Reorganizacja struktury pętli chromatyny za pośrednictwem CRISPR

Ta metoda może pomóc nam odpowiedzieć na kluczowe pytania związane z ekspresją genów, pokazując nam dokładnie, jak struktura chromatyny wpływa na ekspresję genów i jak organizacja chromatyny reguluje dynamikę transkrypcji. Opracowaliśmy tę technologię, ponieważ chcieliśmy mieć możliwość kontrolowanej zmiany architektury chromosomalnej, aby umożliwić tworzenie pętli chromatyny dalekiego zasięgu. Jednocześnie mają zdolność do odwrócenia kontekstu chromatyny w celu przywrócenia endogennej struktury chromosomalnej.

Ta metoda została zaprojektowana z myślą o łatwości użycia i szerokim zastosowaniu. Wykorzystaliśmy nietoksyczny dimeryzator, a także ortogonalne gatunki dcas9, aby umożliwić szersze zastosowanie systemu. Opracowaliśmy tę metodę, ponieważ chcieliśmy być w stanie odpowiedzieć na odwieczne pytanie, czy ekspresja genów rodzi architekturę chromosomalną, czy też struktura chromosomów prowadzi do zmian w ekspresji genów.

Projektowanie sekwencji RNA przewodnika CRISPR i utrzymanie kultur komórkowych są opisane w protokole tekstowym. Mapy plazmidowe i użyte startery są tam wymienione. Przygotowanie plazmidu należy rozpocząć od zmieszania pięciu mikrogramów lentiwirusowego plazmidu CRISPR z trzema mikrolitrami BsmB1, trzema mikrolitrami fosfatazy alkalicznej, sześcioma mikrolitrami 10-krotnego buforu wytrawiającego i 0,6 mikrolitra świeżo przygotowanego 100-milimolowego DTT.

Doprowadź całkowitą objętość do 60 mikrolitrów podwójnie destylowanej wody i inkubuj mieszaninę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut w celu trawienia i defosforylacji plazmidu. Następnie żel oczyszcza strawiony plazmid w plazmidzie pętlowym i podwójnie destylowanej wodzie. Następnie przygotuj reakcje wyżarzania dla par przewodników RNA.

Połącz jeden mikrolitr każdego przewodnika RNA o stężeniu 100 mikromolów z jednym mikrolitrem 10x buforu ligacyjnego T4, 6,5 mikrolitra podwójnie destylowanej wody i 0,5 mikrolitra T4 PNK, aby uzyskać całkowitą objętość reakcji 10 mikrolitrów. Aby wyżarzać pary przewodników RNA do ich sekwencji docelowych, inkubuj mieszaniny w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut, a następnie inkubuj w temperaturze 95 stopni Celsjusza przez 5 minut, a następnie stopniowo obniżaj temperaturę do 25 stopni Celsjusza, zmniejszając ją o pięć stopni Celsjusza na minutę. Następnie rozcieńczyć wyżarzane przewodnikowe RNA w ilości od jednego do dwustu w wodzie podwójnie destylowanej.

Teraz przygotuj dwie reakcje podwiązania. Wymieszaj jeden mikrolitr strawionego plazmidu z 0,5 mikrolitra rozcieńczonego przewodnika okołołopatkowego RNA, 2,5 mikrolitra 2x buforu ligacyjnego, jednym mikrolitrem podwójnie destylowanej wody i 0,5 mikrolitra ligazy. Inkubować reakcje w temperaturze pokojowej przez 10 minut, aby podwiązać plazmid trawiony przez przewodniki BsmB1.

Następnie przekształć nowo ligowany plazmid w stabilne trzy bakterie i amplifikuj bakterie za pomocą dowolnej metody przygotowania plazmidu. Na sześciodołkowej płytce, na dołek, wysiew 750 000 limfocytów T 2n3 w DMEM z 10% FBS i 1% paciorkowcem pióra. Użyj jednego dołka na każdą konstrukcję i inkubuj komórki przez 24 godziny.

Następnego dnia zmień pożywkę na świeży antybiotyk wolny od DMEM z 10% FBS. Zaraz po zmianie pożywki dla każdej studzienki posianych komórek należy przygotować probówkę z mieszaniną do produkcji lentiwirusa. Na każdą reakcję rozcieńczyć 11 mikrolitrów odczynnika do transfekcji na bazie lipidów ze 150 mikrolitrami pożywki Opti-MEM dla każdej reakcji.

Następnie w oddzielnych probówkach przygotuj DNA. Połączyć dwa mikrogramy plazmidu wektora lentiwirusowego CLOud9 z dwoma mikrogramami innych składników opakowania lentiwirusowego. Rozcieńczyć tę mieszaninę w 150 mikrolitrach pożywki Opti-MEM.

Następnie połączyć równe objętości rozcieńczonej mieszaniny plazmidu lentiwirusowego w rozcieńczonym odczynniku do transfekcji na bazie lipidów i inkubować mieszaniny przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Następnie do każdej studzienki komórek dodaj jedną probówkę przygotowanych mieszanin i kontynuuj inkubację. 48 godzin później przenieś pożywkę do produkcji wirusa z dołków płytkowych do stożków i wiruj je z prędkością 300 g przez pięć minut.

Następnie przenieść supernatant do świeżych probówek, aby wyrzucić granulowane resztki. Teraz natychmiast użyj pożywki do produkcji wirusa do transdukcji komórek docelowych lub zamroź ją w temperaturze 80 stopni Celsjusza do wykorzystania w przyszłości. Zacznij od dodania 250 mikrolitrów każdego interesującego konstruktu wirusowego, który w tym przypadku składa się z komplementarnych plazmidów CLOud9 do 50-mililitrowej stożkowej probówki zawierającej 80 000 komórek.

Następnie dodaj tyle polibrenu, aby wynosił od jednego do ośmiu mikrogramów na mililitr w roztworze. Następnie dostosuj całkowitą objętość w każdej probówce do jednego mililitra za pomocą pożywki bez antybiotyków. Teraz, aby zwiększyć kontakt między cząsteczkami wirusa a komórkami, wiruj komórki pod ciśnieniem 800 g przez 30 minut w temperaturze pokojowej.

Następnie ponownie zawiesić komórki w supernatancie przez pipetowanie. Następnie załadować zawiesinę komórek na płytki hodowlane i inkubować je przez 24 godziny. Następnego dnia zbierz komórki.

Odwirować je w 300 g przez pięć minut w temperaturze pokojowej i ponownie zawiesić w normalnym podłożu. Następnego dnia dodaj puromycynę i higromycynę do pożywki, aby wybrać podwójnie transdukowane komórki. Odpowiednie stężenie antybiotyku powinno być wcześniej określone dla każdego typu komórek.

Następnie należy inkubować komórki w pożywce selekcyjnej przez co najmniej trzy dni przed przystąpieniem do dalszych aplikacji i kontynuować konserwację komórek i pożywki selekcyjnej. Aby dimeryzować wybrane i transdukowane komórki CLOud9, dodaj jeden milimolowy ABA do naczynia hodowlanego. W przypadku kontroli dodaj DMSO, a następnie utrzymuj komórki za pomocą ABA lub DMSO przez czas trwania eksperymentu.

Aby odwrócić dimeryzację, umyj komórki wystarczającą ilością PBS, aby dwukrotnie pokryć powierzchnię płytki. Następnie hoduj komórki w pożywkach wolnych od ABA, aby utrzymać je w stanie niedimeryzowanym. Właściwe zastosowanie systemu CLOud9 indukuje odwracalny kontakt komplementarnych konstruktów CSA i CSP CLOud9 poprzez dodanie lub usunięcie ABA do pożywki do hodowli komórkowych.

Konstrukty CSA i CSP są lokalizowane w odpowiednich regionach genomu przy użyciu standardowej przewodnika RNAse CRISPR. Zastosowano immunoprecypitację chromatyny, a następnie ilościową reakcję PCR, aby zapewnić dokładną lokalizację w celu każdego składnika CLOud9. Dodatkowo koimmunoprecypacja z ABA i bez ABA weryfikowała dimeryzację CSA i CSP w obecności liganda, a także odwracalność w przypadku braku liganda.

Po dimeryzacji ABA większy kontakt między beta-globiną a LCR mierzono poprzez potwierdzenie wychwytywania chromosomów. Nie zaobserwowano tego jednak w kontrolkach zawierających ani tylko CSA, ani tylko konstrukcję CSP. Stworzenie interakcji beta-globina LCR nie wyeliminowało całkowicie endogennego kontaktu z globiną LCR.

Dodał tylko do oryginalnego kontaktu. Wzrost kontaktów LCR beta-globiny obserwowano przez 72 godziny dimeryzacji, niezależnie od dokładnego regionu w docelowym LCR lub regionie promotora beta-globiny. Na koniec potwierdzono odwracalność systemu za pomocą potwierdzenia potwierdzenia chromosomu po usunięciu ABA.

Spowodowało to całkowite odnowienie potwierdzenia endogennego. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o codziennej zmianie pożywki i dodawaniu świeżych dimeryzowanych komórek transdukowanych CLOud9. Nie zapominaj, że praca z lentiwirusem może być niezwykle niebezpieczna i podczas wykonywania tej procedury należy zawsze podejmować wszelkie środki ostrożności stosowane w BSL 2.