Name: Bezznacznikowe wzbogacanie neutrofili z wydzielania przez pacjenta z dróg oddechowych przy użyciu mikrofluidyki inercyjnej w pętli zamkniętej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-07T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 37 s
Description: Poznaj metodę bezznacznikowego wzbogacania neutrofili z wydzielin dróg oddechowych pacjenta przy użyciu spiralnej mikrofluidyki inercyjnej. Technika ta umożliwia izolację komórek bez chemicznych zaburzeń.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ta praca była wspierana przez NIH/NIAID (R21AI119042) oraz program NIH U24 Sample Sparing assay (U24-AI118656).

Pobranie próbki zostało zatwierdzone przez University of Pittsburgh Institutional Review Board (IRB# PRO16060443, PRO10110387). Wszystkie eksperymenty są przeprowadzane w komorze bezpieczeństwa biologicznego z odpowiednimi środkami ochrony osobistej.
1. Produkcja urządzeń i litografia miękka
UWAGA: Standardowe techniki miękkiej litografii15,16 zostały użyte do stworzenia mikrokanału polidimetylosiloksanu (PDMS).
<ol>
	<li>Wymieszaj prekursor PDMS w stosunku 10:1 zasady i utwardzacza.</li>
	<li>Wlać 30 g mieszaniny prekursorów PDMS na mikroobrabianą formę aluminiową (patrz <silna klasa="xfig">Rysunek 1 dla wymiarów) i 20 g mieszaniny prekursorów PDMS na 100 mm szalkę Petriego. 
	UWAGA: Szalka Petriego służy do wytwarzania grubej warstwy PDMS (~3 mm) na warstwę nośną. Warstwa nośna PDMS zapewnia jednolite właściwości fizyczne powierzchni w całej mikrofluidyce. Alternatywnie można użyć cienkiej folii PDMS na szkiełku podstawowym. Forma wzorcowa o określonych wymiarach kanału została zaprojektowana i wykonana metodą mikrofrezowania na blasze aluminiowej. Kanał spiralny zastosowany w tym badaniu był spiralnym mikrokanałem z 8 pętlami z jednym wlotem i dwoma wylotami, o promieniu rosnącym z 8 mm do 24 mm w celu efektywnej separacji na podstawie rozmiaru.</li>
	<li>Umieść formę i szalkę Petriego w eksykatorze próżniowym w celu odgazowania, aż na powierzchni nie będą widoczne pęcherzyki, zwykle 5 - 10 minut. Użyj odkurzacza domowego do eksykatora.</li>
	<li>Zwolnij próżnię i umieść formę oraz szalkę Petriego w piekarniku o temperaturze 90 °C na 1 godz 
	UWAGA: Zamiast piekarnika można użyć płyty grzejnej lub innych narzędzi grzewczych.</li>
	<li>Wyjmij formę i szalkę Petriego z piekarnika i pozwól im ostygnąć w temperaturze pokojowej przez 10 minut.</li>
	<li>Ostrożnie wytnij kontur i przebij otwory dostępu do płynów w urządzeniu za pomocą dziurkacza 2 mm. 
	UWAGA: Rozmiar stempla może się różnić w zależności od rozmiaru rurki lub prowadnicy płynu.</li>
	<li>Przyklej taśmę do strony kanału urządzenia i grubej folii PDMS i ostrożnie odklej kleszczykami, aby usunąć kurz.</li>
	<li>Potraktuj zarówno stronę kanałową urządzenia, jak i zwykły PDMS plazmą powietrzną i połącz z przygotowaną warstwą nośną zwykłego PDMS (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1A).</li>
	<li>Umieść wiór na szkiełku podstawowym o wymiarach 50 mm x 70 mm i umieść go w piekarniku o temperaturze 70 °C na co najmniej 30 minut, aby zwiększyć siłę wiązania.</li>
</ol>
2. Pobieranie wydzieliny tchawicy od pacjentów wentylowanych mechanicznie
UWAGA: Wydzieliny tchawicy mogą być uzyskane od pacjentów wentylowanych mechanicznie podczas normalnej, rutynowej pielęgnacji dróg oddechowych, przy użyciu protokołu zmodyfikowanego z konwencjonalnych metod, aby dostosować się do standardowego, dorosłego pacjenta wentylowanego. Próbki zostały pozbawione elementów pozwalających na identyfikację i natychmiast wysłane do przetworzenia.
<ol>
	<li>Jeśli wskazana jest aspiracja tchawicy, użyj cewnika do ekstrakcji wydzieliny z dróg oddechowych.</li>
	<li>Ostrożnie przesunąć cewnik do połowy rurki dotchawiczej i wkroplić 5 ml 0,9% sterylnej normalnej soli fizjologicznej z ampułko-strzykawki o pojemności 10 ml.</li>
	<li>Gdy cewnik jest w pełni zaawansowany lub napotkany jest opór, odessać wydzieliny i zebrać do sterylnego pojemnika na plwocinę.</li>
	<li>Zbierz 10 ml wydzieliny tchawicy do sterylnego pojemnika na plwocinę i umieść go na lodzie. Natychmiast wyślij próbki do przetworzenia.</li>
</ol>
3. Przygotowanie próbki wydzieliny tchawicy
UWAGA: Wszystkie eksperymenty muszą być przeprowadzane pod kolerą bezpieczeństwa biologicznego z odpowiednim sprzętem ochrony osobistej.
<ol>
	<li>Rozproszyć 1 ml próbek wydzieliny z dróg oddechowych w 9 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) za pomocą plastikowej strzykawki o pojemności 10 ml (do 10-krotnego rozcieńczenia). Użyj pipety, aby homogenizować próbkę śluzu.</li>
	<li>Odcedź rozcieńczalnik za pomocą nylonowego sitka komórkowego o wielkości 40 μm, aby usunąć duże kawałki lub skrzepy krwi, które mogą blokować otwór dostępowy do mikroprzepływów lub kanał. Po przetworzeniu umieścić próbkę na lodzie.</li>
	<li>Rozcieńczalnik każdej próbki należy rozcieńczyć przy użyciu 100-krotnie większej objętości buforu PBS, co daje 1,000-krotnie rozcieńczoną zawiesinę. Umieścić próbkę na lodzie podczas całej operacji dysocjacji.</li>
</ol>
4. Konfiguracja eksperymentalna
UWAGA: Wszystkie eksperymenty muszą być przeprowadzane pod kolerą bezpieczeństwa biologicznego z odpowiednim sprzętem ochrony osobistej.
<ol>
	<li>Zmontuj chip PDMS z prowadnicą płynu, aby zapewnić równomierny przepływ do każdego z czterech spiralnych mikrokanałów (<silna klasa="xfig">Rysunek 1B). 
	UWAGA: Zastosowano cztery kanały w celu zwiększenia przepustowości poprzez zrównoleglenie, a także optymalizacji objętości i gęstości komórek powstałej zawiesiny. Prowadnica płynu została zaprojektowana i wykonana za pomocą drukarki 3D typu stereolitografia z przezroczystą żywicą. Port wlotowy i wylotowy prowadnicy płynu wykorzystuje żeńskie złącza Luer, co ułatwia podłączanie i stabilne uszczelnienie podczas pracy.</li>
	<li>Podłącz męskie złącze Luer 1/16 cala do wlotu, wylotu ściany wewnętrznej (IW) i portu wylotowego ściany zewnętrznej (OW) prowadnicy płynu i podłącz silikonową rurkę do zawiesiny próbki.</li>
	<li>Włóż końcówki do każdego końca wlotu i wylotu, aby dotrzeć do dna zbiornika na próbkę.</li>
	<li>Połączyć pompę perystaltyczną z rurką wlotową.</li>
	<li>Umieść koniec rurki doprowadzającej i rurki wylotowej IW w zbiorniku próbki i umieść koniec rurki wylotowej OW w zbiorniku na odpady (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1C, D).</li>
	<li>Umieścić 50 ml probówkę przefiltrowanego PBS bez wapnia i magnezu w zbiorniku na próbkę.</li>
	<li>Rozpocznij pompowanie przy niskim natężeniu przepływu (~1 ml/min), aby zalać urządzenie. 
	UWAGA: Gdy pęcherzyki zostaną przechwycone w kanale, popchnij górną część kanału pęsetą, aby zdestabilizować i wyeliminować pęcherzyki powietrza. Gdy urządzenie jest całkowicie napełnione roztworem buforowym, wymień probówkę PBS, aby przygotować probówkę z próbką wydzieliny z dróg oddechowych.</li>
	<li>Po umieszczeniu próbki w zbiorniku na próbkę włącz pompę perystaltyczną i ustaw natężenie przepływu na 4 ml/min (<silna klasa = "xfig" > Rysunek 1C, D).</li>
	<li>Gdy objętość próbki osiągnie wyznaczoną objętość (~1 ml), przerwij operację i odłącz silikonową rurkę. 
	UWAGA: Proponowana metoda jest bardziej skuteczna w zmniejszaniu dużej objętości rozcieńczalnika (>50 ml) do objętości probówki mikrowirówki (~1 ml) (<silna klasa="xfig">Rysunek 2).</li>
</ol>
5. Analiza cytometrii przepływowej
UWAGA: Do porównania metod dysocjacji (mikrofluidyka i liza) użyto cytometrii przepływowej z immunofluorescencją.
<ol>
	<li>Dodać mysie przeciwciało monoklonalne anty-ludzkie CD66b sprzężone z izotiocyjanianem fluoresceiny (FITC) i mysie przeciwciało monoklonalne anty-ludzkie CD45 sprzężone z allofikocyjaniną (APC) do zawiesin początkowych (etap 3.3) i otrzymanych zawiesin (etap 4.9) (200 μl każdego przeciwciała) w stosunku 1:25 v/v.</li>
	<li>Próbki należy inkubować w temperaturze 4 °C w ciemności przez 30 minut.</li>
	<li>Przeanalizować obie próbki za pomocą cytometru przepływowego w celu ilościowego określenia PMNs. 
	UWAGA: Populacja, która jest podwójnie dodatnia FITC-APC, CD66b dodatnia i CD45-dodatnia, została uznana za neutrofile. Odzysk obliczono na podstawie stosunku całkowitej liczby komórek wejściowych do wynikowego zawieszenia.</li>
</ol>
6. Analiza wydania NE
UWAGA: Aby porównać funkcjonalność wyizolowanych neutrofili metodą mikrofluidyczną i metodą lizy, użyto zestawu do oznaczania NE.
<ol>
	<li>Dodać PMA (znajdujący się w zestawie do oznaczania) do każdej otrzymanej zawiesiny (otrzymanej w kroku 4.9) do końcowego stężenia 50 nM.</li>
	<li>Próbki należy inkubować w temperaturze 37 °C przez 2 godziny.</li>
	<li>Odwirować zawiesiny o sile 300 x g przez 10 min.</li>
	<li>Przenieść 10 μl każdego supernatantu na 96-dołkową płytkę (znajdującą się w zestawie do oznaczania). 
	UWAGA: Można również użyć 96-dołkowej mikropłytki z płaskim dnem i czarnym polistyrenem.</li>
	<li>Dodać 90 μl rozcieńczonego buforu do oznaczania (dostarczonego w zestawie do testów) do każdego dołka.</li>
	<li>Dodać 10 μl substratu elastazy (Z-Ala-Ala-Ala-Ala 2Rh110, znajdującego się w zestawie do oznaczania).</li>
	<li>Inkubować przez 1,5 godziny w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Odczytaj 96-dołkową płytkę za pomocą fluorometru o długości fali wzbudzenia 485 nm i długości fali emisji 525 nm. 
	UWAGA: Poziom NE podzielono przez liczbę PMN z analizy cytometrii przepływowej.</li>
</ol>

<ol><li>Hamid, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+of+sputum+processing+for+cell+counts%2C+immunocytochemistry+and+in+situ+hybridisation%5BTitle%5D)+AND+%22European+Respiratory+Journal%22%5BJournal%5D)">Methods of sputum processing for cell counts, immunocytochemistry and in situ hybridisation.</a> European Respiratory Journal. 20 (Supplement 37), 19S-23S (2002).</li>
<li>van Overveld, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+homogenization+of+induced+sputum+by+dithiothreitol+on+polymorphonuclear+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Effects of homogenization of induced sputum by dithiothreitol on polymorphonuclear cells.</a> J Physiol Pharmacol. 56, Suppl 4. 143-154 (2005).</li>
<li>Qiu, D., Tan, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dithiothreitol+has+a+dose-response+effect+on+cell+surface+antigen+expression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Allergy+Clin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Dithiothreitol has a dose-response effect on cell surface antigen expression.</a> J Allergy Clin Immunol. 103 (5 Pt 1), 873-876 (1999).</li>
<li>Usher, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+Neutrophil+Apoptosis+by+the+Pseudomonas+aeruginosa+Exotoxin+Pyocyanin%3A+A+Potential+Mechanism+of+Persistent+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Induction of Neutrophil Apoptosis by the Pseudomonas aeruginosa Exotoxin Pyocyanin: A Potential Mechanism of Persistent Infection.</a> The Journal of Immunology. 168 (4), 1861-1868 (2002).</li>
<li>Di Carlo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inertial+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Inertial microfluidics.</a> Lab Chip. 9 (21), 3038-3046 (2009).</li>
<li>Martel, J. M., Toner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inertial+focusing+dynamics+in+spiral+microchannels%5BTitle%5D)+AND+%22Phys+Fluids%22%5BJournal%5D)">Inertial focusing dynamics in spiral microchannels.</a> Phys Fluids. 24 (3), 32001(2012).</li>
<li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fundamentals+and+applications+of+inertial+microfluidics%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Fundamentals and applications of inertial microfluidics: a review.</a> Lab Chip. 16 (1), 10-34 (2016).</li>
<li>Hou, H. W., Bhattacharyya, R. P., Hung, D. T., Han, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+detection+and+drug-resistance+profiling+of+bacteremias+using+inertial+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Direct detection and drug-resistance profiling of bacteremias using inertial microfluidics.</a> Lab Chip. 15 (10), 2297-2307 (2015).</li>
<li>Warkiani, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultra-fast%2C+label-free+isolation+of+circulating+tumor+cells+from+blood+using+spiral+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Ultra-fast, label-free isolation of circulating tumor cells from blood using spiral microfluidics.</a> Nat Protoc. 11 (1), 134-148 (2016).</li>
<li>Warkiani, M. E., Tay, A. K., Guan, G., Han, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane-less+microfiltration+using+inertial+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Membrane-less microfiltration using inertial microfluidics.</a> Sci Rep. 5, 11018(2015).</li>
<li>Warkiani, M. E., Wu, L., Tay, A. K., Han, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-Volume+Microfluidic+Cell+Sorting+for+Biomedical+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Large-Volume Microfluidic Cell Sorting for Biomedical Applications.</a> Annu Rev Biomed Eng. 17, 1-34 (2015).</li>
<li>Kwon, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+Cell+Retention+Device+for+Perfusion+of+Mammalian+Suspension+Culture%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Microfluidic Cell Retention Device for Perfusion of Mammalian Suspension Culture.</a> Sci Rep. 7 (1), 6703(2017).</li>
<li>Wu, L., Guan, G., Hou, H. W., Bhagat, A. A., Han, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+of+leukocytes+from+blood+using+spiral+channel+with+trapezoid+cross-section%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Separation of leukocytes from blood using spiral channel with trapezoid cross-section.</a> Anal Chem. 84 (21), 9324-9331 (2012).</li>
<li>Guan, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spiral+microchannel+with+rectangular+and+trapezoidal+cross-sections+for+size+based+particle+separation%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Spiral microchannel with rectangular and trapezoidal cross-sections for size based particle separation.</a> Sci Rep. 3, 1475(2013).</li>
<li>Kotz, K., Cheng, X., Toner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PDMS+Device+Fabrication+and+Surface+Modification%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">PDMS Device Fabrication and Surface Modification.</a> J Vis Exp. (8), e319(2007).</li>
<li>Duffy, D. C., McDonald, J. C., Schueller, O. J. A., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+Prototyping+of+Microfluidic+Systems+in+Poly%28dimethylsiloxane%29%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Rapid Prototyping of Microfluidic Systems in Poly(dimethylsiloxane).</a> Analytical Chemistry. 70 (23), 4974-4984 (1998).</li>
<li>Ryu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-Derived+Airway+Secretion+Dissociation+Technique+To+Isolate+and+Concentrate+Immune+Cells+Using+Closed-Loop+Inertial+Microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Patient-Derived Airway Secretion Dissociation Technique To Isolate and Concentrate Immune Cells Using Closed-Loop Inertial Microfluidics.</a> Anal Chem. 89 (10), 5549-5556 (2017).</li>
<li>Mach, A. J., Di Carlo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuous+scalable+blood+filtration+device+using+inertial+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Continuous scalable blood filtration device using inertial microfluidics.</a> Biotechnol Bioeng. 107 (2), 302-311 (2010).</li>
<li>Di Carlo, D., Irimia, D., Tompkins, R. G., Toner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuous+inertial+focusing%2C+ordering%2C+and+separation+of+particles+in+microchannels%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Continuous inertial focusing, ordering, and separation of particles in microchannels.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (48), 18892-18897 (2007).</li>
<li>Xiang, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fundamentals+of+elasto-inertial+particle+focusing+in+curved+microfluidic+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Fundamentals of elasto-inertial particle focusing in curved microfluidic channels.</a> Lab Chip. 16 (14), 2626-2635 (2016).</li>
<li>Lotvall, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Asthma+endotypes%3A+a+new+approach+to+classification+of+disease+entities+within+the+asthma+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22J+Allergy+Clin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Asthma endotypes: a new approach to classification of disease entities within the asthma syndrome.</a> J Allergy Clin Immunol. 127 (2), 355-360 (2011).</li>
<li>Houston, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sputum+neutrophils+in+cystic+fibrosis+patients+display+a+reduced+respiratory+burst%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cyst+Fibros%22%5BJournal%5D)">Sputum neutrophils in cystic fibrosis patients display a reduced respiratory burst.</a> J Cyst Fibros. 12 (4), 352-362 (2013).</li>
<li>Janoff, A., Scherer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mediators+of+inflammation+in+leukocyte+lysosomes.+IX.+Elastinolytic+activity+in+granules+of+human+polymorphonuclear+leukocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Mediators of inflammation in leukocyte lysosomes. IX. Elastinolytic activity in granules of human polymorphonuclear leukocytes.</a> J Exp Med. 128 (5), 1137-1155 (1968).</li>
<li>Kawabata, K., Hagio, T., Matsuoka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+neutrophil+elastase+in+acute+lung+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">The role of neutrophil elastase in acute lung injury.</a> Eur J Pharmacol. 451 (1), 1-10 (2002).</li>
<li>Rubin, B. K. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27514587">Plastic Bronchitis.</a> Clin Chest Med. 37 (3), 405-408 (2016).</li>
<li>Kokot, K., Teschner, M., Schaefer, R. M., Heidland, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stimulation+and+inhibition+of+elastase+release+from+human+neutrophils+dependent+on+the+calcium+messenger+system%5BTitle%5D)+AND+%22Miner+Electrolyte+Metab%22%5BJournal%5D)">Stimulation and inhibition of elastase release from human neutrophils dependent on the calcium messenger system.</a> Miner Electrolyte Metab. 13 (2), 133-140 (1987).</li>
</ol>

Autorzy dokonali zgłoszenia patentowego na opisywaną tu technologię.

W mikrofluidyce inercyjnej cząstki i komórki lokalizują się w określonej pozycji bocznej w mikrokanale na podstawie ich wielkości 5,18,19,20. Ze względu na łączny wpływ siły oporu Deana i bezwładnej siły nośnej w zakrzywionym mikrokanale, duże cząstki lub neutrofile (>10 μm) znajdują się wewnątrz kanału, a małe cząstki, agregaty śluzu i zanieczyszczenia mniejsze niż 6 μm są umieszczane na zewną...

Ponieważ komórki są zamknięte w dużej ilości śluzu w wydzielinach dróg oddechowych, ocena funkcjonalna leukocytów za pomocą testu in vitro została utrudniona. Ditiotreitol (DTT) jest najpowszechniejszym buforem do lizy do dysocjacji i homogenizacji plwociny w celu analizy cytologicznej i wykrywania mediatorów, zapewniając jednocześnie tolerowaną żywotność izolowanych komórek1,2. Jednak DTT może zakłócać powierzchniowe antygeny neutrofili w drogach oddechowych, powodując zakłócenie funkcji neutrofili, takich jak uwalnianie elastazy i mieloperoksydazy (MPO)2,3. W związku z tym przeprowadzono niewiele badań nad funkcją neutrofili w drogach oddechowych u ludzi, które mogą nie ujawniać fizjologicznych cech pulmonary4. Tymczasem mikrofluidyka inercyjna poczyniła postępy w izolowaniu komórek z różnych biomatryc pacjentów5,6. Równowaga między bezwładnościowymi siłami nośnymi a oporem Deana wyrównuje cząstkę/komórkę zgodnie z ich rozmiarem, co umożliwia separację cząstek bez etykiet7. Nasza grupa wcześniej wprowadziła metodę przygotowania próbki do krążących komórek nowotworowych8,9, patogeny we krwi8, komórki z hodowli zawiesinowej 10,11,12, oraz leukocyty wielojądrzaste (PMNs) z krwi13,14.
Tutaj wprowadzamy protokół do przygotowania komórek odpornościowych z wydzielin z dróg oddechowych pacjenta za pomocą mikrofluidyki inercyjnej w pętli zamkniętej do dalszego testu in vitro, takiego jak test elastazy neutrofilowej (NE). Metoda ta zapewnia zarówno wysokie stężenie, jak i odzysk, zwłaszcza gdy występuje znaczne zachodzenie na siebie w kierunku bocznym komórki/cząstki, z której ma zostać usunięta komórka/cząstka będąca przedmiotem zainteresowania, co jest powszechnie obserwowane w próbkach klinicznych. Poprzez recyrkulację dużych cząstek lub komórek skoncentrowanych na ścianie wewnętrznej (IW) z powrotem do probówki z próbką wejściową, cząstka lub komórka będąca przedmiotem zainteresowania koncentruje się w pierwotnym zbiorniku, podczas gdy płyny tła z małymi agregatami mucyny przechodzą przez zbiornik odpadów. Pomimo niejednorodnych właściwości płynnych próbek klinicznych, proponowana metoda pozwala na konsekwentne odzyskiwanie ponad 95% neutrofili z próbek wydzielanych z dróg oddechowych, które są rozcieńczane 1000-krotnie czystym roztworem soli fizjologicznej (~1 ml). Natomiast metoda lizy charakteryzuje się szerokim zakresem wskaźników odzysku PMN w zależności od stanu próbki. Proponowany protokół wychwytuje leukocyty w sposób bezznacznikowy, bez zakłóceń fizycznych lub chemicznych, co daje możliwość pobierania delikatnych komórek z klinicznie trudnych danych biometrycznych za pomocą minimalnie inwazyjnych procedur.

<table><tbody><tr><td>Prekursor PDMS</td><td>Dow corning</td><td>184 SIL ELAST KIT 3,9KG</td><td>Stosunek 10:1 bazy i utwardzacza</td></tr><tr><td>Piec konwekcyjny grawitacyjny</td><td>VWR</td><td>VWR 414005-128</td><td>Prekursor PDMS do utwardzania w 90 stopniach.</td></tr><tr><td>Szalka Petriego 100 mm</td><td>VWR</td><td>89000-324</td><td>Wykonanie PDMS Warstwa nośna</td></tr><tr><td>Dziurkacz Harris Uni-core</td><td>Sigma-aldrich</td><td>WHAWB100076</td><td>średnicy 2 mm lub innej w zależności od rozmiaru rurki</td></tr><tr><td>Maszyna plazmowa</td><td>Femto Science</td><td>Cute</td><td>Surface obróbka plazmowa dla urządzenia PDMS do dolnej podstawy.</td></tr><tr><td>Prowadnica szklana 2" x 3"</td><td>TED PELLA, INC.</td><td>2195</td><td>Do obsługi urządzenia PDMS</td></tr><tr><td>Rurka silikonowa utwardzana platyną Masterflex ze szpulą, L/S 14</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-96410-14</td><td>Rurka do pompy mikroprzepływowej i perysplowej</td></tr><tr><td>Złącze Luer 1/16 cala, męskie</td><td>Aparat Harvard</td><td>PC2 72-1443</td><td>Złącze do prowadnicy płynu</td></tr><tr><td>50 ml rurka Falcon</td><td>Corning</td><td>21008-940</td><td>pobieranie i przygotowanie próbek</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami, 1X bez wapnia i magnezu</td><td>Corning</td><td>45000-446&nbsp;</td><td>Roztwór buforowy do rozcieńczenia próbki</td></tr><tr><td>Halyard Zamknięty cewnik ssący, łokieć, 14F/ kanał 4,67mm</td><td>HALYARD HEALTH</td><td>22113</td><td>Cewnik ssący do seceacji tchawicy</td></tr><tr><td>0,9% Sterylny sól fizjologiczna normalna, 10 ml ampułkostrzykawka</td><td>BD PosiFlush</td><td>NHRIC: 8290-306547</td><td>Do pobierania próbek tchawicy od pacjentów</td></tr><tr><td>SecurTainer&trade; III Pojemniki na próbki, 20 ml</td><td>Simport</td><td>1176R36</td><td>Sterylny pojemnik na plwocinę (wydzielinę z dróg oddechowych)</td></tr><tr><td>Strzykawka z końcówką Luer-Lok, 10 ml</td><td>BD</td><td>BD309604</td><td>Aby pipetować homogenizację próbki śluzu i dotrzeć do dna probówki z próbką</td></tr><tr><td>BD&nbsp; igła do napełniania, z BD Luer-Lok&nbsp; Końcówka</td><td>BD</td><td></td><td>Do pipetowania homogenizować próbkę śluzu i dotrzeć do dna probówki z próbką</td></tr><tr><td>40&mikro; M Nylonowe sitko komórkowe&nbsp;</td><td>Falcon</td><td>21008-949</td><td>Do usuwania dużych kawałków lub skrzepów krwi, które mogą blokować otwór dostępowy do mikrofluidyki lub kanał.</td></tr><tr><td>Pompa perystaltyczna (napęd cyfrowy Masterflex L/S)</td><td>Cole-Parmer</td><td>HV-07522-30</td><td>Działanie mikrofluidyki</td></tr><tr><td>Cytometr przepływowy BD LSR II</td><td>Cytometr przepływowy BD</td><td>Bioscience</td> LSR II <td>Kwantyfikacja współczynnika odzysku komórek</td></tr><tr><td>Mysie przeciwciało monoklonalne anty-ludzkie CD66b sprzężone z izotiocyjanianem fluoresceiny (FITC)</td><td>BD Bioscience</td><td>561927</td><td>Barwienie immunologiczne neutrofili do analizy cytometrem przepływowym</td></tr><tr><td>Mysie przeciwciało monoklonalne anty-ludzkie CD45 sprzężone z allofikocyjaniną (APC)</td><td>BD Bioscience</td><td>561864</td><td>Barwienie immunologiczne neutrofili do analizy cytometrem przepływowym</td></tr><tr><td>Czytnik płytek</td><td>Thermo Fisher scientific</td><td>Varioskan</td><td>Czytnik płytek do testu elastazy neutrofilowej, ex485/em525</td></tr><tr><td>Zestaw do oznaczania elastazy neutrofilowej</td><td>Cayman Chemical</td><td>600610</td><td>Ocena funkcjonalności neutrofili</td></tr><tr><td>Mikrosfery fluoresbrite YG 10,0 i mikro; m</td><td>PolyScience, Inc.</td><td>18140-2</td><td>Cząstki fluorescencyjne do wyrażania trajektorii białych krwinek w mikrofluidyce</td></tr></tbody></table>

bezznacznikowe wzbogacanie neutrofili z wydzielania przez pacjenta z dróg oddechowych przy użyciu mikrofluidyki inercyjnej w pętli zamkniętej

Label-free Neutrophil Enrichment from Patient-derived Airway Secretion Using Closed-loop Inertial Microfluidics

Wydzieliny dróg oddechowych zawierają dużą liczbę komórek związanych z odpornością, np. neutrofile, makrofagi i limfocyty, które mogą być wykorzystane jako główne źródło do oceny różnych chorób płuc, zarówno do celów badawczych, jak i klinicznych. Jednak ze względu na niejednorodny i lepki charakter śluzu pacjenta, obecnie nie ma niezawodnej metody dysocjacji, która nie uszkadza komórek odpornościowych gospodarza w wydzielinie dróg oddechowych pacjenta. W tym badaniu wprowadzamy metodę przygotowania próbki, która wykorzystuje mikrofluidykę inercyjną do oceny immunologicznej pacjenta. Niezależnie od niejednorodnych właściwości płynnych próbek klinicznych, proponowana metoda pozwala odzyskać ponad 95% neutrofili z próbek wydzielanych przez drogi oddechowe, które są rozcieńczane 1000-krotnie mililitrami czystej soli fizjologicznej. Poprzez recyrkulację skoncentrowanego strumienia wyjściowego do początkowego zbiornika próbki zapewnia się wysokie stężenie, odzysk i czystość komórek odpornościowych; Recyrkulacja jest uważana za kompromis w stosunku do jednobiegowej operacji mikrofluidycznej opartej na strzykawce. Działanie mikrofluidyki spiralnej w pętli zamkniętej dostarcza leukocytów bez zakłóceń fizycznych lub chemicznych, jak wykazano w indukowanym przez 12-mirystynian 13-octanu forbolu (PMA) uwalnianie elastazy posortowanych neutrofili.

Uzyskano przejrzyste zawiesiny komórek odpornościowych zarówno przy zastosowaniu mukolizy z użyciem DTT, jak i dysocjacji mikrofluidycznej (Rysunek 3A). Metoda dysocjacji mikrofluidycznej pozwoliła na odzyskanie średnio 4.40 x 105 PMN (od 2.1 x 104 do 5.60 x 105 PMN, n = 6) z próbek wydzieliny z dróg oddechowych rozcieńczonych 1000-krotnie (całkowita objętość 50 mL) w 1 mL czystej zawiesiny. W porównaniu z początkowym rozcieńc...

W tym badaniu demonstrujemy metodę separacji neutrofili bez znaczników z klinicznych wydzielin dróg oddechowych przy użyciu zamkniętej pętli spiralnej inercyjnej mikrofluidyki. Proponowana metoda rozszerzyłaby kliniczne testy in vitro dla różnych chorób układu oddechowego.

Bezznacznikowe wzbogacanie neutrofili z wydzielania przez pacjenta z dróg oddechowych przy użyciu mikrofluidyki inercyjnej w pętli zamkniętej

Airway secretions contain a large number of immune-related cells, e.g., neutrophils, macrophages, and lymphocytes, which can be used as a major resource ...

Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w badaniach nad chorobami płuc, takimi jak zapalenie płuc, astma, mukowiscydoza i przewlekła obturacyjna choroba płuc. Główną zaletą tej techniki jest wyizolowanie i wzbogacenie neutrofili pacjenta z wydzieliny z dróg oddechowych pacjenta bez pionowych zaburzeń chemicznych. Procedurę zademonstruje Kyungyong, doktorant z mojego laboratorium.Na początek utrzymuj stosunek 10 do jednego i wymieszaj prekursor PDMS z bazą i utwardzaczem. Następnie dodaj 30 gramów mieszanki PDMS na aluminiową formę do mikromaszyny. Następnie dodaj kolejne 20 gramów mieszaniny PDMS na 100-milimetrową szalkę Petriego.W celu odgazowania umieścić formę i szalkę Petriego w eksykatorze próżniowym. Po odgazowaniu zwolnij próżnię i umieść formę oraz szalkę Petriego w piekarniku nagrzanym do 90 stopni Celsjusza na godzinę. Po godzinie wyjmij foremkę i szalkę Petriego z piekarnika i pozwól im ostygnąć w temperaturze pokojowej przez 10 minut.Następnie za pomocą noża wytnij kontur i przebij otwory dostępu do płynu dwumilimetrowym dziurkaczem do biopsji na urządzeniu. Po wybiciu otworów zabezpiecz taśmę i przyklej ją do strony kanału urządzenia oraz do grubej folii

label-free-neutrophil-enrichment-from-patient-derived-airway

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

W tym filmie opisujemy procedurę izolowania neutrofili o niskiej gęstości (LDN) z płynu z płukania otrzewnowej u pooperacyjnego pacjenta. Uzyskane w ten sposób LDN mogą być wykorzystane w dalszych eksperymentach w celu zrozumienia ich roli we wzroście i progresji guza.

Izolacja neutrofili o niskiej gęstości otrzewnej: technika uzyskiwania neutrofili o niskiej gęstości z płynu do płukania otrzewnej przy użyciu magnetycznego sortowania komórek aktywowanych

Ten film pokazuje oddzielanie neutrofili od wydzielin tchawicy za pomocą urządzenia mikroprzepływowego ze spiralnymi kanałami. Urządzenie osiąga wydajną separację w zależności od wielkości komórki dzięki wykorzystaniu różnych grubości i kanałów w kształcie trapezu. Wzajemne oddziaływanie sił powoduje, że duże neutrofile gromadzą się w pobliżu ściany wewnętrznej, podczas gdy erytrocyty i agregaty mucyny pozostają w pobliżu ściany zewnętrznej, zapewniając skuteczną separację neutrofili.

Bezznacznikowa separacja neutrofili od wydzieliny tchawicy za pomocą spiralnego kanału mikroprzepływowego

Ten film demonstruje test chemotaksji neutrofili przy użyciu metody all-on-chip. Metoda ta pozwala na bezpośrednią izolację neutrofili z krwi pełnej poprzez immunomagnetyczną selekcję ujemną, a następnie test chemotaksji na chipie mikroprzepływowym.

Mikroprzepływowa metoda oparta na chipie do szybkiej analizy chemotaksji neutrofili przy użyciu krwi pełnej

Ten protokół szczegółowo opisuje test przeznaczony do pomiaru chemotaksji ludzkich neutrofili z jednej kropli krwi pełnej z solidną powtarzalnością. Takie podejście pozwala obejść potrzebę separacji neutrofili i wymaga tylko kilku minut czasu na przygotowanie testu. Chip mikroprzepływowy umożliwia wielokrotny pomiar chemotaksji neutrofili w czasie u niemowląt lub małych ssaków, gdzie objętość próbki jest ograniczona.

Platforma mikroprzepływowa do pomiaru chemotaksji neutrofili z nieprzetworzonej krwi pełnej

Stan zdrowia płuc jest odzwierciedlony przez typ i liczbę komórek odpornościowych, które są obecne w oskrzelikach płuc. Opisujemy technikę płukania oskrzelowo-pęcherzykowego, która umożliwia izolację i badanie nieprzylegających komórek i rozpuszczalnych czynników z dolnych dróg oddechowych myszy.

Płukanie oskrzelowo-pęcherzykowe płuc myszy w celu analizy nacieku komórek zapalnych

Ten artykuł przedstawia szczegółową metodę przeprowadzania szybkiego testu chemotaksji neutrofili poprzez integrację wbudowanej izolacji neutrofili z krwi pełnej oraz testu chemotaksji na pojedynczym chipie mikroprzepływowym.

Kompleksowa metoda do szybkiej analizy chemotaksji neutrofili bezpośrednio z kropli krwi

Ten protokół opisuje nieinwazyjną technikę pobierania próbek nienaruszonego płynu z błony śluzowej z górnych dróg oddechowych. Może być stosowany do ilościowego oznaczania in vivo poziomów mediatorów białkowych, takich jak cytokiny i chemokiny, u osób w każdym wieku.

Nieinwazyjne pobieranie próbek płynu wyściełającego błonę śluzową w celu ilościowego określenia in vivo poziomów mediatorów immunologicznych w górnych drogach oddechowych

Ten manuskrypt opisuje użycie technik wchłaniania przez nos i oskrzela, w szczególności przy użyciu syntetycznych matryc absorpcyjnych (SAM) do pobierania próbek płynu wyściełającego błonę śluzową (MLF) górnych i dolnych dróg oddechowych. Metody te zapewniają lepszą standaryzację i tolerancję niż istniejące techniki pobierania próbek z układu oddechowego.

Absorpcja płynów z nosa i oskrzeli: precyzyjne pobieranie próbek z błony śluzowej układu oddechowego człowieka i laboratoryjne przetwarzanie próbek

Ten artykuł zawiera szczegółową metodologię metod dysocjacji tkanek i frakcjonowania komórkowego, umożliwiając wzbogacenie żywotnych komórek nabłonkowych z bliższych i dalszych obszarów ludzkiego płuca. W tym przypadku podejścia te są stosowane do analizy funkcjonalnej komórek progenitorowych nabłonka płuc poprzez wykorzystanie modeli hodowli organoidów 3D.

Izolacja i wzbogacanie ludzkich komórek progenitorowych nabłonka płuc do hodowli organoidów

W tym protokole, do badania interakcji między komórkami leukocytów w chorobie zapalnej stosuje się biomimetyczne badanie mikropłynów, które może odtworzyć fizjologicznie istotne środowisko mikrokrążenia i odtworzyć całą kaskadę adhezji/migracji leukocytów.

System mikrofizjologiczny do badania interakcji między leukocytami a komórkami śródbłonka podczas stanu zapalnego

Poznaj metodę bezznacznikowego wzbogacania neutrofili z wydzielin dróg oddechowych pacjenta przy użyciu spiralnej mikrofluidyki inercyjnej. Technika ta umożliwia izolację komórek bez chemicznych zaburzeń.

Bezznacznikowe wzbogacanie neutrofili z wydzielania przez pacjenta z dróg oddechowych przy użyciu mikrofluidyki inercyjnej w pętli zamkniętej (Wideo) | JoVE Journal

Bezznacznikowe wzbogacanie neutrofili z wydzielania przez pacjenta z dróg oddechowych przy użyciu mikrofluidyki inercyjnej w pętli zamkniętej

Przeglądaj więcej filmów