Name: Peptydy przeciwdrobnoustrojowe wytwarzane przez selektywne wprowadzanie aminokwasów niekanonicznych pod ciśnieniem (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-04T14:45:00.000+00:00
Duration: 11 min 56 s
Description: Poznaj metodę wprowadzania niekanonicznych aminokwasów do peptydów przeciwdrobnoustrojowych wytwarzanych przez Escherichia coli. Technika umożliwia szybkie testowanie modyfikacji peptydów nisiny i ocenę ich aktywności przeciwbakteryjnej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

J.H.N., T.B. i M.B. potwierdzają finansowanie przez program UE FW7 (SYNPEPTIDE). F.-J.S. i T.F. potwierdzają finansowanie przez Federalne Ministerstwo Edukacji i Nauki (program BMBF "HSP 2020", projekt TU-WIMIplus SynTUBio) oraz Niemiecką Fundację Badawczą (Klaster Doskonałości "Ujednolicenie koncepcji w katalizie").

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Dzięki zastosowaniu SPI do wprowadzania analogów proliny, docelowe struktury nizyny mogą być znacznie modyfikowane, tworząc nowe warianty peptydów o unikalnych kombinacjach sekwencji i właściwościach chemicznych. W ten sposób można obejść podstawowy limit klasycznej technologii genowej, który jest ograniczony do chemii łańcucha bocznego 20 cAA. Dywersyfikacja chemiczna nizyny in vivo , jak pokazano powyżej, demonstruje ogólne podejście do uzupełniania naturalnych PTM i radykalnego zwiększania przestrzeni chemicznej RiPP. Wierzymy, że poszerzenie repertuaru naturalnych aminokwasów jest bardzo obiecujące, szczególnie w przypadku AMP. W białkach ogromny zakres funkcji może być realizowany poprzez zdefiniowany układ 20 cAA w trójwymiarowych strukturach. Przy długości zaledwie 7-100 aa3, sposoby osiągnięcia takich cech strukturalnych tylko za pomocą cAA byłyby ograniczone w przypadku AMP. Nie jest więc zaskakujące, że naturalne AMP w postaci RiPP są powszechnie intensywnie modyfikowane potranslacyjnie4. W ten sam sposób ncAA jako alternatywne elementy budulcowe są bardzo obiecujące, jeśli chodzi o poprawę ich parametrów farmakodynamicznych i farmakokinetycznych (patrz Baumann i in. 201735 i odniesienia tam).
Metodologia SPI zastosowana w tej pracy korzysta ze stosunkowo łatwej konfiguracji eksperymentalnej, prostego wykonania i wysokiej odtwarzalności. Ze względu na globalną substytucję, możliwe jest również włączenie wielomiejscowego ncAA do peptydów docelowych. Z drugiej strony, metoda ta może nie być odpowiednia do zastąpienia aminokwasów często występujących w produkcie docelowego genu. Zasadniczo niepożądane pozycje mogą zostać zmienione przez mutagenezę ukierunkowaną, ale te dodatkowe zmiany mogą również wpływać na kilka właściwości AMP, w tym strukturę i bioaktywność. Gdy szczep auksotroficzny do produkcji jest dostępny, można przetestować kilka ncAA bez konieczności wprowadzania rozległych zmian na poziomie genetycznym. Co więcej, metoda nie ogranicza się do auksotroficznych szczepów E. coli , ale może być również wykonywana przy użyciu naturalnego żywiciela produkcyjnego. Na przykład Zhou i in. wykazali, że SPI do produkcji nowych RiPP działa również w naturalnie Trp-auksotropie L. lactis: Używając zdefiniowanych pożywek, trzy analogi tryptofanu zostały włączone w czterech pozycjach do nizyny50.
Ponieważ metoda SPI prowadzi do globalnego zastąpienia wybranego cAA przez ncAA, ma ona ogólne zastosowanie do szerokiego zakresu docelowych peptydów i białek. Dostępny jest szereg auksotroficznych szczepów E. coli (patrz krok 1), co pozwala na przetestowanie kilku cAA pod kątem zastąpienia przez ncAA. Najczęściej stosuje się analogi met włączone przy użyciu szczepów z niedoborem metA (np. B834(DE3)). Przykładami izostrukturalnych analogów Met są azydohomoalanina (Aha) i homopropargyloglicyna (Hpg), dostępne na rynku ncAA, które można skutecznie włączyć. Oba wprowadzają bioortogonalne uchwyty, które umożliwiają przyłączanie cząsteczek przenoszących kompatybilną funkcjonalność alkinową lub azydkową. Na przykład barwniki fluorescencyjne lub ugrupowania glikolu polietylenowego (PEG) mogą być przyłączane przez katalizowaną miedzią(I) cykloaddycję azydku alkiny (CuAAC)51.
Chociaż obie metody inkorporacji rekombinowanych ncAA (SPI i SCS) zwykle osiągają wystarczające ilości docelowe, plony są często zmniejszone w stosunku do produkcji odpowiednich peptydów i białek typu dzikiego. Ponieważ czystość często koreluje z wydajnością produkcji, mogą być wymagane dodatkowe etapy oczyszczania, szczególnie w przypadku gatunków o niskiej liczebności. W tym konkretnym przypadku produkcji rekombinowanej nizyny, sekwencja lidera oznaczona przez Hisa znacznie upraszcza oczyszczanie RiPP poprzez selektywne wzbogacanie z lizatów komórkowych. Oczyszczanie pokazane w tym protokole poprawia czystość i stężenie nizyny, ale często nie daje czystości AMP wystarczającej do określenia wydajności i określonej aktywności. Oprócz IMAC, powszechnie stosowane metody oczyszczania AMP obejmują HPLC, chromatografię jonowymienną (IEC) i wytrącanie (np. przy użyciu acetonu lub kwasu trichlorooctowego (TCA)) lub ich kombinacje - co daje wieloetapowy schemat oczyszczania52. Należy zauważyć, że ich powszechnie polikationowy charakter może ułatwiać oczyszczanie IEC. Liofilizacja jest często stosowana do przechowywania oczyszczonych AMP.
Idealnie byłoby, gdyby ncAA do włączenia do AMP były dostępne na rynku po przystępnych cenach lub łatwe do wytworzenia za pomocą prostych i powtarzalnych protokołów syntezy chemicznej. Równie ważnym warunkiem wstępnym dla metody SPI jest rozpoznanie, aktywacja i naładowanie ncAA do pokrewnego tRNA przez endogenne lub współeksprymowane aaRS. Można to przetestować in vitro za pomocą aktywacji aminokwasów lub testu aminoacylacji tRNA53. Jako łatwą alternatywę można przeprowadzić ekspresję testów SPI białek modelowych, takich jak białko zielonej fluorescencji (GFP), przeprowadzanych zarówno w obecności, jak i przy braku suplementacji ncAA. Ponadto ważnymi czynnikami są rozpuszczalność w pożywce wzrostowej i przepuszczalność komórek, a także stabilność chemiczna.
W tym przykładzie aktywność przeciwdrobnoustrojowa została zbadana przy użyciu szczepu wskaźnikowego Gram-dodatniego. Ponieważ wyraża wiodącą peptydazę NisP, ostatni etap dojrzewania nizyny jest katalizowany. Usunięcie sekwencji wiodącej (oznaczonej przez Hisa w celu oczyszczenia) można również przeprowadzić in vitro poprzez traktowanie oczyszczonym NisP50 lub trypsyną54. Poza zakresem tych prac, organizmy chorobotwórcze i szczepy wielolekooporne mogą być następnie testowane pod kątem bakteriostatycznego lub bakteriobójczego hamowania przez AMP przy użyciu podobnej metodologii. Klinicznie istotne gatunki docelowe obejmują MRSA, MDR Mycobacterium tuberculosis, VRE, Acinetobacter baumannii, Streptococcus pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa i Klebsiella pneumoniae. Oprócz przedstawionego tutaj testu dyfuzji na płytce agarowej, hamowanie wzrostu można również przeprowadzić przy użyciu odpowiednich płynnych pożywek zaszczepionych gatunkami bakterii i uzupełnionych AMP. Stosując metody rozcieńczania bulionu, minimalne stężenie hamujące (MIC) można określić za pomocą czystych peptydów55. Przedstawiony tutaj test aktywności może być również wykorzystany do oszacowania bioaktywności i siły działania roztworów zawierających AMP w stosunku do związków odniesienia, na przykład dostępnej na rynku nizyny.
Rekombinowana produkcja RiPP jest często możliwa39, co zwykle obejmuje koekspresję genów PTM. Z chwilą, gdy szczep produkcyjny zostanie przeniesiony do chemicznie zdefiniowanego lub syntetycznego podłoża minimalnego zawierającego odpowiedni ncAA, następuje zastąpienie odpowiadającego mu cAA specyficznego dla pozostałości. W związku z tym inne RiPP mogą być wytwarzane przy użyciu tej samej metodologii, pod warunkiem, że ich produkcja rekombinowana jest wykonalna i można znaleźć warunki, w których włączenie ncAA i PTM daje wystarczające ilości produktu docelowego. Należy zauważyć, że oprócz proteomu komórki gospodarza, maszyneria peptydowa PTM może również zostać zmodyfikowana przez ncAA podczas SPI. W związku z tym czas indukcji ekspresji docelowej i długość następnego okresu inkubacji mogą wymagać optymalizacji. Ponieważ włączenie ncAA do enzymów PTM może wpływać na ich stabilność i aktywność, w zasadzie może to mieć wpływ na produkcję przetworzonego RiPP. Wystarczająca skuteczność enzymu PTM jest wskazywana przez tworzenie przetworzonego prepeptydu, wykrywanego przez stwardnienie rozsiane i testy bioaktywności. Jak przedstawiono powyżej, różne indukowalne promotory mogą być stosowane w celu wytworzenia genów PTM najpierw (w przypadku braku ncAA), a następnie indukcji genu peptydu prekursorowego w obecności ncAA. Ogólnie rzecz biorąc, produkcja peptydu docelowego zawierającego cAA musi zostać stłumiona przed dodaniem ncAA, dlatego wymagana jest ścisła represja genu prekursorowego. W ramach tego protokołu osiąga się to poprzez tłumienie kataboliczne poprzez dodanie glukozy do pożywki wzrostowej. Zwłaszcza, że enzymy PTM wymagane do przetwarzania prepeptydów pochodzą zwykle od genetycznie odległego gospodarza, temperatura ekspresji i wykorzystanie kodonów odpowiednich genów mogą wymagać optymalizacji, jeśli produkcja rekombinowana nie została jeszcze ustalona. Zasadniczo obecność ncAA w prepeptydzie może zakłócać rozpoznawanie i przetwarzanie enzymów PTM, w przypadku nizyny NisBC i NisP. W celu włączenia ncAA do AMP zaleca się zatem przeprowadzenie najpierw eksperymentów ekspresji na małą skalę w celu określenia odpowiednich warunków ekspresji i wiarygodności testu aktywności AMP.

Odkrycie antybiotyków w XX wieku i równoległy rozwój nowych związków przeciwbakteryjnych przeciwko mikroorganizmom chorobotwórczym umożliwiło celowane leczenie infekcji bakteryjnych. Jednak ze względu na pojawienie się wielolekoopornych patogenów, takich jak oporny na metycylinę Staphylococcusaureus (MRSA), enterokoki oporne na wankomycynę (VRE), MDR (wielolekooporne) fagi Salmonella typhimurium typu 10 (DT10) i Klebsiella pneumoniae, pilnie konieczne jest opracowanie nowych środków przeciwdrobnoustrojowych1. Peptydy przeciwdrobnoustrojowe (AMP) to wszechstronne, często wysoce specyficzne związki, które są obiecującymi kandydatami do opracowania nowych leków dzięki swoim właściwościom fizykochemicznym, elastyczności, rozmiarowi, hydrofobowości i sposobowi działania2. AMP to małe peptydy składające się zwykle z 7 - 100 aminokwasów. Często mają strukturę kationową bogatą w dodatnio naładowane reszty argininy i lizyny, które oddziałują z docelową błoną komórkową drobnoustrojów, która jest przeciwnie naładowana3. Szczególną podgrupą AMP są peptydy syntetyzowane rybosomalnie i modyfikowane potranslacyjnie (RiPPs)4. Są one wytwarzane przez wiele organizmów z królestwa grzybów i domeny bakterii. Jednym z najbardziej znanych i szeroko stosowanych RiPP jest nizyna, naturalnie wytwarzana przez bakterię kwasu mlekowego Lactococcus lactis (L. lactis). Aktywna przeciwko panelowi bakterii Gram-dodatnich, nisyna jest stosowana jako biokonserwant w przemyśle spożywczym od ponad 50 lat ze względu na swoje właściwości przeciwdrobnoustrojowe i brak rozwiniętej oporności w docelowych szczepach drobnoustrojów5. Badania wykazały, że nizyna destabilizuje i generuje pory w błonach komórkowych bakterii, prowadząc do aktywności przeciwdrobnoustrojowej zarówno przeciwko patogenom Gram-dodatnim, jak i Gram-ujemnym6. Wiążąc się z lipidem II, synteza ściany komórkowej bakterii jest hamowana7. Nizyna jest kodowana przez nisA jako liniowy peptyd prekursorowy, który składa się z lidera i regionu peptydu rdzeniowego (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1). Po syntezie rybosomalnej prenisyna jest najpierw modyfikowana przez dehydratazę NisB. Tutaj reszty seryny i treoniny w regionie rdzenia prepeptydu są odwadniane do dehydroalaniny (Dha) i dehydrobutyryny (Dhb)8. Następnie odwodnione reszty są łączone z cysteiną, tworząc pierścienie lantioninowe (stąd nazwa "lantibiotic" dla antybiotyków zawierających pierścienie lantioninowe) przez katalizowaną enzymatycznie addycję Michaela. Ta modyfikacja potranslacyjna (PTM) jest katalizowana przez cyklazę NisC. U L. lactis zmodyfikowana prenizyna jest następnie transportowana z komórki przez transporter NisT, a peptyd lidera jest rozszczepiany przez proteinazę NisP w celu uwolnienia dojrzałej i aktywnej formy nizyny9. Odpowiedzialny za to lider peptydaza NisP ma wysoką specyficzność substratową, ponieważ efektywnie przetwarza tylko zmodyfikowaną nisynę10.
Ogólnie, aktywne RiPP wynikają z działania enzymów PTM (na przykład NisBC), które drastycznie zwiększają przestrzeń chemiczną krótkich peptydów, np. poprzez acetylację, glikozylację, metylację lub fosforylację. Ten poziom złożoności można dodatkowo zwiększyć poprzez bezpośrednie włączenie NCA. Chociaż często jest to wykonalne, synteza chemiczna AMP jest wyzwaniem dla produkcji na dużą skalę ze względu na ich złożoność strukturalną. Na przykład całkowita synteza chemiczna laktozyny S w 71 etapach reakcji została osiągnięta przy końcowej wydajności 10%, a nizyny przy surowej wydajności zaledwie 0,003%11,12. Dlatego produkcja biologiczna stanowi realną alternatywę, ze względu na wytwarzanie prawidłowych stereocentrów i wysokie stężenie produktu.
Do dnia dzisiejszego ponad 150 ncAA, np. posiadających grupy funkcyjne zawierające fluor lub azydki, zostało włączonych do rekombinowanych białek, a także zgłoszono kilka przykładów AMP zmodyfikowanych przez ncAA13,14,15,16. Dzięki wprowadzeniu ncAA można uzyskać nowe właściwości fizykochemiczne w porównaniu z konwencjonalną mutagenezą. Różnorodność istniejących peptydów może zostać zwiększona, co może prowadzić do powstania nowych antybiotyków.
Jedną z metod włączania ncAA do rekombinowanych peptydów jest selektywna inkorporacja ciśnieniowa (SPI) oparta na użyciu auksotroficznych szczepów bakteryjnych17. Szczepy te nie są zdolne do syntezy odpowiadającego im analogu cAA ncAA. Metodologia wykorzystuje często obserwowaną zrelaksowaną specyficzność substratową, cechę wielu naturalnych syntetaz aminoacylo-tRNA (aaRSs)18. Oprócz naturalnych substratów cAA, enzymy te są często zdolne do rozpoznawania i aktywowania pożądanego ncAA oraz ładowania go do pokrewnych tRNA. Prowadzi to do rybosomalnej inkorporacji ncAA do docelowego produktu genu w sposób specyficzny dla reszty (tj. substytucja cAA → ncAA). Jest to oczywiście możliwe tylko wtedy, gdy pożądany ncAA jest strukturalnie i chemicznie podobny do aminokwasu kanonicznego i tolerowany przez fizjologię komórki, maszynerię translacyjną i docelową sekwencję peptydu lub białka. W określonej konfiguracji doświadczalnej auksotroficzne komórki gospodarza są hodowane w określonym pożywce zaopatrzonej w ograniczające stężenie natywnego aminokwasu, który ma zostać podstawiony. Wzrost lub wymiana komórek przez pożywkę wolną od cAA prowadzi do wewnątrzkomórkowego wyczerpania cAA. W kolejnym kroku dodaje się ncAA i indukuje się ekspresję genu docelowego. Nieuniknione jest, że ncAA są teraz również włączane do wielu innych białek w komórce gospodarza podczas tej fazy ekspresji docelowego genu. Niemniej jednak toksyczność konfiguracji SPI jest utrzymywana na niskim poziomie, ponieważ szczep Escherichia coli (E. coli) jest przekształcany za pomocą plazmidu przenoszącego gen docelowy pod kontrolą silnego promotora (zwykle wysoce konkurencyjnego promotora T7 / systemu polimerazy RNA)19. Bezpośrednio po indukcji (zwykle po wyczerpaniu cAA) komórki gospodarza przestają rosnąć, a ich cytoplazmatyczne maszynerie enzymatyczne są wykorzystywane głównie do ekspresji genu docelowego opartego na plazmidzie. Mutageneza ukierunkowana na miejsce może być wykorzystana do zdefiniowania miejsca (miejsc) instalacji ncAA specyficznej dla reszty w genie docelowym20.
Jako modelowy peptyd do inkorporacji ncAA, wybrano pentacykliczną AMP nisynę A. Ma długość 34 aminokwasów i ma tylko jedną resztę proliny w sekwencji peptydów rdzeniowych (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1). Podobnie jak w subtylizynie, erycynie A i S oraz naskórku, a także w nizynie Z i nizynie Q, konserwatywna prolina wydaje się być niezbędna dla aktywności9,21. Prolina cAA odgrywa szczególnie ważną rolę w rotacji amidu peptydylo-prolilu i stabilizacji struktury drugorzędowej. Jego boczne konformacje pierścienia łańcucha (exo / endo) są odpowiedzialne za termodynamiczną stabilizację wiązania amidowego. Ukierunkowane modyfikacje chemiczne (takie jak hydroksylacja, fluorowanie, metylacja) marszczenia prolilu często mają krytyczny wpływ na stabilność składania, sztywność rusztowania i funkcje wielu struktur biologicznych22. W związku z tym można się spodziewać, że podstawienie analogu proliny Pro→ nada pierścieniowi B, drugiemu pierścieniowi nizyny, nowe i niezwykłe właściwości.
Tutaj do produkcji rekombinowanej nizyny użyto prolinowo-auksotroficznego szczepu E. coli. Wymaga to ekspresji genu prepeptydu nisA, a także genów enzymu modyfikującego nisBC. Genetycznie kodowany produkt peptydowy zawiera N-końcowy lider oznaczony Hisem do oczyszczenia za pomocą chromatografii powinowactwa. Do oznaczania aktywności, L. lactis eksprymujący i wydzielający NisPT jest używany do aktywacji rekombinowanych wariantów nizyny z lizatów komórek E. coli lub oczyszczonych próbek peptydów (<klasa silna = "xfig">Rysunek 1). Dojrzały AMP zostaje wydany po rozszczepieniu lidera przez NisP. W tej metodzie dyfuzji agarowej próbka AMP dyfunduje do stałego podłoża wzrostowego i może hamować wzrost mikroorganizmu Gram-dodatniego. Po inkubacji można to zaobserwować wizualnie za pomocą aureoli hamujących wzrost. Oprócz L. lactis jako wskaźnika, zmodyfikowane warianty nizyny wykazywały aktywność przeciwdrobnoustrojową przeciwko Enterococcus faecalis, Bacillus cereus, Staphylococcus aureus i Lactobacillus johnsonii21,23.
Alternatywną i eksperymentalnie odmienną metodą włączania ncAA do RiPPs jest tłumienie kodonów stop (SCS)24. W tym celu wymagana jest ortogonalna para syntetazy tRNA / aminoacylo-tRNA (aaRS) dla odpowiedniego ncAA. Idealnie, wszystkie te trzy składniki są bioortogonalne, tj. nie wchodzą w interakcje z endogennymi tRNA i aaRS. Specyficzny dla ncAA aaRS może być generowany przez modyfikację miejsca aktywnego enzymu i badanie przesiewowe bibliotek genetycznych zmutowanych syntetaz25. Co więcej, wprowadzenie ncAA wymaga kodonu, który jest ponownie przypisywany i który nie koduje dla cAA. Zwykle używany jest bursztynowy kodon stop24,26.
Niedawno, SPI zostało założone w celu włączenia zawierających α-chloroacetamidy i kompatybilnych z chemią kliknięć ncAA do klasy NisA<sup="xref">27. Na przykład Nε-allok-lizyna została włączona do kaptystruiny peptydu lasso za pomocą metod inkorporacji specyficznych dla miejsca (SCS) i specyficznych dla reszty (SPI), a następnie zmodyfikowana in vitro przez metatezę katalizowaną rutenem28. W porównaniu do SPI, metoda SCS jest bardziej skomplikowana, ponieważ ortogonalna para tRNA / aaRS musi być równolegle wyrażona. Do tej pory o-pary do inkorporacji proliny zostały opracowane29, ale zgodnie z naszą najlepszą wiedzą, nie zgłoszono żadnego przykładu inkorporacji analogowej proliny.
Należy zauważyć, że nie wszystkie ncAA mogą być włączone przy użyciu metodologii SPI. Po pierwsze, wychwyt ncAA do cytoplazmy jest regulowany przez wiele białek transportowych, które są osadzone w błonie cytoplazmatycznej, która jest błoną wewnętrzną dla bakterii Gram-ujemnych, takich jak E. coli. Zwykle E. coli jest zdolna do transportu szerokiej gamy analogów aminokwasów do komórki z łańcuchami bocznymi strukturalnie i chemicznie podobnymi do aminokwasów kanonicznych. Po drugie, wiele chemicznie reaktywnych lub niestabilnych ncAA może działać jako inhibitor wzrostu komórkowego, ponieważ są toksyczne dla metabolizmu i fizjologii komórki gospodarza30. W związku z tym należy wcześniej zbadać wychwyt i toksyczność ncAA dla gospodarza produkcyjnego. Aby uniknąć inaktywacji maszynerii PTM jako efektu ubocznego, ściśle kontrolowany układ ekspresji odpowiedzialnych genów może być wykorzystany do włączenia naturalnego aminokwasu do enzymów modyfikujących (np. nisBC) i ncAA do genu docelowego (np. nisA). Można to osiągnąć za pomocą dwóch różnych promotorów i indukcji ekspresji genów docelowych, jak pokazano w specjalnie zaprojektowanych protokołach SPI31. Jak opisano powyżej, metoda SPI opiera się na zrelaksowanej specyficzności substratowej aaRS, która pozwala na aktywację ncAA i ładowanie pokrewnego tRNA. Następnie tRNA jest dostarczane do rybosomu, po czym następuje tworzenie wiązań amidowych i fałdowanie docelowego (poli)peptydu. W tych procesach mogą stać się istotne mechanizmy korekty i edycji32. Z tych powodów bardzo ważne jest, aby mieć docelowy ncAA, który jest strukturalnie i chemicznie podobny do cAA. Innymi kluczowymi punktami są wystarczająca stabilność (zarówno w pożywce wzrostowej, jak i w metabolizmie komórkowym) oraz rozpuszczalność ncAA. Dodatkowo powinien być albo dostępny w handlu, albo łatwy do syntezy chemicznej.
Tutaj opisujemy protokół dla SPI, pozwalający na specyficzne dla reszt włączenie ncAA do rekombinowanych RiPPs. W szczególności różne analogi proliny są włączane do przeciwdrobnoustrojowego peptydu nizyny A przy użyciu E. coli jako organizmu gospodarza. Spektrometria mas służy do weryfikacji, czy zamienniki aminokwasów i produkty peptydowe są analizowane pod kątem bioaktywności za pomocą testów hamowania wzrostu i mikroskopii fluorescencyjnej przy użyciu drobnoustrojów wskaźnikowych.
Podstawowym wymogiem dla udanej ekspresji rekombinowanej nizyny z określonymi ncAA jest odpowiedni auksotropiczny szczep E. coli prolinii. W przypadku tej auksotrofii proA musi być dysfunkcyjny, na przykład osiągnięty przez nokaut genomowy. Komórki całkowicie pozbawione wewnątrzkomórkowej biosyntezy Pro (tj. delecji proABC) bez możliwości rewersji są stabilnymi auksotrofami. Powszechnie stosowanymi metodami nokautu genów są transdukcja fagów lub nokaut jednogenowy według Datsenko & Wanner33. Co więcej, szczepy nokautujące proA można uzyskać z publicznych repozytoriów, takich jak Addgene, CGSC lub kolekcja Keio. Ponieważ pokazana tutaj rekombinowana ekspresja nisABC opiera się na użyciu promotorów T7, ekspresyjny szczep gospodarza musi przenosić indukowalny gen dla polimerazy RNA T7. Można to osiągnąć poprzez wprowadzenie profaga λDE3 do genomu gospodarza, na przykład za pomocą komercyjnego zestawu. Alternatywnie, szczepy takie jak BL21(DE3) mogą być auksotroficzne, jak opisano powyżej.

<table><tbody><tr><td>chlorek sodu</td><td>Carl Roth, Niemcy</td><td>P029</td><td></td></tr><tr><td>chlorowodorek guanidyny</td><td>Carl Roth, Niemcy</td><td>0035.2</td><td></td></tr><tr><td>wodorofosforan dipotasu</td><td>Carl Roth, Niemcy</td><td>P749.3</td><td></td></tr><tr><td>diwodorofosforan potasu</td><td>Carl Roth, Niemcy</td><td>3904.3</td><td></td></tr><tr><td>diwodorofosforan sodu jednowodny</td><td>Carl Roth, Niemcy</td><td>K300.2</td><td></td></tr><tr><td>wodorofosforan disodowy</td><td>Carl Roth, Niemcy</td><td>P030.2</td><td></td></tr><tr><td>L-alanina</td><td>Carl Roth, Niemcy</td><td>3076.2</td><td></td></tr><tr><td>L-arginina</td><td>Carl Roth, Niemcy</td><td>3144.3</td><td></td></tr><tr><td>Monohydrat L-asparaginy</td><td>Carl Roth, Niemcy</td><td>HN23.1</td><td></td></tr><tr><td>Kwas L-asparaginowy</td><td>Carl Roth, Niemcy</td><td>T202.1</td><td></td></tr><tr><td>L-cysteina</td><td>Carl Roth, Niemcy</td><td>3467.3</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Carl Roth, Niemcy</td><td>3772.1</td><td></td></tr><tr><td>Kwas L-glutaminowy</td><td>Carl Roth, Niemcy</td><td>3774.1</td><td></td></tr><tr><td>L-glicyna</td><td>Carl Roth, Niemcy</td><td>3187.3</td><td></td></tr><tr><td>L-histydyna</td><td>Carl Roth, Niemcy</td><td>3852.3</td><td></td></tr><tr><td>L-izoleucyna</td><td>Carl Roth, Niemcy</td><td>3922.3</td><td></td></tr><tr><td>L-leucyna</td><td>Carl Roth, Niemcy</td><td>3984.3</td><td></td></tr><tr><td>L-lizyna monohydrat</td><td>Carl Roth, Niemcy</td><td>4207.2</td><td></td></tr><tr><td>L-metionina</td><td>Carl Roth, Niemcy</td><td>9359.4</td><td></td></tr><tr><td>L-fenyloalanina</td><td>Carl Roth, Niemcy</td><td>4491.2</td><td></td></tr><tr><td>L-prolina</td><td>Carl Roth, Niemcy</td><td>T205.3</td><td></td></tr><tr><td>L-seryna</td><td>Carl Roth, Niemcy</td><td>4682.4</td><td></td></tr><tr><td>L-treonina</td><td>Carl Roth, Niemcy</td><td>T206.2</td><td></td></tr><tr><td>L-tryptofan</td><td>Carl Roth, Niemcy</td><td>4858.2</td><td></td></tr><tr><td>L-tyrozyna</td><td>Carl Roth, Niemcy</td><td>T207.2</td><td></td></tr><tr><td>L-walina</td><td>Carl Roth, Niemcy</td><td>4879.4</td><td></td></tr><tr><td>siarczan amonu</td><td>Carl Roth, Niemcy</td><td>3746.3</td><td></td></tr><tr><td>magnez siarczan</td><td>Carl Roth, Niemcy</td><td>0261.2</td><td></td></tr><tr><td>D-glukoza</td><td>Carl Roth, Niemcy</td><td>6780</td><td>przygotować 20% (w/v) roztwór do dodania do stopionego agaru</td></tr><tr><td>chlorek wapnia</td><td>Carl Roth, Niemcy</td><td>PN93.2</td><td></td></tr><tr><td>chlorek żelaza(II)</td><td>Sigma-Aldrich, Niemcy</td><td>372870</td><td></td></tr><tr><td>chlorowodorek tiaminy</td><td>Sigma-Aldrich, Niemcy</td><td>T1270</td><td></td></tr><tr><td>biotyna</td><td>Carl Roth, Niemcy</td><td>3822.2</td><td></td></tr><tr><td>siarczan miedzi(II)</td><td>Merck, Niemcy</td><td>102792</td><td></td></tr><tr><td>chlorek manganu(II)</td><td>Carl Roth, Niemcy</td><td>KK36.2</td><td></td></tr><tr><td>chlorek</td><td>Merck, Niemcy</td><td>108816</td><td></td></tr><tr><td>ortomolibdenian immonu</td><td>Sigma-Aldrich, Niemcy</td><td>277908</td><td></td></tr><tr><td>glicerol</td><td>Carl Roth, Niemcy</td><td>7533.3</td><td></td></tr><tr><td>izopropyl &beta;-D-1-tiogalaktopiranozyd</td><td>Sigma-Aldrich, Niemcy</td><td>I6758</td><td></td></tr><tr><td>sól sodowa ampicyliny</td><td>Carl Roth, Niemcy</td><td>K029,5</td><td>stężenie robocze 100 &mikro; g / ml dla E. coli, przygotować zapas 100 mg / ml w ddH2O</td></tr><tr><td>siarczan kanamycyny</td><td>Carl Roth, Niemcy</td><td>T832.2</td><td>stężenie robocze 50 &mikro; g/ml dla E. coli, przygotować 50 mg/ml zapasu w ddH2O</td></tr><tr><td>chloramfenikolu</td><td>Carl Roth, Niemcy</td><td>3886.1</td><td>stężenie robocze 5 &mikro; g/ml dla L. lactis, przygotować 37 mg/ml zapasu etanolu</td></tr><tr><td>(4S)-fluoroproliny</td><td>Bachem, Szwajcaria</td><td>F-3970</td>(4R)-fluoroprolina Bachem, Szwajcaria F-3975<td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>(4S)-hydroksyprolina</td><td>Bachem, Szwajcaria</td><td>F-1395</td><td></td></tr><tr><td>(4R)-hydroksyprolina</td><td>Bachem, Szwajcaria</td><td>F-2980</td><td></td></tr><tr><td>(4S)-metanoprolina</td><td></td><td></td><td>chemicznie syntetyzowany</td></tr> <tr><td>(4R)-metanoprolina</td><td></td><td></td><td>chemicznie syntetyzowany</td></tr><tr><td>kwas solny (HCl)</td><td>Carl Roth, Niemcy</td><td>P074.4</td><td></td></tr><tr><td>etanol</td><td>VWR, Niemcy</td><td>20825.324</td><td></td></tr><tr><td>M17-bulion</td><td>Sigmal-Aldrich, Niemcy</td><td>56156</td><td>produkt komercyjny, patrz Terzaghi BE & Sandine WE, Appl Microbiol., 1975, 29(6):807-13 dla zawartości i przygotowania</td></tr><tr><td>agar-agar</td><td>Carl Roth, Niemcy</td><td>5210.5</td><td></td></tr><tr><td>Nisyna z Lactococcus lactis&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich, Niemcy</td><td>Produkt komercyjny N5764</td><td>, może być stosowany jako odniesienie do bioaktywności</td></tr><tr><td>dimetylosulfotlenku (DMSO)</td><td>Carl Roth, Niemcy</td><td>A994.1</td><td></td></tr><tr><td>imidazol</td><td>Carl Roth, Niemcy</td><td>3899.3</td><td></td></tr><tr><td>Fiolka z autosamplerem 1,5 ml do LC-MS</td><td>Sigma-Aldrich, Niemcy</td><td>Supelco 854165</td><td></td></tr><tr><td>acetonitryl</td><td>VWR, Niemcy</td><td>HiPerSolv CHROMANORM ULTRA dla LC-MS,</td><td>wymagany gatunek 83642 LC-MS</td></tr><tr><td>kwas mrówkowy</td><td>VWR, Niemcy</td><td>HiPerSolv CHROMANORM dla LC-MS, wymagany gatunek 84865</td><td>LC-MS</td></tr><tr><td>1 ml kolumna Ni-NTA IMAC, np. HisTrap FF Crude</td><td>GE Healthcare, UK</td><td>29-0486-31</td><td>różni producenci i żywice dostępne dla IMAC</td></tr><tr><td>0,45 i mikro; m Filtr butelkowy</td><td>VWR, Niemcy</td><td>10040-470</td><td>sterylna filtracja roztworów za pomocą pompy próżniowej</td></tr><tr><td>0,45 i mikro; m filtr strzykawkowy membrana PVDF</td><td>Carl Roth, Niemcy</td><td>CCY1.1</td><td>sterylna filtracja roztworów za pomocą strzykawki i do usuwania cząstek z lizatów komórkowych</td></tr><tr><td>strzykawka luer-lock, PP, 50 ml</td><td>Carl Roth, Niemcy</td><td>T552.2</td><td>sterylna filtracja roztworów&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>1,5 ml probówki Eppendorf</td><td>Eppendorf, Niemcy</td><td>30120086</td><td></td></tr><tr><td>szalki Petriego (polistyren, sterylne)</td><td>Carl Roth, Niemcy</td><td>TA19</td><td></td></tr><tr><td>Czerwień nilowa</td><td>Sigma-Aldrich, Niemcy</td><td>72485</td><td></td></tr><tr><td>E. coli i Delta; proA szczep</td><td>CGSC, kolekcja Keio</td><td>JW0233-2</td><td>prolinowo-auksotroficzny szczep E. coli K-12</td></tr><tr><td>E. coli B834(DE3)</td><td>Novagen (Merck), Niemcy</td><td>69041</td><td>metionino-auksotroficzny szczep E. coli B</td></tr> <tr><td>i lambda; Zestaw do lizogenizacji DE3</td><td>Novagen (Merck), Niemcy</td><td>69734-3</td><td></td></tr><tr>Szczep wskaźnikowy<td>bakterii Lactococcus lactis NZ9000 pNG nisPT</td><td></td><td></td><td>, patrz Khusainov R & Wirówka stołowa Kuipers OP, PLoS One, 8 (9), e74890</td></tr><tr><td>do probówek Eppendorf 1,5 ml</td><td>Eppendorf, Niemcy Pompa</td> perystaltyczna <td>5427 R</td><td></td></tr><tr><td></td><td>GE Healthcare, Wielka Brytania</td> System <td>P1</td><td></td></tr><tr><td>FPLC</td><td>GE Healthcare, Wielka Brytania</td> <td>i Auml; kta Purifier 10 lub podobny</td><td></td></tr><tr><td>mikroskop odwrócony</td><td>Nikon</td><td>TI Eclipse szerokokątny mikroskop fluorescencyjny&nbsp; z obiektywem 100x (N.A. 1.4) i lampą rtęciową</td><td>przykładowa konfiguracja do mikroskopii fluorescencyjnej</td></tr><tr><td>Kamera CCD zwielokrotniająca elektrony (EMCCD)</td><td>Andor Technologies, Wielka Brytania</td><td>Andor Luca&nbsp;</td><td>Przykładowa konfiguracja do mikroskopii fluorescencyjnej</td></tr><tr><td>Filtr wzbudzenia fluorescencji</td><td>Thorlabs, USA</td><td>Kostka dichroiczna (TLV-U-MF2-TRITC)</td><td>przykładowy zestaw do mikroskopii fluorescencyjnej</td></tr><tr><td>filtr emisji fluorescencji</td><td>AHF Analysentechnik, Niemcy</td><td>T 560 LPXR</td><td>przykładowy zestaw do mikroskopii fluorescencyjnej</td></tr><tr><td>szkiełko nakrywkowe 24 x 60 mm</td><td>Carl Roth, Niemcy</td><td>LH26.1</td><td>przykładowy zestaw do mikroskopii fluorescencyjnej</td></tr><tr><td>Olejek immersyjny</td><td>Carl Zeiss, Niemcy</td><td>Immersol 518 F</td> przykładowy zestaw do sonikurki sonicure <td>do mikroskopii fluorescencyjnej</td></tr><tr><td></td><td>Bandelin, Niemcy</td><td>Sonopuls HD3200 z sonotrodą MS-72</td><td>Maksymalna moc wyjściowa HF 200 W</td></tr><tr><td>Kolumna HPLC C5 (2,1x100 mm, 3 i mikro; m wielkość cząstek)</td><td>Sigma-Aldrich, Niemcy</td><td>567227-U</td><td>przykładowa konfiguracja do spektrometrii mas</td></tr><tr><td>ESI-TOF sprzężona z systemem HPLC</td><td>Agilent, USA</td><td>Agilent 6530 Dokładny QTOF masy z przykładową konfiguracją HPLC 1260</td><td>do spektrometrii mas</td></tr></tbody></table>

peptydy przeciwdrobnoustrojowe wytwarzane przez selektywne wprowadzanie aminokwasów niekanonicznych pod ciśnieniem

Antimicrobial Peptides Produced by Selective Pressure Incorporation of Non-canonical Amino Acids

Natura ma wiele możliwości tworzenia nowych funkcji białkowych poprzez modyfikację sekwencji poszczególnych elementów budulcowych aminokwasów. Jednak wszystkie warianty opierają się na 20 aminokwasach kanonicznych (cAA). Jako sposób na wprowadzenie dodatkowych właściwości fizykochemicznych do polipeptydów, włączenie aminokwasów niekanonicznych (ncAA) jest coraz częściej stosowane w inżynierii białek. Ze względu na ich stosunkowo krótką długość, modyfikacja peptydów syntetyzowanych rybosomalnie i modyfikowanych potranslacyjnie przez ncAA jest szczególnie atrakcyjna. Nowe funkcjonalności i uchwyty chemiczne mogą być generowane przez specyficzne modyfikacje poszczególnych pozostałości. Metoda selektywnej inkorporacji ciśnieniowej (SPI) wykorzystuje auksotroficzne szczepy gospodarza, które są pozbawione niezbędnego aminokwasu w chemicznie zdefiniowanych pożywkach wzrostowych. Kilka strukturalnie i chemicznie podobnych analogów aminokwasów może być następnie aktywowanych przez odpowiednią syntetazę aminoacylo-tRNA i zapewnić substytucje cAA(s) → ncAA(s) specyficzne dla reszty w docelowej sekwencji peptydu lub białka. Chociaż w kontekście metody SPI ncAA są również włączane do proteomu gospodarza w fazie ekspresji genów rekombinowanych, większość zasobów komórki jest przypisana do ekspresji genu docelowego. Umożliwia to skuteczne wprowadzanie ncAA specyficznych dla pozostałości, często w połączeniu z dużymi ilościami zmodyfikowanego celu. Prezentowana praca opisuje inkorporację in vivo sześciu analogów proliny do przeciwdrobnoustrojowego peptydu nizyny, lantybiotyku naturalnie wytwarzanego przez Lactococcus lactis. Właściwości przeciwdrobnoustrojowe nizyny mogą być zmieniane i dalej rozszerzane podczas jej fermentacji i ekspresji w auksotroficznymi szczepach Escherichia coli w określonych pożywkach wzrostowych. W związku z tym skutki swoistej dla pozostałości zamiany cAA na ncAA mogą powodować zmiany w aktywności i swoistości przeciwdrobnoustrojowej. Testy aktywności przeciwdrobnoustrojowej i mikroskopia fluorescencyjna są wykorzystywane do testowania nowych wariantów nizyny pod kątem hamowania wzrostu Gram-dodatniego szczepu wskaźnikowego Lactococcus lactis. Spektroskopia mas służy do potwierdzenia włączenia ncAA do bioaktywnych wariantów nizyny.

Niniejszy protokół został opracowany w celu umożliwienia produkcji wariantów nizyny modyfikowanych ncAA z resyduowo-specyficzną inkorporacją analogów proliny metodą SPI. Wcześniej zgłoszono wykonalność oraz wydajności na poziomie 24 mg/L dla rekombinacyjnej produkcji w pełni zmodyfikowanej nizyny typu dzikiego39. Przy zastosowaniu metody SPI wydajności docelowych peptydów/białek są często dobre i mogą osiągać ilości zbliżone do produkcji typu dzikiego48. W ramach pierwszych eksperymentów należy przetestować rekombinacyjną produkcję RiPP typu dzikiego w wybranym gospodarzu aukstroficznym. W tym przypadku jako szczep gospodarza wykorzystano proline-aukstroficzną E. coli MG1655 ΔproBA::frt ΔproC::frt (DE3). W celu inkorporacji ncAAs można zoptymalizować czas hodowli i indukcji, a także skład pożywki i temperaturę, aby uzyskać maksymalną wydajność peptydów.
Test aktywności przeciwdrobnoustrojowej 
Produkcję i oczyszczanie rekombinowanej nizyny typu dzikiego przeprowadzono zgodnie z powyższym protokołem. W tym przypadku w kroku 3.6 zamiast pochodnych ncAA zastosowano prolinę. W celu weryfikacji produkcji RiPP oraz porównania aktywności przeciwdrobnoustrojowej przed i po oczyszczaniu wykorzystano test aktywności przeciwdrobnoustrojowej. Do testu aktywności użyto bezpośrednio frakcji elucji oraz przełomu z kolumny IMAC, badając je przeciwko gram-dodatniemu szczepowi wskaźnikowemu L. lactis (Rycina 2). Ponieważ szczep ten wykazuje ekspresję NisP, warianty nizyny zawarte odpowiednio w lizatach komórek E. coli lub w próbkach oczyszczonego peptydu ulegają aktywacji poprzez proteolityczne odcięcie peptydu sygnałowego. Wyraźnie stwierdzono, że przełom wykazuje aktywność hamującą wzrost. Można to wyjaśnić brakiem wiązania materiału bioaktywnego z kolumną IMAC. Wszystkie przetestowane frakcje elucji wykazały zwiększoną aktywność w porównaniu z próbką nieoczyszczoną, co wskazuje na zagęszczenie peptydu z tagiem His za pomocą IMAC. Należy zauważyć, że bufor elucyjny (jako kontrola negatywna) nie wpływał na wzrost L. lactis w tym teście.
<img alt="Schemat testu podatności na antybiotyki z eluatami, buforem i przepływem; lek Cm (400 µg/mL)." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57551/57551fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Test aktywności przeciwdrobnoustrojowej po oczyszczaniu metodą IMAC rekombinacyjnie otrzymanej nizyny typu dzikiego.Frakcje elucji od 5 do 15 oraz ciecz przepływową po oczyszczaniu IMAC przetestowano w porównaniu z nieoczyszczonym lizatem komórkowym (rozcieńczonym w celu normalizacji OD600) przeciwko szczepowi wskaźnikowemu L. lactis. Wielkość halo zahamowania wzrostu wskazuje na aktywność przeciwdrobnoustrojową. Chloramfenikol w stężeniu 400 µg/mL zastosowano jako kontrolę pozytywną, a bufor elucyjny IMAC jako kontrolę negatywną. <a href="/files/ftp_upload/57551/57551fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Aby udowodnić aktywność przeciwdrobnoustrojową rekombinacyjnie otrzymanych wariantów nizyny zawierających sześć różnych analogów proliny, przeprowadzono test aktywności w celu zbadania inhibicji szczepu wskaźnikowego L. lactis. Rysunek 3 przedstawia inhibicję wzrostu dla pięciu z sześciu próbek otrzymanych przy użyciu analogów proliny. Najlepsze wyniki (oceniane na podstawie wielkości halo) zaobserwowano w eksperymentach z inkorporacją analogów (4R)-fluoroproliny, (4R)-hydroksyproliny oraz (4S)-metanoproliny. Porównując wielkość halo inhibicji wzrostu z nizyną typu dzikiego, otrzymaną i przebadaną równolegle, wszystkie trzy warianty nizyny wykazały podobną siłę inhibicji. Jednak sama wielkość halo nie może służyć do oceny aktywności swoistej, ponieważ nie określono stężenia AMP. Zatem testy te służą jedynie do jakościowego sprawdzenia, czy aktywność przeciwdrobnoustrojowa otrzymanych wariantów nizyny została zachowana czy utracona. Aby wyznaczyć aktywność swoistą, należy określić stężenie wariantów nizyny (patrz Dyskusja).
<img alt="Procesy reakcji chemicznych ze strukturami cząsteczkowymi; schematy przedstawiają przemiany związków." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57551/57551fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3. Analiza aktywności przeciwdrobnoustrojowej lizatów komórkowych zawierających warianty nizyny wytworzone via SPI z analogami proliny. Porównanie wariantów nizyny z próbkami rekombinowanego typu dzikiego. Wszystkie próbki zostały znormalizowane pod kątem OD600 po lizie komórek w stosunku do gęstości zebranej kultury komórkowej. Halo wskazują na bioaktywność w postaci zahamowania wzrostu szczepu wskaźnikowego. Pierwszy rząd od lewej do prawej: (4R)-fluoroprolina, (4R)-hydroksyprolina, (4R)-metanoprolina oraz chloramphenicol (400 µg/mL; pozytywna kontrola przeciwdrobnoustrojowa). Drugi rząd: (4S)-fluoroprolina, (4S)-hydroksyprolina, (4S)-metanoprolina oraz prolina (kontrola typu dzikiego). Należy zwrócić uwagę na nomenklaturę chemiczną; np. (4R)-fluoroprolina jest określana również jako trans-4-fluoroprolina. <a href="/files/ftp_upload/57551/57551fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Spektrometria mas LC-ESI-TOF 
Po oczyszczaniu metodą IMAC włączenie ncAAs do nizyny przeanalizowano za pomocą spektrometrii mas LC-ESI-TOF. Rysunek 4 przedstawia zdekonewolucjonowane widma mas wariantu nizyny zawierającego (4R)-fluoroprolinę. Wariant ten został oczyszczony metodą IMAC zgodnie z powyższym opisem, a następnie przeanalizowany za pomocą spektrometrii mas LC-ESI-TOF, zatem wciąż posiadał on peptyd sygnałowy. Główny pik na Rysunku 4A odpowiada zmodyfikowanej nizynie zawierającej (4R)-fluoroprolinę z zdekonewolucjonowaną masą 6883,18 Da (masa obliczona 6882,05 Da, masa obliczona dla odpowiadającego mu peptydu typu dzikiego z proliną w pozycji 9 wynosi 6864,06 Da). Dwa piki o niższej intensywności i wyższej masie odpowiadają adduktom sodu, zgodnie z oznaczeniem. Rysunek 4B przedstawia gatunki głównego związku o różnych ładunkach, wyznaczone przez algorytm dekonwolucji. Na przykład pik przy 1148,11 m/z odpowiada gatunkowi sześciokrotnie naładowanemu ([M+6H]6+).
<img alt="Wyniki spektrometrii mas; A) znormalizowana obfitość względem masy [Da], B) intensywność względna względem m/z." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57551/57551fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4. Spektrometria mas LC-ESI-TOF rekombinowanych wariantów nizyny zawierających (4R)-fluoroprolinę, oczyszczonych metodą IMAC. (A) Zdekonwolucjonowany chromatogram spektrometrii mas (widok ogólny na wstawce) dla wariantu nizyny (nadal z sekwencją liderową) z (4R)-fluoroproliną (oczekiwane masy (Da): [M+H]+ = 6882,05, [M+Na]+ = 6904,03, [M+2Na]2+ = 6926,02). (B) Widma złożone dla jonów [M+H]+. Oczekiwane masy (Da): [M+5H]5+ = 1377,41, [M+6H]6+ = 1148,01, [M+7H]7+ = 984,15, [M+8H]8+ = 861,26, [M+9H]9+ = 765,67, [M+10H]10+ = 689,21, [M+11H]11+ = 626,64, [M+12H]12+ = 574,50. <a href="/files/ftp_upload/57551/57551fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
Mikroskopia fluorescencyjna 
Aktywność przeciwdrobnoustrojową rekombinowanej nizyny oraz jej wariantów zawierających ncAA można również wykazać poprzez bezpośrednią obserwację L. lactis szczep wskaźnikowy poprzez mikroskopia fluorescencyjna. Do barwienia błony komórkowej bakterii użyto Nile red, silnie hydrofobowego barwnika fluorescencyjnego. Rycina 5 pokazuje jakościową zmianę stanu agregacji hodowli komórkowej oraz morfologię pojedynczych komórek. Komórki zabarwiono czerwienią Nilową (Nile red) i naniesiono na szkiełko podstawowe do mikroskopii. Górny rząd przedstawia komórki bezpośrednio na początku, gdy bufor, rekombinowana nizyna typu dzikiego lub nizyna zawierająca (4R)-fluoroprolina, lub (4R)-hydroksyprolinę. Dolny panel przedstawia odpowiadające im obrazy po 20 minutach inkubacji.
<img alt="Mikroskopia fluorescencyjna, analiza obrazu dyspersji nanocząstek, porównywanie stopni agregacji" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57551/57551fig5.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 5"> 
Rycina 5Mikroskopia fluorescencyjna wpływu rekombinowanej nizyny na komórki Gram-dodatnie. Obrazy mikroskopowe 30 µL L. lactis szczep wskaźnikowy (OD600 = 1) znakowanych czerwienią nilową pobrano przed (panel górny) i po (panel dolny) 20-minutowej inkubacji z 1 µL bufor (A), 0.3 µL rekombinowana nizyna typu dzikiego (B) i 0.6 µL warianty nizyny zawierające (4R)-fluoroprolina (C) i (4R)-hydroksyprolina (D). Niebieskie kółka zaznaczają obszary z zagregowanymi lub zdeformowanymi komórkami, a niebieskie strzałki wskazują obszary, w których można zaobserwować dyfuzję fluorescencyjnych fragmentów błon. <a href="/files/ftp_upload/57551/57551fig5large.jpg" target="_blank">Aby wyświetlić tę figurę w większym rozmiarze, kliknij tutaj.</a>
Rysunek 5A pokazuje, że ogólny wygląd komórek nie uległ zmianie w ciągu 20 minut obserwacji. Wzrastała jedynie liczba osadzonych w tym czasie komórek, w związku z czym w obserwowanym obszarze o wymiarach 80 µm x 80 µm widoczna jest większa ich liczba. Rysunek 5B pokazuje, że komórki Gram-dodatnie po 20 minutach ekspozycji na nisin typu dzikiego pojawiły się w formie agregatów i były rozmyte (zaznaczone niebieskimi okręgami), nawet po dodaniu niskich ilości (tutaj 0,3 µL eluatu IMAC). Dodatkowo z komórek do buforu dyfundował jasny materiał, co wskazuje na mobilizację fragmentów błon znakowanych Nile red w tym przedziale czasowym (zaznaczone niebieskimi strzałkami). Wyniki te wskazują na lizę komórek, co zostało wykazane podczas traktowania nisinem6,49. Podobne efekty zaobserwowano po inkubacji z wariantem nisinu zawierającym (4R)-fluoroprolinę (Rysunek 5C) oraz nisinem zawierającym (4R)-hydroksyprolinę (Rysunek 5D); w obu przypadkach po 20 minutach widoczne były liczne zdeformowane i zagregowane komórki, co stanowi wyraźny kontrast w stosunku do próbki kontrolnej (Rysunek 5A).
<table fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Komponent</td>
			<td>Stężenie</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(NH4)2SO4 </td>
			<td>7,5 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl </td>
			<td>8,5 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>22 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2HPO4</td>
			<td>50 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO₄4</td>
			<td>1 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glukoza</td>
			<td>20 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wszystkie kanoniczne aminokwasy 
			(z wyjątkiem tego do zastąpienia)</td>
			<td>50 mg/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wapń2+</td>
			<td>1 µg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fe2+</td>
			<td>1 µg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierwiastki śladowe 
			(Cu2+, Zn2+, Mn2+, MoOH2+)</td>
			<td>0.01 µg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tiamina</td>
			<td>10 µg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotyna</td>
			<td>10 µg/mL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1. Skład chemicznie zdefiniowanej pożywki bakteryjnej NMM19 po przygotowaniu zgodnie z krokiem 2.

Protokół przedstawia selektywne wprowadzanie aminokwasów (ncAA) do laktokokowego peptydu przeciwbakteryjnego nizyny na bazie Escherichia coli. Jego właściwości mogą być zmieniane podczas ekspresji rekombinowanej poprzez podstawienie pożądanymi ncAA w zdefiniowanych pożywkach wzrostowych. Wynikające z tego zmiany bioaktywności są mapowane za pomocą testów hamowania wzrostu i mikroskopii fluorescencyjnej.

Peptydy przeciwdrobnoustrojowe wytwarzane przez selektywne wprowadzanie aminokwasów niekanonicznych pod ciśnieniem

Nature has a variety of possibilities to create new protein functions by modifying the sequence of the individual amino acid building blocks. However, all ...

Ogólnym celem tej metodologii jest włączenie aminokwasów niekanonicznych do rybosomalnych peptydów przeciwdrobnoustrojowych. Wytwarza się nowe peptydy denaturacyjne, sprawdza je pod kątem obecności ncAA i testuje pod kątem aktywności przeciwdrobnoustrojowej za pomocą testów dyfuzji agaru. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kilka kluczowych pytań w dziedzinie środków przeciwdrobnoustrojowych lub bakteryjnych, takich jak rola niektórych pozycji peptydów w sposobie działania lub w rozwoju oporności.Zgodnie z tymi samymi zasadami różnorodność froopów, takich jak mniejsze peptydy lub mogą być produkowane, a wykrywalność może być testowana przeciwko patogenom, takim jak MRSA. Peptydy nowe w przyrodzie mogą być wytwarzane w celu opracowania środków przeciwdrobnoustrojowych do zwalczania patogenów i przezwyciężania niedoborów leków przeciwdrobnoustrojowych. Główną zaletą tej techniki jest to, że różnorodność aminokwasów niekanonicznych może być testowana równolegle bez konieczności wprowadzania zmian na poziomie genetycznym.W związku z tym stosunkowo łatwo jest równolegle wytwarzać kilka zmodyfikowanych peptydów. Aby rozpocząć tę procedurę, należy przygotować 25 mililitrów pożywki LB zawierającej antybiotyki i jeden procent glukozy w 100-mililitrowej kolbie Erlenmeyera. Zaszczepij go za pomocą kolonii świeżo przekształconych komórek bakteryjnych lub komórek z zamrożonego zasobu komórek.Inkubuj komórki przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 200 obr./min. Następnego dnia dodaj 10 mililitrów nocnej kultury do jednego litra sterylnego świeżego podłoża. Wymieszaj i podziel kulturę na dwie kultury o pojemności 500 mililitrów, każda w dwulitrowej kolbie Erlenmeyera i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 200 obr./min przez dwie godziny Po dwóch godzinach zmierz OD 600, używając sterylnego podłoża jako ślepej próby.Kontynuować inkubację i mierzyć OD w regularnych odstępach czasu, aż OD 600 będzie równe 0,5. Następnie wyciągnij obie kultury bakteryjne i odwiruj w temperaturze czterech stopni Celsjusza i 4,500 x g przez 15 minut. Następnie odlać i wyrzucić supernatant.Zawiesić osad komórkowy w wiadrze wirówkowym umieszczonym na lodzie z 20 mililitrami NMM19 zawierającymi antybiotyki i jeden procent glukozy. Przenieś zawiesinę komórkową do 50-mililitrowej probówki i odwiruj w temperaturze czterech stopni Celsjusza i 4,500 x g przez 10 minut. Następnie ponownie zawieś osad komórkowy w pięciu mililitrach tego samego świeżego podłoża na lodzie.Przenieś zawiesinę komórkową do 500 mililitrów świeżej pożywki i inkubuj w temperaturze 30 stopni Celsjusza i 200 obr./min przez godzinę. Po godzinie podzielić kulturę na dwie równe części w oddzielnych kolbach, po jednej dla każdego ncAA lub kontroli. Do każdej kultury dodać zapas ncAA do końcowego stężenia jednego milimola, a do kontroli typu dzikiego dodać bulion L-proliny do jednego milimola.Następnie indukuj ekspresję genu docelowego za pomocą jednego milimolowego IPTG. Inkubuj kultury przez noc w temperaturze 28 stopni Celsjusza i 200 obr./min. Następnego dnia zmierz OD i weź jeden mililitr każdej kultury do testów aktywności.Zebrać pozostałe komórki każdej kultury, wielokrotnie odwirowując je w temperaturze czterech stopni Celsjusza i 5 000 x g przez 20 minut. Za każdym razem należy usunąć i wyrzucić supernatant aż do zebrania wszystkich komórek. Przechowuj granulki komórek w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do czasu oczyszczenia peptydów.Aby przygotować płytki z agarem GM17, najpierw przygotuj pięciomililitrową nocną kulturę szczepu wskaźnikowego z zamrożonego bulionu glicerolu w bulionie M17 z jednym procentem glukozy i pięcioma mikrogramami na mililitr chloramfenikolu w 25-mililitrowej kolbie Erlenmeyera. Inkubuj w temperaturze 30 stopni Celsjusza bez wstrząsania. Następnego dnia zmierz średnicę zewnętrzną, używając pożywki GM17 jako ślepej próby Dodaj pięć mililitrów świeżej pożywki do nowej kolby.Zaszczepić do OD 600 równego 0,1 i kontynuować inkubację. Po dwóch godzinach mierz OD w regularnych odstępach czasu, aż wartość osiągnie 0,4 do 0,6. Następnie umieść i trzymaj kulturę wstępną na lodzie.Przygotuj 1,5-procentowy agar, ważąc 4,5 grama agaru w szklanej butelce z podłożem. Dodaj 300 mililitrów podwójnie destylowanej wody, a następnie wymieszaj i autoklaw. Przygotuj dwa buliony M17 w 300 mililitrach podwójnie destylowanej wody i autoklawu.Dodaj jeden mililitr kultury wstępnej Lactococcus lactis do 25 mililitrów dwóch bulionów M17 zawierających 10 mikrogramów na mililitr chloramfenikolu i dwa procent glukozy. Następnie dodaj 25 mililitrów letniej stopionej mieszanki agarowej i wlej roztwór do dużej szalki Petriego. Utrzymując sterylne warunki, suszyć płytkę przez 10 do 15 minut.Następnie wysterylizuj końce szklanej pipety Pasteura płomieniem Po ostygnięciu pipety użyj jej szerokiego końca, aby zrobić otwory w zestalonym agarze . Oznaczyć spód płytki Petriego dla każdej próbki obok odpowiedniego położenia otworu. Do oznaczania aktywności pobrać jednomililitrowe próbki kultur produkcyjnych E. coli i odwirować je przez trzy minuty przy 7 000 x g Odessać pozostałą pożywkę i ponownie zawiesić osad komórkowy w 500 mikrolitrach buforu fosforanu sodu przez pipetowanie.Następnie poddaj próbkę sonikacji na lodzie, zanurzając końcówkę sondy sonikołatora w zawiesinie komórki. Rozpocznij sonikację. Następnie odwiruj lizat komórkowy przez 10 minut przy 13 000 x g, aby rozdrobnić resztki komórek.Przenieść supernatant do nowej probówki reakcyjnej na lodzie. Rozcieńczyć i znormalizować supernatanty do jednego mililitra OD 600 równego 0,6, w stosunku do gęstości zebranych komórek, buforem fosforanu sodu i wymieszać. Aby przetestować aktywność przeciwdrobnoustrojową, dodaj 40 mikrolitrów znormalizowanej próbki do wyznaczonego otworu agary wskaźnikowej.Poczekaj, aż wszystkie próbki zostaną rozproszone w agarze . Inkubuj płytkę przez noc w temperaturze 30 stopni Celsjusza. Następnego dnia zrób zdjęcia płytki agarowej za pomocą skanera z płaskim stołem lub aparatu cyfrowego.Wielkość halo zahamowania wzrostu można zmierzyć ręcznie lub za pomocą oprogramowania. Do mikroskopii fluorescencyjnej przygotuj 10-milimolowy roztwór podstawowy czerwieni nilowej w DMSO. Do oznaczania aktywności należy wyhodować szczep wskaźnikowy do OD 600 równy jeden.Odwirować jeden mililitr kultury przez trzy minuty w temperaturze czterech stopni Celsjusza i 5 000 x g. Następnie odrzucić supernatant i ponownie zawiesić próbkę w jednym mililitrze PBS. Następnie odwirować próbkę i ponownie zawiesić.Następnie dodaj jeden mikrolitr czerwonego roztworu podstawowego Nilu i delikatnie wymieszaj. Aby uzyskać obraz mikroskopowy, dodaj 30 mikrolitrów preparatu komórkowego na szkiełko nakrywkowe, wzbudzając przy 520 nanometrach. Ustaw czas akwizycji na 0,2 sekundy, serię kinetyczną na 0,1 Hz i długość serii na 200 obrazów.Następnie dodaj od 0,3 do 1,5 mikrolitra lizatu komórkowego lub oczyszczonych próbek peptydów. Monitoruj i rejestruj emisję fluorescencji na długości fali równej lub większej niż 560 nanometrów. Przechowuj sekwencje obrazów jako pliki avi i analizuj obrazy za pomocą ImageJ.Rysunek ten przedstawia hamowanie wzrostu bakteryjnego szczepu wskaźnikowego przez rekombinowane peptydy przeciwdrobnoustrojowe zawierające analogi proliny. W ramach testu dyfuzji spoiny agarowej wokół pozycji próbki widoczne stają się aureole inhibicji. Ten film przedstawia poklatkową mikroskopię fluorescencyjną szczepu wskaźnikowego bez dodatku peptydów przeciwdrobnoustrojowych.Z biegiem czasu komórki bakteryjne osadzają się na szkiełku okładkowym, ponieważ dodano tylko bufor, wygląd komórek nie zmienia się w ciągu 20 minut obserwacji. Ten upływ czasu mikroskopii fluorescencyjnej pokazuje wpływ peptydu przeciwdrobnoustrojowego na komórki szczepu wskaźnikowego. Z biegiem czasu komórki bakteryjne wydają się zagregowane i rozmyte po ekspozycji na wariant nizyny zawierający niekanoniczny aminokwas 4R hydroksyprolinę, jak zaznaczono strzałką.Oznaczony okręgami lekki materiał dyfunduje z komórek do bufora, co wskazuje, że fragmenty błony zostały zmobilizowane. Rysunek ten przedstawia efekty po inkubacji szczepu wskaźnikowego w postaci nizyny typu dzikiego lub wariantów zawierających aminokwasy niekanoniczne. Po ekspozycji na peptyd przeciwdrobnoustrojowy komórki bakteryjne agregują się, jak pokazano w okręgach.Wskazując lizaty komórek, lekki materiał staje się widoczny wokół komórek, jak pokazano strzałkami. Duża ilość zniekształconych i zagregowanych komórek jest obecna po 20 minutach inkubacji w przeciwieństwie do kontroli negatywnej. Po opanowaniu tę technikę można wykonać w ciągu czterech dni.Obejmuje to produkcję zmodyfikowanych peptydów ncAA oraz testowanie aktywności za pomocą testów dyfuzji spoin agarowych i mikroskopii fluorescencyjnej. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o użyciu świeżych kultur bakterii i odpowiednich pożywek wzrostowych oraz ostrożnym obchodzeniu się z nimi. Do badania aktywności należy zawsze uwzględnić odpowiednie kontrole dodatnie i ujemne.Po tej procedurze można przeprowadzić inne metody oczyszczania peptydów za pomocą chromatografii powinowactwa i/lub HPLC. Spektrometria mas jest obowiązkowa w celu udowodnienia włączenia niekanonicznego aminokwasu. Po jej opracowaniu technika ta utorowała naukowcom drogę do zbadania nowszych peptydów przeciwdrobnoustrojowych, innych przeciwbakteryjnych lub mikrobiologicznych gospodarzy, którzy mogą być wykorzystywani do produkcji różnych peptydów oraz do testowania aktywności przeciwdrobnoustrojowej.Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak włączyć niekanoniczne aminokwasy do peptydów przeciwdrobnoustrojowych.

antimicrobial-peptides-produced-selective-pressure-incorporation-non

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Przedstawiono prostą i ogólną metodę syntezy cyklicznych peptydów za pomocą promieniowania mikrofalowego. Procedura ta umożliwia syntezę cyklicznych peptydów szkieletowych ze zbiorem różnych konformacji przy zachowaniu łańcuchów bocznych i ugrupowań farmakoforycznych, a tym samym pozwala na badanie przesiewowe pod kątem konformacji bioaktywnej.

Opracowanie szkieletowej biblioteki cyklicznych peptydów jako potencjalnych terapii przeciwpasożytniczych z wykorzystaniem promieniowania mikrofalowego

Łatwy w użyciu, bezkomórkowy protokół ekspresji do specyficznego dla reszty włączania niekanonicznych analogów aminokwasów do białek, w tym dalszej analizy, jest prezentowany do badań medycznych, farmaceutycznych, strukturalnych i funkcjonalnych.

Specyficzne dla reszt włączenie aminokwasów niekanonicznych do białek modelowych przy użyciu bezkomórkowego systemu transkrypcyjno-translacyjnego Escherichia coli

Celem tego protokołu jest opracowanie odniesienia dla rozbieżnych białek w grupie, która nie ma spójnych kryteriów nomenklatury i klasyfikacji. Odniesienie to ułatwi analizy i dyskusję na temat grupy jako całości i może być używane jako uzupełnienie ustalonych nazw.

Tworzenie i stosowanie odniesienia w celu ułatwienia dyskusji i klasyfikacji białek w zróżnicowanej grupie

Biologia syntetyczna umożliwia inżynierię białek o niespotykanych dotąd właściwościach przy użyciu kotranslacyjnej insercji aminokwasów niekanonicznych. Tutaj przedstawiliśmy, w jaki sposób spektralnie przesunięty ku czerwieni wariant fluoroforu typu GFP o nowych właściwościach spektroskopowych fluorescencji, określany jako "złote" białko fluorescencyjne (GdFP), jest wytwarzany w E. coli poprzez selektywne włączenie ciśnienia (SPI).

Inżynieria "złotej" fluorescencji poprzez selektywne wprowadzanie ciśnieniowe aminokwasów niekanonicznych oraz analiza białek za pomocą spektrometrii mas i fluorescencji

Tutaj prezentujemy protokół produkcji gram-ujemnych sferoplastów Escherichia coli (E. coli) i Gram-dodatnich protoplastów Bacillus megaterium (B. megaterium), aby wyraźnie zwizualizować i szybko scharakteryzować interakcje peptyd-bakteria. Zapewnia to systematyczną metodę definiowania peptydów lokalizujących i translokujących błonę.

Produkcja i wizualizacja bakteryjnych sferoplastów i protoplastów w celu scharakteryzowania lokalizacji peptydów przeciwdrobnoustrojowych

To badanie przedstawia alternatywną strategię do konwencjonalnej metody opartej na toksycznych analogach w identyfikacji nadprodukcji aminokwasów za pomocą markerów bogatych w rzadkie kodony, aby osiągnąć jednocześnie dokładność, czułość i wysoką przepustowość.

Identyfikacja nadprodukcji aminokwasów za pomocą markerów bogatych w rzadkie kodony

Aby przezwyciężyć ograniczenia klasycznej mutagenezy ukierunkowanej, analogi proliny ze specyficznymi modyfikacjami zostały włączone do kilku białek fluorescencyjnych. Pokazujemy, jak zastąpienie wodoru przez fluor lub pojedynczego przez wiązania podwójne w resztach proliny ("chirurgia molekularna") wpływa na podstawowe właściwości białek, w tym ich fałdowanie i interakcję ze światłem.

Specyficzna dla reszty wymiana proliny przez analogi proliny w białkach fluorescencyjnych: jak "chirurgia molekularna" kręgosłupa wpływa na fałdowanie i stabilność

Ten protokół opisuje metodę uzyskiwania danych ilościowych na temat przeciwgrzybiczej aktywności peptydów i innych związków, takich jak małocząsteczkowe środki przeciwgrzybicze, przeciwko Candida albicans. Wykorzystanie gęstości optycznej zamiast liczenia jednostek tworzących kolonie w celu ilościowego określenia zahamowania wzrostu oszczędza czas i zasoby.

Kwantyfikacja aktywności przeciwgrzybiczej peptydów przeciwko Candida albicans

Protokół ten opisuje metodę produkcji i oceny aktywności przeciwdrobnoustrojowej oraz cytotoksyczności peptydu kationowego Mel4 oraz naśladowcy peptydu RK758. Integrując syntezę chemiczną, ekspresję rekombinowaną oraz standaryzowane testy funkcjonalne, zapewnia usprawniony proces produkcji i testowania peptydów oraz naśladowców małych cząsteczek.

Produkcja i testowanie peptydów przeciwdrobnoustrojowych oraz ich naśladowców

Izotachforeza (ITP) jest wydajną elektrokinetyczną techniką rozdziału i prekonecentracji, znajdującą zastosowanie w wielu obszarach, od detekcji toksyn po przygotowanie próbek. W niniejszym opracowaniu omawiamy zasady fizyczne ITP oraz metodologię zastosowania tej techniki w dwóch konkretnych przykładach: rozdziału i detekcji małych cząsteczek oraz oczyszczaniu kwasów nukleowych z lizatu kultur komórkowych.

Izotachoforeza na chipie do rozdzielania jonów i oczyszczania kwasów nukleinowych

Poznaj metodę wprowadzania niekanonicznych aminokwasów do peptydów przeciwdrobnoustrojowych wytwarzanych przez Escherichia coli. Technika umożliwia szybkie testowanie modyfikacji peptydów nisiny i ocenę ich aktywności przeciwbakteryjnej.

Peptydy przeciwdrobnoustrojowe wytwarzane przez selektywne wprowadzanie aminokwasów niekanonicznych pod ciśnieniem

Przeglądaj więcej filmów