 2*106 komórek/dołek, do plastikowej płytki 10-cm 10*106 komórek lub na szkiełko nakrywkowe 75 000 komórek.</li>
</ol>

<ol><li>Brosens, N., Hayashi, N., White, J. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progesterone+receptor+regulates+decidual+prolactin+expression+in+differentiating+human+endometrial+stromal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Progesterone receptor regulates decidual prolactin expression in differentiating human endometrial stromal cells.</a> Endocrinology. 140, 4809-4820 (1999).</li>
<li>Bell, S. C., D'Arcangues, C., Frase, I. S., Newton, J. R., Odlind, V. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBell%2C+SC+%22Decidualization+and+relevance+to+menstruation%22">Decidualization and relevance to menstruation</a>. , Cambridge University press. 187-212 (1990).</li>
<li>Kariya, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-1+inhibits+in+vitro+decidualization+of+human+endometrial+stromal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Endocrinology+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Interleukin-1 inhibits in vitro decidualization of human endometrial stromal cells.</a> Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 73, 1170-1174 (1991).</li>
<li>Dimitriadis, E., Robb, L., Salamonsen, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin+11+advances+progesterone-induced+decidualization+of+human+endometrial+stromal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Interleukin 11 advances progesterone-induced decidualization of human endometrial stromal cells.</a> Molecular and Human Reproduction. 8, 636-643 (2002).</li>
<li>Wu, W. -X., Brooks, J., Glasier, A. F., McNeilly, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+relationship+between+decidualization+and+prolactin+mRNA+and+production+at+different+stages+of+human+pregnancy%5BTitle%5D)+AND+%22Society+for+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">The relationship between decidualization and prolactin mRNA and production at different stages of human pregnancy.</a> Society for Endocrinology. 14, 255-261 (1995).</li>
<li>Bell, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+and+secretion+of+protein+by+the+endometrium+and+decidua%5BTitle%5D)+AND+%22Implantation%3A+Biology+and+Clinical+Aspects%22%5BJournal%5D)">Synthesis and secretion of protein by the endometrium and decidua.</a> Implantation: Biology and Clinical Aspects. , 95-118 (1988).</li>
<li>Croy, B. A., Chantakru, S., Esadeg, S., Ashkar, A. A., Wei, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decidual+natural+killer+cells%3A+key+regulators+of+placental+development%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Reproductive+Immunology%22%5BJournal%5D)">Decidual natural killer cells: key regulators of placental development.</a> Journal of Reproductive Immunology. 57, 151-168 (2002).</li>
<li>Smarason, A. K., Gunnarsson, A., Alfredsson, J. H., Valdimarsson, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monocytosis+and+monocytic+infiltration+of+decidua+in+early+pregnancy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+and+Laboratory+Immunology%22%5BJournal%5D)">Monocytosis and monocytic infiltration of decidua in early pregnancy.</a> Journal of Clinical and Laboratory Immunology. 21, 1-5 (1986).</li>
<li>Daiter, E., Pampfer, S., Yeung, Y. G., Barad, D., Stanley, E. R., Pollard, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+colony-+stimulating+factor-1+in+the+human+uterus+and+placenta%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Endocrinology+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Expression of colony- stimulating factor-1 in the human uterus and placenta.</a> Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 74, 850-858 (1992).</li>
<li>Casey, M. L., Cox, S. M., Beutler, B., Milewich, L., MacDonald, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cachectin%2Ftumor+necrosis+factor-alpha+formation+in+human+decidua.+Potential+role+of+cytokines+in+infection-induced+preterm+labor%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Cachectin/tumor necrosis factor-alpha formation in human decidua. Potential role of cytokines in infection-induced preterm labor.</a> Journal of Clinical Investigation. 83, 430-436 (1989).</li>
<li>Lala, P. K., Kennedy, T. G., Parhar, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+of+lymphocyte+alloreactivity+by+early+gestational+human+decidua.+II.+Characterization+of+the+suppressor+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Immunology%22%5BJournal%5D)">Suppression of lymphocyte alloreactivity by early gestational human decidua. II. Characterization of the suppressor mechanisms.</a> Cellular Immunology. 127, 368-381 (1988).</li>
<li>Shynlova, O., Nedd-Roderique, T., Li, Y., Dorogin, A., Nguyen, T., Lye, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infiltration+of+myeloid+cells+into+decidua+is+a+critical+early+event+in+the+labour+cascade+and+post-partum+uterine+remodelling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+and+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Infiltration of myeloid cells into decidua is a critical early event in the labour cascade and post-partum uterine remodelling.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 17, 311-324 (2013).</li>
<li>Osman, I., Young, A., Ledingham, M. A., Thomson, A. J., Jordan, F., Greer, I. A., Norman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukocyte+density+and+pro-inflammatory+cytokine+expression+in+human+fetal+membranes%2C+decidua%2C+cervix+and+myometrium+before+and+during+labour+at+term%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Leukocyte density and pro-inflammatory cytokine expression in human fetal membranes, decidua, cervix and myometrium before and during labour at term.</a> Molecular Human Reproduction. 9, 41-45 (2003).</li>
<li>Farine, T., Lye, S. J., Shynlova, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+maternal+leukocytes+are+activated+in+response+to+cytokines+secreted+by+uterine+tissues+of+pregnant+women%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+and+Molecular+Immunology%22%5BJournal%5D)">Peripheral maternal leukocytes are activated in response to cytokines secreted by uterine tissues of pregnant women.</a> Journal of Cellular and Molecular Immunology. 14, 635-638 (2017).</li>
<li>Hamilton, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophages+infiltrate+the+human+and+rat+decidua+during+term+and+preterm+labor%3A+evidence+that+decidual+inflammation+precedes+labor%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Macrophages infiltrate the human and rat decidua during term and preterm labor: evidence that decidual inflammation precedes labor.</a> Biology of Reproduction. 86, 39(2011).</li>
<li>Casey, M. L., Cox, S. M., Word, A., Macdonald, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokines+and+infection-induced+preterm+labour%5BTitle%5D)+AND+%22Reprodution+Fertility+and+Development%22%5BJournal%5D)">Cytokines and infection-induced preterm labour.</a> Reprodution Fertility and Development. 2, 499-510 (1990).</li>
<li>Yellon, S. M., Mackler, A. M., Kirby, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+leukocyte+traffic+and+activation+in+parturition%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Society+for+Gynecologic+Investigation%22%5BJournal%5D)">The role of leukocyte traffic and activation in parturition.</a> Journal of the Society for Gynecologic Investigation. 10, 323-338 (2003).</li>
<li>Gomez-Lopez, N., StLouis, D., Lehr, M. S., Sanchez-Rodriguez, E. N., Arenas-Hernandez, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+cells+in+term+and+preterm+labor%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+%26+Molecular+Immunology%22%5BJournal%5D)">Immune cells in term and preterm labor.</a> Cellular & Molecular Immunology. 11, 571-581 (2014).</li>
<li>Xu, Y., Plazyo, O., Romero, R., Hassan, S. S., Gomez-Lopez, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+leukocytes+from+the+human+maternal-fetal+interface%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation of leukocytes from the human maternal-fetal interface.</a> Journal of Visualized Experiments. 99, (2015).</li>
<li>Trundley, T., Gardner, L., Northfield, J., Moffett, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+isolation+of+cells+from+the+human+fetal-maternal+interface%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Methods for isolation of cells from the human fetal-maternal interface.</a> Methods in Molecular Medicine. 122, 109-122 (2006).</li>
<li>Jividen, K., Movassagh, M. J., Jazaeri, A., Li, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+methods+for+establishing+primary+human+endometrial+stromal+cells+from+hysterectomy+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+experiments%22%5BJournal%5D)">Two methods for establishing primary human endometrial stromal cells from hysterectomy specimens.</a> Journal of Visualized experiments. 87, (2014).</li>
<li>Pelekanos, R. A., Sardesai, V. S., Futrega, K., Lott, W. B., Kuhn, M., Doran, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+expansion+of+mesenchymal+stem%2Fstromal+cells+derived+from+human+placenta+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation and expansion of mesenchymal stem/stromal cells derived from human placenta tissue.</a> Journal of Visualized experiments. 112, (2016).</li>
<li>De Clercq, K., Hennes, A., Vrien, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+mouse+endometrial+epithelial+and+stromal+cells+for+in+vitro+decidualization%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation of mouse endometrial epithelial and stromal cells for in vitro decidualization.</a> Journal of Visualized Experiments. 121, (2017).</li>
<li>Zhang, J., Shynlova, O., Sabras, S., Bang, A., Briollais, L., Lye, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunophenotyping+and+activation+status+of+maternal+and+peripheral+blood+leukocytes+during+pregnancy+and+labour%2C+both+term+and+preterm%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+and+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Immunophenotyping and activation status of maternal and peripheral blood leukocytes during pregnancy and labour, both term and preterm.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 10, 2386-2402 (2017).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia

Opisany tutaj protokół demonstruje efektywną kosztowo i czasowo metodę izolowania pierwotnych komórek liściastych pobranych z błon płodowych całych ludzkich łożysk donoszonych, która jest wysoce dostępna i prosta. Powodzenie tego protokołu zależy od dwóch krytycznych czynników: (1) skuteczności zeskrobywania dziesiętnych z warstwy kosmówkowej błon płodowych oraz (2) staranności, z jaką komórki dziesiętne są traktowane przez cały protokół. Ważne jest, aby zanieczyszczenie tkanki kosmówki było kontrolowane poprzez zapewnie...

Endometrium, jedna z najbardziej aktywnych tkanek dorosłej kobiety, ulega dramatycznej przebudowie każdego cyklu menstruacyjnego w odpowiedzi na stymulację przez hormony jajnikowe, estrogen (E2) i progesteron (P4). Decidua, znana również jako endometrium w ciąży, jest krytycznie ważną tkanką rozrodczą, która powstaje pod koniec fazy poowulacyjnej w wyniku różnicowania napędzanego przez P4 po fazie proliferacyjnej z dominacją E2. Komórki dziesiętne są odpowiedzialne za wydzielanie czynników hormonalnych za pomyślne zagnieżdżenie się blastocysty oraz za rozwój interfejsu maciczno-łożyskowego w celu utrzymania matczynej tolerancji na alloprzeszczep płodu.
Dziesiętna jest wymagana do implantacji i późniejszej przebudowy dziesiętnych tętnic spiralnych. Komórki zrębu endometrium ulegają decydualizacji, pod kontrolą P4 i cAMP, w późnej fazie lutealnej cyklu miesiączkowego1. Proces ten jest inicjowany wokół naczyń krwionośnych i rozprzestrzenia się po całym zrębie, co sugeruje jego rolę w przebudowie naczyń krwionośnych i regulacji transportu leukocytów. Ta transformacja komórkowa charakteryzuje się kolistą morfologią, zwiększonym rozmiarem jądra i ekspansją szorstkiej retikulum endoplazmatycznego i aparatu Golgiego2. Dziesiętne komórki zrębu są zdolne do wytwarzania czynników parakrynnych wspomagających zagnieżdżanie się blastocyst i charakteryzują się wydzielaniem licznych hormonów (tj. prolaktyny), angiogennych czynników wzrostu, białka wiążącego insulinowy czynnik wzrostu-1 (IGFBP-1), prostaglandyn (PG) E (stymulatora wewnątrzkomórkowego cAMP), cytokin, składników macierzy zewnątrzkomórkowej i składników odżywczych niezbędnych do implantacji i rozwoju łożyska3,4, 5,6.
Populacja komórek dziesiętnych nie składa się wyłącznie z dziesiętnych komórek zrębu, ale zawiera również duże, specyficzne dla ciąży populacje leukocytów dziesiętnych. Dziesiątkowanie obejmuje przemijający miejscowy obrzęk i napływ komórek NK (Natural Killer), limfocytów T, komórek dendrytycznych i makrofagów. Największą subpopulacją leukocytów są komórki NK macicy, stanowiące około 50-70% wszystkich leukocytów matczynych naciekających decidua, które są źródłem cytokin i czynników angiogennych, które mogą pomóc w procesie decydualizacji i wzroście liczby w czasie ciąży7. Makrofagi, będące drugą co do wielkości subpopulacją komórek odpornościowych, znajdują się wokół miejsca implantacji i zwiększają się w czasie ciąży8. Są źródłem cytokin i czynników wzrostu, takich jak czynnik stymulujący tworzenie kolonii (CSF-1)9, czynnik martwicy nowotworu α (TNFα)10 i prostaglandyna (PG) E11.
Przez cały okres ciąży i przed porodem, decidua jest głównym źródłem cytokin i chemokin odpowiedzialnych za aktywację obwodowych leukocytów matki i późniejszą migrację do tkanek macicy w celu zainicjowania porodu. Badania na zwierzętach wykazały, że liczne cytokin prozapalnych są regulowane w górę w decidua myszy podczas porodu, takich jak TNF-a, IL-6, IL-12 i IL-1b12. W ludzkim decidua cytokiny prozapalne IL-1b, IL-6 i IL-8 (główny chemoatraktant neutrofili) wykazują wyższą ekspresję podczas porodu w porównaniu do nieuprawiania porodu13. Te wydzielane cytokiny powodują aktywację i napływ leukocytów do tkanek dziesiętnych14; Wzrost liczby dziesiętnych makrofagów i nacieków neutrofili zarówno u człowieka, jak i szczura obserwuje się podczas porodu, przy czym naciek dziesiętny poprzedzający mięśniówkę macicy jest 4-krotnie większy, co wskazuje na kaskadę aktywacji między tymi dwiema sąsiadującymi tkankami macicy<klasa SUP = "xref">15. Te naciekające leukocyty wytwarzają PG zdolne do aktywacji synchronicznych skurczów mięśniówki macicy 16, metaloproteinaz macierzy (MMP) w celu zainicjowania pęknięcia błony 17,18, a także cytokin prozapalnych w celu wzmocnienia procesu aktywacji macicy ("burza cytokinowa").
Ze względu na wiele ważnych funkcji komórek dziesiętnych, takich jak odgrywanie kluczowej roli w procesie implantacji, utrzymywanie tolerancji matki i płodu we wczesnej ciąży oraz udział w aktywacji porodu w terminie, podczas ciąży mogą powstać różne patologie. Na przykład: (1) niepłodność spowodowana nawracającym niepowodzeniem implantacji i nawracającą utratą ciąży może wynikać z niepowodzenia dojrzewania dziesiętnego; (2) wewnątrzmaciczne ograniczenie wzrostu (IUGR) i stan przedrzucawkowy spowodowane nieprawidłowym rozwojem i dysfunkcją decidua/łożyska lub upośledzoną transformacją naczyniową w połączeniu dziesiętno-mięśniowym; a także (3) przedwczesny poród, który może wynikać z przedwczesnej aktywacji dziesiętnej.
W świetle tych poważnych zaburzeń, w połączeniu z etycznymi i praktycznymi ograniczeniami badań in vivo na ludziach, ustalenie pierwotnych ludzkich linii komórek dziesiętnych jest niezbędne do analizy in vitro w celu lepszego zrozumienia i poprawy klinicznego zarządzania powikłaniami ciąży. W związku z tym celem naszych badań było opracowanie protokołu, który pozwala na izolację ludzkich pierwotnych komórek liściastych o wysokiej wydajności i żywotności komórek, pobranych z błon płodowych łożysk donoszonych. Obecny protokół jasno opisuje efektywną czasowo i kosztowo metodę izolowania określonych podtypów komórek dziesiętnych, które mogą być wykorzystywane do różnych analiz in vitro. Charakterystyka liczebności i fenotypu subpopulacji dziesiętnych w terminie i porównanie z pierwszym lub drugim trymestrem ciąży ma kluczowe znaczenie dla określenia ich ról w czasie ciąży.

<table><tbody><tr><td>Hank' s zbilansowany roztwór soli z wapniem i magnezem</td><td>Przygotowany w zakładzie (LTRI)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hank' s zbilansowany roztwór soli bez wapnia i magnezu</td><td>Przygotowany w placówce (LTRI)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wkładki na pieluchy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>Duże nożyczki chirurgiczne</td><td>AL Medical</td><td>2018-12-20.</td><td></td></tr><tr><td>Duże kleszcze chirurgiczne</td><td>Fine Science Tools</td><td>11000-18</td><td></td></tr><tr><td>Plastikowy jednorazowy skrobak do komórek (25 cm)</td><td>Sarstedt</td><td>83.183</td><td></td></tr><tr><td>250 mm (rozmiar 60 oczek) sito metalowe</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S1020-5EA</td><td></td></tr><tr><td>Jednorazowy skalpel z plastikową rączką (#21)</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-927-5D</td><td></td></tr><tr><td>Sterylna plastikowa szalka Petriego (średnica 10 cm)</td><td>Sarstedt</td><td>82.1473.001</td><td></td></tr><tr><td>Sterylny pojemnik na próbki (kubek na mocz, 4.5 uncji)</td><td>VWR</td><td>25384-146</td><td></td></tr><tr><td>Filtr nylonowy (70 mm)</td><td>VWR/Corning</td><td>21008-952</td><td></td></tr><tr><td>Bufor do lizy erytrocytów</td><td>Qiagen</td><td>79217</td><td></td></tr><tr><td>Błękit trypanowy, roztwór 0,4%</td><td>Lonza</td><td>17-942E</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-374-10</td><td></td></tr><tr><td>Hemocytometr</td><td>Reichert</td><td>1490</td><td></td></tr><tr><td>Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 pożywka hodowlana</td><td>Invitrogen</td><td>11835-055</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>Żubr</td><td>080-150</td><td></td></tr><tr><td>Normocin (50mg/ mL)</td><td>Invivogen</td><td>ant-nr-1</td><td></td></tr><tr><td>Plastikowa górna jednostka filtracyjna (membrana 0,22 mm, 500 mL)</td><td>Milipore</td><td>SCGPT05RE</td><td></td></tr><tr><td>Kolagenaza 2, liofilizowany proszek</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6885</td><td></td></tr><tr><td>Inhibitor trypsyny sojowej, proszek</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9003-250mg</td><td></td></tr><tr><td>DNaza w proszku</td><td>Roche</td><td>10104159001</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej (proszek BSA)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1600-100</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop konfokalny z wirującym dyskiem - Leica DMI 6000B</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Obrazowanie Cytometr przepływowy - Strumień obrazu MK2</td><td>Oprogramowanie Amnis</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IDEA</td><td>Millipore Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało wimentyny sprzężone z APC</td><td>R& Systemy D</td><td>IC2105A</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało CD45 sprzężone z APC H7</td><td>BD</td><td>641399</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało cytokeratynowe sprzężone z FITC</td><td>MAC Miltenyi Biotec</td><td>130-080-101</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało cytokeratyny 7 skoniugowane PerCP</td><td>Novus</td><td>NBP2-47941PCP</td><td></td></tr><tr><td>eFluor450 Utrwalany barwnik żywotności</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>65-0863-14</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało pierwszorzędowe Vimentin</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-7558</td><td></td></tr><tr><td>CD45 przeciwciało pierwszorzędowe</td><td>Dako</td><td>M0701</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało pierwszorzędowe cytokeratyny</td><td>Dako</td><td>M0821</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało pierwszorzędowe cytokeratyny 7</td><td>Dako</td><td>M7018</td><td></td></tr><tr><td>Mysz IgG</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-2025</td><td></td></tr><tr><td>Koza IgG</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-2028</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało drugorzędowe Alexa Fluor 546</td><td>Invitrogen</td><td>A10036</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało drugorzędowe Alexa Fluor 594</td><td>Fisher Scientific</td><td>A-11058</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td></td></tr></tbody></table>

izolacja pierwotnych ludzkich komórek liściastych z błon płodowych łożysk donoszonych

Isolation of Primary Human Decidual Cells from the Fetal Membranes of Term Placentae

Decidua, znana również jako endometrium w ciąży, jest niezwykle ważną tkanką rozrodczą. Komórki dziesiętne, składające się głównie z liściastych komórek zrębu i komórek odpornościowych, są odpowiedzialne za wydzielanie czynników hormonalnych i zapalnych, które mają kluczowe znaczenie dla pomyślnej implantacji blastocysty, rozwoju łożyska i odgrywają rolę w inicjacji porodu w terminie i wcześniaku. Wiele powikłań ciąży może wynikać z zaburzeń równowagi między różnymi populacjami komórek składającymi się na decidua. Zmiany w proporcji określonych typów komórek dziesiętnych mogą zakłócić te kluczowe procesy i zwiększyć ryzyko wystąpienia poważnych powikłań ciąży, takich jak niepowodzenie implantacji zarodka, wewnątrzmaciczne ograniczenie wzrostu, stan przedrzucawkowy i przedwczesny poród. Przedstawiony tutaj protokół demonstruje efektywną kosztowo i czasowo metodę izolacji pierwotnych ludzkich komórek dziesiętnych pobranych z błon płodowych łożysk donoszonych. Łącząc trawienie enzymatyczne i delikatne mechaniczne rozerwanie tkanki dziesiętnej, uzyskano wysoką wydajność komórek dziesiętnych praktycznie bez zanieczyszczenia kosmówki. Co ważne, scharakteryzowano izolowane komórki dziesiętne (komórki zrębu (55-60%), leukocyty (35%), komórki nabłonkowe (1%) lub trofoblast (0,01%) i utrzymano wysoką żywotność (80%), co potwierdzono testem wielobarwnej obrazowania metodą cytometrii przepływowej. Protokół ten jest specyficzny dla decidua parietalis i może być dostosowany do łożysk w pierwszym i drugim trymestrze ciąży. Po wyizolowaniu komórki dziesiętne mogą być wykorzystywane do wielu zastosowań eksperymentalnych mających na celu zrozumienie roli różnych subpopulacji komórek dziesiętnych w powikłaniach ciąży.

Aby zweryfikować wydajność i żywotność wyizolowanych komórek, poddano je charakterystyce za pomocą dwóch metod: cytometrii przepływowej oraz immunocytochemii (ICC). Analizie poddano 4 populacje komórek; komórki zrębu w stanie decydualizacji wykryto za pomocą przeciwciała przeciwko wimentyną, markeru pan-leukocytowego CD45 użyto do identyfikacji komórek odpornościowych błony podstawnej, cytokeratyny użyto do wykrycia komórek nabłonkowych/śródbłonkowych, a na koniec cytokeratyny 7 użyto do ...

Ten protokół demonstruje metodę izolacji pierwotnych ludzkich komórek dziesiętnych pobranych z błon płodowych łożysk terminowych, które mogą być używane do różnych zastosowań (np. immunocytochemia, cytometria przepływowa, itp.), mając na celu zbadanie roli różnych populacji komórek w komplikacjach ciąży.

Izolacja pierwotnych ludzkich komórek liściastych z błon płodowych łożysk donoszonych

The decidua, also known as the pregnant endometrium, is a critically important reproductive tissue. Decidual cells, comprised mainly of decidualized ...

Ogólnym celem tego protokołu izolacji komórek jest opracowanie metody izolowania pierwotnych komórek dziesiętnych o wysokiej wydajności żywotności komórek końcowych. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie rozrodu człowieka, takie jak rola liściasta w implantacji blastocyst i inicjacji porodu. Może również zapewnić wgląd w różne patologie związane z ciążą.Główną zaletą tej techniki jest to, że zapewnia ona efektywną czasowo i kosztowo metodę izolacji pierwotnych komórek dziesiętnych o wysokiej żywotności końcowej. Na początek zostaw pięć 50-mililitrowych probówek na stojaku i dwie butelki HBSS i HBSS w okapie. Następnie odpipetować 25 mililitrów HBSS do odpowiednio oznakowanej probówki.Następnie połóż nachodzące na siebie pieluchy w dygestorium. Następnie wyjmij termin placenta z pojemnika i umieść go w dygestorium. Umieść łożysko na podkładce pod pieluchę stroną matczyną do góry.Jeśli łożysko jest skierowane stroną matczyną do dołu, użyj dodatkowej pieluszki, aby obrócić łożysko. Poszukaj miejsca pęknięcia membrany i wykonaj nacięcia za pomocą nożyczek i kleszczy, aby membrana mogła się rozłożyć i położyć płasko na powierzchni dygestoria. Następnie użyj

isolation-primary-human-decidual-cells-from-fetal-membranes-term

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Zidentyfikowaliśmy łożysko jako główny organ krwiotwórczy podczas rozwoju. Stwierdziliśmy, że macierzyste komórki krwiotwórcze (HSCs) są zarówno generowane, jak i powielane w łożysku w unikalnych niszach mikrośrodowiskowych. W niniejszej pracy opisujemy techniki eksperymentalne niezbędne do izolacji i wizualizacji HSCs w łożysku myszy.

Izolacja i analiza hematopoetycznych komórek macierzystych z łożyska

W niniejszym protokole opisujemy sekcję łożysk myszy w 10,5 dniu ciąży, a następnie izolację komórek trofoblastycznych z wykorzystaniem gradientu Percoll. Następnie demonstrujemy zastosowanie wyizolowanych komórek w teście inwazji na Matrigelu.

Izolacja pierwotnych komórek trofoblastów myszy oraz test inwazji trofoblastów

Przedstawiono dwie techniki izolowania kropelek lipidów komórkowych z 1) komórek drożdży i 2) ludzkich łożysk. Centralnym elementem obu procedur jest wirowanie w gradionym gradimencie gęstości, w którym powstałą pływającą warstwę zawierającą kropelki można łatwo zwizualizować za pomocą oka, wyekstrahować i określić ilościowo za pomocą analizy Western Blot w celu uzyskania czystości.

Izolacja kropelek lipidów komórkowych: dwie techniki oczyszczania, zaczynając od komórek drożdży i ludzkich łożysk

Opisujemy protokół izolacji i hodowli ludzkich komórek nabłonka owodni (hAEC) przy użyciu odczynników wolnych od produktów zwierzęcych, zgodnie z aktualnymi wytycznymi dobrej praktyki produkcyjnej (cGMP).

Izolacja, kriokonserwacja i hodowla ludzkich komórek nabłonka owodni do zastosowań klinicznych

Opisany tutaj jest protokół do izolacji i dalszego badania naciekających leukocytów decidua basalis i decidua parietalis - ludzkiego interfejsu matczyno-płodowego. Protokół ten utrzymuje integralność markerów powierzchniowych komórek i daje wystarczającą ilość żywotnych komórek do dalszych zastosowań, co udowodniono w analizie cytometrii przepływowej.

Izolacja leukocytów z ludzkiego interfejsu matka-płód

Opisany tutaj jest protokół do izolowania i analizy naciekających leukocytów tkanek na styku matki i płodu (macica, decidua i łożysko) myszy. Protokół ten zachowuje integralność większości markerów powierzchniowych komórek i zapewnia wystarczającą liczbę żywotnych komórek do dalszych zastosowań, w tym analizy cytometrii przepływowej.

Izolacja leukocytów z tkanek myszy na granicy matczyno-płodowej

Ten protokół opisuje metodę efektywnej transfekcji siRNA w świeżo wyizolowanych ludzkich cytotrofoblastach kosmkowych za pomocą mikroporacji i identyfikacji kompleksów DNA-białko w tych komórkach. Transfekowane komórki mogą być monitorowane za pomocą analiz Western blot i EMSA podczas 4-dniowego czasu hodowli.

Transfekcja siRNA i analizy EMSA na świeżo wyizolowanych ludzkich cytotrofoblastach kosmkowych

Tutaj opisujemy metody preparowania tkanek płodowych i matczynych z ludzkiego łożyska, a następnie izolacji i ekspansji mezenchymalnych komórek macierzystych/zrębowych (MSC) z tych tkanek.

Izolacja i ekspansja mezenchymalnych komórek macierzystych/zrębowych pochodzących z ludzkiej tkanki łożyska

Ten manuskrypt przedstawia unikalny model in vitro immunooczyszczanych ludzkich komórek cytopifoblastu kosmkowego hodowanych w warunkach hipoksji/reoksygenacji. Model ten jest odpowiedni do badania ochronnego wpływu obiecujących metod leczenia, takich jak melatonina, na powikłania ciąży związane ze zwiększonym stresem oksydacyjnym i zmienioną funkcją łożyska.

Ludzki model hodowli komórek trofoblastu pierwotnego w celu zbadania ochronnego działania melatoniny przed zakłóceniami wywołanymi niedotlenieniem/reoksygenacją

To badanie przedstawia zweryfikowaną i zoptymalizowaną procedurę izolacji i hodowli ludzkich komórek zrębu endometrium do przeprowadzenia testu decydualizacji in vitro. Co więcej, badanie to dostarcza szczegółowej metody skutecznego knockdown określonego genu za pomocą siRNA w ludzkich komórkach zrębu endometrium.

Izolacja ludzkich komórek zrębu endometrium do dendualizacji in vitro

Ten protokół umożliwia oczyszczanie, charakteryzację i hodowlę pierwotnych trophoblastów pozabłonowych HLA-G+ (EVT) z łożyska podstawnego i błony kosmówkowej ludzkich łożysk końcowych. Pierwotne kultury EVT utrzymują żywotność przez 96 h, co pozwala na współhodowlę z dopasowanymi do próbek komórkami układu odpornościowego matki oraz następcze analizy przepływowe cytometryczne i molekularne ich interakcji.

Oczyszczanie pozabłonkowych trofoblastów HLA-G+ z ludzkich tkanek łożyska w okresie ciąży do fenotypowań i analizy funkcjonalnej

Poznaj metodę izolacji pierwotnych ludzkich komórek liściastych z błon płodowych łożysk donoszonych. Technika ta umożliwia badania nad implantacją blastocysty i patologiami ciąży.

Izolacja pierwotnych ludzkich komórek liściastych z błon płodowych łożysk donoszonych

Przeglądaj więcej filmów