Wstrzykiwanie lipopolisacharydu myszom w celu naśladowania wnikania produktów pochodzenia mikrobiologicznego po naruszeniu bariery jelitowej

Ogólnym celem tego eksperymentu jest przedstawienie modelu, który naśladuje wnikanie produktów pochodzenia mikrobiologicznego po naruszeniu bariery jelitowej. Model ten może być wykorzystany do badania odpowiedzi immunologicznych po inwazji mikroorganizmów. Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie nieswoistych zapaleń jelit, takie jak niekontrolowany stan zapalny, który charakteryzuje się zwiększoną przepuszczalnością nabłonka jelitowego.

Główną zaletą tej techniki jest to, że nie tylko wykorzystuje zdefiniowaną pompę, ale jest również nieskomplikowanym podejściem, które nie wymaga operacji i może być stosowane w każdym środowisku laboratoryjnym. Procedurę zademonstruję ja, Rachel Mak'Anyengo, doktorantka i Berna Kaya, doktorantka. Trzymaj mysz delikatnie, ale stanowczo i trzymaj zwierzę jedną ręką.

Upewnij się, że mysz jest bezpiecznie trzymana i może normalnie oddychać. Lekko przechylić nos myszy w kierunku podłogi, aby odsłonić brzuch do wstrzyknięcia. Zlokalizuj linię środkową brzucha i wstrzyknij wymaganą objętość LPS w lewym lub prawym dolnym

Bardzo ważne jest, aby upewnić się, że igła wchodzi do jamy otrzewnej, aby uniknąć błędnych wstrzyknięć. Igła nie powinna również wchodzić zbyt głęboko w jamę otrzewnej, aby uniknąć uszkodzenia narządów wewnętrznych. Delikatnie włóż zwierzę z powrotem do klatki domowej.

Monitorować myszy pod kątem występowania i nasilenia endotoksemii w momencie wstrzyknięcia, a następnie co dwie godziny przez osiem godzin. Uwagi należy zapisać w załączonym arkuszu wyników. Przygotuj probówki zbiorcze, dodając jeden mililitr jednoetapowego odczynnika do izolacji RNA do dwóch mililitrowych probówek wstępnie wypełnionych kulkami ceramicznymi o średnicy 1,4 milimetra.

Po eutanazji i zapłodnieniu myszy użyj nożyczek, aby przeciąć skórę i warstwę mięśniową, odsłaniając jamę brzuszną z narządami wewnętrznymi. Ostrożnie wypreparuj śledzionę, wątrobę i okrężnicę. Oczyść tłuszcz z każdego narządu, a następnie umieść w PBS na lodzie.

Następnie za pomocą nożyczek lub skalpela wytnij kawałek o długości 0,5 centymetra z każdego narządu. Krótko wysusz chusteczkę na kawałku papierowej chusteczki i umieść ją w probówce zbiorczej, upewniając się, że jest całkowicie zanurzona w odczynniku do izolacji RNA. Następnie homogenizuj tkankę w wysokoobrotowym homogenizatorze stołowym.

W przypadku tkanek miękkich, takich jak śledziona, wątroba i okrężnica, należy stosować jeden cykl homogenizacji z dużą prędkością przez 30 sekund. Po homogenizacji próbki inkubować przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Ostrożnie zanurz probówki w ciekłym azocie, aby zatrzasnąć lizat tkankowy.

Przechowywać zamrożony lizat w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do czasu izolacji RNA. Rozpocznij izolację RNA od rozmrożenia zamrożonego lizatu tkankowego na lodzie. Po rozmrożeniu odwirować próbkę w temperaturze 1000 razy G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby osadzać pozostałe cząstki tkanki, które mogą pozostać.

Po odwirowaniu przenieś supernatanty do nowej, wolnej od nukleaz probówki o pojemności 1,5 mililitra i dodaj 200 mikrolitrów lodowatego chloroformu na jeden mililitr odczynnika do izolacji RNA. Natychmiast potrząsaj chrząstką przez 10 do 15 sekund. Po inkubacji próbek przez dwie do trzech minut w temperaturze pokojowej, odwirować w temperaturze 12 000 razy G przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Próbka będzie teraz zawierać trzy fazy, dolną fazę czerwonego chloroformu fenolowego, interfazę i górną bezbarwną fazę wodną. Zbierz górną fazę wodną zawierającą RNA i przenieś do nowej, wolnej od nukleaz probówki o pojemności 1,5 mililitra. Aby wytrącić RNA, dodaj 0,5 mililitra lodowatego izopropanolu na jeden mililitr odczynnika izolującego RNA i delikatnie wymieszaj, odwracając probówkę pięć do sześciu razy.

Po inkubacji przez 10 do 15 minut w temperaturze pokojowej odwirować w temperaturze 12 000 razy G przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po odwirowaniu całkowicie usunąć supernatant zawierający izopropanol bez naruszania osadu. Następnie umyj granulki jednym mililitrem lodowatego 75% etanolu na jeden mililitr odczynnika izolacyjnego RNA użytego do początkowej lizy i krótko zwiruj próbkę.

Po odwirowaniu próbki w temperaturze 7500 lub 12 000 razy G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, całkowicie usunąć supernatant bez naruszania osadu. Pozostaw otwarte probówki pod kapturem chemicznym na trzy do pięciu minut, aby wysuszyć granulkę RNA na powietrzu w temperaturze pokojowej. Następnie rozpuść osad RNA w 20 do 50 mikrolitrach wody wolnej od nukleaz, ostrożnie pipetując w górę iw dół.

Następnie inkubuj próbkę w temperaturze 55 stopni Celsjusza przez 10 do 15 minut, aby jeszcze bardziej poprawić roztwór RNA. Trawić zanieczyszczające DNA, najpierw dodając wodę wolną od nukleaz do maksymalnie 10 mikrogramów RNA, tak aby końcowa objętość wynosiła 50 mikrolitrów po dodaniu buforu i enzymu. Następnie dodać pięć mikrolitrów 10-krotnego buforu DNazy 1 i jeden mikrolitr rekombinowanej DNazy 1 na próbkę i delikatnie wymieszać, pipetując w górę iw dół.

Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 20 do 30 minut. Po inkubacji należy zwirować DNazę w odczynniku aktywacyjnym, a następnie dodać pięć mikrolitrów do próbki i dobrze wymieszać. Inkubować przez pięć minut w temperaturze pokojowej, mieszając od czasu do czasu ręcznie.

Po odwirowaniu w temperaturze 10 000 razy G przez półtorej minuty, przenieś supernatant zawierający RNA wolne od DNA do nowej probówki wolnej od nukleazy. Na koniec zmierz stężenie i jakość RNA za pomocą spektrofotometru. Po wstrzyknięciu LPS wynik choroby, który obejmuje ocenę wyglądu i aktywności zwierząt, otwarcia ich oczu oraz częstości i jakości oddychania, wykreślono na osi Y w funkcji czasu na osi X.

QPCR w celu ilościowego określenia ekspresji cytokin ujawnił, że Il6 osiągnął szczyt dwie godziny po wstrzyknięciu LPS w śledzionę i okrężnicę oraz cztery godziny po wstrzyknięciu do wątroby. Ekspresja Il1 beta, Tnf alfa i Il10 osiągnęła szczyt cztery godziny po wstrzyknięciu we wszystkich tkankach. W ciągu ośmiu godzin ekspresja Il6, Il1 beta, Tnf alfa i Il10 powróciła do poziomów wyjściowych.

Podczas wykonywania procedury należy pamiętać o rozważeniu dawki LPS, stanu higieny myszy, punktu czasowego zakończenia eksperymentu i, co najważniejsze, tła genetycznego szczepu myszy. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak naśladować wnikanie związków pochodzenia bakteryjnego do gospodarza po przełamaniu bariery. Niska, subletalna dawka LPS systematycznie wstrzykiwana myszom indukuje regulację w górę cytokin prozapalnych, które są określane ilościowo za pomocą analizy RGQ PCR.