Name: Trawienie białek, ultrafiltracja i chromatografia wykluczania wielkości w celu optymalizacji izolacji egzosomów z ludzkiego osocza krwi i surowicy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 22 s
Description: Poznaj metodę izolacji egzosomów z ludzkiego osocza krwi i surowicy wykorzystującą trawienie białek, ultrafiltrację oraz chromatografię wykluczania wielkości. Technika ta zwiększa dokładność analizy proteomicznej i ułatwia identyfikację biomarkerów chorób.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było wspierane przez wewnętrzne fundusze z CSU (do KMD), kontrakt ATCC #2016-0550-0002 (podzlecenie NIAID HHSN272201600013C) oraz Fundacji Billa i Melindy Gatesów (OPP1039688) (dla KMD/NKG). Dziękujemy letniemu programowi NSF Research Experience for Undergraduates (REU) na Uniwersytecie Stanowym Kolorado za dodatkowe wsparcie.

Ta praca została uznana za niebędącą badaniem na ludziach po wstępnej ocenie przez Institutional Review Board (IRB) Uniwersytetu Stanowego Kolorado, ponieważ wszystkie próbki ludzkie zostały pobrane jako pozbawione elementów identyfikujących próbki z biorepozytorium Bioreclamation IVT i zostały zebrane zgodnie z zatwierdzonymi przez IRB protokołami.
1. Przygotowanie surowej próbki (osocza lub surowicy) poprzez granulowanie większych pęcherzyków i resztek komórkowych
Uwaga: Względy bezpieczeństwa: osocze, surowica i inne płyny biologiczne są materiałami biologicznymi i muszą być traktowane ze szczególną ostrożnością, podczas noszenia podstawowego sprzętu ochrony osobistej, w tym rękawic i fartucha laboratoryjnego. Zdecydowanie zaleca się, aby próbki biologiczne były przetwarzane w komorze bezpieczeństwa biologicznego; Jeśli nie jest to możliwe, zaleca się stosowanie ochrony oczu.
<ol>
	<li>Zrównoważyć próbkę surowicy lub osocza, umieszczając probówkę w warunkach bez wstrząsania w lodówce o temperaturze 4 °C na noc (z przechowywania w temperaturze -20 lub -80 °C).</li>
	<li>Porcjować 250 μl próbki do probówki mikrowirówkowej za pomocą pipety o pojemności 1 000 μl.</li>
	<li>Odwirować próbkę o masie 18 000 x g przez 30 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Za pomocą pipety o pojemności 200 μl usunąć 200 μl oczyszczonego supernatantu i dodać go do nowej probówki do mikrowirówki. Podczas przenoszenia supernatantu należy unikać jakiegokolwiek granulowanego materiału. Wyrzuć granulowany materiał.</li>
	<li>Określić ilościowo zawartość białka w próbce za pomocą testu kwasu bicinchoninowego (BCA), stosując protokół producenta. Aby wykonać test, rozcieńczyć próbkę w stosunku 1:50 w 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS). Przetestuj każdą próbkę w duplicate. 
	nuta: Używaj 1x PBS w całym protokole, chyba że zaznaczono inaczej. Średnio 200 μl oczyszczonej surowicy lub osocza (po 18 000 x g) daje 15 mg białka ogółem. Inne rodzaje próbek, o niższej lub wyższej zawartości białka, mogą wymagać dodatkowych rozcieńczeń BCA.</li>
	<li>Podwielokrotność 10 mg próbki umieścić w nowej probówce do mikrowirówki. Wykorzystać stężenie uzyskane w kroku 1.5 w celu obliczenia odpowiedniej objętości próbki. Porcjować próbkę za pomocą pipety o pojemności 200 μl. 
	nuta: Zaleca się przechowywanie pozostałej próbki w temperaturze -80 °C. Porcję próbki należy podzielić na porcje w różnych probówkach w ilości 10 mg na probówkę, aby uniknąć wielokrotnych cykli zamrażania i rozmrażania w przyszłości.</li>
</ol>
2. Trawienie nieegzosomalnych białek krwi
Uwaga: Etap trawienia ma na celu redukcję białek nieegzosomalnych, które mogą współoczyszczać się z egzosomami. Jeśli do dalszych analiz wymagane jest zachowanie białek powierzchniowych egzosomów, należy wziąć pod uwagę, że ten etap może potencjalnie zakłócić tę analizę. Proces ten nie miał znacząco negatywnego wpływu na wykrycie egzosomalnego CD63, białka tetraspaniny eksponowanego powierzchniowo.
<ol>
	<li>Przygotować roztwór proteinazy K o stężeniu 500 μg/ml w PBS. Dodaj odpowiednią ilość proteinazy K do stożkowej probówki. Następnie dodaj bufor i wir przez 30 s, 3x w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Dodać 50 μl roztworu proteinazy K do podwielokrotności próbki 10 mg i delikatnie wymieszać, pipetując w górę i w dół za pomocą pipety o pojemności 200 μl.</li>
	<li>Inkubować próbkę w temperaturze 37 °C w łaźni wodnej przez 30 minut. Umieścić probówkę w stojaku na probówki pływakowe i unikać całkowitego zanurzenia probówki w łaźni wodnej, aby uniknąć potencjalnego wycieku.</li>
	<li>Przenieść próbkę i pływający stojak na probówki do łaźni wodnej o temperaturze 60 °C na 10 minut w celu dezaktywacji proteinazy K.</li>
</ol>
3. Usuwanie małych białek i peptydów za pomocą ultrafiltracji wirówkowej
<ol>
	<li>Przed użyciem przepłukać urządzenie ultrafiltracyjne zawierające filtr odcięcia masy cząsteczkowej (MWCO) 100 kDa za pomocą PBS. W tym celu należy dodać do filtra 500 μl PBS za pomocą pipety o pojemności 1 000 μl. Obracaj urządzeniem na poziomie 3 700 x g przez 5 minut. Odrzuć pozostały retentat, jak również eluat. 
	nuta: Pojemność próbki urządzenia do ultrafiltracji musi wynosić od 0,5 ml do 4 ml, aby zapewnić osiągnięcie końcowej zmniejszonej objętości próbki wynoszącej 50 μl.</li>
	<li>Pobrać próbkę z kroku 2.4 i zwiększyć objętość do 500 μl, dodając PBS. Odpipetować próbkę do wstępnie przepłukanego urządzenia do ultrafiltracji. 
	nuta: Średnio objętość próbki z kroku 2.4 wynosi 185 μl (120 do 150 μl próbki i 50 μl roztworu proteinazy K).</li>
	<li>Umieścić urządzenie do ultrafiltracji w wirówce stołowej o stałym kącie nachylenia przy 3 700 x g w temperaturze 4 °C, aż próbka zmniejszy się do objętości 50 μl. 
	ostrożność: W przypadku stosowania urządzeń ultrafiltracyjnych z objętością martwą należy zachować ostrożność, aby uniknąć całkowitego wysuszenia membrany filtracyjnej podczas etapów wirowania.</li>
	<li>Dodaj 500 μl PBS bezpośrednio do membrany filtracyjnej i pipetuj w górę i w dół 5 razy. Odwirować jak w kroku 3.3. Wykonaj ten etap prania w sumie 3 razy.</li>
	<li>Przenieść ostatnie 50 μl retentatu do nowej probówki do mikrowirówki.</li>
	<li>Przepłukać membranę filtra 200 μl PBS, pipetując 10 razy w górę i w dół, a następnie przenieść płukanie do probówki z kroku 3.5.</li>
	<li>Umieść uchwyt filtra w odwrotnej pozycji w nowej probówce. Uruchomić odzyskiwanie wirowania wstecznego przez 5 minut przy 2,000 x g, aby pobrać pozostałą próbkę z membrany. Połączyć próbkę z próbką z kroku 3.5.</li>
</ol>
4. Oczyszczanie pęcherzyków za pomocą chromatografii wykluczającej rozmiar (SEC)
<ol>
	<li>Dodać 850 μl gnojowicy SEC, z kulkami o MWCO 700 kDa, do pustej, zakrytej grawitacyjnie kolumny przepływowej za pomocą pipety o pojemności 1 000 μl. Umieść kolumny w stojaku o odpowiednim rozmiarze wyposażonym w tackę ociekową.</li>
	<li>Odkręć spód kolumny i pozwól płynowi spłynąć przez 5 minut. Po odsączeniu dodaj 10 ml PBS, aby zmyć żywicę. Odczekaj 20 minut, aż pranie spłynie z kolumny.</li>
	<li>Umieścić zagęszczoną próbkę traktowaną proteinazą K z etapu 3.5 w stożkowej probówce o pojemności 15 ml i zwiększyć objętość próbki do 5 ml, dodając PBS za pomocą pipety serologicznej. Delikatnie wymieszać probówkę, kołysząc przez 1 minutę, a następnie powoli nanieść próbkę na kolumnę przygotowaną w kroku 4.2 za pomocą pipety serologicznej. 
	nuta: Po zdjęciu nasadki kolumny próbka przepłynie grawitacyjnie przez żywicę; próbka o pojemności 5 ml całkowicie przepłynie przez kolumnę w ciągu 10 minut.</li>
	<li>Zebrać przepływ w nowej stożkowej probówce o pojemności 15 ml.</li>
	<li>Za pomocą pipety serologicznej ponownie nanieść pobrany materiał na żywicę, aby usunąć pozostały materiał poniżej 700 kDa.</li>
	<li>Zebrać przepływ w nowej stożkowej probówce o pojemności 15 ml. Umyj żywicę dwukrotnie, dodając 1 ml PBS. Zebrać przepływ w rurze z kroku 4.5; całkowita końcowa objętość wyniesie około 7 ml. 
	nuta: Po kroku 4.6 próbka zostanie rozcieńczona około 35 razy w stosunku do pierwotnej objętości próbki; Poniższe kroki zmniejszą objętość i zagęszczą oczyszczoną próbkę egzosomu.</li>
</ol>
5. Stężenie oczyszczonych egzosomów i kwantyfikacja całkowitego białka
<ol>
	<li>Przed użyciem przepłukać urządzenie ultrafiltracyjne filtrem MWCO o mocy 3 kDa z PBS, zgodnie z opisem w kroku 3.1.</li>
	<li>Dodać próbkę z kroku 4.6 do urządzenia ultrafiltracyjnego i odwirować w wirniku z odchylanym wiadrem o temperaturze 3 700 x g w temperaturze 4 °C. Bufor przejdzie przez filtr i może zostać odrzucony. Skoncentrowane egzosomy zostaną zatrzymane nad filtrem. Odwirować próbkę do momentu, aż objętość powyżej filtra (retentatu) zmniejszy się do 200 μl.</li>
	<li>Przenieść retentat do nowej probówki do mikrowirówki.</li>
	<li>Przepłukać membranę filtracyjną 200 μl PBS, pipetując przez membranę 10 razy, a następnie przenieść płukanie do probówki z kroku 5.3. Pozwoli to na pobranie dowolnej pozostałej próbki egzosomu.</li>
	<li>Doprowadzić objętość próbki do 500 μl, dodając PBS. Mieszać, powoli pipetując 10 razy w górę i w dół. 
	nuta: W tym miejscu protokół można wstrzymać. Próbki należy przechowywać w temperaturze 4 °C przez noc lub w temperaturze -20/-80 °C w przypadku długotrwałego przechowywania.</li>
	<li>Określić ilościowo zawartość białka w próbce za pomocą testu BCA, korzystając z protokołu producenta. Rozcieńczyć próbkę w stosunku 1:10 i 1:50 w PBS. Uruchom każdą próbkę w pliku duplicate. 
	nuta: Zaczynając od 10 mg całkowitego białka surowicy lub osocza, całkowita wydajność białka w oczyszczonych egzosomach z kroku 5.6 wynosi średnio 150 μg. Dodatkowe rozcieńczenia mogą być konieczne, jeżeli używane są próbki inne niż surowica lub osocze; Wydajność może się różnić w zależności od rodzaju próbki.</li>
</ol>
6. Kwantyfikacja i wymiarowanie egzosomów za pomocą analizy śledzenia nanocząstek (NTA)
<ol>
	<li>Dodać 5 μg oczyszczonych egzosomów (oznaczonych ilościowo w 5.6) do 1 ml PBS i wirować przez 15 s na niskiej i średniej prędkości.
	<ol>
		<li>Umieścić próbkę w jednorazowej strzykawce o pojemności 1 ml. Jeśli to możliwe, umieść strzykawkę w automatycznej pompie strzykawkowej ustawionej tak, aby wstrzykiwała rozcieńczoną próbkę egzosomu z szybkością 30 μl/min.</li>
		<li>Wykonuj pomiary NTA przy użyciu ustawień przechwytywania wideo: wzmocnienie ekranu 3 - 4 i poziom kamery 12 - 13.</li>
		<li>Zdefiniuj skrypt do analizy, aby uruchomić trzy repliki techniczne przez co najmniej 30 sekund przy użyciu stałego przepływu dla każdej repliki. Na potrzeby analizy ustaw próg przechwytywania na 5, 
		nuta: Szczegółowe informacje na temat korzystania z automatycznej strzykawki oraz ustawienia przechwytywania wideo są dostępne w pliku reference13. Ustawienia przechwytywania i analizy dla NTA muszą być spójne dla różnych próbek, aby zapewnić porównywalność.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. Oznaczanie redukcji białka rozpuszczalnego
<ol>
	<li>Dodać 1 - 10 μg oczyszczonych egzosomów do buforu próbki SDS i przeprowadzić elektroforezę w żelu poliakrylamidowym (PAGE) przy użyciu 4 - 12% żelu Bis-Tris w 1x buforze MES SDS przez 35 minut przy 200 V. Przenieść rozdzielone białka do membrany nitrocelulozowej 0,2 μm, przykładając napięcie 50 V przez 1 - 1,5 godziny. Przeprowadzić analizę western blot w celu oceny obecności albuminy, apolipoproteiny A i B oraz marker egzosomu CD 63 zgodnie ze standardowymi metodologiami. 
	nuta: Pełne protokoły dla metod w wersji 7.1 można znaleźć w reference14; w szczególności SP007: Uruchamianie żeli poliakrylamidowych i SP011: Protokół Western blot.</li>
	<li>Oddziel 10 μg oczyszczonych egzosomów za pomocą PAGE, jak w kroku 7.1 i wybarwij prążki białkowe za pomocą barwnika coomassie, postępując zgodnie ze standardowymi zaleceniami, aby uwidocznić zmienność i redukcję białka między próbkami. 
	nuta: Dalsze szczegóły dotyczące protokołu dla western blot specyficznych dla CD63 są opisane przez Diaza i wsp. 15</li>
</ol>

<ol><li>Stoorvogel, W., Kleijmeer, M. J., Geuze, H. J., Raposo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biogenesis+and+functions+of+exosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">The biogenesis and functions of exosomes.</a> Traffic. 3 (5), 321-330 (2002).</li>
<li>Raposo, G., Stoorvogel, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles%3A+exosomes%2C+microvesicles%2C+and+friends%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles: exosomes, microvesicles, and friends.</a> J Cell Biol. 200 (4), 373-383 (2013).</li>
<li>Schorey, J. S., Harding, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles+and+infectious+diseases%3A+new+complexity+to+an+old+story%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles and infectious diseases: new complexity to an old story.</a> J Clin Invest. 126 (4), 1181-1189 (2016).</li>
<li>Taylor, D. D., Gercel-Taylor, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosome+platform+for+diagnosis+and+monitoring+of+traumatic+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Philos+Trans+R+Soc+Lond+B+Biol+Sci%22%5BJournal%5D)">Exosome platform for diagnosis and monitoring of traumatic brain injury.</a> Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 369 (1652), (2014).</li>
<li>Nilsson, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prostate+cancer-derived+urine+exosomes%3A+a+novel+approach+to+biomarkers+for+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Prostate cancer-derived urine exosomes: a novel approach to biomarkers for prostate cancer.</a> Br J Cancer. 100 (10), 1603-1607 (2009).</li>
<li>Linares, R., Tan, S., Gounou, C., Arraud, N., Brisson, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-speed+centrifugation+induces+aggregation+of+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22J+Extracell+Vesicles%22%5BJournal%5D)">High-speed centrifugation induces aggregation of extracellular vesicles.</a> J Extracell Vesicles. 4, 29509(2015).</li>
<li>Lobb, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+exosome+isolation+protocol+for+cell+culture+supernatant+and+human+plasma%5BTitle%5D)+AND+%22J+Extracell+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma.</a> J Extracell Vesicles. 4, 27031(2015).</li>
<li>Vergauwen, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confounding+factors+of+ultrafiltration+and+protein+analysis+in+extracellular+vesicle+research%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Confounding factors of ultrafiltration and protein analysis in extracellular vesicle research.</a> Scientific Reports. 7 (1), 2704(2017).</li>
<li>Welton, J. L., Webber, J. P., Botos, L. A., Jones, M., Clayton, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ready-made+chromatography+columns+for+extracellular+vesicle+isolation+from+plasma%5BTitle%5D)+AND+%22J+Extracell+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Ready-made chromatography columns for extracellular vesicle isolation from plasma.</a> J Extracell Vesicles. 4, 27269(2015).</li>
<li>Sódar, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-density+lipoprotein+mimics+blood+plasma-derived+exosomes+and+microvesicles+during+isolation+and+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Low-density lipoprotein mimics blood plasma-derived exosomes and microvesicles during isolation and detection.</a> Sci Rep. 6, 24316(2016).</li>
<li>de Menezes-Neto, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Size-exclusion+chromatography+as+a+stand-alone+methodology+identifies+novel+markers+in+mass+spectrometry+analyses+of+plasma-derived+vesicles+from+healthy+individuals%5BTitle%5D)+AND+%22J+Extracell+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Size-exclusion chromatography as a stand-alone methodology identifies novel markers in mass spectrometry analyses of plasma-derived vesicles from healthy individuals.</a> J Extracell Vesicles. 4, 27378(2015).</li>
<li>Corso, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reproducible+and+scalable+purification+of+extracellular+vesicles+using+combined+bind-elute+and+size+exclusion+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Reproducible and scalable purification of extracellular vesicles using combined bind-elute and size exclusion chromatography.</a> Scientific Reports. 7 (1), 11561(2017).</li>
<li>Nanosight Ltd. NanoSight NTA 2.1 Analytical Software, Operating Manual. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://nanobio.physics.ucsb.edu/pdfs/equipment/Nanosight%20NTA2.1%20software%20manual.pdf">http://nanobio.physics.ucsb.edu/pdfs/equipment/Nanosight%20NTA2.1%20software%20manual.pdf</a> (2010).</li>
<li>Dobos, K. Production Manuals & SOPs. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://csu-cvmbs.colostate.edu/academics/mip/research/Pages/dobos-lab-production-manuals-sops.aspx">http://csu-cvmbs.colostate.edu/academics/mip/research/Pages/dobos-lab-production-manuals-sops.aspx</a> (2017).</li>
<li>Diaz, G., Wolfe, L. M., Kruh-Garcia, N. A., Dobos, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+the+Membrane-Associated+Proteins+of+Exosomes+Released+from+Human+Macrophages+after+Mycobacterium+tuberculosis+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Changes in the Membrane-Associated Proteins of Exosomes Released from Human Macrophages after Mycobacterium tuberculosis Infection.</a> Sci Rep. 6, 37975(2016).</li>
<li>Yuana, Y., Levels, J., Grootemaat, A., Sturk, A., Nieuwland, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-isolation+of+extracellular+vesicles+and+high-density+lipoproteins+using+density+gradient+ultracentrifugation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Extracell+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Co-isolation of extracellular vesicles and high-density lipoproteins using density gradient ultracentrifugation.</a> J Extracell Vesicles. 3, (2014).</li>
<li>Théry, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+exosomes+from+cell+culture+supernatants+and+biological+fluids%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids.</a> Curr Protoc Cell Biol. , Chapter 3 Unit 3.22 (2006).</li>
<li>Muller, L., Hong, C. S., Stolz, D. B., Watkins, S. C., Whiteside, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+biologically-active+exosomes+from+human+plasma%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Isolation of biologically-active exosomes from human plasma.</a> J Immunol Methods. 411, 55-65 (2014).</li>
<li>Böing, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-step+isolation+of+extracellular+vesicles+by+size-exclusion+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22J+Extracell+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Single-step isolation of extracellular vesicles by size-exclusion chromatography.</a> J Extracell Vesicles. 3, (2014).</li>
<li>Sweeney, P. J., Walker, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteinase+K+%28EC+3.4.21.14%29%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Proteinase K (EC 3.4.21.14).</a> Methods Mol Biol. 16, 305-311 (1993).</li>
<li>Baranyai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+Exosomes+from+Blood+Plasma%3A+Qualitative+and+Quantitative+Comparison+of+Ultracentrifugation+and+Size+Exclusion+Chromatography+Methods%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Isolation of Exosomes from Blood Plasma: Qualitative and Quantitative Comparison of Ultracentrifugation and Size Exclusion Chromatography Methods.</a> PLoS One. 10 (12), e0145686(2015).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Zoptymalizowana metoda zwiększania czystości i wydajności egzosomów z krwi zwiększy zdolność do dokładnego wydobywania pęcherzyków zewnątrzkomórkowych jako źródła biomarkerów wielu chorób. Standardowe metody stosowane obecnie do izolowania egzosomów, w szczególności metody ultrawirowania i wytrącania, mają kilka wad, w tym agregację egzosomów i granulowanie rozpuszczalnych białek 7,17,18. Alternatywnie, zastosowanie SEC wykazało...

Egzosomy to nanopęcherzyki (o rozmiarach od 30 nm do 150 nm) uwalniane przez prawie wszystkie komórki w ludzkim ciele w celu ułatwienia procesów komunikacji między komórkami1,2. Co ciekawe, skład egzosomów zmienia się w zależności od komórek, z których pochodzą, a także od statusu zdrowotnego danej osoby3,4,5. Dodatkowo egzosomy można pobrać z kilku płynów biologicznych, takich jak: ślina, mocz i krew2. Ze względu na te cechy egzosomy są uważane za dobre źródło biomarkerów choroby. Niestety nie ma standardowej metody izolacji egzosomów. Niektóre laboratoria rozważają wirowanie wieloetapowe, z końcowym krokiem o dużej prędkości przy 100 000 x g przy użyciu gradientów gęstości jako złotą metodą izolacji egzosomów. Jednak ostatnie badania wykazały, że ultrawirowanie indukuje agregację egzosomów z rozpuszczalnymi białkami i innymi egzosomami, a także wpływa na integralność egzosomów, co może utrudniać dalsze zastosowania6,7. Inne popularne metody izolacji egzosomów obejmują między innymi: wytrącanie za pomocą komercyjnych odczynników na bazie glikolu polietylenowego (PEG), ultrafiltrację odśrodkową i chromatografię wykluczającą wielkość (SEC). Komercyjne odczynniki wykorzystujące polimery glikolu polietylenowego (PEG) wzbogacają egzosomy, powodując ich wytrącanie się i tworzenie osadu. Ograniczeniami przy stosowaniu tego polimeru jest zanieczyszczenie resztkowym polimerem PEG oraz duża ilość rozpuszczalnych białek nieegzosomalnych w produkcie końcowym. Ultrafiltracja wykorzystuje wirowanie do oczyszczania i zagęszczania pęcherzyków za pomocą membrany celulozowej; Egzosomy są zatrzymywane nad filtrem, podczas gdy mniejsze zanieczyszczenia i inne białka przechodzą przez błonę7,8. Podobnie jak inne metody, ultrafiltracja odśrodkowa ma ograniczoną zdolność do oczyszczania egzosomów ze względu na zatrzymywanie wysokich poziomów białek nieegzosomalnych, w tym kompleksów białkowych i agregatów. Wreszcie, oczyszczanie SEC wykorzystuje porowatą żywicę do oddzielania cząsteczek według wielkości. SEC wykazał obiecujące wyniki, pokonując większość problemów napotykanych przy innych metodach poprzez wychwytywanie większości białek zanieczyszczających i zachowanie integralności egzosomalnej, ponieważ izolacja opiera się na grawitacji lub systemach niskociśnieniowych7,9. Jednak koizolacja większych agregatów białkowych i lipoprotein 10 podczas SEC wpływa na czystość końcowego preparatu egzosomu. Chociaż niektóre metody zostały przetestowane pod kątem oczyszczania egzosomów z supernatantów hodowli komórkowych i plazmy7, lub tylko plasma9,11, nie ma informacji o skuteczności metod bezpośrednio porównujących osocze krwi i surowicę od tej samej osoby.
Tutaj skupiamy się na oczyszczaniu egzosomów krwi, porównując różne procesy pracy, aby ustalić, czy techniki wzbogacania pęcherzyków są możliwe do przełożenia między osoczem a surowicą. Analiza śledzenia nanocząstek i western blot zostały wykorzystane do ilościowego określenia różnic w stężeniu, czystości i składzie białek egzosomów w produktach końcowych. Ostatnia metoda, szczegółowo opisana w tym protokole, zwiększa liczbę pęcherzyków i zmniejsza poziom białek nieegzosomalnych. Co ważne, wykazano drastyczne zmniejszenie powszechnych białek współprecypitujących, w tym albumin i apolipoprotein. Duża obfitość tych dwóch białek we krwi i częstotliwość, z jaką oczyszczają się one z egzosomami, powoduje niespójności między "oczyszczonymi" próbkami, zniekształcając dalsze analizy. Protokół ten obejmuje użycie dostępnej na rynku żywicy SEC; żywica składa się z porowatych kulek, w których białka mniejsze niż 700 kDa mogą dostać się do kulek. Po dostaniu się do środka białka są zatrzymywane przez ligand oktyloaminy. Eluat składa się z egzosomów i cząsteczek większych niż 700 kDa12. Dodatkowo, w celu zmniejszenia ilości agregatów białkowych i apolipoprotein, które unikają wychwytywania perełek, włączamy do procesu pracy etap trawienia proteazy. Obecnie nie ma jednej techniki zdolnej do maksymalizacji wydajności egzosomów przy jednoczesnym zmniejszeniu współoczyszczania białek nieegzosomalnych. Badanie to pokazuje, że protokół oczyszczania, który łączy wstępne traktowanie trawieniem proteazy z wieloma metodami odzyskiwania i oczyszczania, może być stosowany w celu zwiększenia wydajności i czystości egzosomów z surowicy krwi i osocza.

<table><tbody><tr><td>Nanosight</td><td>Malvern</td><td>NS300</td><td></td></tr><tr><td>Mikrowirówka stołowa&nbsp;</td><td>Thermo</td><td>Legend Mico21</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka stołowa&nbsp;</td>Kąpiel wodna <td>Beckman Coulter</td><td>Allegra 6R</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Czytnik</td> mikropłytek Benchmark <td>B2000-4</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do oznaczania białek BCA</td><td>BIOTEK</td><td></td> Epoch Pierce THERMO 23227 <td></td></tr><tr><td>Zestaw do oznaczania białek Micro BCA</td><td>THERMO</td><td>23235</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>96 płytka dołkowa</td><td>Corning</td><td>15705-066</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Filtr odśrodkowy Amicon Ultra-0,5 z membraną Ultracel-100</td><td>EMD-Millipore</td><td>UFC510096</td><td></td></tr><tr><td>Filtry odśrodkowe Amicon Ultra-4</td><td>EMD-Millipore</td><td>UFC800324</td><td></td></tr><tr><td>Capto Core 700</td><td>GE Healthcare</td><td>17548103</td><td></td></tr><tr><td>Poly-Prep&nbsp; Kolumny chromatograficzne</td><td>BIORAD</td><td>7311550</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE 4-12% Bis-tris Żele białkowe</td><td>THERMO</td><td>NP0323BOX</td><td></td></tr><tr><td>Membrana nitrocelulozowa, rolka, 0,2 i mikro; m</td><td>BIORAD</td><td>1620112</td><td></td></tr><tr><td>Proteinaza K,&nbsp; Tritirachium album</td><td>EMD-Millipore</td><td>539480</td><td></td></tr><tr><td>SimplyBlue SafeStain</td><td>THERMO</td><td>LC6065</td><td></td></tr><tr><td>SIGMAFAST&nbsp; BCIP/NBT</td><td>Millipore-SIGMA</td><td>B5655</td><td></td></tr><tr><td>4-chloro-1-naftol</td><td>Millipore-SIGMA</td><td>C6788</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-CD63 (królicze przeciwciało anty-ludzkie) z kozim przeciwciałem anty-króliczym HRP</td><td>SYSTEM BIOSCIENCES</td><td>EXOAB-CD63A-1</td><td>Przeciwciała pierwszorzędowe i drugorzędowe</td></tr><tr><td>Przeciwciało ALB (F-10)</td><td>SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY, INC.</td><td>sc-271605</td><td>Przeciwciało pierwszorzędowe</td></tr><tr><td>Przeciwciało apoB (C1.4)</td> <td>SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY, INC.</td><td>sc-13538</td><td>Przeciwciało pierwszorzędowe</td></tr><tr><td>apoA-I Przeciwciało (B-10)</td><td>SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY, INC.</td><td>sc-376818</td><td>Przeciwciało pierwszorzędowe</td></tr></tbody></table>

trawienie białek, ultrafiltracja i chromatografia wykluczania wielkości w celu optymalizacji izolacji egzosomów z ludzkiego osocza krwi i surowicy

Protein Digestion, Ultrafiltration, and Size Exclusion Chromatography to Optimize the Isolation of Exosomes from Human Blood Plasma and Serum

Egzosomy, rodzaj nanopęcherzyków uwalnianych ze wszystkich typów komórek, mogą być izolowane z dowolnego płynu ustrojowego. Zawartość egzosomów, w tym białek i RNA, jest unikalna dla komórek, z których pochodzą, i może być stosowana jako wskaźniki choroby. Kilka powszechnych protokołów wzbogacania, w tym ultrawirowanie, daje egzosomy obciążone rozpuszczalnymi zanieczyszczeniami białkowymi. W szczególności odkryliśmy, że najobficiej występujące białka we krwi często oczyszczają się razem z egzosomami i mogą zakłócać dalsze badania proteomiczne, udaremniając identyfikację kandydatów na biomarkery o niskiej liczebności. Dodatkowym problemem jest niepowtarzalność kwantyfikacji białek egzosomów ze względu na niespójne odwzorowanie poziomów białek nieegzosomalnych. Opisany tutaj protokół został opracowany w celu usunięcia białek nieegzosomalnych, które oczyszczają się wraz z egzosomami, dodając rygoru procesowi oczyszczania egzosomów. Porównano pięć metod z wykorzystaniem sparowanego osocza krwi i surowicy od pięciu dawców. Analiza z wykorzystaniem analizy śledzenia nanocząstek i testu białek kwasu mikrobicinchoninowego wykazała, że połączony protokół wykorzystujący ultrafiltrację i chromatografię wykluczania wielkości zapewnił optymalne wzbogacenie pęcherzyków i usunięcie rozpuszczalnych białek. Zastosowano Western blotting w celu sprawdzenia, czy oczekiwane obfite białka krwi, w tym albuminy i apolipoproteiny, zostały wyczerpane.

Poniższe dane uzyskano z użyciem sparowanych próbek osocza i surowicy od pięciu zdrowych dawców krwi. W celu określenia wpływu każdego etapu przetwarzania przeprowadzono pięć wariantów przedstawionego protokołu, a następnie porównano odzysk egzosomów oraz usuwanie białek nieegzosomalnych. Przetestowane metody obejmowały: 1) SEC 700 kDa + ultrafiltracja 3 kDa; 2) ultrafiltracja 100 kDa; 3) Proteinaza K + ultrafiltracja 100 kDa; 4) SEC 700 kDa + ultrafiltracja 100 kDa oraz 5) Proteinaza K +...

Tutaj prezentujemy protokół oczyszczania egzosomów zarówno z osocza, jak i surowicy z redukcją kooczyszczania nieegzosomalnych białek krwi. Zoptymalizowany protokół obejmuje ultrafiltrację, leczenie proteazą i chromatografię wykluczania wielkości. Ulepszone oczyszczanie egzosomów przynosi korzyści w dalszych analizach, w tym dokładniejszej kwantyfikacji pęcherzyków i charakterystyce proteomicznej.

Trawienie białek, ultrafiltracja i chromatografia wykluczania wielkości w celu optymalizacji izolacji egzosomów z ludzkiego osocza krwi i surowicy

Exosomes, a type of nanovesicle released from all cell types, can be isolated from any bodily fluid. The contents of exosomes, including proteins and ...

Ogólnym celem tej procedury jest oczyszczenie pęcherzyków z krwi przy jednoczesnej redukcji współoczyszczających białek i kompleksów, które mogą zakłócać dalszą analizę, w tym śledzenie nanocząstek i proteomikę. Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania, takie jak jakie są zmiany proteomiczne w pęcherzykach surowicy lub osocza w stanie chorobowym w porównaniu ze stanem zdrowym. Główną zaletą tej techniki jest zwiększona dokładność w liczeniu pęcherzyków.Usuwając obfite zanieczyszczenia niepęcherzykowe, zwiększamy identyfikację białek o niskiej liczebności i potencjalnych biomarkerów choroby. Implikacje tej metody obejmują odkrycie nowych biomarkerów diagnostycznych. Umożliwia dokładniejsze określenie składu proteomicznego pęcherzyków zewnątrzkomórkowych w złożonych matrycach, takich jak krew.Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które dopiero zaczynają oczyszczać pęcherzyki, będą miały trudności, ponieważ istnieje wiele opublikowanych technik. Na odtwarzalność dalszej analizy proteomicznej ma wpływ kooczyszczanie obfitych białek surowicy. Zrównoważyć próbkę surowicy lub osocza, umieszczając probówkę w warunkach bez wstrząsania w lodówce o temperaturze czterech stopni Celsjusza n

protein-digestion-ultrafiltration-size-exclusion-chromatography-to

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

W tym artykule przedstawiono metodę izolacji egzosomów z krwi pełnej i dalszej analizy za pomocą śledzenia nanocząstek za pomocą półautomatycznego instrumentu. Prezentowana technologia zapewnia niezwykle czułą metodę wizualizacji i analizy cząstek w ciekłej zawiesinie.

Innowacyjna metoda kwantyfikacji egzosomów i pomiaru wielkości

Płyn żółciowy jest cennym źródłem pęcherzyków zewnątrzkomórkowych/egzosomów, które zawierają potencjalnie ważne biomarkery. Protokół ten stanowi solidną metodę izolowania egzosomów z ludzkiej żółci w celu dalszych analiz, w tym profilowania miRNA.

Izolacja i profilowanie egzosomów zawierających mikroRNA z ludzkiej żółci

MikroRNA odgrywają ważną rolę regulacyjną i stają się nowymi celami terapeutycznymi dla różnych chorób ludzkich. Wykazano, że miRNA są przenoszone w lipoproteinach o dużej gęstości. Opracowaliśmy uproszczoną metodę szybkiego izolowania oczyszczonego HDL nadającego się do analizy miRNA z ludzkiego osocza.

Szybka i uproszczona metoda wysokoprzepustowej izolacji miRNA z wysoko oczyszczonej lipoproteiny o wysokiej gęstości

Ten protokół opisuje izolację i kwantyfikację małych RNA lipoprotein o dużej gęstości.

Izolacja lipoprotein o dużej gęstości do niekodującej kwantyfikacji małego RNA

Protokół tutaj pokazuje, że pęcherzyki zewnątrzkomórkowe mogą być odpowiednio oddzielone od kondycjonowanych pożywek do hodowli komórkowych za pomocą chromatografii wykluczającej rozmiar.

Chromatografia wykluczająca wielkość do oddzielania pęcherzyków zewnątrzkomórkowych od kondycjonowanych pożywek do hodowli komórkowych

Ten protokół zapewnia szybką i dostosowaną do wielkości metodę izolacji małych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych poprzez optymalizację wielkości dyszy rozpylającej powietrze, ciśnienia płynu w osłonie, ciśnienia przepływu próbki, napięcia, wzmocnienia i parametrów progu wyzwalania.

Optymalizacja parametrów sortowania metodą cytometrii przepływowej w celu wysokoprzepustowej izolacji i oczyszczania małych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych

Obecny protokół zawiera szczegółowe opisy skutecznego izolowania pęcherzyków zewnątrzkomórkowych moczu za pomocą funkcjonalizowanych kulek magnetycznych. Ponadto obejmuje kolejne analizy, w tym western blotting, proteomikę i fosfoproteomikę.

Izolacja pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z biofluidów na podstawie powinowactwa chemicznego do analizy proteomicznej i fosfoproteomicznej

Ten artykuł opisuje metodologię izolacji, charakterystyki i kwantyfikacji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych pochodzących z ludzkiego osocza (EV) i przedstawia przebieg pracy do bezznacznikowej analizy proteomu EV przy użyciu chromatografii cieczowej z tandemową spektrometrią mas (LC-MS/MS).

Izolacja, charakterystyka i analiza proteomiczna pęcherzyków zewnątrzkomórkowych pochodzących z osocza w celu odkrycia biomarkerów sercowo-naczyniowych

Ten protokół opisuje izolację małych dodatkowych pęcherzyków z murzyniego mięśnia szkieletu i szpiku kostnego z wykorzystaniem trawienia enzymatycznego i chromatografii wykluczającej rozmiar, umożliwiającą powtarzalne odzyskiwanie frakcji wzbogaconych w pęcherzyki z tkanek o złożonej strukturze i niskim wydajności, do dalszej analizy molekularnej.

Izolacja małych zewnątrzkomórkowych wezykuł od mysiej tkanki kostnej i szpiku kostnego przez chromatografię wykluczającą na podstawie wielkości

Tutaj opisujemy protokoły rozbijania komórek ssaków poprzez mielenie w stanie stałym w temperaturze kriogenicznej, wytwarzanie ekstraktu komórkowego z powstałego proszku komórkowego i izolowanie interesujących kompleksów białkowych poprzez wychwytywanie powinowactwa na paramagnetycznych kulkach w skali mikronowej sprzężonych z przeciwciałami.

Wychwytywanie powinowactwa do kompleksu białkowego z komórek ssaków poddanych mieleniu w kriomerze

Poznaj metodę izolacji egzosomów z ludzkiego osocza krwi i surowicy wykorzystującą trawienie białek, ultrafiltrację oraz chromatografię wykluczania wielkości. Technika ta zwiększa dokładność analizy proteomicznej i ułatwia identyfikację biomarkerów chorób.

Trawienie białek, ultrafiltracja i chromatografia wykluczania wielkości w celu optymalizacji izolacji egzosomów z ludzkiego osocza krwi i surowicy (Wideo) | JoVE Journal

Trawienie białek, ultrafiltracja i chromatografia wykluczania wielkości w celu optymalizacji izolacji egzosomów z ludzkiego osocza krwi i surowicy

Przeglądaj więcej filmów