Bezznacznikowe wzbogacanie neutrofili z wydzielania przez pacjenta z dróg oddechowych przy użyciu mikrofluidyki inercyjnej w pętli zamkniętej

Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w badaniach nad chorobami płuc, takimi jak zapalenie płuc, astma, mukowiscydoza i przewlekła obturacyjna choroba płuc. Główną zaletą tej techniki jest wyizolowanie i wzbogacenie neutrofili pacjenta z wydzieliny z dróg oddechowych pacjenta bez pionowych zaburzeń chemicznych. Procedurę zademonstruje Kyungyong, doktorant z mojego laboratorium.

Na początek utrzymuj stosunek 10 do jednego i wymieszaj prekursor PDMS z bazą i utwardzaczem. Następnie dodaj 30 gramów mieszanki PDMS na aluminiową formę do mikromaszyny. Następnie dodaj kolejne 20 gramów mieszaniny PDMS na 100-milimetrową szalkę Petriego.

W celu odgazowania umieścić formę i szalkę Petriego w eksykatorze próżniowym. Po odgazowaniu zwolnij próżnię i umieść formę oraz szalkę Petriego w piekarniku nagrzanym do 90 stopni Celsjusza na godzinę. Po godzinie wyjmij foremkę i szalkę Petriego z piekarnika i pozwól im ostygnąć w temperaturze pokojowej przez 10 minut.

Następnie za pomocą noża wytnij kontur i przebij otwory dostępu do płynu dwumilimetrowym dziurkaczem do biopsji na urządzeniu. Po wybiciu otworów zabezpiecz taśmę i przyklej ją do strony kanału urządzenia oraz do grubej folii PDMS. Użyj kleszczyków, aby ostrożnie odkleić taśmę, aby usunąć kurz.

Następnie zacznij traktować stronę kanałową urządzenia i zwykły PDMS plazmą powietrzną. Następnie należy połączyć zarówno stronę kanału, jak i zwykły PDMS z przygotowaną warstwą nośną zwykłego PDMS. Następnie pozostaw chip na szklanym szkiełku o wymiarach 102 na 76 milimetrów.

Umieść szkiełko w piekarniku w temperaturze 70 stopni Celsjusza na co najmniej 30 minut, aby zwiększyć siłę wiązania. Użyj 10-mililitrowej strzykawki, aby zebrać jeden mililitr próbek wydzieliny z dróg oddechowych w dziewięciu mililitrach soli fizjologicznej buforowanej fosforanami. Następnie za pomocą pipety homogenizować próbkę śluzu.

Następnie użyj nylonowego sitka do komórek o grubości 40 mikrometrów, aby odcedzić rozcieńczalnik i usunąć duże kawałki tkanki lub skrzepy krwi. Po zakończeniu odcedzania umieścić próbkę na lodzie. Następnie dodaj 50 mililitrów soli fizjologicznej buforowanej fosforanem do 0,5 mililitra rozcieńczalnika do próbek, aby uzyskać końcowe stężenie 1,000 razy rozcieńczonej próbki.

Użyj prowadnicy płynu, aby zmontować chip PDMS, aby zapewnić równomierny przepływ do każdego z czterech spiralnych mikrokanałów. Następnie użyj męskiego złącza Luer o średnicy 1/16 cala, aby podłączyć do wlotu, wewnętrznego wylotu ściennego i zewnętrznych portów wylotowych ściennych prowadnicy płynu. Następnie podłącz silikonową rurkę do zawiesiny próbki.

Następnie podłącz pompę perystaltyczną do rurki wlotowej. Umieść rurkę wylotową ze ściany zewnętrznej w zbiorniku na odpady. Następnie umieść koniec rurki doprowadzającej i rurkę wylotową ściany wewnętrznej w zbiorniku na próbkę.

Po umieszczeniu rurki pozostaw 50-mililitrową rurkę wypełnioną pięcioma mililitrami soli fizjologicznej buforowanej fosforanami bez wapnia i magnezu w zbiorniku na próbkę. Następnie, aby zalać urządzenie, rozpocznij pompowanie z natężeniem przepływu około jednego mililitra na minutę. Po umieszczeniu próbki w zbiorniku na próbkę włącz pompę perystaltyczną i ustaw natężenie przepływu na cztery mililitry na minutę.

Gdy objętość próbki osiągnie żądaną objętość około jednego do dwóch mililitrów, przerwij operację i odłącz rurkę. Próbka kliniczna składająca się z wydzieliny tchawicy pacjenta jest wykorzystywana do metody dysocjacji mikroprzepływowej w celu uzyskania populacji komórek bogatych w PMN. Poddając metodę dysocjacji mikroprzepływowej, otrzymuje się wysoko oczyszczone CD45, CD66B oraz bogatą populację komórek PMN.

W tym przypadku próbki uzyskane od dwóch różnych pacjentów reprezentowanych jako przypadek pierwszy i drugi są poddawane dysocjacji mikroprzepływowej w celu uzyskania powstałej zawiesiny komórek. Następnie, po poddaniu próbki wydzieliny z dróg oddechowych pacjenta mikrofluidyce, 94% PMN jest konsekwentnie odzyskiwane ze wszystkich sześciu próbek. Z drugiej strony, poddanie próbki pacjenta metodzie mukolizy DTT spowodowało odzyskanie tylko 53,5% PMN przy dużym zróżnicowaniu między próbkami.

Neutrofile wyizolowane metodami mikrofluidycznymi i mukolitycznym DTT są traktowane PMA w celu wywołania uwalniania elastazy neutrofilowej. Co ciekawe, próbki pacjentów poddane działaniu mikrofluidyki wykazują nienaruszone funkcjonalne komórki ze zwiększonym uwalnianiem elastazy przez stymulację PMA. Natomiast komórki uzyskane po dysocjacji mukolitycznej nie wykazują znaczącego wzrostu uwalniania elastazy z sześciu różnych badanych próbek pacjentów.

Wynika to z chemicznie zaburzonej powierzchni neutrofili. Po opanowaniu tę technikę można wykonać w 50 minut, jeśli jest wykonywana prawidłowo. Oczekuje się, że dzięki zapewnieniu protokołu dysocjacji w celu wychwytywania neutrofili z klinicznych wydzielin dróg oddechowych, metoda przedstawiona w tym badaniu rozszerzy zakres badań klinicznych nad chorobami układu oddechowego, takimi jak zapalenie płuc, astma, mukowiscydoza i przewlekła obturacyjna choroba płuc.

Implikacje tej techniki rozciągają się na terapię chorób płuc związanych z odpornością, takich jak astma i przewlekła obturacyjna choroba płuc, ponieważ proponowane metody zapewniają sposób na wychwycenie komórek odpornościowych pacjenta w sposób nieinwazyjny i wolny od znaczników. Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w badania nad układem oddechowym, można ją również zastosować do innych płynów biologicznych pacjentów z trudnymi danymi biometrycznymi, takimi jak płyn z nosa, płyn szyjkowy i płyn jelitowy. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak oddzielić neutrofile od wydzielania przez drogi oddechowe pacjenta za pomocą mikrofluidyki o zamkniętej pętli spiralnej bezwładności.

Nie zapominaj, że praca z próbkami klinicznymi może być bardzo niebezpieczna. Wszystkie eksperymenty muszą być przeprowadzane w komorze bezpieczeństwa biologicznego wraz ze środkami ochrony indywidualnej.