Name: Fluorescencyjna tomografia molekularna do obrazowania in vivo ksenoprzeszczepów glejaka (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 52 s
Description: Poznaj nieinwazyjną tomografię fluorescencyjną FMT do obrazowania glejaka in vivo. Ta metoda pozwala monitorować dynamikę guza i odpowiedź na leczenie w czasie rzeczywistym u myszy.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Dr. Frederickowi Langowi, MD Anderson Cancer Center za neurosfery GBM-PDX. Praca ta była wspierana przez Defeat GBM Research Collaborative, spółkę zależną National Brain Tumor Society (Frank Furnari), R01-NS080939 (Frank Furnari), Fundację Jamesa S. McDonnella (Frank Furnari); Jorge Benitez otrzymał nagrodę od Amerykańskiego Towarzystwa Nowotworów Mózgu (ABTA); Ciro Zanca był częściowo wspierany przez amerykańsko-włoską fundację na rzecz walki z rakiem. Frank Furnari otrzymuje wynagrodzenie i dodatkowe wsparcie od Ludwig Institute for Cancer Research.

Wykorzystanie eksperymentalnych zwierząt badawczych i czynników zakaźnych, takich jak lentiwirus, do transdukcji komórek rakowych, wymaga uprzedniej zgody instytucjonalnego programu opieki nad zwierzętami oraz instytucjonalnego komitetu ds. bezpieczeństwa biologicznego. Protokół ten jest zgodny z wytycznymi dotyczącymi opieki nad zwierzętami Uniwersytetu Kalifornijskiego w San Diego (UCSD).
1. Znakowanie komórek glejaka za pomocą konstruktu FP635 lub FP720
<ol>
	<li>Wyprodukuj i oczyść lentiwirusa zgodnie z protokołem opisanym przez Tiscornia i wsp.12</li>
	<li>Hodowla około 2,0 x 106 komórek z ludzkiej linii komórkowej glejaka z DMEM plus 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) w 15-centymetrowym naczyniu; lub hodowla 2,0 x 106 sfer ludzkiego glejaka pochodzącego od pacjenta (GBM-PDX) z DMEM/F12 1:1 z suplementem B27 plus ludzkim rekombinowanym naskórkowym czynnikiem wzrostu (EGF; 20 ng / ml) i FGF (10 ng / ml) w kolbie T75.</li>
	<li>Utrzymuj wszystkie komórki w temperaturze 37 °C, 5% CO2 i 100% wilgotności względnej.</li>
	<li>Oddziel komórki.
	<ol>
		<li>W przypadku komórek glejaka: usuń supernatant z płytek i dodaj 3-5 ml trypsyny 1X do komórek glejaka.</li>
		<li>W przypadku kulek GBM: zebrać komórki, pipetując je do probówki o pojemności 15 ml.
		<ol>
			<li>Wirować kulki GBM przy 200 x g przez 5 minut za pomocą wirówki stołowej w temperaturze pokojowej.</li>
			<li>Usunąć supernatant i dodać 3-5 ml roztworu do oddzielania komórek.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Inkubować wszystkie komórki w temperaturze 37 °C przez 10-15 minut.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ostrożnie rozdzielić komórki, pipetując kilkakrotnie w górę i w dół (upewnić się, że kulki i komórki glejaka są całkowicie zdysocjowane) i wirować w dół z prędkością 200 x g przez 5 minut.</li>
	<li>Usunąć supernatant i ponownie zawiesić komórki za pomocą 5 ml pożywki, kilkakrotnie pipetując w górę i w dół. Określ żywotność komórek przez wykluczenie błękitu trypanowego.</li>
	<li>Płytka 1,0 x 106 komórek docelowych w 10-centymetrowym naczyniu z 5 ml pożywki przez pipetowanie.</li>
	<li>Transdukcja komórek za pomocą lentiwirusa wykazującego ekspresję białek fluorescencyjnych przy wielokrotności infekcji (MOI) 5, jak opisano przez Tiscornia i wsp.12 i inkubować w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Po 24 godzinach usunąć pożywkę z transdukowanych komórek, dodać 5 ml świeżej pożywki i inkubować przez dodatkowe 48 godzin w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Dysocjować zakażone komórki w zawiesinę jednokomórkową, jak opisano w krokach 1.4-1.6. Odwirować komórki w temperaturze 200 x g przez 5 minut i ponownie zawiesić w 500 μl roztworu sortującego (sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) z 1% FBS).</li>
	<li>Odpipetować zawiesinę komórek do probówek FACS. Wybarwić komórki 1 μl/ml dichlorowodorku 4',6-diamidino-2-fenyloindolu (DAPI), aby wykluczyć martwe komórki. Kontrole ujemne są wymagane do ustawienia bramek cytometru przepływowego (komórki nietransdukowane i komórki nietransdukowane/barwione DAPI).</li>
	<li>Sortuj komórki fluorescencyjnie dodatnie/DAPI-ujemne do roztworu sortującego, jak opisano przez Basu i wsp.13, i zbierz posortowane komórki do stożkowej probówki o pojemności 15 ml.</li>
	<li>Odwirowywać posortowane komórki w ilości 200 x g przez 5 minut, usunąć supernatant i ponownie zawiesić w 5 ml pożywki hodowlanej. Posortowane komórki umieścić w 10-centymetrowym naczyniu, pipetując. Inkubować w temperaturze 37 °C przez co najmniej 48–72 godziny.</li>
	<li>Rozwiń posortowane komórki, dysocjując komórki zgodnie z krokami 1.4-1.6 i posiewając je w wielu szalkach do eksperymentów in vivo. 
	UWAGA: Aby uzyskać więcej informacji na temat przygotowania i oczyszczania sortowania komórek, zobacz Basu i wsp.13</li>
</ol>
2. Wewnątrzczaszkowe wstrzykiwanie komórek glejaka oznaczonych iRFP myszom z niedoborem odporności
UWAGA: Przed rozpoczęciem operacji upewnij się, że sala operacyjna i narzędzia są czyste do zabiegu. Do wstrzyknięć wewnątrzczaszkowych należy stosować samce lub samice myszy z niedoborem odporności atymiczne nagie (Foxn1nu) w wieku 4-5 tygodni i 17-19 g. Zwierzęta powinny być trzymane w pomieszczeniach przez co najmniej 3 dni po przyjeździe i przed zabiegiem.
<ol>
	<li>Przygotowanie komórek
	<ol>
		<li>Zebrać i zdysocjować fluorescencyjne dodatnie komórki glejaka do zawiesiny jednokomórkowej (kroki 1.4-1.6) i ponownie zawiesić 0,5 lub 1,0 x 106 komórek w 2-5 μl PBS na wstrzyknięcie na zwierzę. Odpipetować zawiesinę komórek do probówki mikrowirówki o pojemności 1,5 ml i umieścić na lodzie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie i podawanie znieczulenia
	<ol>
		<li>Przygotować 200 μl roztworu soli fizjologicznej zawierającego ketaminę (100 mg/kg) i ksylazynę (10 mg/kg) na 20 gramów masy ciała myszy. Zważ zwierzęta i oblicz odpowiednią dawkę znieczulenia.</li>
		<li>Zapewnij dootrzewnowe wstrzyknięcie znieczulenia i nałóż maść okulistyczną na oczy, aby zapobiec odwodnieniu. Aby uzyskać więcej informacji na temat tego kroku, zobacz Kathleen i wsp.14 Umieść zwierzę na podkładce termicznej z podgrzaną wodą o temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Sprawdź, czy zwierzęta są znieczulone, monitorując reakcję na uszczypnięcie palca u nogi (odruch pedałowania), zwykle w ciągu 5-10 minut.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Iniekcja wewnątrzczaszkowa
	<ol>
		<li>Załadować strzykawkę Hamiltona o pojemności 5 μl (igła z końcówką) z zawiesiną komórek i zamontować w uchwycie sondy.</li>
		<li>Umieść mysz w ramce stereotaktycznej dla małych zwierząt i przymocuj głowę za pomocą nauszników i adaptera siekaczy, postępując zgodnie ze szczegółami opisanymi przez Cetina i wsp.15</li>
		<li>Zdezynfekuj głowę 70% roztworem etanolu i betadyny. Upewnij się, że pole operacyjne jest całkowicie sterylne. Wykonaj środkowe nacięcie małym skalpelem i oddziel skórę i tkanki łączne.</li>
		<li>Umieścić strzykawkę Hamiltona na punkcie bregma za pomocą mikromanipulatora.</li>
		<li>Przesunąć uchwyt sondy o 1.0 mm przednio-tylny i 2.0 mm w bok od punktu bregma. Zaznacz tę pozycję ołówkiem.</li>
		<li>W tym miejscu ostrożnie wykonaj otwór w czaszce za pomocą ręcznego wiertła z mikrosilnikiem, wywierając lekki nacisk w dół, aż naczynia krwionośne staną się widoczne. Nie należy zaburzać pajęczynówki i miąższu mózgu.</li>
		<li>Wprowadzić igłę do otworu na zadziory i przesunąć się 3,0 mm poniżej powierzchni zadziorów.</li>
		<li>Ustawić objętość (2-5 μl) i natężenie przepływu (1 μl/min) iniekcji za pomocą zmotoryzowanego wtryskiwacza stereotaktycznego lub ręcznie wykonać wstrzyknięcie.</li>
		<li>Po wstrzyknięciu należy stopniowo usuwać igłę, wznosząc się o 1,0 mm co 1 minutę i oczyścić miejsce wstrzyknięcia 70% etanolem.</li>
		<li>Zamknij ranę skóry za pomocą zszywek chirurgicznych lub wykonując szwy chirurgiczne (często nazywane szwami) i zobacz Kathleen i wsp.14, aby uzyskać więcej informacji.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Odzyskiwanie zwierząt
	<ol>
		<li>Przenieś zwierzę na wodną poduszkę termiczną (37 °C) i monitoruj temperaturę ciała, częstość oddechów i tętno, aż do pełnego wyzdrowienia. Podawaj analgezję zgodnie ze standardowymi protokołami. 
		UWAGA: Aby uzyskać więcej informacji na temat procedury stereotaktycznej, operacji i współrzędnych, zobacz inne raporty5,14,15.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Obrazowanie FMT
UWAGA: Zgodnie z celem eksperymentu, komórki glejaka wielopostaciowego oznaczone iRFP mogą być monitorowane in vivo przed, w trakcie lub po leczeniu. W celu obrazowania należy znieczulić zwierzęta za pomocą komory indukcyjnej izofluranu, utrzymać w kasecie obrazowania podczas skanowania i zobrazować w stacji dokującej imagera FMT.
<ol>
	<li>Wyjąć zwierzę z klatki i umieścić je w komorze indukcyjnej izofluranu. Zamknij komorę i włącz przepływ tlenu i parownik na 3-5%.</li>
	<li>Monitoruj zwierzę aż do całkowitego znieczulenia, zwykle w ciągu 1-2 minut. Nieprzytomne zwierzęta nie powinny reagować na bodźce zewnętrzne.</li>
	<li>Wyjmij znieczulone zwierzę z komory i umieść je w kasecie obrazowania, umieszczając najpierw adapter głowy, a następnie kładąc zwierzę przodem do dołu. Upewnij się, że głowica znajduje się na środku kasety.</li>
	<li>Umieść górną płytę kasety na górze i dokręć pokrętła regulacyjne do 17 mm.</li>
	<li>Gdy zwierzę jest już zabezpieczone w kasecie obrazowej, przystąp do obrazowania, wkładając kasetę do wewnętrznej stacji dokującej kamery FMT, gdzie izofluran jest pompowany, aby utrzymać zwierzę w stanie znieczulenia.</li>
	<li>Uruchom oprogramowanie imagera i analizatora, klikając dwukrotnie ikonę oprogramowania.</li>
	<li>W oknie "Eksperymentalne" wybierz "Baza danych" i "Grupa badawcza".</li>
	<li>Przejdź do zakładki "Skanuj" i wybierz temat do obrazu, klikając "wybierz temat". Wybierz także kanał laserowy w panelu "Kanał laserowy". W przypadku ogniw oznaczonych FP635 wybierz "kanał laserowy 635 nm", a w przypadku ogniw oznaczonych FP720 wybierz "kanał laserowy 680 nm".</li>
	<li>Uzyskaj obraz, klikając opcję "Przechwyć" w oknie "Karta Skanuj". Następnie dostosuj pole skanowania, klikając i przeciągając pole skanowania na przechwyconym obrazie do określonej liczby lokalizacji źródłowych, zwykle w zakresie 20-25 źródeł po stronie ipsilateralnej.</li>
	<li>Zaznacz opcję "Dodaj do kolejki rekonstrukcji" i naciśnij "Skanuj" w oknie "Zakładka Skanuj".</li>
	<li>Poczekaj na zakończenie skanowania, a następnie wyjmij kasetę z obrazem ze stacji dokującej.</li>
	<li>Zdejmij górną płytę kasety i umieść zwierzę z powrotem w klatce.</li>
	<li>Powtórzyć kroki 3.1-3.12 dla pozostałych zwierząt.</li>
</ol>
4. Analiza obrazu
<ol>
	<li>W oprogramowaniu imagera i analizatora wybierz okno "Karta Analiza".</li>
	<li>Załaduj zbiór danych i temat do analizy, klikając przycisk "+" w panelu "Wybór zestawu danych" w oknie "Karta Analiza".</li>
	<li>Po załadowaniu obrazu w oknie "Zakładka Analiza" należy przeprowadzić analizę obszaru zainteresowania (ROI), wybierając ikonę elipsoidy, znajdującą się w lewym górnym rogu okna "Zakładka Analiza".</li>
	<li>Dostosuj próg do zera w panelu "dane statystyczne", klikając prawym przyciskiem myszy kolumnę "próg" w oknie "zakładka Analiza".</li>
	<li>Całkowita wartość w panelu "Dane statystyczne" reprezentuje sygnał z komórek glejaka znakowanego fluorescencyjnie wszczepionych do mózgu myszy.</li>
	<li>Powtórzyć kroki 4.2-4.4 dla pozostałych zwierząt. Załaduj lub usuń nowy temat, klikając odpowiednio przycisk "+" lub "−" w panelu "Wybór zestawu danych" w oknie "Karta Analiza". 
	UWAGA: Aby uzyskać więcej informacji na temat obrazowania FMT i działania oprogramowania, zobacz20.</li>
</ol>

<ol><li>Ostrom, Q. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CBTRUS+Statistical+Report%3A+Primary+Brain+and+Other+Central+Nervous+System+Tumors+Diagnosed+in+the+United+States+in+2009-2013%5BTitle%5D)+AND+%22Neuro-Oncology%22%5BJournal%5D)">CBTRUS Statistical Report: Primary Brain and Other Central Nervous System Tumors Diagnosed in the United States in 2009-2013.</a> Neuro-Oncology. 18 (suppl_5), v1-v75 (2016).</li>
<li>Pauli, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Personalized+In+Vitro+and+In+Vivo+Cancer+Models+to+Guide+Precision+Medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discovery%22%5BJournal%5D)">Personalized In Vitro and In Vivo Cancer Models to Guide Precision Medicine.</a> Cancer Discovery. 7 (5), 462-477 (2017).</li>
<li>Stewart, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+Utility+of+Patient-Derived+Xenografts+to+Determine+Biomarkers+of+Prognosis+and+Map+Resistance+Pathways+in+EGFR-Mutant+Lung+Adenocarcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Clinical Utility of Patient-Derived Xenografts to Determine Biomarkers of Prognosis and Map Resistance Pathways in EGFR-Mutant Lung Adenocarcinoma.</a> Journal of Clinical Oncology. 33 (22), 2472-2480 (2015).</li>
<li>Gao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+screening+using+patient-derived+tumor+xenografts+to+predict+clinical+trial+drug+response%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">High-throughput screening using patient-derived tumor xenografts to predict clinical trial drug response.</a> Nat Med. 21 (11), 1318-1325 (2015).</li>
<li>Ozawa, T., James, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishing+Intracranial+Brain+Tumor+Xenografts+With+Subsequent+Analysis+of+Tumor+Growth+and+Response+to+Therapy+using+Bioluminescence+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Establishing Intracranial Brain Tumor Xenografts With Subsequent Analysis of Tumor Growth and Response to Therapy using Bioluminescence Imaging.</a> J. Vis. Exp. (41), e1986(2010).</li>
<li>Kondo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+experimental+brainstem+tumor+model+using+in+vivo+bioluminescence+imaging+in+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Child%27s+Nervous+System%22%5BJournal%5D)">An experimental brainstem tumor model using in vivo bioluminescence imaging in rat.</a> Child's Nervous System. 25 (5), 527-533 (2009).</li>
<li>Nyati, S., Young, G., Ross, B. D., Rehemtulla, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNyati%2C+S+%22ATM+Kinase%3A+Methods+and+Protocols%22">ATM Kinase: Methods and Protocols</a>. Kozlov, S. V. , Springer. New York. 97-111 (2017).</li>
<li>Kondo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Longitudinal+assessment+of+regional+directed+delivery+in+a+rodent+malignant+glioma+model%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosurg+Pediatr%22%5BJournal%5D)">Longitudinal assessment of regional directed delivery in a rodent malignant glioma model.</a> J Neurosurg Pediatr. 4 (6), 592-598 (2009).</li>
<li>Badr, C. E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBadr%2C+CE+%22Bioluminescent+Imaging%3A+Methods+and+Protocols%22">Bioluminescent Imaging: Methods and Protocols</a>. Badr, C. E. , Humana Press. 1-18 (2014).</li>
<li>Shcherbakova, D. M., Verkhusha, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Near-infrared+fluorescent+proteins+for+multicolor+in+vivo+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Meth%22%5BJournal%5D)">Near-infrared fluorescent proteins for multicolor in vivo imaging.</a> Nat Meth. 10 (8), 751-754 (2013).</li>
<li>Filonov, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bright+and+stable+near-infrared+fluorescent+protein+for+in+vivo+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotech%22%5BJournal%5D)">Bright and stable near-infrared fluorescent protein for in vivo imaging.</a> Nat Biotech. 29 (8), 757-761 (2011).</li>
<li>Tiscornia, G., Singer, O., Verma, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+and+purification+of+lentiviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protocols%22%5BJournal%5D)">Production and purification of lentiviral vectors.</a> Nat. Protocols. 1 (1), 241-245 (2006).</li>
<li>Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+Specific+Cell+Population+by+Fluorescence+Activated+Cell+Sorting+%28FACS%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS).</a> J. Vis. Exp. (41), e1546(2010).</li>
<li>Pritchett-Corning, K. R., Luo, Y., Mulder, G. B., White, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+rodent+surgery+for+the+new+surgeon%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Principles of rodent surgery for the new surgeon.</a> J Vis Exp. (47), (2011).</li>
<li>Cetin, A., Komai, S., Eliava, M., Seeburg, P. H., Osten, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stereotaxic+gene+delivery+in+the+rodent+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protocols%22%5BJournal%5D)">Stereotaxic gene delivery in the rodent brain.</a> Nat. Protocols. 1 (6), 3166-3173 (2007).</li>
<li>Benitez, J. A., et al. <a target="_blank" href="https://www.nature.com/articles/ncomms15223">PTEN regulates glioblastoma oncogenesis through chromatin-associated complexes of DAXX and histone H3.3.</a> Nature Communications. 8, 15223(2017).</li>
<li>Kirschner, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+of+Orthotopic+Glioblastoma+Xenografts+in+Mice+Using+a+Clinical+CT+Scanner%3A+Comparison+with+Micro-CT+and+Histology%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">Imaging of Orthotopic Glioblastoma Xenografts in Mice Using a Clinical CT Scanner: Comparison with Micro-CT and Histology.</a> PLOS ONE. 11 (11), e0165994(2016).</li>
<li>Mannheim, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardization+of+Small+Animal+Imaging-Current+Status+and+Future+Prospects%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Imaging+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Standardization of Small Animal Imaging-Current Status and Future Prospects.</a> Molecular Imaging and Biology. , (2017).</li>
<li>Engblom, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoblasts+remotely+supply+lung+tumors+with+cancer-promoting+SiglecFhigh+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Osteoblasts remotely supply lung tumors with cancer-promoting SiglecFhigh neutrophils.</a> Science. 358 (6367), (2017).</li>
<li>Lauber, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((State+of+the+art+in+vivo+imaging+techniques+for+laboratory+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Animals%22%5BJournal%5D)">State of the art in vivo imaging techniques for laboratory animals.</a> Laboratory Animals. 51 (5), 465-478 (2017).</li>
<li>Zanca, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glioblastoma+cellular+cross-talk+converges+on+NF-%CE%BAB+to+attenuate+EGFR+inhibitor+sensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Glioblastoma cellular cross-talk converges on NF-κB to attenuate EGFR inhibitor sensitivity.</a> Genes & Development. 31 (12), 1212-1227 (2017).</li>
<li>Villa, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+LXR-Cholesterol+Axis+Creates+a+Metabolic+Co-Dependency+for+Brain+Cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">An LXR-Cholesterol Axis Creates a Metabolic Co-Dependency for Brain Cancers.</a> Cancer Cell. 30 (5), 683-693 (2016).</li>
<li>Liu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EGFR+Mutation+Promotes+Glioblastoma+through+Epigenome+and+Transcription+Factor+Network+Remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">EGFR Mutation Promotes Glioblastoma through Epigenome and Transcription Factor Network Remodeling.</a> Molecular Cell. 60 (2), 307-318 (2015).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Ksenoprzeszczepy nowotworowe są szeroko stosowane w badaniach nad rakiem i opracowano szereg dobrze znanych technik obrazowania: BLI; rezonans magnetyczny (MRI); pozytonowa tomografia emisyjna (PET), tomografia komputerowa (CT); FMT. Każde z tych podejść ma swoje wady i zalety, ale ostatecznie uzupełniają się nawzajem pod względem rodzaju dostarczanych informacji. Jedną z najczęściej stosowanych technologii obrazowania in vivo jest BLI 5,6,7,8.</sup...

Rak jest jedną z głównych przyczyn zgonów związanych z chorobami u ludzi w uprzemysłowionym świecie. Ze względu na niezwykle wysoką liczbę ofiar śmiertelnych pilnie potrzebne są nowe metody leczenia. Glejak wielopostaciowy (GBM) jest niezwykle śmiertelnym typem raka mózgu, składającym się z heterogennych populacji guza mózgu, komórek zrębu i komórek odpornościowych. Według Centralnego Rejestru Nowotworów Mózgu w USA, częstość występowania pierwotnych złośliwych i niezłośliwych guzów mózgu wynosi około 22 przypadków na 100 000. Oczekuje się, że w 2017 roku w USA zostanie zdiagnozowanych około 11 000 nowych przypadków1.
Badania przedkliniczne badają prawdopodobieństwo skuteczności leku, procedury lub leczenia przed testami na ludziach. Jednym z pierwszych etapów badań przedklinicznych jest identyfikacja potencjalnych celów molekularnych do leczenia farmakologicznego przy użyciu komórek nowotworowych wszczepionych do organizmu gospodarza, zdefiniowanych jako modele ludzkiego ksenoprzeszczepu. W tym kontekście, modele ksenoprzeszczepów wewnątrzczaszkowego guza mózgu wykorzystujące ksenoprzeszczepy pochodzące od pacjentów (PDX) są szeroko stosowane do badania biologii, progresji, ewolucji i odpowiedzi terapeutycznej guza mózgu, a ostatnio do opracowywania biomarkerów, badań przesiewowych leków i medycyny spersonalizowanej2,3,4.
Jedną z najbardziej przystępnych cenowo i nieinwazyjnych metod obrazowania in vivo do monitorowania wewnątrzczaszkowych ksenoprzeszczepów jest obrazowanie bioluminescencyjne (BLI)5,6,7,8. Jednak niektóre ograniczenia BLI obejmują podawanie i dostępność substratu, stabilność enzymu oraz wygaszanie i rozpraszanie światła podczas akwizycji obrazowania9. W tym miejscu przedstawiamy FMT w podczerwieni jako alternatywną metodę obrazowania do monitorowania przedklinicznych modeli glejaka. W tej metodzie akwizycja sygnału i kwantyfikacja wszczepionych wewnątrzczaszkowo PDX, wyrażających białko fluorescencyjne bliskiej podczerwieni iRFP72010,11 (odtąd określane jako FP720) lub turboFP635 (odtąd określane jako FP635), odbywa się za pomocą systemu obrazowania FMT. Korzystając z technologii FMT, guzy ortotopowe mogą być monitorowane in vivo przed, w trakcie lub po leczeniu, w sposób nieinwazyjny, wolny od substratów i ilościowy do obserwacji przedklinicznych.

<table><tbody><tr><td>DMEM/Wysoki poziom glukozy&nbsp;</td><td>HyClone/GE</td><td>SH30022.1</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12 1:1&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>11320-082</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>HyClone/GE</td><td>SH30071.03</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Innowacyjne technologie komórkowe</td><td>AT-104</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>HyClone/GE</td><td>SH30236.01</td><td></td></tr><tr><td>B27 suplement</td><td>Gibco</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>ludzka rekombinowana EGF&nbsp;</td><td>Stemcell Technologies</td><td>2633</td><td></td></tr><tr><td>rekombinowany ludzki FGF</td><td>Stemcell Technologies</td><td>2634</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Corning</td><td>21-031-00</td><td></td></tr><tr><td>Probówki FACS</td><td>Falcon</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>62248</td><td></td></tr><tr><td>Blasticidin</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A1113903</td><td></td></tr><tr><td>p24 ELISA&nbsp;</td><td>Clontech</td><td>632200</td><td></td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>Akorn</td><td>NDC 59399-110-20</td><td></td></tr><tr><td>Ketamine</td><td>Zoetis</td><td>NADA 043-403</td><td>Substancja kontrolowana</td></tr><tr><td>Maść</td><td>Dechron</td><td>NDC 17033-211-38</td><td></td></tr><tr><td>Szew wchłanialny</td><td>CpMedical</td><td>VQ392</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka 5 ul</td><td>Hamilton</td><td>26200-U</td><td>Numer katalogowy sprzedawany przez Sigma-Aldrich</td></tr><tr><td>Cell Sorter</td><td>Sony</td><td>SH8007</td><td></td></tr><tr><td>Mysz stereotaktyczna ramka&nbsp;</td><td>Stoelting</td><td>51730</td><td></td></tr><tr><td>Zmotoryzowany wtryskiwacz stereotaktyczny</td><td>Stoelting</td><td>53311</td><td></td></tr><tr><td>Wiertarka ręczna z mikrosilnikiem</td><td>Foredom</td><td>K1070</td><td></td></tr><tr><td>Podkładka do podgrzewania myszy&nbsp;</td>System tomografii fluorescencyjnej <td>Ken Scientific Corporation</td><td>TP-22G</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Oprogramowanie do obrazowania PerkinElmer</td><td>FMT 2500 XL</td><td></td></tr><tr><td>TrueQuant&nbsp;</td><td>Perkin Elmer&nbsp;</td><td></td><td></td>7005319</tr><tr><td>Ultrawirówka Optima L-80 XP</td><td>Beckman Coulter</td><td>392049</td><td></td></tr><tr><td>Naczynia do hodowli tkankowych 100 mm</td><td>Olympus Plastics</td><td>25-202</td><td></td></tr><tr><td>Naczynia do hodowli tkankowych 150 mm</td><td>Olympus Plastics</td><td>25-203</td><td></td></tr><tr><td>Kolby do hodowli tkankowych T75</td><td>Corning</td><td>430720U</td><td></td></tr><tr><td>50 ml probówki stożkowe</td><td>Corning</td><td>430290</td><td></td></tr><tr><td>Probówki stożkowe 15 ml</td><td>Olympus Plastics</td><td>28-101</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka Avanti J-20</td><td>Beckman Coulter</td><td>J320XP-IM-5</td><td></td></tr><tr><td>Probówka, polipropylen, cienkościenna, 5.0 ml</td> Probówka <td>326819</td><td></td><td>Beckman Coulter</td></tr><tr><td>, cienkościenna, polipropylenowa, 38,5 mL, 25 x 89 mm</td><td>Beckman Coulter</td><td>326823</td><td></td></tr><tr><td>Atymiczne nagie myszy</td><td>Charles River Laboratories</td><td>Kod szczepu&nbsp; 490 (Homozygota)</td><td>Wymagana uprzednia zgoda Instytucjonalnego Programu Opieki nad Zwierzętami oraz Instytucjonalnego Komitetu ds. Bezpieczeństwa Biologicznego.&nbsp; &nbsp; &nbsp;</td></tr></tbody></table>

fluorescencyjna tomografia molekularna do obrazowania in vivo ksenoprzeszczepów glejaka

Fluorescence Molecular Tomography for In Vivo Imaging of Glioblastoma Xenografts

Rakotwórczość to zdolność komórek rakowych do tworzenia masy guza. Szeroko stosowanym podejściem do określenia, czy komórki są rakotwórcze, jest wstrzykiwanie myszom z niedoborem odporności podskórnie komórek rakowych i mierzenie masy guza po tym, jak stanie się on widoczny i wyczuwalny. Iniekcje ortotopowe komórek nowotworowych mają na celu wprowadzenie ksenoprzeszczepu do mikrośrodowiska, które najbardziej przypomina tkankę, z której pochodzi badany guz. Badania nad rakiem mózgu wymagają wewnątrzczaszkowego wstrzyknięcia komórek rakowych, aby umożliwić tworzenie się i analizę guza w unikalnym mikrośrodowisku mózgu. Obrazowanie in vivo ksenoprzeszczepów wewnątrzczaszkowych natychmiast monitoruje masę guza myszy wszczepionych ortotopowo. W tym miejscu przedstawiamy zastosowanie fluorescencyjnej tomografii molekularnej (FMT) ksenoprzeszczepów guza mózgu. Komórki rakowe są najpierw transdukowane białkami fluorescencyjnymi w bliskiej podczerwieni, a następnie wstrzykiwane do mózgu myszy z obniżoną odpornością. Zwierzęta są następnie skanowane w celu uzyskania ilościowych informacji o masie guza przez dłuższy czas. Wstępne znakowanie komórek pozwala na opłacalną, powtarzalną i wiarygodną ocenę ilościową obciążenia guzem u każdej myszy. Wyeliminowaliśmy konieczność wstrzykiwania substratów obrazowych, a tym samym zmniejszyliśmy stres u zwierząt. Ograniczeniem tego podejścia jest niemożność wykrycia bardzo małych mas; Ma jednak lepszą rozdzielczość dla większych mas niż inne techniki. Może być stosowany do oceny skuteczności leczenia farmakologicznego lub zmian genetycznych linii komórkowych glejaka i próbek pobranych od pacjentów.

Komórki glejaka wielopostaciowego U87EGFRvIII (komórki U87 nadmiernie eksponujące wariant III receptora EGF) hodowano zgodnie z krokiem 1.2. Lentiwirusy produkowano i oczyszczano zgodnie z krokiem 1.1. Stężenie wirusa określono za pomocą analizy p24 ELISA. Komórki transdukowano lentiwirusami niosącymi białka fluorescencyjne z zakresu podczerwieni zgodnie z krokiem 1.8. Plazmid kodujący FP72010,1 został udostępniony przez dr. V.V. ...

Ortotopowe wewnątrzczaszkowe wstrzykiwanie komórek nowotworowych było używane w badaniach nad rakiem do badania biologii, progresji, ewolucji i odpowiedzi terapeutycznej guza mózgu. W tym artykule przedstawiamy fluorescencyjną tomografię molekularną ksenoprzeszczepów nowotworowych, która zapewnia obrazowanie przyżyciowe w czasie rzeczywistym i ilościowe określenie masy guza w przedklinicznych modelach glejaka.

Fluorescencyjna tomografia molekularna do obrazowania in vivo ksenoprzeszczepów glejaka

Tumorigenicity is the capability of cancer cells to form a tumor mass. A widely used approach to determine if the cells are tumorigenic is by injecting ...

Ogólnym celem tej procedury eksperymentalnej jest ustanowienie przedklinicznego modelu obrazowania guza mózgu za pomocą fluorescencyjnej tomografii molekularnej lub FMT. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie biologii guzów mózgu, badań nad rakiem i odkrywania leków dotyczących agresywności guza, heterogeniczności i reakcji na leczenie. Główną zaletą tej techniki jest to, że guzy mogą być monitorowane in vivo przed, w trakcie lub po leczeniu w sposób nieinwazyjny, bez szwów i ilościowy.Kolejną zaletą tej techniki jest możliwość zastosowania do innych typów modeli ksenoprzeszczepów wszczepianych w różne narządy zwierzęcia. Zacznij od wysiewu jednej razy 10 do szóstej komórki glejaka w pięciu mililitrach pożywki do 10-centymetrowej pożywki na 24-godzinną inkubację w inkubatorze do hodowli komórkowych. Następnego ranka należy przeprowadzić transdukcję komórek lentiwirusem, powodując ekspresję odpowiedniego białka fluorescencyjnego będącego przedmiotem zainteresowania przy wielokrotności infekcji wynoszącej pięć i zwrócić komórki do inkubatora.Po 24 godzinach zastąp supernatant pięcioma mililitrami świeżej pożywki i inkubuj kulturę przez kolejne 48 godzin. P

fluorescence-molecular-tomography-for-vivo-imaging-glioblastoma

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Ksenoprzeszczepy ludzkich guzów mózgu zmodyfikowane lucyferazą mogą być tworzone wewnątrzczaszkowo u myszy atymicznych, z późniejszym monitorowaniem wzrostu guza i odpowiedzi na terapię za pomocą obrazowania bioluminescencyjnego. W połączeniu z analizą przeżywalności, monitorowanie bioluminescencyjne stanowi niezbędne narzędzie badawcze w badaniach przedklinicznych terapii rozważanych w leczeniu guzów mózgu.

Tworzenie wewnątrzczaszkowych ksenograftów guzów mózgu z późniejszą analizą wzrostu guza i odpowiedzi na terapię z wykorzystaniem obrazowania bioluminescencyjnego

Dośródczaszkowa implantacja komórek GL261 u myszy C57BL/6 powoduje powstanie złośliwych glejaków, które odzwierciedlają wiele cech charakterystycznych dla ludzkiego wielopostaciowego glejakaa. Wykorzystaliśmy komórki GL261 stabilnie wykazujące ekspresję lucyferazy, co pozwoliło nam zastosować obrazowanie in vivo do śledzenia progresji guza. Przedstawiono procedurę chirurgiczną oraz trójwymiarowe obrazowanie in vivo.

Implantacja wewnątrzczaszkowa z następującym obrazowaniem bioluminescencyjnym 3D in vivo glejaków mysich

Dyfuzyjna tomografia fluorescencyjna oferuje stosunkowo niskokosztowe i potencjalnie wysokoprzepustowe podejście do przedklinowego obrazowania guzów in vivo. Przedstawiono metodologię zbierania danych optycznych, kalibracji i rekonstrukcji obrazu dla bezkontaktowego systemu w dziedzinie czasu sterowanego tomografią komputerową, z wykorzystaniem fluorescencyjnego celowania w biomarker nowotworowy – receptor Epidermal Growth Factor Receptor w modelu glejaka u myszy.

Tomografia dyfuzyjna fluorescencji w dziedzinie czasu sterowana tomografią komputerową u małych zwierząt w celu lokalizacji biomarkerów nowotworowych

Opisujemy zintegrowaną metodę precyzyjnej implantacji stereotaktycznej ludzkich komórek wielopostaciowego glejaka do mózgów myszy nago oraz następującego po niej seryjnego obrazowania in vivo w celu monitorowania wzrostu i odpowiedzi na leczenie powstałych ksenograftów.

Stereotaktyczna implantacja wewnątrzczaszkowa i obrazowanie bioluminescencyjne in vivo ksenoprzeszczepów guzów w mysim modelu glioblastoma multiforme

W tym filmie opisujemy protokół dla genetycznie modyfikowanych komórek glejaka do ekspresji białka fluorescencyjnego w podczerwieni lub iRFP. Te znakowane fluorescencyjnie komórki glejaka są przydatne w obrazowaniu tkanek głębokich w celu zrozumienia rozwoju guzów mózgu.

Znakowanie fluorescencyjne komórek glejaka: metoda transfekcji oparta na wektorze lentiwirusowym w celu uzyskania komórek glejaka wyrażających białko fluorescencyjne do obrazowania tkanek głębokich

W tym filmie opisujemy fluorescencyjną tomografię molekularną lub FMT do obrazowania in vivo fluorescencyjnych ksenoprzeszczepów glejaka znakowanego białkiem w modelach mysich. Technika ta jest przydatna do wyjaśnienia efektów terapii przeciwnowotworowych na poziomie molekularnym.

Fluorescencyjna tomografia molekularna: technika obrazowania in vivo ksenoprzeszczepów glejaka znakowanego białkiem fluorescencyjnym w modelu mysim

Źródło: Clark, A.J., et al. Obrazowanie bioluminescencyjne immunokompetentnego modelu zwierzęcego glejaka. J. Vis. Exp. (2016)Ten film przedstawia obrazowanie bioluminescencyjne w celu śledzenia progresji glejaka w immunokompetentnym modelu myszy, przy użyciu komórek nowotworowych eksprymujących lucyferazy i lucyferyny do nieinwazyjnego ilościowego określenia wzrostu guza.

Obrazowanie bioluminescencyjne immunokompetentnego mysiego modelu glejaka

Ustaliliśmy korowy model glejaka ortotopowego u myszy do przyżyciowej mikroskopii dwufotonowej, który podsumowuje ograniczenia biofizyczne, które normalnie występują podczas wzrostu guza. Przewlekłe szklane okienko zastępujące czaszkę nad guzem umożliwia śledzenie postępu guza w czasie za pomocą mikroskopii dwufotonowej.

Ortotopowy mysi model glejaka wielopostaciowego utrzymujący fizyczne ograniczenia miąższu mózgu i nadający się do przyżyciowej mikroskopii dwufotonowej

Komórki glejaka GL261 dostarczają użytecznego immunokompetentnego modelu zwierzęcego glejaka. Celem tego protokołu jest zademonstrowanie właściwych technik monitorowania wzrostu guza wewnątrzczaszkowego za pomocą obrazowania bioluminescencyjnego in vivo oraz zweryfikowanie użyteczności komórek GL261 zmodyfikowanych lucyferazą do badania immunologii guza i podejść immunoterapeutycznych w leczeniu glejaka.

Obrazowanie bioluminescencyjne immunokompetentnego modelu zwierzęcego glejaka

Tutaj używamy obrazowania bioluminescencyjnego, rentgenowskiego i pozytonowej tomografii emisyjnej/tomografii komputerowej, aby zbadać, jak hamowanie aktywności mTOR wpływa na guzy szpiczaka kostnego przeszczepionego szpiczakiem kostnym w modelu ksenoprzeszczepu. Pozwala to na fizjologicznie istotne, nieinwazyjne i multimodalne analizy działania przeciwszpiczaka mózgu terapii ukierunkowanych na guzy szpiczaka kostnego przeszczepione szpiczakiem kostnym in vivo.

Multimodalna bioluminescencyjna i pozytroniczna tomografia emisyjna/tomografia obliczeniowa ksenoprzeszczepów szpiczaka mnogiego szpiku kostnego u myszy NOG

Prezentujemy nowatorskie podejście do dwufotonowej mikroskopii dostarczania przez nowotwór znakowanych fluorescencyjnie nanocząstek tlenku żelaza do glejaka w modelu mysim.

Dwufotonowa mikroskopia przyżyteczna glejaka w modelu mysim

Poznaj nieinwazyjną tomografię fluorescencyjną FMT do obrazowania glejaka in vivo. Ta metoda pozwala monitorować dynamikę guza i odpowiedź na leczenie w czasie rzeczywistym u myszy.

Fluorescencyjna tomografia molekularna do obrazowania in vivo ksenoprzeszczepów glejaka

Przeglądaj więcej filmów