Name: Reorganizacja struktury pętli chromatyny za pośrednictwem CRISPR (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-14T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 20 s
Description: Poznaj metodę CLOuD9 do reorganizacji pętli chromatyny za pomocą CRISPR-dCas9 w celu modulacji ekspresji genów. Technika umożliwia odwracalne zmiany architektury chromosomowej i badanie dynamiki transkrypcyjnej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy H. Chang, T. Oro, S. Tavazoie, R. Flynn, P. Batista, E. Calo i całemu laboratorium Wang za wsparcie techniczne i krytyczne przeczytanie manuskryptu. S.L.M. otrzymało wsparcie w tej pracy poprzez NSFGRF (DGE-114747), NDSEGF (FA9550-11-C-0028) oraz National Cancer Institute (1F99CA222541-01). K.C.W. jest wspierany przez Nagrodę Kariery dla Naukowców Medycznych od Burroughs Wellcome Fund, Jest stypendystką Fundacji Donalda E. i Delii B. Baxterów.

1. Projekt gRNA
<ol>
	<li>Wybierz standardowe narzędzie do projektowania gRNA, aby zaprojektować przewodnik RNAs10. Dla każdego eksperymentu należy użyć komplementarnych par wcześniej opracowanych konstruktów CLOuD99 (tj. co najmniej 1 konstrukt S. aureus (CSA) i 1 S. pyogenes (CSP)).
	<ol>
		<li>W wybranym narzędziu do projektowania online należy użyć sekwencji "NGG" Protospacer Adjacent Motif (PAM) o długości prowadnicy 20 bp dla CSP oraz sekwencji PAM "NNGRRT" o długości prowadnicy 21 dla CSA.</li>
		<li>Wybierz przewodniki na podstawie oceny szczegółowości i zaprojektuj przewodniki na obu pasmach, aby zmaksymalizować szanse na uzyskanie działającego przewodnika.</li>
		<li>Zamów 2 oligonukleotydy na przewodnik od producenta oligo: dla oligo do przodu dodaj "caccg" do końca 5' sekwencji prowadzącej, a dla odwróconego oligo, dodaj "aaac" do końca 5' i "c" do końca 3' przed złożeniem zamówienia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Początkowo zaprojektuj 3-5 gRNA dla każdego regionu zainteresowania, rozłożone na obszarze 250-1000 pz. Oceń skuteczność celowania gRNA w następujący sposób:
	<ol>
		<li>Klon zidentyfikował gRNA do aktywnego plazmidu Cas9 (patrz krok 3) i przejściowo transfekował do komórek 293T (patrz krok 4)11.</li>
		<li>Hoduj komórki przez 2-3 dni w zmodyfikowanym pożywce Dulbecco's Eagle Medium (DMEM) z 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i 1% penicyliną-streptomycyną (paciorkowcowość), a następnie zbierz i wyekstrahuj genomowe DNA12.</li>
		<li>Amplifikacja docelowych regionów za pomocą reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR). Uruchom produkty na 1,5% żelu agarozowym i oczyść odpowiednie pasma.</li>
		<li>Wykonaj test endonukleazy T7 zgodnie z opisem w protokole Guschin i wsp.13,14. 
		UWAGA: Skuteczne prowadnice to te, które są zdeterminowane do cięcia DNA w miejscu docelowym.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Hodowla komórkowa
<ol>
	<li>Utrzymuj komórki w zdrowym i aktywnie dzielącym się stanie.
	<ol>
		<li>W przypadku K562 hodowla w pożywkach Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 z 10% FBS i 1% paciorkowca.
		<ol>
			<li>Hoduj K562s w kolbie z szyjką o średnicy 25 cmi 2 w celu konserwacji i dostosuj gęstość komórek do 400 000 komórek na ml każdego dnia.</li>
			<li>Po transdukcji K562 za pomocą konstruktów CLOuD9 dodać 2 μg/ml puromycyny i 100 μg/ml higromycyny do pożywki konserwującej.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Dla 293Ts hodowla w zmodyfikowanym pożywce Dulbecco Eagle Medium (DMEM) z 10% FBS i 1% paciorkowcem.
		<ol>
			<li>Wyhoduj 293Ts na 10 cm2 talerzach i podziel, gdy się zlewają.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Przygotowanie plazmidu i insercja gRNA15
Uwaga: Mapy plazmidów są dostępne w dodatku, a startery użyte w przykładowych eksperymentach są dostępne w Tabeli Uzupełniającej 1.
<ol>
	<li>Wymieszaj 5 μg lentiwirusowego plazmidu CRISPR z 3 μl BsmBI, 3 μl fosfatazy alkalicznej, 6 μl 10x buforu i 0,6 μl świeżo przygotowanego 100 mM DTT. Doprowadzić całkowitą objętość do 60 μl za pomocąddH2O i inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut w celu trawienia i defosforylacji plazmidu.</li>
	<li>Żel oczyszcza strawiony plazmid i eluuje w ddH2O.</li>
	<li>Wymieszaj 1 μl każdego z sparowanych prowadników w 100 μM z 1 μl 10x buforu ligacyjnego T4, 6,5 μl ddH2O i 0,5 μl T4 PNK, aby uzyskać 10 μl całkowitej objętości. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut, następnie w temperaturze 95 °C przez 5 minut, a następnie zmniejszać do 25 °C w temperaturze 5 °C/min. 
	Uwaga: Spowoduje to wyżarzanie pary prowadnic.</li>
	<li>Rozcieńczyć wyżarzane prowadnice (od kroku 3.3) w stosunku 1:200 w ddH2O.</li>
	<li>Zmieszać 1 μl strawionego plazmidu z kroku 3.2 z 0,5 μl rozcieńczonych ligowanych prowadnic z kroku 3.4, 2,5 μl 2x buforu, 1 μl ddH2O i 0,5 μl ligazy, aby uzyskać całkowitą reakcję 5,5 μl. Inkubuj to w temperaturze pokojowej przez 10 minut, aby podwiązać przewodniki do plazmidu trawionego przez BsmBI.</li>
	<li>Przekształć nowo ligowany plazmid z kroku 3.5 w bakterie Stbl3 i amplifikować przy użyciu dowolnej metody przygotowania plazmidu.</li>
</ol>
4. Produkcja lentiwirusów
<ol>
	<li>Policz 750 000 komórek 293T na studzienkę na płytkę sześciodołkową za pomocą hemocytometru i zasiaj je w DMEM z 10% FBS i 1% paciorkowcem. Użyj jednej studni dla każdej konstrukcji.</li>
	<li>24 godziny po wysiewie zmień pożywkę na świeży DMEM bez antybiotyków z 10% FBS.</li>
	<li>W jednej probówce rozcieńczyć 11 μl odczynnika do transfekcji na bazie lipidów ze 150 μl pożywki OptiMEM, na reaction11.</li>
	<li>W osobnej probówce rozcieńczyć 2 μg plazmidu wektora lentiwirusowego CLOuD9 z kroku 3.6, 0,35 μg pMDLg/pRRE, 1 μg pRSV-Rev i 0,65 μg pMD2.G ze 150 μl pożywki OptiMEM, na reaction11.</li>
	<li>Dla każdej reakcji dodać rozcieńczone mieszaniny plazmidów lentiwirusowych do rozcieńczonego odczynnika do transfekcji na bazie lipidów w stosunku 1:1 i inkubować przez 5 min11.</li>
	<li>Dodać całą objętość każdego zmieszanego kompleksu z kroku 4.5 do odpowiednich studzienek komórek 293T wolnych od antybiotyków z kroku 4.2.</li>
	<li>48 godzin później zebrać pożywkę do produkcji wirusa, pipetując do świeżej probówki i wirować do 300 x g przez 5 minut. Po odwirowaniu przenieś supernatant do nowej probówki, aby usunąć resztki komórek.</li>
	<li>Natychmiast należy użyć pożywki do produkcji wirusa w celu transdukcji komórek docelowych lub zamrozić w temperaturze -80 °C do wykorzystania w przyszłości.</li>
</ol>
5. Transdukcja komórek w lentiwirusie
<ol>
	<li>Dodaj 250 μl każdego interesującego konstruktu wirusa (składającego się z komplementarnych plazmidów CLOuD9) do stożkowej probówki o pojemności 15 ml zawierającej 80 000 komórek do aplikacji CLOuD9.</li>
	<li>Doprowadzić całkowitą objętość pożywki w każdym stożku do 1 ml za pomocą pożywki wolnej od antybiotyków i dodać polibren do końcowego stężenia między 1-8 μg/ml (maksymalne stężenie polibrenu tolerowane przez zastosowany typ komórki będzie musiało zostać określone doświadczalnie).</li>
	<li>Wirować komórki w temperaturze 800 x g przez 30 minut w temperaturze pokojowej, a następnie ponownie zawiesić przez pipetowanie bez usuwania supernatantu wirusa. Przenieść całą zawiesinę komórkową na płytkę do hodowli komórkowej.</li>
	<li>24 godziny po transdukcji, wirować komórki w dół przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Odessać wirusowy supernatant i ponownie zawiesić komórki w zwykłej pożywce do hodowli komórkowych.</li>
	<li>Następnego dnia dodaj puromycynę (1 μg/ml dla komórek 293T) i higromycynę (25 μg/ml dla komórek 293T) do pożywki do hodowli komórkowej, aby wybrać komórki podwójnie transdukowane. Eksperymentalnie określić odpowiednie stężenia puromycyny i higromycyny dla danego typu komórki przed rozpoczęciem eksperymentów.</li>
	<li>Komórki należy przechowywać w pożywce selekcyjnej przez co najmniej 3 dni przed jakimikolwiek dalszymi eksperymentami i utrzymywać w pożywce selekcyjnej przez cały czas trwania wszystkich eksperymentów.</li>
</ol>
6. Dimeryzacja i wypłukiwanie komórek
<ol>
	<li>Dodać 1 mM kwasu abscysynowego (ABA) lub równoważną objętość dimetylosulfotlenku (DMSO) do kontroli do hodowli komórkowej w celu dimeryzacji wybranych i transdukowanych komórek CLOuD9. Zużyć ABA w ciągu 6 miesięcy od daty otrzymania, przechowywać w chłodnym miejscu i chronić przed światłem przez cały okres użytkowania. W razie potrzeby można użyć 2 mM ABA.
	<ol>
		<li>Zmieniaj pożywkę codziennie, aby zapewnić świeże ABA (lub DMSO dla kontroli) na czas trwania eksperymentów. 
		UWAGA: Nie zaobserwowano jeszcze ograniczenia długości dimeryzacji.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Odwrotna dimeryzacja poprzez usunięcie pożywki zawierającej ABA i dwukrotne przemycie komórek roztworem soli fizjologicznej buforowanym fosforanem (PBS), aby pokryć powierzchnię płytki. Następnie hoduj komórki w pożywkach wolnych od ABA, aby utrzymać stan niedimeryzowany.</li>
</ol>
7. Immunoprecypitacja i ko-immunoprecypitacje
UWAGA: Spraw, aby wszystkie były świeże i bezpośrednio przed użyciem.
<ol>
	<li>Po zakończeniu eksperymentów dimeryzacji zbierz i odwiruj komórki, a następnie odessaj supernatant.</li>
	<li>Sieciowanie i zamrażanie komórek
	<ol>
		<li>Przygotuj świeży zapas 1% formaldehydu w PBS w temperaturze pokojowej, używając świeżych materiałów. Na każde 2 miliony komórek delikatnie ponownie zamieszaj z 1 ml 1% formaldehydu w temperaturze pokojowej dokładnie przez 10 minut, obracając. 
		UWAGA: Użyj minimalnej objętości 10 ml do sieciowania mniej niż 10 milionów komórek.</li>
		<li>Usieciowanie hartować z dodatkiem glicyny do końcowego stężenia 0,125 M, a następnie inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej, obracając się.</li>
		<li>Zakręć komórki i umyj 1-2x lodowatym PBS. Granulki komórkowe można następnie zamrozić w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze -80 °C lub natychmiast zużyć. 
		UWAGA: Ciepło odwróci wiązania krzyżowe formaldehydu. W pośpiechu komórki mogą być przechowywane bezpośrednio w temperaturze -80 °C bez szybkiego zamrażania.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotować koniugat przeciwciało/kulka 
	Uwaga: Optymalizacja warunków dla wybranego przeciwciała (tj. testowanie różnych do lizy komórek i przeprowadzanie IP) może być warta zachodu. Dwa popularne, bufor do lizy Farnham i zmodyfikowany bufor RIPA, mogą mieć znaczący wpływ na wydajność IP i wydajność sonikacji. Wszystkie kompozycje buforowe znajdują się w Tabeli Materiałów. Dodatkowo należy pamiętać, że sonikacja chromatyny może potrwać kilka godzin.
	<ol>
		<li>Ponownie zawiesić kulki, krótko wirując, jeśli jest to odpowiednie dla wybranego przeciwciała.</li>
		<li>Przenieś odpowiednią ilość koralików do eksperymentu do probówki o pojemności 1,5 ml. Jako punkt wyjścia użyj 20 μl kulek na każdy 1 μg przeciwciała. Nie dodawaj jeszcze przeciwciała. 
		UWAGA: Jako punkt wyjścia należy użyć 10 μg przeciwciała z 200 μl kulek na 1 mg całkowitego lizatu, chyba że wiadomo, że przeciwciało jest mniej lub bardziej skuteczne, niż by to sugerowało. W przypadku białek o niskiej liczebności może być konieczna korekta tego stosunku.</li>
		<li>W przypadku stosowania buforu do lizy Farnhama, przemyć 3x w buforze rozcieńczającym IP. W przypadku stosowania buforu do lizy RIPA należy przemyć 3x w buforze do lizy RIPA.</li>
		<li>Ponownie zawieś koraliki w końcowym woluminie tego samego bufora z kroku 7.3.3 (rozcieńczenie IP lub bufor RIPA), który jest >1x i <5x większy niż objętość początkowa. tj. W przypadku początkowej objętości kulki 100 μl należy użyć od 100 do 500 μl końcowej objętości zawiesiny.</li>
		<li>Dodaj przeciwciało do umytych kulek teraz w odpowiednim stężeniu. Aby uzyskać dobre przeciwciało HA lub Flag przeciwko konstruktom IP CLOuD9, należy użyć przeciwciał w stosunku 1:50 (μg białka: μg lizatu białkowego) i inkubować między 8+ h i przez noc w temperaturze 4 °C, obracając się. Alternatywnie inkubować przez 2-4 godziny w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Usunąć supernatant z kulek i wyrzucić.</li>
		<li>Płukanie koralików 3x za pomocą bufora do mycia.</li>
		<li>Zawiesić w minimalnej objętości bufor używany do nocnej inkubacji z przeciwciałem (rozcieńczenie IP lub bufor RIPA). Przechowywać w chłodzie, aż połączy się z lizatem białkowym.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Sonizacja chromatyny
	<ol>
		<li>Najpierw poddaj komórki lizie z dodatkiem buforu pęczniejącego do granulek komórek na lodzie przez 10 minut, przesuwając komórki co kilka minut, aby zapobiec osiadaniu. 
		UWAGA: Ogólnie rzecz biorąc, 500 μl buforu pęczniejącego dodaje się do 25 milionów komórek i stamtąd skaluje, ale nie należy używać mniej niż 500 μl buforu na <25 milionów komórek.</li>
		<li>Odbijaj ręcznie zarówno zgodnie z ruchem wskazówek zegara, jak i przeciwnie do ruchu wskazówek zegara, po 13 razy.</li>
		<li>Następnie wirować jądra w dół w temperaturze 4 °C przez 5 minut w temperaturze 1 500 x g. Całkowicie odessać supernatant i powtórzyć w celu usunięcia pozostałego supernatantu, a następnie zważyć osad komórkowy w mg.</li>
		<li>Dodaj inhibitor proteazy do buforu do lizy jąder (bufor Farnhama lub bufor RIPA, powyżej, wybierz jeden).</li>
		<li>Dodać 10 razy więcej buforu do lizy jąder do granulowanych jąder w celu ponownego zawieszenia (na przykład dodać 1 ml buforu do lizy jąder do 0,100 g osadu). Krótko wirować i lizować przez 10 minut na lodzie. 
		UWAGA: Należy pamiętać o rozmiarze rurki do sonikacji. Idealna objętość to często <1 ml, więc próbki mogą wymagać podzielenia się, jeśli granulki są bardzo duże.
		<ol>
			<li>W przypadku Co-IP, należy krótko poddać sonikację jąder, aby rozpuścić materiał i schłodzić SDS do poziomu umożliwiającego immunoprecypitację za pomocą 2-3 objętości buforu rozcieńczającego, a następnie przejść do kroku 7.4.6. W przypadku bardzo wrażliwych przeciwciał należy dodać więcej buforu rozcieńczającego, aby jeszcze bardziej zmniejszyć stężenie SDS. 
			UWAGA: Przerwij sonikację, gdy lizat się usunie; Zmieni się z nieprzezroczystej/półprzezroczystej bieli na całkowicie przezroczyste. Utrzymuj próbki tak zimne, jak to możliwe i nie przesadzaj z dźwiękiem.</li>
			<li>W przypadku ChIP należy dokładnie poddać sonikę DNA, aby uzyskać fragmenty DNA o długości 150-1000 pz, a następnie przejść do kroku 7.4.6.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Wirować nierozpuszczalny materiał z maksymalną prędkością przez 10 minut w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Przenieś rozpuszczalny materiał do świeżej probówki.</li>
		<li>W przypadku Co-IP zmierz stężenie białka i przejdź do obniżania w kroku 7.5.</li>
		<li>W przypadku ChIP usunąć 10 μl podwielokrotności oczyszczonego lizatu i dodać 40 μl buforu elucyjnego IP i 6 μl 5 M NaCl do tego, co daje w sumie 56ul. Gotować przez 15 minut w temperaturze 95 °C, dodać 5-10 μl 3 M NaOAc pH 5 i oczyścić na kolumnie oczyszczającej PCR. Zmierz stężenie DNA, mierząc absorbancję przy 260 nm i standaryzuj próbki. Następnie przejdź do rozwijania w kroku 7.5. 
		UWAGA: Dodatkowy lizat można zamrozić w temperaturze -80 °C i użyć w późniejszym czasie, ale najlepsze wyniki uzyskuje się ze świeżego lizatu. W przypadku zamrażania nie zamrażaj/nie rozmrażaj lizy więcej niż raz.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Rozwijanego
	<ol>
		<li>Przenieś odpowiednią ilość lizatu białkowego do świeżej probówki. W przypadku stosowania buforu do lizy Farnhama, rozcieńczyć w 2,1 objętości buforu rozcieńczającego IP (powyżej).</li>
		<li>Odłożyć 100 μl supernatantu do kontroli wejściowej i przechowywać w temperaturze 4 °C do następnego dnia.</li>
		<li>Dodaj teraz koniugat kulka/przeciwciało z kroku 7.3.8 do próbek.</li>
		<li>Obracaj próbki w temperaturze 4 °C przez noc i upewnij się, że objętość jest wystarczająca do ruchu cieczy w probówkach o pojemności 1,5 ml.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umyj i elute
	<ol>
		<li>Po nocnej rotacji zachowaj supernatant jako frakcję niewiążącą. Następnie umyj kulki 3-5x w buforze rozcieńczającym IP.</li>
		<li>Przygotować bufor elucyjny IP w temperaturze pokojowej, bez inhibitorów.</li>
		<li>Kompleksy elutyczne z 50 μl buforu elucyjnego wstrząsać wirem w temperaturze 67 °C przez 15 minut. Przenieść elucję do nowej probówki i powtórzyć z kolejnymi 50 μl. Połączyć je oba, aby uzyskać łącznie 100 μl elucji. 
		UWAGA: Jeśli jest zbyt dużo tła z tej procedury elucji, ciepło może zostać zmniejszone lub wyeliminowane podczas wytrząsania/inkubacji. Na ogół zmniejsza to wydajność białka docelowego, ale znacznie zmniejsza tło.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Odwrotne usieciowanie przez ogrzewanie w temperaturze 67 °C przez >4 h. 
	UWAGA: Nie jest to absolutnie konieczne w przypadku Co-IP, ale może być pomocne.
	><ol>
		<li>W przypadku Co-IP, aby zapewnić pełną dimeryzację między interesującymi celami, uruchom eluaty na żelu SDS Page i sonduj przeciwciała przeciwko znacznikowi HA lub znacznikowi Flag, jak wskazano, wszystko w stosunku 1: 1,000. Następnie przejdź do kroku 8.</li>
		<li>W przypadku ChIP-qPCR, aby zapewnić prawidłową lokalizację i ukierunkowanie każdego składnika CRISPR-dCas9, należy oczyścić produkt elucji na kolumnie i wymyć w 10 μl. Przeprowadzić ilościową reakcję łańcuchową polimerazy (qPCR) oczyszczonego DNA w czasie rzeczywistym. Startery wykorzystane w prezentowanych danych dostępne są w tabeli uzupełniającej 1. Następnie przejdź do kroku 8.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
8. Ekstrakcja RNA i ilościowy PCR
<ol>
	<li>Aby zbadać wywołane przez CLOuD9 zmiany w ekspresji genów, najpierw wyizoluj i oczyść całkowite RNA zarówno z osadów komórek kontrolnych, jak i dimeryzowanych osadów komórkowych.</li>
	<li>Wykonaj komplementarne DNA (cDNA) z oczyszczonego RNA metodą odwrotnej transkrypcji17 i wykonaj analizy qPCR. Podkłady są dostępne w Tabeli Uzupełniającej 1.</li>
</ol>
9. Test wychwytywania konformacji chromosomów
<ol>
	<li>Aby zaobserwować zmiany w częstości kontaktów loci genomowych indukowanych przez CLOuD9, należy przeprowadzić testy wychwytywania konformacji chromosomów (3C)8.</li>
	<li>Określ ilościowo produkty ligacji 3C w dwóch zestawach duplikatów dla każdej z trzech kontrprób biologicznych za pomocą ilościowego PCR w czasie rzeczywistym. Normalizować próbki do sygnałów 3C z locus tubuliny. Podkłady są dostępne w Tabeli Uzupełniającej 1.</li>
</ol>

<ol><li>Krivega, I., Dean, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+looping+as+a+target+for+altering+erythroid+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+N.Y.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Chromatin looping as a target for altering erythroid gene expression.</a> Ann. N.Y. Acad. Sci. 1368, 31-39 (2016).</li>
<li>Matharu, N., Ahituv, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minor+loops+in+major+folds%3A+Enhancer-promoter+looping%2C+chromatin+restructuring%2C+and+their+association+with+transcriptional+regulation+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Minor loops in major folds: Enhancer-promoter looping, chromatin restructuring, and their association with transcriptional regulation and disease.</a> PLoS Genet. 11, e1005640(2015).</li>
<li>Dekker, J., Martí-Renom, M. A., Mirny, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+the+three-dimensional+organization+of+genomes%3A+interpreting+chromatin+interaction+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Exploring the three-dimensional organization of genomes: interpreting chromatin interaction data.</a> Nat. Rev Genet. 14, 390-403 (2013).</li>
<li>Kim, A., Dean, A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22610406">Chromatin loop formation in the b-globin locus and its role in globin gene transcription.</a> Mol Cells. 34, 1-5 (2012).</li>
<li>Petrascheck, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+looping+induced+by+a+transcriptional+enhancer+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">DNA looping induced by a transcriptional enhancer in vivo.</a> Nucleic Acids Res. 33, 3743-3750 (2005).</li>
<li>Ameres, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducible+DNA-loop+formation+blocks+transcriptional+activation+by+an+SV40+enhancer%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Inducible DNA-loop formation blocks transcriptional activation by an SV40 enhancer.</a> EMBO J. 24, 358-367 (2005).</li>
<li>Deng, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlling+Long-Range+Genomic+Interactions+at+a+Native+Locus+by+Targeted+Tethering+of+a+Looping+Factor%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Controlling Long-Range Genomic Interactions at a Native Locus by Targeted Tethering of a Looping Factor.</a> Cell. 149, 1233-1244 (2012).</li>
<li>Deng, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactivation+of+developmentally+silenced+globin+genes+by+forced+chromatin+looping%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Reactivation of developmentally silenced globin genes by forced chromatin looping.</a> Cell. 158, 849-860 (2014).</li>
<li>Morgan, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manipulation+of+Nuclear+Architecture+through+CRISPR-Mediated+Chromosomal+Looping%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Manipulation of Nuclear Architecture through CRISPR-Mediated Chromosomal Looping.</a> Nature Communications. 8, 13 July (2017).</li>
<li>Haeussler, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+off-target+and+on-target+scoring+algorithms+and+integration+into+the+guide+RNA+selection+tool+CRISPOR%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR.</a> Genome Biol. 17 (1), 148(2016).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Lipofectamine+2000+Reagent%22">Lipofectamine 2000 Reagent</a>. , Invitrogen by Life Technologies. (2013).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22DNeasy+Blood+%26+Tissue+Kit+Handbook%22">DNeasy Blood & Tissue Kit Handbook</a>. , QIAGEN. (2006).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Determining+Genome+Targeting+Efficiency+using+T7+Endonuclase+I+%28M0302%29%22">Determining Genome Targeting Efficiency using T7 Endonuclase I (M0302)</a>. , New England BioLabs. (2016).</li>
<li>Guschin, D. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+general+assay+for+monitoring+endogenous+gene+modification%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">A rapid and general assay for monitoring endogenous gene modification.</a> Methods Mol Biol. 649, 247-256 (2010).</li>
<li>Shalem, O., Sanjana, N. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-scale+CRISPR-Cas9+knockout+screening+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells.</a> Science. , 83-87 (2014).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22RNeasy+Mini+Handbook%22">RNeasy Mini Handbook</a>. , QIAGEN. (2012).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22SuperScript+VILO+cDNA+Synthesis+Product+Information+Sheet%22">SuperScript VILO cDNA Synthesis Product Information Sheet</a>. , Thermo Fisher Scientific Inc. (2015).</li>
<li>Theunissen, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+identification+of+culture+conditions+for+induction+and+maintenance+of+naive+human+pluripotency%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Systematic identification of culture conditions for induction and maintenance of naive human pluripotency.</a> Cell Stem Cell. 15, 471-487 (2014).</li>
<li>Mokry, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+genome-wide+analysis+of+transcription+factor+occupancy%2C+RNA+polymerase+II+binding+and+steady+state+RNA+levels+identify+differentially+regulated+functional+gene+classes%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Integrated genome-wide analysis of transcription factor occupancy, RNA polymerase II binding and steady state RNA levels identify differentially regulated functional gene classes.</a> Nucleic Acids Res. 40, 148-158 (2012).</li>
<li>Drier, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+oncogenic+MYB+feedback+loop+drives+alternate+cell+fates+in+adenoid+cystic+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">An oncogenic MYB feedback loop drives alternate cell fates in adenoid cystic carcinoma.</a> Nat Genet. 48, 265-272 (2016).</li>
<li>Ryan, R. J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+enhancer-associated+rearrangements+reveals+mechanisms+of+oncogene+dysregulation+in+B-cell+lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discov%22%5BJournal%5D)">Detection of enhancer-associated rearrangements reveals mechanisms of oncogene dysregulation in B-cell lymphoma.</a> Cancer Discov. 5, 1058-1071 (2015).</li>
<li>Montavon, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+regulatory+archipelago+controls+Hox+genes+transcription+in+digits%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A regulatory archipelago controls Hox genes transcription in digits.</a> Cell. 147, 1132-1145 (2011).</li>
<li>Lupianez, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruptions+of+topological+chromatin+domains+cause+pathogenic+rewiring+of+gene-enhancer+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Disruptions of topological chromatin domains cause pathogenic rewiring of gene-enhancer interactions.</a> Cell. 161, 1012-1025 (2015).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Najbardziej krytycznymi etapami pętli chromatyny CLOuD9 są: 1) projektowanie lub stosowanie odpowiednich gRNA, 2) codzienna zmiana pożywki na komórkach transdukowanych CLOuD9, w tym ABA lub DMSO, 3) utrzymanie świeżości ABA oraz 4) przeprowadzanie dokładnych i starannych ocen konformacji chromatyny.
Ograniczenia CLOuD9 polegają przede wszystkim na możliwości projektowania przewodników do wybranego regionu docelowego. Przewodniki RNA wykonują ważne zadanie lokalizacji składników dCas9 w docelowych regionach DNA, które mają być dimeryzowane, a skuteczność przewodników opiera się na ich konkretnym miejscu docelowym. Bez odpowiednich składników gRNA układ CLOuD9 nie będzie w stanie tworzyć odwracalnie indukowanych pętli. W związku z tym, projektując wiele prowadnic dla każdego regionu zainteresowania i rozkładając je w regionie 250-1000 pz, zapewniony zostanie co najmniej jeden udany przewodnik. Lokalizacja przewodnika jest również integralną częścią dokładnych wyników. Ważne jest, aby unikać przewodników znajdujących się w miejscach wiązania czynnika transkrypcyjnego lub innych krytycznych regionach, aby zapobiec efektom tła, takim jak regulacja transkrypcji w górę lub w dół. Ponadto dokładna lokalizacja konstruktu CLOuD9 może nieznacznie wpływać na transkrypcję docelowego genu. Podkreśla to znaczenie testowania wielu par prowadnic dla każdego regionu docelowego w celu zidentyfikowania najbardziej wytrzymałej pary do celów eksperymentalnych. Ponadto, w każdej parze regionów docelowych, konstrukt CSA powinien być ukierunkowany na gRNA dla S. aureus, a konstrukt CSP powinien być ukierunkowany na gRNA dla S. pyogenes w celu ukierunkowanej swoistości.
Aby zapewnić dokładne wyniki i prawidłową dimeryzację, ważne jest również utrzymanie świeżości środowisk komórkowych po transdukcji konstruktów CLOuD9. Codzienna zmiana pożywki i dodanie świeżego dimeryzatora (lub kontroli) zapewnia, że komplementarne konstrukty pozostaną w pobliżu i zachowają zmienioną konformację chromatyny. Co więcej, zagwarantowanie, że ABA jest świeże i odpowiednio przechowywane zgodnie z protokołem producenta (otwarte w ciągu 6 miesięcy, przechowywane w niskiej temperaturze, chronione przed światłem) jest niezbędne do uzyskania autentycznych wyników.
Warto zauważyć, że dimeryzator ABA dla CLOuD9 był używany z białkami dimeryzacyjnymi ABI i PYL, a nie z częściej stosowanym systemem FRB i FKBP. Konieczność opracowania rapalogu dla systemu FRB/FKBP ograniczyłaby możliwość zastosowania CLOuD9 ze względu na toksyczność dla komórek nowotworowych. Alternatywny system ABI/PYL obszedł to ograniczenie, skutecznie umożliwiając szersze zastosowanie CLOuD9.
Wspólnie opracowaliśmy CLOuD9, unikalną i solidną technologię, która może w sposób wymuszony, ale odwracalny, tworzyć kontakty między docelowymi loci genomowymi dalekiego zasięgu. Poprzez indukcję pętli chromatyny wykazujemy również, że CLOuD9 może być wykorzystany do modyfikacji ekspresji genów w odpowiednim kontekście komórkowym. Zdolność adaptacyjna technologii pozwala na nieograniczone badanie interakcji między dowolnymi dwoma loci genomowymi, bez konieczności posiadania wcześniejszej wiedzy na temat regionów pętli lub mechanizmów pętli. Ponadto unikalna, wykazana odwracalność CLOuD9 umożliwia dalsze badania mechanizmów pętli w chorobie i rozwoju. Chociaż efekty pętli chromatyny na cel zostały wyraźnie wykazane, nie ma jeszcze danych dających wgląd w skutki pętli poza celem i późniejszy wpływ na pętle docelowe.
Nasze dane ilustrują tylko kilka zastosowań tego narzędzia, ale sugerują główną ideę, że układ chromatyny wskazuje na ekspresję genów. Nasza technologia może być wykorzystana do badania i ujawniania niuansów struktury chromatyny w regulacji genów, poprawiając w ten sposób ogólne zrozumienie roli fałdowania chromatyny w transkrypcji genów. Lepsze zrozumienie subtelności dynamiki transkrypcji może prowadzić do badań i leczenia raka, chorób dziedzicznych i zaburzeń wrodzonych, w których wyraźne składanie chromatyny niewątpliwie zmienia ekspresję genów 20,21,22,23. Kolejne prace z wykorzystaniem technologii CLOuD9 dostarczą dalszych informacji na temat układu i dynamiki domen chromatyny oraz sposobu, w jaki napędzają one fałdowanie w celu utrzymania stabilnej ekspresji genów zarówno w rozwoju, jak i chorobie.

Związek między fałdowaniem chromatyny w jądrze a specyficzną organizacją genomu wzbudził duże zainteresowanie w ostatnich latach, ponieważ wykazano, że jest ściśle związany z ekspresją genów1,2. Chociaż dokładny związek między aktywnością genów a modulacją struktury chromatyny pozostaje niejasny, postawiono hipotezę, że interakcje między kontaktami chromosomalnymi w wyniku dynamicznej trójwymiarowej organizacji chromatyny pełnią funkcję regulacji genów3. Rzeczywiście, taki efekt został dobrze zademonstrowany w locus ludzkiego genu globiny, gdzie region kontroli locus (LCR) reguluje aktywność genów globiny w sposób specyficzny rozwojowo, tworząc pętlę chromatyny między dwoma regionami4. Jednak zarówno w tym, jak i w innych regionach nie jest jasne, czy pętla chromatyny jest przyczyną, czy konsekwencją zmian w ekspresji genów.
Do tej pory wyzwania związane z badaniem tego zjawiska pozostawały nierozwiązane. Na przykład inne próby indukowania pętli chromatyny obejmowały modyfikację liniowej sekwencji DNA lub skomplikowane procedury wymagające dużej ilości wiedzy na temat konkretnych elementów, które ułatwiają pętlę5,6,7,8. Dodatkowo, podczas gdy poprzednie prace sugerowały, że pętle chromatyny napędzają ekspresję genów w określonym i ograniczonym kontekście7,8, poziom, na którym pętla chromatyny wpływa na transkrypcję globalnie, jest niepewny. Chociaż zainteresowanie wpływem pętli dalekiego zasięgu na ekspresję genów stale rosło w ostatnich latach, pytania bez odpowiedzi dotyczące nawiązywania i utrzymywania kontaktów chromatyny w celu zmiany aktywności genów utrzymują się.
Technologia, którą opracowaliśmy, wykorzystuje niedobór nukleazy zgrupowane regularnie rozmieszczone krótkie powtórzenia palindromiczne (CRISPR)-CRISPR-associated protein 9 (dCas9), aby umożliwić szerokie zastosowanie w dowolnym genomowym loci9. Technologia ta eliminuje złożone problemy związane z modyfikacjami liniowej sekwencji DNA i jest dostępna bez znaczącej wcześniejszej wiedzy na temat poszczególnych składników pętli. Przede wszystkim narzędzie jest uniwersalne i ma szerokie zastosowanie w pętlach chromatyny rozpoznawanych w fazie rozwoju, a także w różnych chorobach, takich jak rak. Moc CLOuD9 jest demonstrowana poprzez odwracalną zmianę struktury pętli w celu skutecznego modulowania ekspresji genów.

<table><tbody><tr><td>RPMI 1640&nbsp; media</td><td>Life Technologies</td><td>11875-119</td><td>Do hodowli komórkowych K562</td></tr><tr><td>Podłoża DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>11995-065</td><td>1X, do hodowli komórek 293T</td></tr><tr><td>lentiCRISPR v2</td><td>Addgene plazmid</td> <td># 52961</td><td>Do rozwoju plazmidu CLOuD9</td></tr><tr><td>pRSV-Rev</td><td>Addgene plazmid</td> <td># 12253</td><td>Do produkcji lentiwirusa</td></tr><tr><td>pMD2.G</td><td>Plazmid Addgene</td> <td># 12259</td><td>Do produkcji lentiwirusa</td></tr><tr><td>pMDLg / pRRE</td><td>Plazmid Addgene</td> <td># 12251</td><td>Do produkcji lentiwirusa</td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11668-019</td><td>Do produkcji lentiwirusa</td></tr><tr>przeciwciało<td>anty-HA</td><td>Sygnalizacja komórkowa</td><td>3724</td> Do przeciwciała anty-Flag przeciwko <td>immunoprecypitacji</td></tr><tr><td></td><td>Sigma</td><td>F1804</td><td>Dla immunoprecypitacja</td></tr><tr><td>DNeasy Zestaw do krwi i tkanek</td><td>Qiagen</td><td>69504</td><td>Do ekstrakcji DNA</td></tr><tr><td>TRIzol</td><td>Life Technologies</td><td>15596-018</td><td>Do ekstrakcji RNA</td></tr><tr><td>RNeasy Kit</td><td>Qiagen</td><td>74106</td><td>Do ekstrakcji RNA</td></tr><tr><td>Indeks górny VILO</td><td>Life Technologies</td><td>11754-050</td><td>Do cDNA&nbsp;</td></tr><tr><td>SYBR Green I MasterMix</td><td>Roche</td><td>4707516001</td><td>Do analizy qPCR</td></tr><tr><td>Light Cycler 480II</td><td>Roche</td><td></td><td>Do analizy qPCR</td></tr><tr><td>przeciwciało anty-H3K4me3</td><td>AbCam</td><td>ab8580</td><td>Do przeciwciała anty-RNA ChIP-qPCR</td></tr><tr><td>Aktywny</td><td>motyw</td><td>61083</td><td>Do ChIP-qPCR</td></tr><tr><td>Inhibitor proteazy wolny od EDTA</td><td>Roche</td><td>11873580001</td><td>Do białka ekstrakcja</td></tr><tr><td>4-12% Tris Glycine gel</td><td>Biorad</td><td></td><td>Dowolny rozmiar, Do przeciwciała Western blot</td></tr><tr><td>anty-Rabbit HRP</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-2030</td><td>Do przeciwciała Western blot</td></tr><tr><td>anty-mysie HRP</td><td>Sygnalizacja komórkowa</td><td>7076S</td><td>Dla Western blot</td></tr><tr><td>K562 i H3K293 Dane ChIP-Seq</td><td>Koduj</td><td>ENCSR000AKU</td><td>Do analizy ChIP-seq</td></tr><tr><td>Dane K562 i H3K293 ChIP-Seq</td><td>Kodowanie</td><td>ENCSR000APE</td><td>Do analizy ChIP-seq</td></tr><tr><td>K562 i H3K293 Dane ChIP-Seq</td><td>Kodowanie</td><td>ENCSR000FCJ</td><td>Do analizy ChIP-seq</td></tr><tr><td>Dane K562 i H3K293 ChIP-Seq</td><td>GEO</td><td>GSM1479215</td><td>Do analizy ChIP-seq</td></tr><tr><td>Dynabeads Białko A do immunoprecypitacji</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10001D</td><td>Do immunoprecypitacji</td></tr><tr><td>Dynabeads Białko G dla Immunoprecypitacja</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10004D</td><td>Do immunoprecypitacji</td></tr><tr><td>RNA Clean & Concentrator-5</td><td>Zymo Research</td><td>R1015</td><td>Do oczyszczania RNA</td></tr><tr><td>Pierce 16% Formaldehyd Bez metanolu</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>28908</td><td>Do sieciowania</td></tr><tr><td>plazmidu PX458 Addgene</td><td></td><td>48138</td><td>Sugerowany aktywny plazmid Cas9 do klonowania gRNA, ale każdy aktywny plazmid Cas9 zrobi to</td></tr><tr><td>Zestaw do oczyszczania QIAquick PCR</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td>Do oczyszczania</td></tr> <tr>PCR<td>FastDigest BsmBI</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>FD0454</td><td>Do klonowania przewodnika RNA</td></tr><tr><td>FastAP</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>EF0651</td><td>Do klonowania przewodnika RNA</td></tr><tr><td>10X FastDigest Buffer</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>B64</td><td>Do klonowania przewodnika RNA</td></tr><tr><td>QIAquick Gel Extraction Kit</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td>Do klonowania przewodnika RNA</td></tr><tr><td>10X T4 Ligation Buffer</td><td>NEB</td><td>B0202S</td><td>Do klonowania przewodnikowych RNA</td></tr><tr><td>T4 PNK</td><td>NEB</td><td>M0201S</td><td>Do klonowania przewodnika RNA</td></tr><tr><td>2X Szybki bufor ligazy</td><td>NEB</td><td>B2200S</td><td>Do klonowania przewodnika RNA</td></tr><tr><td>Szybka ligaza</td><td>NEB</td><td>M2200S</td><td>Do klonowania przewodnika RNA</td></tr><tr><td>Buffers</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Farnham lysis buffer</td><td></td><td></td><td>1% Tris-Cl pH 8,0, 1% SDS, 1% roztwór wodny inhibitora proteazy (nie-EDTA) i 1 mM EDTA w wodzie</td></tr><tr><td>Modyfikowany bufor</td><td></td><td></td> RIPA <td>1% NP40/Igepal, 0,5% deoksycholan sodu, 0,1% SDS, 1 mM EDTA i 1% roztwór wodny inhibitora proteazy (nie-EDTA) w PBS pH 7,8 lub 7,4</td></tr><tr><td>IP bufor</td><td></td><td></td> rozcieńczający <td>0,01% SDS, 1,1% Triton-X 100, 1,2 mM EDTA, 16,7 mM Tris-HCl pH 8,0, 167 mM NaCl, 0,1x inhibitor proteazy</td></tr><tr><td>Bufor</td><td></td><td></td> płuczący <td>100 mM Tris pH 9, 100 mM LiCl, 1% NP-40 i 1% deoksycholan sodu</td></tr><tr><td>Bufor</td><td></td><td></td> pęczniejący <td>0,1 M Tris pH 7,5, 10 mM octan potasu, 15 mM octan magnezu, 1% NP-40</td></tr><tr><td>Bufor</td><td></td><td></td> rozcieńczający <td>0,01% SDS, 1,1% Triton X-100, 1,2 mM EDTA, 16,7 mM Tris pH 8 i 167 mM</td></tr><tr><td>bufor elucyjny NaCl IP</td><td></td><td></td><td>1% SDS, 10% NaHCO3 &nbsp;</td></tr></tbody></table>

reorganizacja struktury pętli chromatyny za pośrednictwem crispr

CRISPR-Mediated Reorganization of Chromatin Loop Structure

Ostatnie badania wyraźnie wykazały, że długodystansowe, trójwymiarowe interakcje pętli chromatyny odgrywają znaczącą rolę w regulacji ekspresji genów, ale czy pętla jest odpowiedzialna, czy jest wynikiem zmian w ekspresji genów, jest nadal niewiadoma. Do niedawna sposób, w jaki pętla chromatyny wpływa na regulację aktywności genów i funkcji komórkowych, był stosunkowo niejednoznaczny, a ograniczenia w istniejących metodach manipulowania tymi strukturami uniemożliwiały dogłębne zbadanie tych interakcji. Aby rozwiać tę niepewność, opracowaliśmy metodę selektywnej i odwracalnej reorganizacji pętli chromatyny przy użyciu CRISPR-dCas9 (CLOuD9). Dynamika systemu CLOuD9 została wykazana przez udaną lokalizację konstruktów CLOuD9 w celu ukierunkowania loci genomowych w celu modulowania lokalnej konformacji chromatyny. Co ważne, potwierdzono również zdolność do odwrócenia indukowanego kontaktu i przywrócenia endogennej konformacji chromatyny. Modulacja ekspresji genów za pomocą tej metody ustanawia zdolność do regulacji ekspresji genów komórkowych i podkreśla ogromny potencjał zastosowań tej technologii w tworzeniu stabilnych pętli chromatyny de novo, które znacząco wpływają na ekspresję genów w kontekście raka i rozwoju.

Pętla chromatyny odgrywa znaczącą rolę w regulacji genów; jednak nie ma postępu technologicznego, który pozwalałby na selektywną i odwracalną modyfikację pętli chromatyny. W tym miejscu opisujemy potężny system reorganizacji pętli chromatyny za pomocą CRISPR-dCas9 (CLOuD9), który wykazano, że selektywnie i odwracalnie moduluje ekspresję genów w docelowych loci.

Reorganizacja struktury pętli chromatyny za pośrednictwem CRISPR

Recent studies have clearly shown that long-range, three-dimensional chromatin looping interactions play a significant role in the regulation of gene ...

Ta metoda może pomóc nam odpowiedzieć na kluczowe pytania związane z ekspresją genów, pokazując nam dokładnie, jak struktura chromatyny wpływa na ekspresję genów i jak organizacja chromatyny reguluje dynamikę transkrypcji. Opracowaliśmy tę technologię, ponieważ chcieliśmy mieć możliwość kontrolowanej zmiany architektury chromosomalnej, aby umożliwić tworzenie pętli chromatyny dalekiego zasięgu. Jednocześnie mają zdolność do odwrócenia kontekstu chromatyny w celu przywrócenia endogennej struktury chromosomalnej.Ta metoda została zaprojektowana z myślą o łatwości użycia i szerokim zastosowaniu. Wykorzystaliśmy nietoksyczny dimeryzator, a także ortogonalne gatunki dcas9, aby umożliwić szersze zastosowanie systemu. Opracowaliśmy tę metodę, ponieważ chcieliśmy być w stanie odpowiedzieć na odwieczne pytanie, czy ekspresja genów rodzi architekturę chromosomalną, czy też struktura chromosomów prowadzi do zmian w ekspresji genów.Projektowanie sekwencji RNA przewodnika CRISPR i utrzymanie kultur komórkowych są opisane w protokole tekstowym. Mapy plazmidowe i użyte startery są tam wymienione. Przygotowanie plazmidu należy rozpocząć od zmieszania pięciu mikrogramów lentiwirusowego plazmidu CRISPR z trzema mikrolitrami BsmB1, trzema mikrolitrami fosfatazy alkalicznej, sześcioma mikrolitrami 10-krotnego buforu wytrawiającego i 0,6 mikrolitra świeżo przygotowanego 100-milimolowego DTT.Doprowadź całkowitą objętość do 60 mikrolitrów podwójnie destylowanej wody i inkubuj mieszaninę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut w celu trawienia i defosforylacji plazmidu. Następnie żel oczyszcza strawiony plazmid w plazmidzie pętlowym i podwójnie destylowanej wodzie. Następnie przygotuj reakcje wyżarzania dla par przewodników RNA.Połącz jeden mikrolitr każdego przewodnika RNA o stężeniu 100 mikromolów z jednym mikrolitrem 10x buforu ligacyjnego T4, 6,5 mikrolitra podwójnie destylowanej wody i 0,5 mikrolitra T4 PNK, aby uzyskać całkowitą objętość reakcji 10 mikrolitrów. Aby wyżarzać pary przewodników RNA do ich sekwencji docelowych, inkubuj mieszaniny w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut, a następnie inkubuj w temperaturze 95 stopni Celsjusza przez 5 minut, a następnie stopniowo obniżaj temperaturę do 25 stopni Celsjusza, zmniejszając ją o pięć stopni Celsjusza na minutę. Następnie rozcieńczyć wyżarzane przewodnikowe RNA w ilości od jednego do dwustu w wodzie podwójnie destylowanej.Teraz przygotuj dwie reakcje podwiązania. Wymieszaj jeden mikrolitr strawionego plazmidu z 0,5 mikrolitra rozcieńczonego przewodnika okołołopatkowego RNA, 2,5 mikrolitra 2x buforu ligacyjnego, jednym mikrolitrem podwójnie destylowanej wody i 0,5 mikrolitra ligazy. Inkubować reakcje w temperaturze pokojowej przez 10 minut, aby podwiązać plazmid trawiony przez przewodniki BsmB1.Następnie przekształć nowo ligowany plazmid w stabilne trzy bakterie i amplifikuj bakterie za pomocą dowolnej metody przygotowania plazmidu. Na sześciodołkowej płytce, na dołek, wysiew 750 000 limfocytów T 2n3 w DMEM z 10% FBS i 1% paciorkowcem pióra. Użyj jednego dołka na każdą konstrukcję i inkubuj komórki przez 24 godziny.Następnego dnia zmień pożywkę na świeży antybiotyk wolny od DMEM z 10% FBS. Zaraz po zmianie pożywki dla każdej studzienki posianych komórek należy przygotować probówkę z mieszaniną do produkcji lentiwirusa. Na każdą reakcję rozcieńczyć 11 mikrolitrów odczynnika do transfekcji na bazie lipidów ze 150 mikrolitrami pożywki Opti-MEM dla każdej reakcji.Następnie w oddzielnych probówkach przygotuj DNA. Połączyć dwa mikrogramy plazmidu wektora lentiwirusowego CLOud9 z dwoma mikrogramami innych składników opakowania lentiwirusowego. Rozcieńczyć tę mieszaninę w 150 mikrolitrach pożywki Opti-MEM.Następnie połączyć równe objętości rozcieńczonej mieszaniny plazmidu lentiwirusowego w rozcieńczonym odczynniku do transfekcji na bazie lipidów i inkubować mieszaniny przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Następnie do każdej studzienki komórek dodaj jedną probówkę przygotowanych mieszanin i kontynuuj inkubację. 48 godzin później przenieś pożywkę do produkcji wirusa z dołków płytkowych do stożków i wiruj je z prędkością 300 g przez pięć minut.Następnie przenieść supernatant do świeżych probówek, aby wyrzucić granulowane resztki. Teraz natychmiast użyj pożywki do produkcji wirusa do transdukcji komórek docelowych lub zamroź ją w temperaturze 80 stopni Celsjusza do wykorzystania w przyszłości. Zacznij od dodania 250 mikrolitrów każdego interesującego konstruktu wirusowego, który w tym przypadku składa się z komplementarnych plazmidów CLOud9 do 50-mililitrowej stożkowej probówki zawierającej 80 000 komórek.Następnie dodaj tyle polibrenu, aby wynosił od jednego do ośmiu mikrogramów na mililitr w roztworze. Następnie dostosuj całkowitą objętość w każdej probówce do jednego mililitra za pomocą pożywki bez antybiotyków. Teraz, aby zwiększyć kontakt między cząsteczkami wirusa a komórkami, wiruj komórki pod ciśnieniem 800 g przez 30 minut w temperaturze pokojowej.Następnie ponownie zawiesić komórki w supernatancie przez pipetowanie. Następnie załadować zawiesinę komórek na płytki hodowlane i inkubować je przez 24 godziny. Następnego dnia zbierz komórki.Odwirować je w 300 g przez pięć minut w temperaturze pokojowej i ponownie zawiesić w normalnym podłożu. Następnego dnia dodaj puromycynę i higromycynę do pożywki, aby wybrać podwójnie transdukowane komórki. Odpowiednie stężenie antybiotyku powinno być wcześniej określone dla każdego typu komórek.Następnie należy inkubować komórki w pożywce selekcyjnej przez co najmniej trzy dni przed przystąpieniem do dalszych aplikacji i kontynuować konserwację komórek i pożywki selekcyjnej. Aby dimeryzować wybrane i transdukowane komórki CLOud9, dodaj jeden milimolowy ABA do naczynia hodowlanego. W przypadku kontroli dodaj DMSO, a następnie utrzymuj komórki za pomocą ABA lub DMSO przez czas trwania eksperymentu.Aby odwrócić dimeryzację, umyj komórki wystarczającą ilością PBS, aby dwukrotnie pokryć powierzchnię płytki. Następnie hoduj komórki w pożywkach wolnych od ABA, aby utrzymać je w stanie niedimeryzowanym. Właściwe zastosowanie systemu CLOud9 indukuje odwracalny kontakt komplementarnych konstruktów CSA i CSP CLOud9 poprzez dodanie lub usunięcie ABA do pożywki do hodowli komórkowych.Konstrukty CSA i CSP są lokalizowane w odpowiednich regionach genomu przy użyciu standardowej przewodnika RNAse CRISPR. Zastosowano immunoprecypitację chromatyny, a następnie ilościową reakcję PCR, aby zapewnić dokładną lokalizację w celu każdego składnika CLOud9. Dodatkowo koimmunoprecypacja z ABA i bez ABA weryfikowała dimeryzację CSA i CSP w obecności liganda, a także odwracalność w przypadku braku liganda.Po dimeryzacji ABA większy kontakt między beta-globiną a LCR mierzono poprzez potwierdzenie wychwytywania chromosomów. Nie zaobserwowano tego jednak w kontrolkach zawierających ani tylko CSA, ani tylko konstrukcję CSP. Stworzenie interakcji beta-globina LCR nie wyeliminowało całkowicie endogennego kontaktu z globiną LCR.Dodał tylko do oryginalnego kontaktu. Wzrost kontaktów LCR beta-globiny obserwowano przez 72 godziny dimeryzacji, niezależnie od dokładnego regionu w docelowym LCR lub regionie promotora beta-globiny. Na koniec potwierdzono odwracalność systemu za pomocą potwierdzenia potwierdzenia chromosomu po usunięciu ABA.Spowodowało to całkowite odnowienie potwierdzenia endogennego. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o codziennej zmianie pożywki i dodawaniu świeżych dimeryzowanych komórek transdukowanych CLOud9. Nie zapominaj, że praca z lentiwirusem może być niezwykle niebezpieczna i podczas wykonywania tej procedury należy zawsze podejmować wszelkie środki ostrożności stosowane w BSL 2.

crispr-mediated-reorganization-of-chromatin-loop-structure

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

Analiza oddziaływań chromatyny za pomocą sekwencjonowania parowanych końców (ChIA-PET) jest metodą detekcji oddziaływań chromatyny de novo, służącą lepszemu zrozumieniu kontroli transkrypcyjnej.

Analiza oddziaływań chromatyny z sekwencjonowaniem parowanych końców (ChIA-PET) w celu mapowania oddziaływań chromatyny i zrozumienia regulacji transkrypcji

Regulacja środowiska chromatyny jest niezbędnym procesem niezbędnym do prawidłowej ekspresji genów. W tym miejscu opisujemy metodę kontrolowania ekspresji genów poprzez rekrutację maszynerii modyfikującej chromatynę w sposób specyficzny dla genu i odwracalny.

Tłumienie transkrypcji genów poprzez przekierowywanie maszynerii komórkowej za pomocą chemicznych modyfikatorów epigenetycznych

Ukierunkowana edycja epigenomu DNA reprezentuje potężne podejście terapeutyczne. Protokół ten opisuje produkcję, oczyszczanie i koncentrację wektorów lentiwirusowych typu "wszystko w jednym" zawierających transgen CRISPR-dCas9-DNMT3A do zastosowań w edycji epigenomu w neuronach pochodzących z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC).

Platforma wektorów lentiwirusowych do efektywnego dostarczania narzędzi do edycji epigenomu do modeli chorób pochodzących z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Ta metoda jest przeznaczona do śledzenia tworzenia domen chromatyny za pośrednictwem PRC2 w liniach komórkowych, a metoda może być dostosowana do wielu innych systemów.

Metoda badania tworzenia się de novo domen chromatyny

Genom jest zorganizowany w przestrzeni jądrowej w różne struktury, które mogą być ujawnione za pomocą technologii przechwytywania konformacji chromosomów. Metoda Hi-C w jądrze zapewnia zbiór interakcji chromatyny w całym genomie w liniach komórkowych Drosophila, który generuje mapy kontaktów, które można badać w rozdzielczości megabazowej na poziomie fragmentu restrykcyjnego.

W jądrze Hi-C w komórkach Drosophila

Kurtyna DNA, wysokoprzepustowa technika obrazowania pojedynczych cząsteczek, stanowi platformę do wizualizacji w czasie rzeczywistym różnych interakcji białko-DNA. Niniejszy protokół wykorzystuje technikę kurtyny DNA do zbadania biologicznej roli i mechanizmu molekularnego Abo1, ATPazy AAA + zawierającej bromodomenę Schizosaccharomyces pombe.

Rozszyfrowanie molekularnego mechanizmu składania histonów za pomocą techniki kurtyny DNA

Protokół opisuje metody edycji epigenomu opartej na CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) w ludzkich liniach komórkowych przy użyciu transfekcji plazmidowego DNA i nukleofekcji mRNA.

Edycja epigenomu CRISPR w komórkach ludzkich przy użyciu transfekcji plazmidowego DNA i dostarczania nukleofekcji mRNA

Sekwencyjna ekstrakcja soli białek związanych z chromatyną jest użytecznym narzędziem do określania właściwości wiązania dużych kompleksów białkowych. Metoda ta może być stosowana do oceny roli poszczególnych podjednostek lub domen w ogólnym powinowactwie kompleksu białkowego do chromatyny masowej.

Sekwencyjne ekstrakcje soli do analizy właściwości wiązania chromatyny luzem przez kompleksy modyfikujące chromatynę

Interakcje DNA-białko są niezbędne dla wielu procesów biologicznych. Podczas oceny funkcji komórkowych analiza interakcji DNA-białko jest niezbędna do zrozumienia regulacji genów. Immunoprecypitacja chromatyny (ChIP) jest potężnym narzędziem do analizy takich interakcji in vivo.

Analiza promotora ligandu c-KIT z wykorzystaniem immunoprecypitacji chromatyny

Ta praca opisuje protokół immunoprecypitacji chromatyny (ChIP) przy użyciu dojrzałej linii mysich komórek T. Protokół ten jest odpowiedni do badania rozkładu określonych znaczników histonowych w określonych miejscach promotora lub w całym genomie.

Immunoprecypitacja chromatyny (ChIP) w liniach mysich limfocytów T

Poznaj metodę CLOuD9 do reorganizacji pętli chromatyny za pomocą CRISPR-dCas9 w celu modulacji ekspresji genów. Technika umożliwia odwracalne zmiany architektury chromosomowej i badanie dynamiki transkrypcyjnej.

Reorganizacja struktury pętli chromatyny za pośrednictwem CRISPR

Przeglądaj więcej filmów