Name: Głęboka iniekcja skórna jako model zakażenia skóry Candida albicans do analiz histologicznych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 45 s
Description: Poznaj metodę głębokiej iniekcji skórnej Candida albicans do analiz histologicznych. Technika zachowuje architekturę skóry i umożliwia lokalizację komórek odpornościowych podczas infekcji grzybiczych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

FG jest wspierany przez Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro (IG 2016Id.18842), Cariplo Foundation (Grant 2014-0655) i Fondazione Regionale per la Ricerca Biomedica (FRRB). 
IZ jest wspierany przez grant NIH 1R01AI121066-01A1, 1R01DK115217, grant DK034854 HDDC P30, Harvard Medical School Milton Found, CCFA Senior Research Awards (412708), Eleanor and Miles Shore 50th Anniversary Fellowship Program oraz Fundację Cariplo (2014-0859).

Wszystkie procedury zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) i działały pod nadzorem Departamentu Zasobów Zwierzęcych w Szpitalu Dziecięcym (ARCH) w Szpitalu Dziecięcym w Bostonie lub zostały zatwierdzone przez włoskie Ministerstwo Zdrowia i przeprowadzone przez Instytucjonalny Komitet Opieki nad Zwierzętami na Uniwersytecie Milano-Bicocca.
1. Przygotowanie C. albicans
<ol>
	<li>Kultura C. albicans, szczep CAF3-113, w probówkach zawierających bogate podłoże (ekstrakt drożdżowy, dekstroza peptonowa (YEPD), 1% (w/v) ekstrakt drożdżowy, 2% (w/v) peptonu Bacto, 2% (w/v) glukozy) uzupełnione urydyną (50 mg/L) w temperaturze 25 °C. W tych warunkach C. albicans rośnie jako drożdże. 
	UWAGA: Można stosować inne szczepy C. albicans, takie jak izolat kliniczny szczepu C. albicans SC531413. Ponieważ niedawno wykazaliśmy, że proces wrzodziejący jest indukowany przez aktywację wrodzonego układu odpornościowego14, teoretycznie można zastosować każdy szczep C. albicans, który zachowuje zarówno składniki ściany komórkowej i strukturę, jak i zdolność do tworzenia projekcji strzępek.</li>
	<li>Monitoruj kulturę, zliczając stężenie komórkowe za pomocą analizatora licznika komórek.</li>
	<li>Zbierz kulturę, gdy osiągnie stężenie około 8 x 106 komórek/ml. Alternatywnie użyj spektrofotometru do pomiaru OD600. 
	UWAGA: Zwykle wartość OD600 = 1 odpowiada stężeniu drożdży 3 x 107 komórek/ml, ale zalecane jest miareczkowanie.</li>
	<li>Zawiesić hodowlę w pożywce YEPD-urydyna, używając HEPES (50 mM, pH 7,5) jako czynnika buforowego i inkubować kulturę w temperaturze 37 °C w celu wywołania tworzenia strzępek. Sprawdź tworzenie strzępek pod mikroskopem przy 100-krotnym powiększeniu. Tworzenie strzępek jest widoczne 5 godzin po wyhodowaniu w temperaturze 37 °C; jednak należy użyć komórek 16 godzin po inkubacji w temperaturze 37 °C, gdy procent strzępek osiągnie prawie 95% całkowitej hodowli.</li>
	<li>W celu dalszego wzbogacenia preparatu w stężenie strzępek, odwirować porcje kultury przy 3 300 x g przez 5 minut. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w sterylnym PBS o stężeniu 1 x10,8 strzępek/ml.</li>
</ol>
2. Głębokie wstrzyknięcie skórne
<ol>
	<li>Na 24 godziny przed zabiegiem zakażenia znieczulić myszy wstrzyknięciem dootrzewnowym ketaminy (80 - 100 mg/kg) i ksylazyny (10 mg/kg), a następnie ogolić bok myszy za pomocą elektrycznej maszynki do strzyżenia. 
	UWAGA: Po każdym zabiegu obejmującym znieczulenie umieść myszy pod lampą grzewczą, aż skutecznie wyzdrowieją.</li>
	<li>Odpocznij myszy przez 24 godziny, aby uniknąć stanu zapalnego spowodowanego procesem golenia.</li>
	<li>24 godziny po zabiegu golenia znieczulić myszy wstrzyknięciem dootrzewnowym ketaminy (80 - 100 mg/kg) i ksylazyny (10 mg/kg).</li>
	<li>Sprawdź odruch łapy, aby upewnić się, że myszy są głęboko znieczulone. Oceń odruch łapy, mocno ściskając łapę. Jeśli znieczulenie zostanie osiągnięte, zwierzę nie odczuwa bólu i nie porusza się.</li>
	<li>Wstrzyknąć strzępki C. albicans do głębokiej skóry właściwej za pomocą strzykawki insulinowej o pojemności 0,3 ml z igłą 30 G x 8 mm w końcowej objętości 50 μl/wstrzyknięcie, co odpowiada 5 x 106 strzępek na wstrzyknięcie.
	<ol>
		<li>Pociągnij skórę ogolonego boku dwoma palcami, aby wstrzyknąć objętość bezpośrednio do głębokiej skóry właściwej. Wprowadzić igłę pod kątem 10 - 15° skosem igły skierowanym do góry.</li>
		<li>Pod tym kątem patogen zostanie wstrzyknięty na głębokość około 300 - 500 μm. Aby upewnić się, że wstrzyknięcie jest prawidłowo wykonane, należy sprawdzić, czy wstrzyknięta objętość tworzy guzek, który wchłania się kilka minut po wstrzyknięciu. 
		UWAGA: Guz powstały po wstrzyknięciu będzie miał około 1cm2. Jest to obszar, który zostanie usunięty w wyznaczonym punkcie czasowym w celu analizy molekularnej lub histologicznej.</li>
		<li>W przypadku punktów czasowych krótszych niż 24 godziny (zalecane) należy oznaczyć obszar infekcji markerem, ponieważ guzek powstały w wyniku wstrzyknięcia utrzymuje się przez kilka minut, po czym ulega wchłonięciu. W przypadku punktów czasowych trwających 24 godziny lub dłużej ten krok nie jest wymagany, ponieważ owrzodzenie lub torbiel będą wyraźnie widoczne.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Pobieranie próbek i przygotowanie do barwienia histologicznego
<ol>
	<li>Poddaj myszy eutanazji zgodnie z procedurami instytucjonalnymi.</li>
	<li>Za pomocą kleszczy chirurgicznych pociągnij skórę na granicy miejsca wstrzyknięcia, uprzednio oznaczonego markerem. Za pomocą nożyczek chirurgicznych wyciąć zainfekowane miejsce, przecinając skórę zgodnie z zaznaczoną linią. 
	UWAGA: Uważaj, aby oddzielić skórę od otrzewnej za pomocą nożyczek z okrągłą końcówką.</li>
	<li>Zanurz skórę w jednorazowej formie bazowej wypełnionej związkiem o optymalnej temperaturze cięcia (OCT), wewnętrzną stroną skóry skierowaną do góry. Próbkę należy zamrozić w ciekłym azocie, aż związek stanie się biały. Nie pozwól, aby ciekły azot pokrył próbkę przed jej całkowitym zamrożeniem, ponieważ mogłoby to spowodować uszkodzenie próbki. 
	UWAGA: Uwaga! W kroku 3.3 załóż osłonę twarzy w celu ochrony przed ciekłym azotem.</li>
	<li>Jeżeli próbki nie są natychmiast wykorzystywane do przygotowania szkiełek, należy je szybko przechowywać w temperaturze -80 °C. 
	UWAGA: Próbki można przechowywać w temperaturze -80 °C przez czas nieokreślony.</li>
</ol>
4. Przygotowanie slajdów
<ol>
	<li>Przeciąć próbkę na pół, aby przygotować plastry do badania histologicznego, zaczynając od środka próbki.</li>
	<li>Pokrój plastry o grubości 5 μm za pomocą kriostatu. 
	UWAGA: W przypadku próbek skóry temperatura kriostatu nie powinna być wyższa niż -25 °C. Wyższa temperatura spowodowałaby częściowe stopienie H-OCT, a zatem próbki nie byłyby utrzymywane we właściwej pozycji podczas procedury cięcia.</li>
	<li>Użyj dodatnio naładowanych szkiełek mikroskopowych, aby zebrać plasterki.</li>
	<li>Jeśli zebrane plastry nie zostaną wykorzystane wkrótce po przygotowaniu, należy je przechowywać w temperaturze -20 °C. W tym momencie plastry można przechowywać w temperaturze -20 °C przez czas nieokreślony.</li>
</ol>
5. Barwienie hematoksyliny i eozyny
<ol>
	<li>Zabarwić szkiełka przez zanurzenie w hematoksylinie Gilla na 4 minuty. Myć szkiełka pod bieżącą wodą z kranu przez 5 minut.</li>
	<li>Zabarwić szkiełka przez zanurzenie w roztworze Eozyny Y na 1 minutę. Umyj szkiełka pod bieżącą wodą z kranu przez 5 minut. Przed kontynuowaniem protokołu opłucz szkiełka wodą destylowaną.</li>
	<li>Odwodnić przez zanurzenie w seryjnie rosnących stężeniach roztworów etanolu (50%, 70%, 80%, 95%, 100%). Zanurz szkiełka na 15 s w każdym roztworze etanolu.</li>
	<li>Czyścić szkiełka przez co najmniej 2 minuty przez zanurzenie w histologicznym środku czyszczącym.</li>
	<li>Zamontuj prowadnice za pomocą medium montażowego i szkiełek nakrywkowych.</li>
	<li>Uzyskuj obrazy preparatów za pomocą skanera mikroskopowego przy 40-krotnym powiększeniu.</li>
</ol>
6. Barwienie kwasem okresowym Schiffa (PAS)
<ol>
	<li>Przymocuj szkiełka ≥99,5% acetonem w temperaturze pokojowej przez 1 minutę. Myj szkiełka pod bieżącą wodą z kranu przez 1 minutę.</li>
	<li>Zabarwić szkiełka przez zanurzenie w roztworze kwasu okresowego (1 g/dl) na 5 minut. Umyj szkiełka w 3 podmianach wody destylowanej.</li>
	<li>Zabarwić szkiełka przez zanurzenie w odczynniku Schiffa na 15 min. Myć szkiełka pod bieżącą wodą z kranu przez 5 min.</li>
	<li>Zabarwić szkiełka przez zanurzenie w hematoksylinie Gilla na 5 minut. Myć szkiełka pod bieżącą wodą z kranu przez 30 sekund.</li>
	<li>Odwodnić szkiełka przez zanurzenie w 3 zmianach 100% etanolu. Za każdym razem zanurzaj zjeżdżalnie na 15 sekund.</li>
	<li>Czyścić szkiełka przez co najmniej 2 minuty przez zanurzenie w histologicznym środku czyszczącym.</li>
	<li>Zamontuj prowadnice za pomocą medium montażowego i szkiełek nakrywkowych.</li>
	<li>Uzyskaj obrazy szkiełek za pomocą skanera do slajdów mikroskopowych.</li>
</ol>
7. Pobieranie próbek i przygotowanie do ekstrakcji RNA
<ol>
	<li>Poddaj myszy eutanazji zgodnie z procedurami instytucjonalnymi. Usunąć próbki skóry jak w kroku 3.2.</li>
	<li>Zanurzyć próbki w probówce typu snap-cap o pojemności 2 ml z 1 ml odczynnika do ekstrakcji kwasem tiocyjanianu guanidyny, fenolu i chloroformu. 
	UWAGA: W tym miejscu można wstrzymać działanie protokołu, a próbki można przechowywać w temperaturze -80 °C.</li>
	<li>Pociąć próbkę na kawałki o wielkości około 0,2cm2 za pomocą kleszczy chirurgicznych. 
	UWAGA: Uwaga! Większość odczynników do izolacji RNA jest toksyczna i mutagenna. Kroki 7.3 i 7.4 należy wykonać pod wyciągiem.</li>
	<li>Rozbij próbkę za pomocą młyna perełkowego z prędkością 20 oscylacji/s przez 20 minut. Alternatywnie można użyć mechanicznego garncarza.</li>
	<li>Sprawdź skuteczną homogenizację próbek, szukając obecności nienaruszonych kawałków skóry. Powtórzyć ten krok, jeśli próbki nie są całkowicie zhomogenizowane.</li>
	<li>Odwirować próbki o masie 16 000 x g przez 1 minutę. Zachować supernatanty do ekstrakcji RNA i wyrzucić osad. Ten krok jest wykonywany w celu wyeliminowania włosów i zanieczyszczeń, które mogłyby zablokować kolumny ekstrakcyjne.</li>
	<li>Kontynuuj ekstrakcję RNA za pomocą kolumn oczyszczających RNA14.</li>
	<li>Użyj spektrofotometru, aby ocenić oczyszczanie i stężenie RNA. Jeżeli ekstrakty RNA nie są natychmiast używane do przygotowania cDNA, należy przechowywać próbki w temperaturze -80 °C.</li>
</ol>

<ol><li>Belkaid, Y., Segre, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dialogue+between+skin+microbiota+and+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Dialogue between skin microbiota and immunity.</a> Science. 346 (6212), 954-959 (2014).</li>
<li>Kashem, S. W., Kaplan, D. H. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27178391">Skin Immunity to Candida albicans.</a> Trends Immunol. 37 (7), 440-450 (2016).</li>
<li>Havlickova, B., Czaika, V. A., Friedrich, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidemiological+trends+in+skin+mycoses+worldwide%5BTitle%5D)+AND+%22Mycoses%22%5BJournal%5D)">Epidemiological trends in skin mycoses worldwide.</a> Mycoses. 51, 2-15 (2008).</li>
<li>Wisplinghoff, H., Bischoff, T., Tallent, S. M., Seifert, H., Wenzel, R. P., Edmond, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nosocomial+Bloodstream+Infections+in+US+Hospitals%3A+Analysis+of+24%2C179+Cases+from+a+Prospective+Nationwide+Surveillance+Study%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Nosocomial Bloodstream Infections in US Hospitals: Analysis of 24,179 Cases from a Prospective Nationwide Surveillance Study.</a> Clin Infect Dis. 39 (3), 309-317 (2004).</li>
<li>Romani, L. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/14661066">Immunity to fungal infections.</a> Nat Rev Immunol. 4 (1), 11-24 (2004).</li>
<li>Odds, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenesis+of+Candida+infections%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Acad+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Pathogenesis of Candida infections.</a> J Am Acad Dermatol. 31 (3), S2-S5 (1994).</li>
<li>MacCallum, D. M., Odds, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+events+in+the+intravenous+challenge+model+for+experimental+Candida+albicans+infections+in+female+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Mycoses%22%5BJournal%5D)">Temporal events in the intravenous challenge model for experimental Candida albicans infections in female mice.</a> Mycoses. 48 (3), 151-161 (2005).</li>
<li>Dai, T., Kharkwal, G. B., Tanaka, M., Huang, Y. -Y., Bil de Arce, V. J., Hamblin, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+external+traumatic+wound+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Virulence%22%5BJournal%5D)">Animal models of external traumatic wound infections.</a> Virulence. 2 (4), 296-315 (2018).</li>
<li>Gaspari, A. A., Burns, R., Nasir, A., Ramirez, D., Barth, R. K., Haidaris, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD86+%28B7-2%29%2C+but+not+CD80+%28B7-1%29%2C+expression+in+the+epidermis+of+transgenic+mice+enhances+the+immunogenicity+of+primary+cutaneous+Candida+albicans+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">CD86 (B7-2), but not CD80 (B7-1), expression in the epidermis of transgenic mice enhances the immunogenicity of primary cutaneous Candida albicans infections.</a> Infect Immun. 66 (9), 4440-4449 (1998).</li>
<li>Koh, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+models+of+Candida+gastrointestinal+colonization+and+dissemination%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryot+Cell%22%5BJournal%5D)">Murine models of Candida gastrointestinal colonization and dissemination.</a> Eukaryot Cell. 12 (11), 1416-1422 (2013).</li>
<li>Mear, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Candida+albicans+Airway+Exposure+Primes+the+Lung+Innate+Immune+Response+against+Pseudomonas+aeruginosa+Infection+through+Innate+Lymphoid+Cell+Recruitment+and+Interleukin-22-Associated+Mucosal+Response%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Candida albicans Airway Exposure Primes the Lung Innate Immune Response against Pseudomonas aeruginosa Infection through Innate Lymphoid Cell Recruitment and Interleukin-22-Associated Mucosal Response.</a> Infect Immun. 82 (1), 306-315 (2014).</li>
<li>Leoni, G., Neumann, P. -A., Sumagin, R., Denning, T. L., Nusrat, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wound+repair%3A+role+of+immune-epithelial+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Mucosal+Immunol%22%5BJournal%5D)">Wound repair: role of immune-epithelial interactions.</a> Mucosal Immunol. 8 (5), 959-968 (2015).</li>
<li>Fonzi, W. A., Irwin, M. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isogenic+strain+construction+and+gene+mapping+in+Candida+albicans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Isogenic strain construction and gene mapping in Candida albicans.</a> Genetics. 134 (3), 717-728 (1993).</li>
<li>Santus, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skin+infections+are+eliminated+by+cooperation+of+the+fibrinolytic+and+innate+immune+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Immunol%22%5BJournal%5D)">Skin infections are eliminated by cooperation of the fibrinolytic and innate immune systems.</a> Sci Immunol. 2 (15), (2017).</li>
<li>Florescu, D. F., Brostrom, S. E., Dumitru, I., Kalil, A. C. <a target="_blank" href="https://journals.lww.com/infectdis/Abstract/2010/07000/Candida_albicans_Skin_Abscess_in_a_Heart.6.aspx">Candida albicans Skin Abscess in a Heart Transplant Recipient.</a> Infect Dis Clin Pract. 18 (4), 243-246 (2010).</li>
<li>Pradeu, T., Cooper, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+danger+theory%3A+20+years+later%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">The danger theory: 20 years later.</a> Front Immunol. 3, 287(2012).</li>
<li>Cheng, A. G., DeDent, A. C., Schneewind, O., Missiakas, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+play+in+four+acts%3A+Staphylococcus+aureus+abscess+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A play in four acts: Staphylococcus aureus abscess formation.</a> Trends Microbiol. 19 (5), 225-232 (2011).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Tutaj opisaliśmy metodę infekcji C. albicans w celu zbadania procesu zapalnego, który jest inicjowany po wejściu grzyba do głębokiej skóry właściwej.
Mimo że tworzenie się ropni skóry jest stosunkowo rzadkim zdarzeniem po zakażeniu C. albicans 15, wstrzyknięcie grzyba bezpośrednio do głębokiej skóry właściwej pozwala nie tylko na badanie powstawania ropni wywołanego przez grzyby, ale także na analizę specyficznych komórek odpornościowych, które uczestn...

Ciało ludzkie pokryte jest niezwykle dużą ilością mikroorganizmów. Powierzchnia skóry jest siedliskiem prawie miliona bakterii na centymetr kwadratowy1. Liczba ta nie odzwierciedla jednak pełnej różnorodności mikroorganizmów, które kolonizują skórę. Oprócz bakterii, organizm ludzki jest skolonizowany przez wiele gatunków grzybów, w tym C. albicans, który jest w stanie przetrwać zarówno na poziomie błony śluzowej, jak i skóry2.
W ostatnich latach odsetek osób, u których zdiagnozowano infekcje grzybicze, ogromnie wzrósł. Wynika to głównie z większej liczby osób z obniżoną odpornością, tj. pacjentów zakażonych wirusem HIV oraz pacjentów, którzy przeszli chemioterapię lub leki immunosupresyjne po przeszczepie3. W badaniu przeprowadzonym w Stanach Zjednoczonych, Wisplinghoff i wsp. wykazali, że 9,5% szpitalnych zakażeń krwi było spowodowanych przez gatunki Candida4. Ze względu na zwiększone występowanie infekcji grzybiczych, a zwłaszcza ze względu na podwyższony odsetek gatunków Candida występujących podczas infekcji krwi, zrozumienie, w jaki sposób patogen ten wymyka się kontroli układu odpornościowego, jest niezwykle ważne.
C. albicans to grzyb dymorficzny, który rośnie w różnych formach morfologicznych, takich jak drożdże, blastospory, pseudostrzępki i strzępki, w zależności od warunków środowiskowych5. W formie strzępki C. albicans wykazuje najwyższą zdolność inwazyjności i ma zdolność przenikania przez nabłonek6.
Zakażenia C. albicans były badane przy użyciu kilku eksperymentalnych metod. Najczęstszym modelem zakażenia jest dożylne wstrzyknięcie drożdży C. albicans7. Jednak model ten nie uwzględnia wszystkich procesów, które zachodzą, zanim grzyb zdoła rozprzestrzenić się do krwiobiegu. Inny model wykorzystuje zdolność C. albicans do inwazji nabłonka. Ta metoda, znana również jako model papieru ściernego8, została opracowana przez Gaspari et al. w 1998 roku9 i polega na użyciu papieru ściernego do ścierania skóry, eliminując w ten sposób warstwę rogową naskórka przed nałożeniem C. albicans. Zabieg ten pozwala grzybowi wniknąć w nabłonek, umożliwiając w ten sposób analizę zdolności inwazyjnych tego patogenu. Wreszcie, w różnych badaniach wykorzystano inne modele zakażeń dla przewodu pokarmowego10 i dróg oddechowych11.
Powstawanie rany (jak w modelu z papieru piaskowego) powoduje aktywację kilku szlaków, w tym rekrutacji i aktywacji komórek odpornościowych, w celu przyspieszenia procesu gojenia12. Może to zmienić lub zamaskować odpowiedź immunologiczną specyficznie wywołaną przeciwko patogenowi, prowadząc w ten sposób do mylących wyników.
Tutaj opisujemy metodę infekcji skóry, która pozwala uniknąć początkowego powstania rany i indukcji podstawowego środowiska zapalnego. Aby zachować nienaruszoną strukturę nabłonka, bezpośrednio wstrzykujemy C. albicans w postaci strzępki do głębokiej skóry właściwej. Mimo że pojedyncze wstrzyknięcie może wywołać łagodny stan zapalny, ilość stanu zapalnego jest ograniczona i ograniczona w porównaniu z tworzeniem się otwartej rany, jak w modelu z papieru ściernego. Podejście, które tutaj opisujemy, pozwala na badanie odpowiedzi immunologicznej na infekcję grzybiczą i rozprzestrzenianie się przy jednoczesnym unikaniu nadmiernego i istniejącego wcześniej środowiska zapalnego spowodowanego uszkodzeniami mechanicznymi.

<table><tbody><tr><td>Reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Euroclone</td><td>ECB4053L</td><td>ciepły w temperaturze 37 stopni Celsjusza; Kąpiel C przed użyciem</td></tr><tr><td>Laboratoria histoliniowe</td><td>związku H-OCT</td><td>R0030</td><td></td></tr><tr><td>Laboratoria linii histoliniowej</td><td>hematoksyny Gilla</td><td>09-178-2</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór eozyny Y, alkoholowe</td><td>laboratoria histoliniowe</td><td>09-209-05</td><td></td></tr><tr><td>Absolut</td><td>etanolu scharlau</td><td>ET00232500</td><td></td></tr><tr><td>Citro-HISTOCLEAR</td><td>laboratoria</td> <td>histo-lineR0050</td><td></td></tr><tr><td>Eukitt, podłoże montażowe</td><td>bio-optica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aceton</td><td>sigma-aldrich</td><td>179124</td><td></td></tr><tr><td>PAS system barwienia</td><td>sigma-aldrich</td><td>395B-1KT</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Peptone</td><td>BD</td><td>211677</td><td></td></tr><tr><td>Ekstrakt z drożdży baktonowych</td><td>BD</td><td>212750</td><td></td></tr><tr><td>D(+)-Glukoza bezwodna do biologii molekularnej</td><td>Applichem PanReac</td><td>50-99-7</td><td></td></tr><tr><td>Uridine</td><td>Merck Millipore</td><td>8451</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Applichem PanReac</td><td>A1070,0500</td><td></td></tr><tr><td>Probówki Safe-Lock 2 ml</td><td>eppendorf</td><td>30121597</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol Reagent</td><td>Life Technologies</td><td>15596018</td><td>Toksyczny, i mutagenny. Stosuj wszystkie potrzebne środki ostrożności</td></tr><tr><td>Rneasy Mini Kit</td><td>QIAGEN</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>ciekły azot</td><td></td><td></td><td>Nosić ochronę oczu</td></tr><tr><td>Instrument</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Coulter Counter-Particle Count</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wirówka do redlic 5415 R</td><td>eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MC 3000 Kriostat mikrotomowy</td><td>Laboratoria</td><td></td><td></td>histo-line</tr><tr><td>TissueLiser</td><td>QIAGEN</td><td></td><td></td></tr><<tr><td>strong>Materiały</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0,3 ml Strzykawka insulinowa z igłą 30G x 8mm&nbsp;</td><td>BD</td><td>324826</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze</td><td></td><td></td><td></td>chirurgiczne</tr><tr><td>Nożyczki</td><td></td><td></td><td></td>chirurgiczne</tr><tr><td>Forma bazowa jednorazowe</td><td>laboratoria histo-line</td><td>2781</td><td></td></tr><tr><td>Dodatnio naładowane preparaty biomikroskopowe</td><td>bio-optica</td><td>09-2000</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe 24 x 50 mm</td><td>termonaukowe</td><td>11911998</td><td></td></tr></tbody></table>

głęboka iniekcja skórna jako model zakażenia skóry candida albicans do analiz histologicznych

Deep Dermal Injection As a Model of Candida albicans Skin Infection for Histological Analyses

Skóra jest niezwykle rozbudowanym organem ciała i, ze względu na tę dużą powierzchnię, jest stale narażona na działanie mikroorganizmów. Uszkodzenie skóry może łatwo prowadzić do infekcji skóry właściwej, które z kolei mogą powodować rozprzestrzenianie się patogenów do krwiobiegu. Zrozumienie, w jaki sposób układ odpornościowy zwalcza infekcje na bardzo wczesnym etapie i w jaki sposób gospodarz może wyeliminować patogeny, jest ważnym krokiem w kierunku stworzenia podstaw dla przyszłych interwencji terapeutycznych. W tym miejscu opisujemy model infekcji Candida albicans, który może uwidocznić procesy zachodzące we wczesnym okresie infekcji, w tym gdy patogen przekroczył barierę nabłonkową, a także odpowiedź immunologiczną wywołaną inwazją C. albicans. Wykorzystaliśmy ten model infekcji do przeprowadzenia analiz histologicznych, które pokazują komórki odpornościowe, które infiltrują skórę, a także obecność i lokalizację patogenu. Próbki pobrane po zakażeniu mogą być przetworzone do ekstrakcji RNA.

Dzięki wstrzyknięciu patogenu bezpośrednio do głębokiej skóry właściwej, morfologia strukturalna tkanki pozostaje nienaruszona (Rysunek 1A).
Zachowanie integralności strukturalnej skóry umożliwia wykrycie komórek odpornościowych oraz ich lokalizację w miejscu infekcji. Większe powiększenie przedstawione na Rysunku 1B ujawnia, że ropień składa się głównie z leukocytów po...

Tutaj opisujemy protokół, który umożliwia analizę histologiczną i molekularną próbek skóry po śródskórnym wstrzyknięciu Candida albicans. Protokół ten utrzymuje integralność strukturalną skóry i pozwala na lokalizację komórek odpornościowych rezydujących w tkance lub nowo zrekrutowanych, a także dystrybucję patogenów.

Głęboka iniekcja skórna jako model zakażenia skóry Candida albicans do analiz histologicznych

The skin is an extremely extended organ of the body and, due to this large surface, it is continuously exposed to microorganisms. Skin damage can easily ...

Ogólnym celem tej procedury jest obserwacja aktywacji układu odpornościowego podczas infekcji skóry poprzez wstrzyknięcie Candida albicans w celu zachowania architektury skóry i lokalizacji specyficznych komórek odpornościowych i nieimmunologicznych. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie immunologii, takie jak natura i lokalizacja komórek odpornościowych rekrutowanych podczas infekcji skóry oraz głównych zaangażowanych mediatorów. Główną zaletą tej techniki jest utrzymanie architektury strukturalnej skóry po wstrzyknięciu grzyba, co pozwala nam zrozumieć lokalizację każdego typu komórek odpornościowych.Częścią procedury będzie Giulia Stamerra, doktorantka z laboratorium profesor Mariny Vai. Na początek zaszczepij szczep C.Albicans CAF3-1 w probówkach zawierających bogatą pożywkę uzupełnioną 50 miligramami na litr urydyny i kulturą w temperaturze 25 stopni Celsjusza. W tych warunkach C.albicans rośnie jako drożdże.Monitoruj kulturę za pomocą analizatora licznika komórek lub spektrofotometru do pomiaru stężenia komórkowego. Gdy kultura osiągnie osiem razy 10 do szóstych komórek na mililitr, zbierz próbkę. Użyj pożywki YEPD-urydyny z Hepes jako środka buforowego, aby ponownie zawiesić komórki i inkubować je w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aby wywołać tworzenie strzępek.Po pięciu godzinach w hodowli, kiedy strzępki powinny być widoczne, pod mikroskopem przy 100-krotnym powiększeniu sprawdź tworzenie strzępek. Hoduj komórki przez łącznie 16 godzin, w tym czasie 95% kultury utworzy strzępki. Aby jeszcze bardziej wzbogacić stężenie strzępek, odwirować porcje kultury w temperaturze 3 300 razy g przez pięć minut.Odrzucić supernatant i użyć sterylnego PBS do ponownego zawieszenia osadu w stężeniu od jednego razy 10 do ósmych strzępek na mililitr. Po znieczuleniu ogolonej myszy zgodnie z protokołem tekstowym sprawdź odruch łapy, aby upewnić się, że zwierzę jest głęboko uspokojone. Aby wstrzyknąć strzępki C. albicans do głębokiej skóry właściwej, użyj dwóch palców, aby pociągnąć skórę ogolonego boku napiętą, a następnie włóż igłę o rozmiarze 30 i średnicy 8 milimetrów przymocowaną do strzykawki insulinowej o średnicy 0,3 mililitra pod kątem od 10 do 15 stopni, ze skosem igły skierowanym do góry i wstrzyknij końcową objętość 50 mikrolitrów odpowiadającą pięć razy 10 szóstym strzępkom.Jeśli kąt wstrzyknięcia jest większy niż 15 stopni, patogen zostanie wstrzyknięty zbyt głęboko w skórę właściwą, co grozi uszkodzeniem otrzewnej, a przede wszystkim utratą możliwości badania infekcji specyficznie na poziomie skóry. Pod tym kątem patogen zostanie wstrzyknięty na głębokość około 300 do 500 mikronów. Aby upewnić się, że wstrzyknięcie jest prawidłowo wykonane, należy sprawdzić, czy wstrzyknięta objętość tworzy guzek, który wchłania się po kilku minutach.W przypadku punktów czasowych krótszych niż 24 godziny należy użyć markera, aby zaznaczyć obszar zakażenia, ponieważ guzek powstały po wstrzyknięciu utrzymuje się przez kilka minut. W przypadku punktów czasowych trwających 24 godziny lub później ten krok nie jest wymagany, ponieważ owrzodzenie lub torbiel będą wyraźnie widoczne. Po eutanazji myszy zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi, za pomocą kleszczy chirurgicznych należy pociągnąć skórę na granicy miejsca wstrzyknięcia oznaczonego wcześniej markerem, a następnie za pomocą nożyczek chirurgicznych wyciąć zakażone miejsce, przecinając skórę zgodnie z zaznaczoną linią.Zanurz skórę wewnętrzną stroną skierowaną do góry w jednorazowej formie wypełnionej związkiem OCT. Próbkę należy zamrozić w ciekłym azocie, aż związek stanie się biały. Nie pozwól, aby ciekły azot pokrył próbkę przed jej całkowitym zamrożeniem, ponieważ spowoduje to uszkodzenie próbki.Aby przygotować szkiełka, zaczynając od środka próbki, przeciąć próbkę na pół, aby przygotować plasterki do histologii, a następnie za pomocą kriostatu pokrój plastry o grubości pięciu mikronów. Użyj dodatnio naładowanych szkiełek mikroskopowych, aby zebrać plasterki. Aby przeprowadzić barwienie H&E, zanurz szkiełka w hematoksylinie Gilla na cztery minuty, a następnie umyj szkiełka pod bieżącą wodą z kranu przez pięć minut.Zanurz szkiełka w roztworze eozyny-Y na jedną minutę, umyj szkiełka pod bieżącą wodą z kranu przez pięć minut, a następnie użyj wody destylowanej do wypłukania szkiełek. Następnie należy odwodnić próbki, zanurzając je w serii etanolu na 15 sekund każda. Aby oczyścić szkiełka, przenieś je do histologicznego środka czyszczącego na co najmniej dwie minuty, a następnie użyj podłoża montażowego i szkiełek nakrywkowych do zamontowania próbek.Użyj skanera preparatów mikroskopowych przy 40-krotnym powiększeniu, aby zobrazować szkiełka. Wykonaj barwienie roztworem kwasu miesiączkowego lub PAS za pomocą acetonu o temperaturze pokojowej, aby utrwalić szkiełka na jedną minutę, a następnie użyj bieżącej wody z kranu, aby umyć szkiełka przez jedną minutę. Zanurzyć szkiełka w PAS na pięć minut, a następnie użyć trzech podmian wody destylowanej do umycia próbek.Następnie zanurz szkiełka w odczynniku Schiffa na 15 minut, a następnie umyj je pod bieżącą wodą z kranu przez pięć minut. Zanurz próbkę w hematoksylinie Gilla na pięć minut, aby je zabarwić, a następnie umyj szkiełka pod bieżącą wodą z kranu przez 30 sekund. Odwodnić próbki, zanurzając je w trzech przemianach 100% etanolu na 15 sekund każda, a następnie zanurzyć szkiełka w histologicznym środku czyszczącym.Za pomocą podłoża montażowego i szkiełek nakrywkowych zamontuj oczyszczone próbki, a następnie użyj skanera do szkiełek mikroskopowych, aby zobrazować próbki. Po eutanazji myszy i usunięciu próbek skóry, jak pokazano wcześniej w tym filmie, zanurz próbki w dwumililitrowej probówce z zatrzaskiem z jednym mililitrem odczynnika do ekstrakcji kwaśnego chloroformu tiocyjanianu guanidyny. Użyj kleszczy chirurgicznych, aby pociąć tkankę na kawałki o powierzchni 0,2 centymetra kwadratowego.Za pomocą młyna perełkowego rozbijaj próbki z prędkością 20 oscylacji na sekundę przez 20 minut. Jeśli nienaruszone kawałki skóry są nadal obecne, powtarzaj rozbijanie, aż próbka zostanie całkowicie zhomogenizowana. Odwirować próbki z prędkością 16 000 g przez jedną minutę.Zachowaj supernatanty do ekstrakcji RNA i wyrzuć osad. Ten krok jest wykonywany w celu wyeliminowania włosów i zanieczyszczeń, które mogłyby zakłócać proces ekstrakcji. Po wyekstrahowaniu RNA za pomocą kolumny oczyszczającej należy użyć spektrofotometru do pomiaru stężenia i czystości RNA.Utrzymanie integralności strukturalnej skóry pozwala na wykrycie komórek odpornościowych i ich lokalizację w miejscu infekcji. To duże powiększenie ujawnia, że ropień składa się głównie z PMC, które powstrzymują rozprzestrzenianie się patogenu poprzez jego uwięzienie w miejscu infekcji. Okoliczne obszary ropnia wzbogacone są również w PMC.Na tym rysunku barwienie PAS, które nadaje grzybowi fioletowo-purpurowy kolor, wyraźnie pokazuje, że patogen jest zamknięty w ropniu utworzonym przez rekrutację granulocytów. C. albicans jest wyraźnie widoczny w większym powiększeniu i wydaje się być otoczony komórkami martwiczymi i odpornościowymi. Na początku procesu infekcji rekrutacja komórek odpornościowych prowadzi do powstania ropnia.Od 48 do 72 godzin po zakażeniu uwidoczniono przerwanie struktur skóry i powstanie blizny z powodu fazy gojenia po wydaleniu patogenu. Jak pokazano tutaj, myszy typu dzikiego wykazują proces wrzodziejący, który nasila się z czasem. Po zastosowaniu określonych metod leczenia lub niedoborów genetycznych powstawanie owrzodzenia może zostać zmniejszone i/lub zniesione.W niektórych przypadkach zamiast wrzodu utworzy się torbiel, jak pokazano tutaj. Po tej procedurze infekcji można wykonać inne metody, takie jak ekstrakcja białek, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak aktywacja określonych szlaków wewnątrzkomórkowych. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wykonać wstrzyknięcie C.Albicans w skórę, aby zbadać udział układu odpornościowego podczas infekcji bakteryjnej bez naruszania architektury nabłonka.Nie zapominaj, że praca z odczynnikami do ekstrakcji RNA może być niezwykle niebezpieczna i podczas wykonywania tej procedury należy zawsze podejmować środki ostrożności, takie jak używanie dygestorium.

deep-dermal-injection-as-model-candida-albicans-skin-infection-for

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Ten film demonstruje rozwój mysiego modelu in vivo do badania tworzenia biofilmu Candida albicans w tkance podskórnej. Eksperyment polega na wszczepieniu urządzeń zakażonych Candida w okolicy pleców zwierzęcia w celu rozwoju biofilmu.

Candida albicans (Candida albicans) Tworzenie biofilmu w mysim modelu in vivo

In vivo czasoprzestrzenne interakcje patogenów i obrony immunologicznej na poziomie błony śluzowej nie są łatwe do zobrazowania u istniejących kręgowców gospodarzy. Przedstawiona metoda opisuje wszechstronną platformę do badania kandydozy błony śluzowej u żywych kręgowców przy użyciu pęcherza pławnego młodego danio pręgowanego jako miejsca zakażenia.

Modelowanie kandydozy błony śluzowej u larw danio pręgowanego przez wstrzyknięcie do pęcherza pławnego

Przedstawiamy eksperymentalną procedurę rozwoju biofilmu Candida albicans w mysim modelu podskórnym. Biofilmy grzybów określono ilościowo, określając liczbę jednostek tworzących kolonie oraz nieinwazyjne obrazowanie bioluminescencyjne, w którym ilość wytwarzanego światła odpowiada liczbie żywotnych komórek.

Candida albicans (Candida albicans) Rozwój biofilmu na istotnych z medycznego punktu widzenia ciałach obcych w mysim modelu podskórnym, a następnie obrazowanie bioluminescencyjne

Galleria mellonella służy jako model bezkręgowców dla rozsianej kandydozy. W tym miejscu szczegółowo opisujemy protokół infekcji i podajemy dane pomocnicze dotyczące skuteczności modelu.

Model zakażenia robakiem woskowym Galleria mellonella dla rozsianej kandydozy

Celem tego protokołu jest wizualizacja kształtu i lokalizacji komórek Candida albicans w przewodzie pokarmowym ssaków.

Wizualizacja Candida albicans w mysim przewodzie pokarmowym za pomocą fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ

Ten manuskrypt opisuje metodę badania przesiewowego bibliotek mutantów Candida albicans średniej wielkości pod kątem fenotypów morfogenezy podczas aktywnej infekcji u ssaków za pomocą nieinwazyjnej mikroskopii konfokalnej.

Zastosowanie obrazowania in vivo do badań przesiewowych fenotypów morfogenezy u zmutowanych szczepów Candida albicans podczas aktywnej infekcji u ssaka gospodarza

Infekcja stawu okołoprotezowego (PJI) spowodowana przez niebezpieczne patogeny jest powszechna w ortopedii klinicznej. Istniejące modele zwierzęce nie są w stanie dokładnie symulować rzeczywistej sytuacji PJI. W tym miejscu stworzyliśmy mysi model PJI związany z biofilmem Candida albicans, aby badać i opracowywać nowe terapie PJI.

Model zakażenia Candida albicans stawu okołoprotezowego u myszy

Tworzymy mysi model infekcji związanej z cewnikiem (CRI) związanej z C.albicans, w której na cewniku tworzy się biofilm, a interakcja między C.albicans a gospodarzem dobrze koreluje z klinicznym CRI. Model ten pomaga w badaniach przesiewowych w kierunku CRI związanego z biofilmem C. albicans, kładąc podwaliny pod transformację kliniczną.

Model zakażenia Candida albicans związany z cewnikiem u myszy

Ten protokół opisuje zastosowanie przeciwbakteryjnej terapii fotodynamicznej (aPDT) w mysim modelu kandydozy jamy ustnej. aPDT wykonano przy użyciu rozpuszczalnej w wodzie mieszaniny kurkuminoidów i niebieskiego światła LED.

Przeciwbakteryjna terapia fotodynamiczna za pośrednictwem kurkuminoidów na mysim modelu kandydozy jamy ustnej

Niniejszy protokół opisuje model mysi wykorzystujący podskórną implantację grzbietową do badania zakażeń związanych z implantami, umożliwiając kompleksowe badanie mechanizmów patofizjologicznych i wspierając rozwój kryteriów diagnostycznych z ukierunkowanymi strategiami terapeutycznymi.

Zwierzęcy model zakażeń związanych z implantami u myszy

Poznaj metodę głębokiej iniekcji skórnej Candida albicans do analiz histologicznych. Technika zachowuje architekturę skóry i umożliwia lokalizację komórek odpornościowych podczas infekcji grzybiczych.

Głęboka iniekcja skórna jako model zakażenia skóry Candida albicans do analiz histologicznych

Przeglądaj więcej filmów