Głęboka iniekcja skórna jako model zakażenia skóry Candida albicans do analiz histologicznych

Ogólnym celem tej procedury jest obserwacja aktywacji układu odpornościowego podczas infekcji skóry poprzez wstrzyknięcie Candida albicans w celu zachowania architektury skóry i lokalizacji specyficznych komórek odpornościowych i nieimmunologicznych. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie immunologii, takie jak natura i lokalizacja komórek odpornościowych rekrutowanych podczas infekcji skóry oraz głównych zaangażowanych mediatorów. Główną zaletą tej techniki jest utrzymanie architektury strukturalnej skóry po wstrzyknięciu grzyba, co pozwala nam zrozumieć lokalizację każdego typu komórek odpornościowych.

Częścią procedury będzie Giulia Stamerra, doktorantka z laboratorium profesor Mariny Vai. Na początek zaszczepij szczep C.Albicans CAF3-1 w probówkach zawierających bogatą pożywkę uzupełnioną 50 miligramami na litr urydyny i kulturą w temperaturze 25 stopni Celsjusza. W tych warunkach C.albicans rośnie jako drożdże.

Monitoruj kulturę za pomocą analizatora licznika komórek lub spektrofotometru do pomiaru stężenia komórkowego. Gdy kultura osiągnie osiem razy 10 do szóstych komórek na mililitr, zbierz próbkę. Użyj pożywki YEPD-urydyny z Hepes jako środka buforowego, aby ponownie zawiesić komórki i inkubować je w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aby wywołać tworzenie strzępek.

Po pięciu godzinach w hodowli, kiedy strzępki powinny być widoczne, pod mikroskopem przy 100-krotnym powiększeniu sprawdź tworzenie strzępek. Hoduj komórki przez łącznie 16 godzin, w tym czasie 95% kultury utworzy strzępki. Aby jeszcze bardziej wzbogacić stężenie strzępek, odwirować porcje kultury w temperaturze 3 300 razy g przez pięć minut.

Odrzucić supernatant i użyć sterylnego PBS do ponownego zawieszenia osadu w stężeniu od jednego razy 10 do ósmych strzępek na mililitr. Po znieczuleniu ogolonej myszy zgodnie z protokołem tekstowym sprawdź odruch łapy, aby upewnić się, że zwierzę jest głęboko uspokojone. Aby wstrzyknąć strzępki C. albicans do głębokiej skóry właściwej, użyj dwóch palców, aby pociągnąć skórę ogolonego boku napiętą, a następnie włóż igłę o rozmiarze 30 i średnicy 8 milimetrów przymocowaną do strzykawki insulinowej o średnicy 0,3 mililitra pod kątem od 10 do 15 stopni, ze skosem igły skierowanym do góry i wstrzyknij końcową objętość 50 mikrolitrów odpowiadającą pięć razy 10 szóstym strzępkom.

Jeśli kąt wstrzyknięcia jest większy niż 15 stopni, patogen zostanie wstrzyknięty zbyt głęboko w skórę właściwą, co grozi uszkodzeniem otrzewnej, a przede wszystkim utratą możliwości badania infekcji specyficznie na poziomie skóry. Pod tym kątem patogen zostanie wstrzyknięty na głębokość około 300 do 500 mikronów. Aby upewnić się, że wstrzyknięcie jest prawidłowo wykonane, należy sprawdzić, czy wstrzyknięta objętość tworzy guzek, który wchłania się po kilku minutach.

W przypadku punktów czasowych krótszych niż 24 godziny należy użyć markera, aby zaznaczyć obszar zakażenia, ponieważ guzek powstały po wstrzyknięciu utrzymuje się przez kilka minut. W przypadku punktów czasowych trwających 24 godziny lub później ten krok nie jest wymagany, ponieważ owrzodzenie lub torbiel będą wyraźnie widoczne. Po eutanazji myszy zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi, za pomocą kleszczy chirurgicznych należy pociągnąć skórę na granicy miejsca wstrzyknięcia oznaczonego wcześniej markerem, a następnie za pomocą nożyczek chirurgicznych wyciąć zakażone miejsce, przecinając skórę zgodnie z zaznaczoną linią.

Zanurz skórę wewnętrzną stroną skierowaną do góry w jednorazowej formie wypełnionej związkiem OCT. Próbkę należy zamrozić w ciekłym azocie, aż związek stanie się biały. Nie pozwól, aby ciekły azot pokrył próbkę przed jej całkowitym zamrożeniem, ponieważ spowoduje to uszkodzenie próbki.

Aby przygotować szkiełka, zaczynając od środka próbki, przeciąć próbkę na pół, aby przygotować plasterki do histologii, a następnie za pomocą kriostatu pokrój plastry o grubości pięciu mikronów. Użyj dodatnio naładowanych szkiełek mikroskopowych, aby zebrać plasterki. Aby przeprowadzić barwienie H&E, zanurz szkiełka w hematoksylinie Gilla na cztery minuty, a następnie umyj szkiełka pod bieżącą wodą z kranu przez pięć minut.

Zanurz szkiełka w roztworze eozyny-Y na jedną minutę, umyj szkiełka pod bieżącą wodą z kranu przez pięć minut, a następnie użyj wody destylowanej do wypłukania szkiełek. Następnie należy odwodnić próbki, zanurzając je w serii etanolu na 15 sekund każda. Aby oczyścić szkiełka, przenieś je do histologicznego środka czyszczącego na co najmniej dwie minuty, a następnie użyj podłoża montażowego i szkiełek nakrywkowych do zamontowania próbek.

Użyj skanera preparatów mikroskopowych przy 40-krotnym powiększeniu, aby zobrazować szkiełka. Wykonaj barwienie roztworem kwasu miesiączkowego lub PAS za pomocą acetonu o temperaturze pokojowej, aby utrwalić szkiełka na jedną minutę, a następnie użyj bieżącej wody z kranu, aby umyć szkiełka przez jedną minutę. Zanurzyć szkiełka w PAS na pięć minut, a następnie użyć trzech podmian wody destylowanej do umycia próbek.

Następnie zanurz szkiełka w odczynniku Schiffa na 15 minut, a następnie umyj je pod bieżącą wodą z kranu przez pięć minut. Zanurz próbkę w hematoksylinie Gilla na pięć minut, aby je zabarwić, a następnie umyj szkiełka pod bieżącą wodą z kranu przez 30 sekund. Odwodnić próbki, zanurzając je w trzech przemianach 100% etanolu na 15 sekund każda, a następnie zanurzyć szkiełka w histologicznym środku czyszczącym.

Za pomocą podłoża montażowego i szkiełek nakrywkowych zamontuj oczyszczone próbki, a następnie użyj skanera do szkiełek mikroskopowych, aby zobrazować próbki. Po eutanazji myszy i usunięciu próbek skóry, jak pokazano wcześniej w tym filmie, zanurz próbki w dwumililitrowej probówce z zatrzaskiem z jednym mililitrem odczynnika do ekstrakcji kwaśnego chloroformu tiocyjanianu guanidyny. Użyj kleszczy chirurgicznych, aby pociąć tkankę na kawałki o powierzchni 0,2 centymetra kwadratowego.

Za pomocą młyna perełkowego rozbijaj próbki z prędkością 20 oscylacji na sekundę przez 20 minut. Jeśli nienaruszone kawałki skóry są nadal obecne, powtarzaj rozbijanie, aż próbka zostanie całkowicie zhomogenizowana. Odwirować próbki z prędkością 16 000 g przez jedną minutę.

Zachowaj supernatanty do ekstrakcji RNA i wyrzuć osad. Ten krok jest wykonywany w celu wyeliminowania włosów i zanieczyszczeń, które mogłyby zakłócać proces ekstrakcji. Po wyekstrahowaniu RNA za pomocą kolumny oczyszczającej należy użyć spektrofotometru do pomiaru stężenia i czystości RNA.

Utrzymanie integralności strukturalnej skóry pozwala na wykrycie komórek odpornościowych i ich lokalizację w miejscu infekcji. To duże powiększenie ujawnia, że ropień składa się głównie z PMC, które powstrzymują rozprzestrzenianie się patogenu poprzez jego uwięzienie w miejscu infekcji. Okoliczne obszary ropnia wzbogacone są również w PMC.

Na tym rysunku barwienie PAS, które nadaje grzybowi fioletowo-purpurowy kolor, wyraźnie pokazuje, że patogen jest zamknięty w ropniu utworzonym przez rekrutację granulocytów. C. albicans jest wyraźnie widoczny w większym powiększeniu i wydaje się być otoczony komórkami martwiczymi i odpornościowymi. Na początku procesu infekcji rekrutacja komórek odpornościowych prowadzi do powstania ropnia.

Od 48 do 72 godzin po zakażeniu uwidoczniono przerwanie struktur skóry i powstanie blizny z powodu fazy gojenia po wydaleniu patogenu. Jak pokazano tutaj, myszy typu dzikiego wykazują proces wrzodziejący, który nasila się z czasem. Po zastosowaniu określonych metod leczenia lub niedoborów genetycznych powstawanie owrzodzenia może zostać zmniejszone i/lub zniesione.

W niektórych przypadkach zamiast wrzodu utworzy się torbiel, jak pokazano tutaj. Po tej procedurze infekcji można wykonać inne metody, takie jak ekstrakcja białek, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak aktywacja określonych szlaków wewnątrzkomórkowych. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wykonać wstrzyknięcie C.Albicans w skórę, aby zbadać udział układu odpornościowego podczas infekcji bakteryjnej bez naruszania architektury nabłonka.

Nie zapominaj, że praca z odczynnikami do ekstrakcji RNA może być niezwykle niebezpieczna i podczas wykonywania tej procedury należy zawsze podejmować środki ostrożności, takie jak używanie dygestorium.