Name: Mysi model aspiracji jamy ustnej i gardła bakteryjnego zapalenia płuc związanego z respiratorem i nabytego w szpitalu (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 32 s
Description: Poznaj mysi model aspiracji jamy ustnej i gardła do badania zapalenia płuc związanego z respiratorem. Ta technika pozwala testować nowe terapie i badać mechanizmy oporności na antybiotyki.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Narodowy Instytut Alergii i Chorób Zakaźnych w Narodowym Instytucie Zdrowia [Granty o numerach R01 AI117211, R01 AI130060, R21 AI127954 i R42 AI106375 do BS] oraz Amerykańską Agencję ds. Żywności i Leków [Umowa HHSF223201710199C do BML].

Wszystkie procedury dotyczące zwierząt muszą być zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC).
1. Przygotowanie inokulum bakteryjnego
<ol>
	<li>Wyizoluj kolonie bakterii.
	<ol>
		<li>Szczep bakteryjny (np. A. baumannii "HUMC1") należy rozprowadzić na odpowiednim sterylnym podłożu agarowym (np. Tryptycznym agarze sojowym), uważając, aby wytworzyć izolowane kolonie.</li>
		<li>Inkubować w odpowiednich warunkach (np. przez noc w temperaturze 37 °C).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Uprawiaj kulturę z dnia na dzień.
	<ol>
		<li>Wybrać reprezentatywną, wyizolowaną kolonię z płytki agarowej ze sterylną pętlą zaszczepiającą i użyć jej do zaszczepienia 10 ml odpowiedniego sterylnego podłoża bulionowego (np. Tryptycznego bulionu sojowego).</li>
		<li>Pozwolić, aby próbka dotarła do fazy stacjonarnej w odpowiednich warunkach (np. w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem przy 200 obr./min przez noc w stożkowej fiolce o pojemności 50 ml z wentylowaną nakrętką).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Rozwijaj subkulturę.
	<ol>
		<li>Przenieś 100 μl nocnej kultury do 10 ml świeżego sterylnego bulionu za pomocą pipety.</li>
		<li>Pozostawić do osiągnięcia fazy wykładniczej/logarytmicznej w odpowiednich warunkach (np. 37 °C z wytrząsaniem przy 200 obr./min przez 3 godziny w stożkowej fiolce o pojemności 50 ml z odpowietrzoną nakrętką).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umyj subkulturę.
	<ol>
		<li>Usuń subkulturę z jej inkubującego środowiska.</li>
		<li>Wirować przy 4 000 × g przez 5 minut, aby osadzać bakterie.</li>
		<li>Odessać i wyrzucić supernatant.</li>
		<li>Dodać 10 ml sterylnego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) do osadu i energicznie mieszać, aż do całkowitego zawieszenia.</li>
		<li>Powtórz kroki 1.4.2 - 1.4.4 dwukrotnie, w sumie 3 prania.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dostosuj stężenie zawiesiny bakteryjnej.
	<ol>
		<li>Za pomocą spektrofotometru, który mierzy gęstość optyczną przy 600 nm (OD600), zmierz gęstość optyczną zawiesiny bakteryjnej.</li>
		<li>Dodać sterylny PBS do zawiesiny bakteryjnej, aż gęstość optyczna inokulum spadnie do OD600 0,5, stosując równanie Ci×Vi = Cf×Vf, gdzie "C" to stężenie, "V" to objętość, "i" to wartość początkowa, a "f" to wartość końcowa. *Cf powinno zawsze wynosić 0,5; Vf jest zmienną do rozwiązania.</li>
		<li>Jeśli zawiesina bakteryjna spadnie poniżej OD600 wynoszącego 0,5, odwirować ją przy 4,000 × g przez 5 minut, aby osadzać bakterie i usunąć odpowiednią ilość supernatantu, aby osiągnąć OD600 0,5.</li>
		<li>Wykonaj seryjne rozcieńczenia w sterylnym PBS (np. trzy rozcieńczenia 1:100, aby uzyskać 1 × 10-6) i płytkę na sterylnym agarze w celu wyznaczenia współczynnika korelacji, który ujawnia stężenie bakterii w jednostkach tworzących kolonie na ml (jtk/ml) przy OD600 0,5,5, 
		Uwaga: Wartość tego współczynnika korelacji będzie różna dla każdego szczepu każdego gatunku i musi być określona przed przygotowaniem inokulum na infekcję.</li>
		<li>Po ustaleniu współczynnika korelacji, użyć go do stworzenia inokulum o pożądanym stężeniu (np. 2 × 108-1 × 109 CFUs/mL); jeśli pożądane inokulum jest większe niż OD600 0,5, odwirować zawiesinę bakteryjną o stężeniu 4000 × g przez 5 minut w celu osadzenia bakterii i usunąć odpowiednią ilość supernatantu, aby osiągnąć pożądane stężenie.</li>
		<li>Wykonaj badania pilotażowe in vivo, aby określić zjadliwość każdego izolatu bakteryjnego w każdym szczepie myszy, ponieważ wartości te będą się różnić między izolatami bakteryjnymi tego samego gatunku a myszami o różnym pochodzeniu genetycznym. Dla różnych gatunków Gram-ujemnych LD100 u myszy wynosi na ogół 1 - 5 × 108 CFU / mysz, chociaż niektóre szczepy są śmiertelne przy niższych inokulach.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zamroź identyczne porcje do wykorzystania w przyszłości jako precyzyjny inokula na żądanie, jak wcześniej opublikowano8 (opcjonalnie).
	<ol>
		<li>Przygotować 1 l inokulum bakteryjnego zgodnie z powyższym opisem, przenieść do dwóch stożkowych fiolek o pojemności 500 ml i odwirować przy 4 000 × g przez 5 minut.</li>
		<li>Odrzucić 450 ml supernatantu z każdej stożkowej fiolki i ponownie zawiesić granulki bakterii w pozostałym supernatantze.</li>
		<li>Przenieść skoncentrowane inokulum bakteryjne do zlewki o pojemności 250 ml zawierającej mieszadło magnetyczne i ciągle mieszać na płytce mieszającej z prędkością 300 obr./min.</li>
		<li>Ostrożnie przenieść dokładnie 600 μl skoncentrowanego inokulum bakteryjnego (np. 1 ×10 10 CFUs/ml) za pomocą pipety do 1,6 ml fiolki kriogenicznej zawierającej dokładnie 300 μl sterylnegoH2Oi 300 μL sterylnego glicerolu; wymieszać i przechowywać w temperaturze -80 °C. 
		Uwaga: Glicerol niezbędny do przechowywania może zakłócić wyniki eksperymentów i spowodować nadmierną śmiertelność, dlatego konieczne jest jej wypłukanie.</li>
		<li>Gdy próbka jest gotowa do użycia, rozmrażać ją przez 10 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Przenieś 1 ml do stożkowej fiolki o pojemności 50 ml, dodaj 9 ml sterylnego PBS i odwiruj przy 4 000 × g przez 5 minut, aby otoczkować bakterie. Odessać supernatant i ponownie zawiesić wcześniej określoną ilość jtk (1 ml × stężenie zamrożonego materiału w jtk/ml) w odpowiedniej objętości PBS, aby osiągnąć pożądane stężenie dla inokulum zakaźnego.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Myszy anestezjologiczne
<ol>
	<li>Ketamina/Ksylazyna 
	Uwaga: Znieczulenie ketaminą/ksylazyną trwa długo, co daje badaczowi, który jest nowy w tej technice, wystarczająco dużo czasu na zakończenie procedury inokulacji, zanim mysz się obudzi.
	<ol>
		<li>Przygotować 10 ml roztworu do wstrzykiwań, łącząc 8,5 ml PBS klasy farmaceutycznej, 1 ml 100 mg/ml roztworu podstawowego ketaminy (końcowe stężenie 10 mg/ml) i 0,5 ml 20 mg/ml roztworu podstawowego ksylazyny (końcowe stężenie 10 mg/ml).</li>
		<li>Podawać 10 μl/g we wstrzyknięciu dootrzewnowym (IP) (np. 250 μl dla myszy 25 g).</li>
		<li>Nałóż maść okulistyczną na oczy myszy znieczulonych ketaminą/ksylazyną, ponieważ ich oczy są podatne na uszkodzenia podczas dłuższych okresów znieczulenia.</li>
		<li>Umieść mysz w klatce i monitoruj, aż wybudzi się ze znieczulenia. 
		Uwaga: Zwierzę nie powinno być pozostawiane bez opieki, dopóki nie odzyska wystarczającej przytomności, aby utrzymać pozycję leżącą w mostku.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Izofluran 
	Uwaga: Myszy szybko budzą się ze znieczulenia wywołanego izofluranem po wyjęciu z komory indukcyjnej, więc ta metoda znieczulenia powinna być stosowana dopiero po osiągnięciu biegłości w procedurze inokulacji.
	<ol>
		<li>Umieść naiwne myszy w odpowiedniej wielkości komorze indukcyjnej z przepływającym tlenem.</li>
		<li>Po zamknięciu komory znieczulij myszy za pomocą precyzyjnego waporyzatora, aby dodać izofluran w stężeniu 4% (v/v) przez co najmniej 5 minut; potwierdź znieczulenie, wyjmując mysz z komory indukcyjnej i mierząc, ile czasu zajmuje wybudzenie się z narkozy (~60 s). 
		Uwaga: Należy pamiętać, że czas znieczulenia może się różnić w zależności od wytycznych instytucjonalnych, a niektóre zwierzęta mogą potrzebować więcej niż 5 minut, aby w pełni się znieczulić.</li>
		<li>Utrzymuj znieczulenie do 10 minut, dostosowując stężenie izofluranu do 2 - 3%; jeśli całkowity czas znieczulenia wynosi >15 minut, nałóż maść okulistyczną na oczy znieczulonych myszy.</li>
		<li>Umieść mysz w klatce i monitoruj, aż obudzi się ze znieczulenia, jak w kroku 2.1.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Zaszczepianie/zarażanie myszy
<ol>
	<li>Zawieś znieczuloną mysz, zawieszając ją za górne siekacze na mocnym, cienkim sznurku (np. nici dentystycznej) przymocowanym do nieruchomego przedmiotu na wysokości około dwukrotności długości ciała myszy (np. 20 cm) nad powierzchnią roboczą (np. ławką laboratoryjną).</li>
	<li>Delikatnie wyciągnij język myszy z ust za pomocą sterylnych, tępo zakończonych kleszczy. Przenieś język na sterylny palec w rękawiczce, aby zapobiec przypadkowemu zmiażdżeniu języka myszy. Trzymaj język na zewnątrz jamy ustnej, umożliwiając dostęp do części ustnej gardła i zapobiegając połknięciu inokulum na bok.</li>
	<li>Trzymając język myszy, umieść 50 μl inokulum (zawiesiny bakteryjnej) w jamie ustnej i gardle za pomocą mikropipety; część ustna znajduje się na styku jamy ustnej i gardła w kierunku tylnej części jamy ustnej. 
	Uwaga: Bardzo ważne jest, aby dostarczać płyn wyłącznie pipetując do pierwszego przystanku mikropipety. Mysz przestanie oddychać na kilka sekund, gdy inokulum zostanie umieszczone w jamie ustnej gardła; W końcu odruchowe aspiracja spowoduje, że mysz wdycha zawiesinę bakteryjną, na co wskazuje charakterystyczny trzask płynu dostającego się do płuc, co skutkuje infekcją zapalenia płuc.</li>
	<li>Jeśli inokulum nie jest umieszczone wystarczająco daleko z tyłu, aby zablokować normalne oddychanie, ściśnij nozdrza kleszczami, aby wymusić odruchowe aspirację przez usta, a następnie wdychanie inokulum.</li>
	<li>Po zaszczepieniu zwolnij język, zdejmij mysz ze sznurka do zawieszenia, umieść ją w klatce i monitoruj, aż wybudzi się ze znieczulenia, jak w kroku 2.1.</li>
</ol>
4. Monitorowanie postępu choroby
Uwaga: Ze względu na cierpienie zwierząt, różne wskaźniki powinny być używane do wskazania, kiedy myszy stają się w stanie agonalnym; eutanazja powinna być przeprowadzona po tym ustaleniu, zgodnie z wcześniej zatwierdzonym protokołem IACUC; różne markery umierania obejmują temperaturę ciała, utratę wagi, wygląd, chód i inne biomarkery, które można uzyskać z krwi (np. za pomocą iSTAT)9,10,11,12,13,14,15,16.
<ol>
	<li>Poddać myszy eutanazji zgodnie z wcześniej zatwierdzonym protokołem IACUC (np. CO2 , a następnie zwichnięcie szyjki macicy).</li>
	<li>Usuń płuca z uśpionej myszy, przecinając tchawicę, tętnicę płucną i żyłę płucną w pobliżu płuc.
	<ol>
		<li>mikroskopia
		<ol>
			<li>Umieść płuca (lub część) w formie na próbkę.</li>
			<li>Wypełnij formę próbki związkiem o optymalnej temperaturze cięcia (O.C.T.), całkowicie zanurzając tkankę.</li>
			<li>Zamrażać próbkę w temperaturze -80 °C.</li>
			<li>Wyślij próbkę do laboratorium patomorfologicznego, aby ją przeciąć i zamontować na szkiełkach do mikroskopii.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Obciążenie bakteryjne
		<ol>
			<li>Zważyć tkankę płucną na wadze analitycznej.</li>
			<li>Przenieść tkankę płucną do stożkowej fiolki o pojemności 50 ml zawierającej 2 - 5 ml sterylnego PBS (w zależności od wielkości tkanki).</li>
			<li>Homogenizować tkankę płucną za pomocą homogenizatora tkankowego.</li>
			<li>Wykonać seryjne rozcieńczenia homogenatu w sterylnym PBS, aby osiągnąć około 1,000 CFU/ml, w oparciu o oczekiwane obciążenie bakteryjne w płucach.
			<ol>
				<li>Na przykład, jeśli spodziewane jest 1 × 109 CFUs/mg, wykonaj trzy rozcieńczenia 1:100: Przenieś 100 μl homogenatu do 9,9 ml PBS i odwiruj; jest to pierwsze rozcieńczenie 1:100. Przenieść 100 μl pierwszego rozcieńczenia w stosunku 1:100 do 9,9 ml PBS i zawirować; Jest to drugie rozcieńczenie 1:100. Przenieść 100 μl drugiego rozcieńczenia 1:100 do 9,9 ml PBS i wirować; Jest to trzecie i ostatnie rozcieńczenie 1:100.</li>
				<li>Jeśli obciążenie bakteryjne w płucach jest nieznane, wykonaj szereg rozcieńczeń, aby uchwycić oczekiwany zakres.</li>
			</ol>
			</li>
			<li>Rozcieńczenie (rozcieńczenia) płytki na sterylnym agarze
			<ol>
				<li>Przygotuj sterylny bulion sojowy tryptyczny (TSB) z płytkami agarowymi (TSA): Połącz 30 g TSB, 15 g agaru i 1 l wody, wymieszaj z mieszadłem magnetycznym i podgrzewaj do wrzenia w temperaturze ~100 °C przez 5 minut. Pozostaw do ostygnięcia, a następnie sterylizuj w autoklawie w cyklu płynnym przez 15 minut. Pozostaw do ostygnięcia do ~55 °C, przenieść 10 ml świeżo autoklawizowanego TSA na sterylne szalki Petriego i pozostawić do ostygnięcia do temperatury pokojowej. Pozostaw do wyschnięcia na blacie przez 2 - 5 dni lub bez przykrycia pod szafką bezpieczeństwa biologicznego przez 10 minut.</li>
				<li>Przenieść 100 μl rozcieńczenia na szalkę Petriego zawierającą sterylny TSA i rozprowadzić na TSA za pomocą rozsiewacza lub szklanych kulek.</li>
				<li>Przechowywać szalkę Petriego przez noc w temperaturze 37 °C w nawilżanym inkubatorze (tj. inkubatorze o temperaturze 37 °C zawierającym odkrytą 1-litrową zlewkę wypełnioną wodą)</li>
			</ol>
			</li>
			<li>Oznaczyć homogenat płuc jtk/ml na podstawie posiewu agarowego (np. 100 jtk na płytce TSA ze 100 μl trzeciego i końcowego rozcieńczenia opisanego powyżej wyniesie 100 jtk/100 μl × 100dil#1 × 100dil#2 × 100dil#3 = 1×109 jtk/ml).</li>
			<li>Obliczać jtk jtk/mg tkanki płucnej na podstawie podzielenia homogenatu płuc jtk/ml przez mg homogenatu tkanki płucnej/ml (np. jeśli w próbce opisanej powyżej użyto 100 mg tkanki płucnej homogenizowanej w 5 ml PBS, to 1 × 109 jtk/ml ÷ 100 mg/5 ml = 5 × 107 jtk/mg).</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Media Centre, W. H. O. World Health Organization. Fact Sheet - Top 10 Causes of Death. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs310/en/">http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs310/en/</a> (2017).</li>
<li>Spellberg, B., Talbot, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recommended+Design+Features+of+Future+Clinical+Trials+of+Antibacterial+Agents+for+Hospital-Acquired+Bacterial+Pneumonia+and+Ventilator-Associated+Bacterial+Pneumonia%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Recommended Design Features of Future Clinical Trials of Antibacterial Agents for Hospital-Acquired Bacterial Pneumonia and Ventilator-Associated Bacterial Pneumonia.</a> Clinical Infectious Diseases. 51 (S1), S150-S170 (2010).</li>
<li>Kalil, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Management+of+Adults+With+Hospital-acquired+and+Ventilator-associated+Pneumonia%3A+2016+Clinical+Practice+Guidelines+by+the+Infectious+Diseases+Society+of+America+and+the+American+Thoracic+Society%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Management of Adults With Hospital-acquired and Ventilator-associated Pneumonia: 2016 Clinical Practice Guidelines by the Infectious Diseases Society of America and the American Thoracic Society.</a> Clinical Infectious Diseases. 63 (5), e61-e111 (2016).</li>
<li>Medina, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+model+of+pneumococcal+pneumonia%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Murine model of pneumococcal pneumonia.</a> Methods in Molecular Biology. , 405-410 (2010).</li>
<li>Azoulay-Dupuis, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+efficacy+of+a+new+fluoroquinolone%2C+sparfloxacin%2C+against+penicillin-susceptible+and+-resistant+and+multiresistant+strains+of+Streptococcus+pneumoniae+in+a+mouse+model+of+pneumonia%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">In vivo efficacy of a new fluoroquinolone, sparfloxacin, against penicillin-susceptible and -resistant and multiresistant strains of Streptococcus pneumoniae in a mouse model of pneumonia.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 36 (12), 2698-2703 (1992).</li>
<li>Mizgerd, J. P., Skerrett, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+human+pneumonia%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Lung+Cellular+and+Molecular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Animal models of human pneumonia.</a> American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 294 (3), L387-L398 (2008).</li>
<li>Rayamajhi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-surgical+intratracheal+instillation+of+mice+with+analysis+of+lungs+and+lung+draining+lymph+nodes+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Non-surgical intratracheal instillation of mice with analysis of lungs and lung draining lymph nodes by flow cytometry.</a> Journal of Visualized Experiments. (51), (2011).</li>
<li>Nielsen, T. B., Bruhn, K. W., Pantapalangkoor, P., Junus, J. L., Spellberg, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryopreservation+of+virulent+Acinetobacter+baumannii+to+reduce+variability+of+in+vivo+studies%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Cryopreservation of virulent Acinetobacter baumannii to reduce variability of in vivo studies.</a> BMC Microbiology. 15, 252(2015).</li>
<li>Trammell, R. A., Toth, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Markers+for+predicting+death+as+an+outcome+for+mice+used+in+infectious+disease+research%5BTitle%5D)+AND+%22Comparative+Medicine%22%5BJournal%5D)">Markers for predicting death as an outcome for mice used in infectious disease research.</a> Comparative Medicine. 61 (6), 492-498 (2011).</li>
<li>Bast, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+murine+model+of+pneumococcal+pneumonia%3A+use+of+temperature+as+a+measure+of+disease+severity+to+compare+the+efficacies+of+moxifloxacin+and+levofloxacin%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Novel murine model of pneumococcal pneumonia: use of temperature as a measure of disease severity to compare the efficacies of moxifloxacin and levofloxacin.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 48 (9), 3343-3348 (2004).</li>
<li>Hankenson, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Weight+loss+and+reduced+body+temperature+determine+humane+endpoints+in+a+mouse+model+of+ocular+herpesvirus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Association+for+Laboratory+Animal+Science%22%5BJournal%5D)">Weight loss and reduced body temperature determine humane endpoints in a mouse model of ocular herpesvirus infection.</a> Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 52 (3), 277-285 (2013).</li>
<li>Adamson, T. W., Diaz-Arevalo, D., Gonzalez, T. M., Liu, X., Kalkum, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypothermic+endpoint+for+an+intranasal+invasive+pulmonary+aspergillosis+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Comparative+Medicine%22%5BJournal%5D)">Hypothermic endpoint for an intranasal invasive pulmonary aspergillosis mouse model.</a> Comparative Medicine. 63 (6), 477-481 (2013).</li>
<li>Nielsen, T. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diabetes+Exacerbates+Infection+via+Hyperinflammation+by+Signaling+through+TLR4+and+RAGE%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Diabetes Exacerbates Infection via Hyperinflammation by Signaling through TLR4 and RAGE.</a> mBio. 8 (4), (2017).</li>
<li>Nielsen, T. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monoclonal+Antibody+Protects+Against+Acinetobacter+baumannii+Infection+by+Enhancing+Bacterial+Clearance+and+Evading+Sepsis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Monoclonal Antibody Protects Against Acinetobacter baumannii Infection by Enhancing Bacterial Clearance and Evading Sepsis.</a> Journal of Infectious Diseases. 216 (4), 489-501 (2017).</li>
<li>Cheng, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+serotypes+5+and+8+capsular+polysaccharides+in+protection+against+Staphylococcus+aureus+in+murine+models+of+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Vaccine+Immunotherapy%22%5BJournal%5D)">Evaluation of serotypes 5 and 8 capsular polysaccharides in protection against Staphylococcus aureus in murine models of infection.</a> Human Vaccine Immunotherapy. 13 (7), 1609-1614 (2017).</li>
<li>Wong, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+and+Pathophysiological+Overview+of+Acinetobacter+Infections%3A+a+Century+of+Challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Microbiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Clinical and Pathophysiological Overview of Acinetobacter Infections: a Century of Challenges.</a> Clinical Microbiology Reviews. 30 (1), 409-447 (2017).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Z pewnością myszy nie są miniaturowymi ludźmi. Wyniki uzyskane z modeli mysich muszą być rozpatrywane w kontekście, a następnie interpretowane pod kątem możliwości zastosowania u ludzi, w oparciu o różnice i podobieństwa między tymi dwoma gatunkami6. Ważne jest również, aby wybrać odpowiednią odmianę myszy, ponieważ niektóre są bardziej podatne na niektóre infekcje niż inne; To samo dotyczy szczepu patogenu z wyboru16.
Niezbędne jest przeprowadza...

Infekcja dolnych dróg oddechowych jest najbardziej śmiertelną chorobą zakaźną na świecie i najczęstszą przyczyną zgonów w krajach rozwijających się1. Na całym świecie infekcje te odpowiadają za ponad 3,2 miliona zgonów1. Ponadto szpitalne zapalenie płuc jest jedną z najczęstszych i najbardziej śmiertelnych form zakażeń nabytych w opiece zdrowotnej i jest wywoływane przez najbardziej oporne na antybiotyki patogeny2,3. Typową drogą nabycia bakteryjnego zapalenia płuc zarówno w przypadku pozaszpitalnego, jak i szpitalnego zapalenia płuc jest aspiracja treści ustno-gardłowej do pęcherzyków płucnych. Mysie modele używane do badania tych chorób często używają inokulacji donosowej4, odkładając większość bakterii poza płucami, powodując niezamierzone powikłania i objawy, takie jak zapalenie zatok i uraz fizyczny, które są niezgodne z postępem choroby u człowieka, do naśladowania którego zostały zaprojektowane modele. Inne modele mogą wykorzystywać komory inhalacyjne i urządzenia do mikrozamgławiania, które dokładniej naśladują wirusowe, gruźlicze i grzybicze zapalenie płuc, ale nie odwzorowują dokładnie normalnej drogi nabycia typowych bakteryjnych zapaleń płuc.
Model mysiego zapalenia płuc z aspiracją ustno-gardłową może być wykorzystany do symulacji naturalnej drogi i patogenezy bakteryjnego zapalenia płuc. Poprzez zaszczepienie 50 μl zawiesiny bakteryjnej do jamy ustnej gardła znieczulonych myszy za pomocą pipety, następuje odruchowe aspiracja, która powoduje zakaźne zapalenie płuc. Korzystając z tego modelu, można badać patogenezę patogenów wywołujących zapalenie płuc i nowe metody leczenia tych chorób za pomocą modelu o wyższej wierności, bardziej analogicznego do zakażeń zachłystowego zapalenia płuc obserwowanych u ludzi. Dodatkowo, w przeciwieństwie do podobnych modeli, które infekują przez jamę ustną5,6, ten model zapewnia, że pełne inokulum dociera do płuc zamiast do jelit, gdzie może powodować stan zapalny i infekcje poza miejscem zdarzenia, takie jak zapalenie żołądka i zapalenie jelit. Wreszcie, w przeciwieństwie do innego opublikowanego modelu, który wymaga laryngoskopu i zaszczepia przez trachea7, ten model nie blokuje dróg oddechowych za pomocą igły do zgłębnika i nie wymaga wstrzyknięcia w celu podania inokulum. Zamiast tego inokulacja opiera się na naturalnym odruchu aspiracji myszy.

<table><tbody><tr><td>Agar</td><td>BD</td><td>214530</td><td>Połącz z TSB, aby zrobić</td></tr><tr><td>koraliki TSA, szkło borokrzemianowe</td><td>Kimble</td><td>135003</td><td>Sterylizuj przez pieczenie lub autoklawowanie przed każdym użyciem</td></tr><tr><td>Zlewka, 250 ml</td><td>Pyrex</td><td>1003</td><td>Używany podczas precyzyjnego porcjowania skoncentrowanego inokulu bakteryjnego</td></tr><tr><td>Wirówka</td><td>Sorvall</td><td>ST 40R</td><td>Zdolny do 4,000 i razy; g przy 4& stopniach; C</td></tr><tr><td>Komora do znieczulenia</td><td>Kent Scientific Corporation</td><td>VetFlo-0720</td><td>Może pomieścić do 5 myszy</td></tr><tr><td>Cryomold, średni rozmiar</td><td>Sakura Tissue-Tek</td><td>4566</td><td>Jednorazowe formy do próbek winylowych, 15 i razy; 15 razy; </td></tr><tr><td>Nić dentystyczna</td><td>5 mm Oral-B</td><td>37000469537</td><td>Przywiązać do stabilnego słupka ok. 6 cali nad wysokością stołu</td></tr><tr><td>Kleszcze</td><td>VWR</td><td>82027-440</td><td>Służy do delikatnego wyciągania języka z ust myszy</td></tr><tr><td>Homogenizator do tkanki płucnej Autoklaw</td><td>Omni International</td><td>TM125-115</td><td>przed pierwszym użyciem; płukać między próbkami</td></tr><tr><td>Izofluran do znieczulenia</td><td>Abbott</td><td>10015516</td><td>Można zastosować alternatywny lek; odpowiednio zmodyfikuj procedurę</td></tr><tr><td>Wkład iSTAT</td><td>Abbott</td><td>03P79-25</td><td>Dostępne są różne wkłady dostosowane do Twoich potrzeb</td></tr><tr><td>Ketamina, 100 mg / ml</td><td>Western Medical Supply</td><td>4165</td><td>Rozcieńczyć 1:10 w PBS do 1 mg / ml i połączyć z ksylazyną w 1 mg / ml</td></tr><tr><td>Maść do oczu</td><td>Akorn</td><td>Tears Odnowione</td><td>Unikaj dotykania oka końcówką dozownika</td></tr><tr><td>Optymalna temperatura cięcia (O.C.T.) Związek</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-730-571</td><td>Służy do zamrażania próbek płuc w temperaturze -80 & stopni; C do przygotowania do sekcji patologicznej</td></tr><tr><td>szalka Petriego</td><td>VWR</td><td>25384-302</td><td>Polistyren, jednorazowy, sterylizowany, 100 i razy; 15 mm</td></tr><tr><td>sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)</td><td>Corning</td><td>21-031-CM</td><td>PBS firmy Dulbecco bez końcówek do pipet z wapniem i magnezem</td></tr><tr><td>, 200-&mu; L</td><td>VWR</td><td>10017-044</td><td>Autoklaw przed użyciem</td></tr><tr><td>Pipet, 200-&mu; L</td> Autoklaw <td>Gilson</td><td>Pipetman P200</td><td>i kalibracja przed użyciem</td></tr><tr><td>Rozsiewacz, komórka bakteryjna</td><td>Bel-Art</td><td>F377360006</td><td>Sterylizuj przez pieczenie lub autoklawowanie przed każdym użyciem</td></tr><tr><td>Mieszadło, magnetyczne, średnica 7,9 mm i czasy; długość 38,1 mm</td><td>VWR</td><td>58948-150</td><td>Służy do mieszania skoncentrowanej inokulacji bakteryjnej podczas porcjowania</td></tr><tr><td>Płytka mieszająca, magnetyczna</td><td>Corning</td><td>PC-620D</td><td>Służy do mieszania skoncentrowanych inokulantów bakteryjnych podczas porcjowania</td></tr><tr><td>Tryptyczny bulion sojowy (TSB)</td><td>BD</td><td>211822</td><td>Połącz z agarem, aby uzyskać</td></tr><tr><td>TSA Fiolka, stożkowa, sterylna, 50 ml</td><td>Corning</td><td>431720</td><td>Służy do przygotowania inokulacji bakteryjnej</td></tr><tr><td>Fiolka, stożkowa, sterylna, 500 ml</td><td></td><td>Corning 431123</td><td>Służy do zagęszczania inokulantu do przygotowania mrożonej inokuli</td></tr><tr><td>Fiolka, kriogeniczna, 2,0 ml</td><td>Corning</td><td>430659</td><td>Służy do kriogenicznego przechowywania skoncentrowanej inokuli bakteryjnej</td></tr><tr><td>Ksylazyna, 20 mg/ml</td><td>Akorn</td><td>AnaSed Iniekcja</td><td>Rozcieńczyć w stosunku 1:20 w PBS do 1 mg/ml i połączyć z ketaminą w stężeniu 1 mg/ml</td></tr></tbody></table>

mysi model aspiracji jamy ustnej i gardła bakteryjnego zapalenia płuc związanego z respiratorem i nabytego w szpitalu

Murine Oropharyngeal Aspiration Model of Ventilator-associated and Hospital-acquired Bacterial Pneumonia

Modele infekcji mysich są kluczowe dla zrozumienia patogenezy choroby i testowania skuteczności nowych terapii przeznaczonych do zwalczania patogenów wywołujących. Zakaźne zapalenie płuc jest jednym z najczęstszych zakażeń zgłaszanych przez pacjentów w klinice, dlatego wymaga odpowiedniego modelu in vivo. Typowe modele zapalenia płuc wykorzystują inokulację donosową, która odkłada nadmiar organizmów poza płucami, powodując niezamierzone powikłania i objawy, takie jak zapalenie zatok, zapalenie żołądka, zapalenie jelit, uraz fizyczny lub mgła mikrocząsteczkowa, aby naśladować rozprzestrzenianie się aerozolu bardziej typowe dla wirusowego, gruźliczego lub grzybiczego zapalenia płuc. Modele te nie odzwierciedlają dokładnie patogenezy typowego bakteryjnego zapalenia płuc nabytego w społeczności lub opiece zdrowotnej. W przeciwieństwie do tego, ten mysi model zachłystowego zapalenia płuc w jamie ustnej i gardle naśladuje drogę kropelkową w zapaleniu płuc nabytym w opiece zdrowotnej. Zaszczepienie 50 μl zawiesiny bakterii do jamy ustnej gardła znieczulonych myszy powoduje odruchowe aspirację, co skutkuje zapaleniem płuc. Dzięki temu modelowi można badać patogenezę patogenów wywołujących zapalenie płuc i nowe metody leczenia tych chorób.

Poprzez dokładne przestrzeganie protokołu można łatwo uzyskać powtarzalne i wiarygodne dane. W przypadku eksperymentów porównawczych kluczowe jest ścisłe stosowanie spersonalizowanego protokołu przygotowania szczepionki. Ważne jest również prawidłowe obchodzenie się z myszami podczas procedury zakażania. Należy umieścić myszy w komorze anestezjologicznej pozbawionej izofluranu. Myszy mogą wpaść w panikę, jeśli zostaną umieszczone w komorze uprzednio wypełnionej izofluranem, co może wywoła...

Zakaźne zapalenie płuc jest jedną z najczęstszych infekcji u ludzi. Odpowiedni model in vivo ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia patogenezy choroby i testowania skuteczności nowych terapii. Dzięki temu mysiemu modelowi aspiracyjnego zapalenia płuc w jamie ustnej i gardle można zbadać patogenezę i nowe metody leczenia tych śmiertelnych infekcji.

Mysi model aspiracji jamy ustnej i gardła bakteryjnego zapalenia płuc związanego z respiratorem i nabytego w szpitalu

Murine infection models are critical for understanding disease pathogenesis and testing the efficacy of novel therapeutics designed to combat causative ...

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie oporności na antybiotyki dotyczące nowych terapii w leczeniu respiratorowego zapalenia płuc. Główną zaletą tej techniki jest to, że dokładnie odwzorowuje kliniczną infekcję w szybki i łatwy do odtworzenia sposób. Aby zaszczepić myszy, powiesić pierwsze znieczulone zwierzę za górne siekacze na mocnym cienkim sznurku.Przymocuj go do nieruchomego przedmiotu nad powierzchnią roboczą, na wysokości około dwukrotnie większej niż długość ciała myszy. Użyj sterylnych kleszczy dłoni, aby delikatnie wyciągnąć język i przenieś język na sterylne palce w rękawiczkach, aby umożliwić dostęp do gardła ustnego. Wciśnij tłok mikropipety do pierwszego oporu, aby umieścić 50 mikrolitrów inokulum w gardle jamy ustnej, aż mysz wdycha zawiesinę bakteryjną przez odruchowe aspiracje.Mysz przestanie oddychać na kilka sekund, gdy inokulum zostanie umieszczone w gardle jamy ustnej, a ostatecznie odruchowa aspiracja spowoduje wdychanie zawiesiny bakteryjnej, na co wskazuje charakterystyczny trzask płynu wchodzącego do płuc. Następnie wróć zwierzę do klatki, z monitorowaniem, aż do pełnego leżenia. W odpowiednim punkcie końcowym doświadczenia nal

murine-oropharyngeal-aspiration-model-ventilator-associated-hospital

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Źródło: Lenhard, A. i in. Model myszy przedstawiający przejście Streptococcus pneumoniae z kolonizatora do patogena po współinfekcji wirusowej powtarza chorobę zaostrzoną przez wiek. J. Vis. Exp. (2022)Ten film pokazuje model współinfekcji myszy, w którym wirus grypy wywołuje przejście Streptococcus pneumoniae z kolonizatora do patogenu. Opisuje etapy związane z kolonizacją bakteryjną, infekcją wirusową i postępem choroby.

Model myszy do badania patogennej przejścia paciorkowca pneumoniae po współinfekcji wirusowej

Źródło: Nielsen, T. B. i in., Model aspiracji orofaryngealnej myszy bakteryjnego zapalenia płuc związanego z respiratorem i nabytego w szpitalu. J. Vis. Exp. (2018)Ten film pokazuje procedurę dostarczania bakterii przez gardło do płuc znieczulonej myszy, aby wywołać infekcję płuc i wywołać odpowiedź immunologiczną.

Przygotowanie modelu aspiracji orofarygealnej u myszy w celu wykrycia bakteryjnych infekcji płuc

Ten film pokazuje proces powstawania infekcji płuc u immunokompetentnego modelu gryzoni poprzez intubację i instalację zawiesin bakteryjnych w płatach płuc. Model ten umożliwia badania skuteczności przeciwbakteryjnej u zwierząt immunokompetentnych.

Wkraplanie dooskrzelowe Streptococcus pneumoniae w immunokompetentnych modelach gryzoni

Opracowaliśmy model uszkodzenia płuc myszy poprzez wstrzyknięcie do tchawicy bakterii Pseudomonas aeruginosa. Model ten naśladuje uszkodzenie płuc podczas zapalenia płuc i ma znaczenie kliniczne.

Pseudomonas aeruginosa Model indukowanego uszkodzenia płuc

Podczas gdy badania in vitro interakcji gospodarz-patogen pozwalają na scharakteryzowanie specyficznych odpowiedzi immunologicznych, modele in vivo są wymagane do obserwacji efektów złożonych odpowiedzi. Wykorzystując ekspozycję na Candida albicans, a następnie infekcję płuc za pośrednictwem Pseudomonas aeruginosa, ustaliliśmy mysi model interakcji mikrobiologicznych zaangażowanych w patogenność zapalenia płuc związaną z respiratorem.

Badanie społeczności drobnoustrojów in vivo: model interakcji między Candida albicans i Pseudomonas aeruginosa w drogach oddechowych za pośrednictwem gospodarza

W literaturze opisano kilka metod modelowania bakteryjnego zapalenia płuc u myszy. W niniejszym artykule opisano nieinwazyjną, niedrogą i szybką metodę wywoływania zapalenia płuc poprzez aspirację (tj. wdychanie) inokulum bakteryjnego pipetowanego do jamy ustnej i gardła. Szczegółowo opisano również dalsze metody oceny wrodzonej odpowiedzi immunologicznej płuc.

Nieinwazyjna i technicznie nieintensywna metoda indukcji i fenotypowania eksperymentalnego bakteryjnego zapalenia płuc u myszy

Ten protokół wywołuje ostre uszkodzenie płuc u myszy, która jest bardzo zbliżona do patogenezy kwaśnego zapalenia płuc obserwowanej u ludzi. Generujemy maksymalne ostre, nieśmiertelne uszkodzenie płuc o niskim pH i uwzględniamy różnice w anatomicznej budowie układu oddechowego gryzoń i człowieka za pomocą otwartej tracheostomii w połączeniu ze zwolnieniem ciśnienia obwodowego.

Mysi model ostrego uszkodzenia płuc z otwartą tracheostomią do aspiracji kwasu żołądkowego skutkuje maksymalnym ostrym nieśmiertelnym uszkodzeniem płuc

Opisano metodę wykrywania infekcji płuc u gryzoni immunokompetentnych. Przy wprawdzie metodę tę można szybko i łatwo przeprowadzić w celu wywołania stabilnego zakażenia wieloma izolatami S. pneumoniae, H. influenzae, P. aeruginosa, K. pneumoniae i A. baumannii.

Solidny model zapalenia płuc u immunokompetentnych gryzoni w celu oceny skuteczności przeciwbakteryjnej przeciwko S. pneumoniae, H. influenzae, K. pneumoniae, P. aeruginosa lub A. baumannii

Tutaj prezentujemy metody poprawy badań nad wtórnym bakteryjnym zapaleniem płuc poprzez zapewnienie nieinwazyjnej drogi wkraplania do dolnych dróg oddechowych, po której następuje odzyskiwanie patogenów i analiza transkryptów. Zabiegi te są powtarzalne i mogą być wykonywane bez specjalistycznego sprzętu, takiego jak kaniule, druty doprowadzające czy światłowodowe.

Precyzyjny system dostarczania i odzyskiwania patogenów dla mysich modeli wtórnego bakteryjnego zapalenia płuc

Ten manuskrypt opisuje stworzenie zakaźnego modelu zapalenia płuc u myszy i odpowiednią charakterystykę leczenia urazów wraz z metodami hodowli bakterii i wkraplania dotchawiczego. Opisano również nowatorskie podejście wykorzystujące wysokowymiarową cytometrię przepływową do oceny krajobrazu immunologicznego.

Eksperymentalny model do oceny ustąpienia zapalenia płuc

Ten artykuł opisuje nowy model myszy do przejścia pneumokoków z bezobjawowego kolonizatora w patogen chorobotwórczy podczas infekcji wirusowej. Model ten można łatwo zaadaptować do badania interakcji wielodrobnoustrojowych i gospodarz-patogen w różnych fazach progresji choroby i u różnych gospodarzy.

Mysi model przejścia Streptococcus pneumoniae z kolonizatora w patogen po koinfekcji wirusowej podsumowuje chorobę zaostrzoną wiekiem

Poznaj mysi model aspiracji jamy ustnej i gardła do badania zapalenia płuc związanego z respiratorem. Ta technika pozwala testować nowe terapie i badać mechanizmy oporności na antybiotyki.

Mysi model aspiracji jamy ustnej i gardła bakteryjnego zapalenia płuc związanego z respiratorem i nabytego w szpitalu

Przeglądaj więcej filmów