Name: Analiza sekwencji genów immunoglobulin w przewlekłej białaczce limfocytowej: od materiału pacjenta do interpretacji sekwencji (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 2 s
Description: Poznaj protokół analizy sekwencji genów immunoglobulin w przewlekłej białaczce limfocytowej. Metoda PCR i analiza sekwencji IMG TV Quest umożliwiają dokładną prognozę i stratyfikację ryzyka u pacjentów z CLL.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy obecnym i byłym członkom naszych grup badawczych, grupie IgCLL i ERIC, za ich zaangażowanie i entuzjazm w studiowaniu immunogenetyki w CLL. Chcielibyśmy również podziękować za pełną zaufania współpracę wszystkim członkom inicjatywy IMGT/CLL-DB, a w szczególności profesor Marie-Paule Lefranc i dr Veronique Giudicelli, Laboratoire d'Immunogenetique Moleculaire, LIGM, Universite Montpellier II, Montpellier, Francja oraz IMGT, międzynarodowemu systemowi informatycznemu ImMunoGeneTics, za ich ogromne wsparcie i pomoc w analizie sekwencji genów IG. Prace te były częściowo wspierane przez granty z TRANSCAN-179 NOVEL JTC 2016; Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro AIRC (Grant Badacza #20246 i Specjalny Program Molekularnej Onkologii Klinicznej-5 per mille #9965), Mediolan, Włochy; Progetti di Rilevante Interesse Nazionale (PRIN) #2015ZMRFEA, MIUR, Rzym, Włochy; Szwedzkie Towarzystwo Onkologiczne, Szwedzka Rada ds. Badań Naukowych, Fundacja Knuta i Alice Wallenbergów, Karolinska Institutet, Uniwersytet w Uppsali, Szpital Uniwersytecki w Uppsali oraz Fundacja Badań nad Rakiem Lion's w Uppsali; Program ODYSSEUS, realizowany w ramach "Działania na rzecz strategicznego rozwoju sektora badawczego i technologicznego", finansowany ze środków Programu Operacyjnego "Konkurencyjność, przedsiębiorczość i innowacje" (NSRO 2014-2020) oraz współfinansowany przez Grecję i Unię Europejską (Europejski Fundusz Rozwoju Regionalnego).

Protokół badawczy został zatwierdzony przez Komitet Etyki Instytutu Naukowego San Raffaele, Mediolan, Włochy.
1. Wybór materiału
<ol>
	<li>Wybór materiału wyjściowego 
	UWAGA: W większości przypadków PBL liczba komórek nowotworowych jest wysoka w momencie rozpoznania (>80-90%). W związku z tym sortowanie lub wzbogacanie komórek białaczkowych zwykle nie jest konieczne.
	<ol>
		<li>W przypadku stosowania krwi obwodowej (PB), najczęstszego materiału z wyboru do analizy sekwencji genu IG, należy użyć objętości krwi między 10-20 ml.</li>
		<li>Alternatywnie, w przypadkach z niską liczbą komórek CLL, należy zastosować sortowanie komórek próbek PB lub materiału z innych tkanek, takich jak szpik kostny (BM) lub węzły chłonne (LN).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Czas pobierania próbek
	<ol>
		<li>Czas pobierania próbek nie jest kluczowy, biorąc pod uwagę, że status IG SHM jest stabilny w godzinach nadliczbowych; to powiedziawszy, należy unikać pobierania próbek w określonych okresach, takich jak bezpośrednio po lub w trakcie terapii, ponieważ mała liczba komórek CLL może skomplikować analizę i prowadzić do niewiarygodnych wyników.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Odbiór i magazynowanie materiałów 
	UWAGA: Zbieranie i przechowywanie materiału wyjściowego zależy w dużym stopniu od wyboru materiału.
	<ol>
		<li>W przypadku próbek PB lub BM należy użyć probówek do pobierania EDTA lub CPT (cytrynian-tris-pirydozofosforan), aby zapobiec zahamowaniu procesu amplifikacji PCR; alternatywnie należy użyć probówek z heparyną.</li>
		<li>W przypadku próbek LN opcjami pobierania są zawiesiny komórek, biopsje ze świeżo zamrożonej tkanki lub, w rzadkich przypadkach, tkanki zatopione w parafinie (FFPE) utrwalone w formalinie.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Separacja gradientu gęstości
UWAGA: Jeśli PB lub BM jest materiałem wyjściowym do wyboru, co jest najczęstszym scenariuszem, zalecana jest izolacja komórek jednojądrzastych za pomocą separacji gradientu gęstości.
<ol>
	<li>Dodać 200 μl EDTA (0,5 M EDTA/ pH 8,0) do 50 ml sterylnej probówki zbiorczej. Dodaj 20 ml PB i 15 ml RPMI. Wymieszać pipetując (wystarczy 2-3 razy).</li>
	<li>Dodaj 15 ml pożywki o gradiencie gęstości do nowej probówki zbiorczej o pojemności 50 ml. 
	UWAGA: W przypadku, gdy objętość PB jest mniejsza niż 20 ml, objętości RPMI (poprzedni krok) i gradient gęstości należy odpowiednio zmodyfikować.</li>
	<li>Powoli nakładaj roztwór z kroku 2.1, aby nie zakłócał gradientu. Wirować przy 800 x g przez 20 minut przy wyłączonym hamulcu wirówki.</li>
	<li>Zebrać jednojądrzasty pierścień komórkowy, który utworzył się między górną warstwą osocza/płytek krwi a warstwą pożywki gradientu gęstości, za pomocą sterylnej pipety Pasteura, a następnie przenieść do sterylnej probówki zbiorczej o pojemności 15 ml.</li>
	<li>Dodaj RPMI do końcowej objętości 12 ml i wymieszaj. Wirować przy 750 x g przez 8 minut. Odrzucić supernatant.</li>
	<li>Ponownie zawiesić osad komórkowy za pomocą 10 ml RPMI i powtórzyć krok 2.5.</li>
	<li>Rozpuść osad komórkowy w 1 ml PBS (DPBS, bez wapnia, bez magnezu). Przeprowadzić zliczanie komórek za pomocą płytki Neubauera, mieszając 20 μl próbki i 80 μl roztworu Türka w stosunku 1:10.</li>
	<li>Jeżeli dalsze przetwarzanie próbki nie jest zaplanowane na ten sam dzień, należy odwirować próbkę o stężeniu 750 x g przez 8 minut. Odrzucić supernatant i przechowywać osad komórkowy w temperaturze -80o C.</li>
</ol>
3. Ekstrakcja kwasów nukleinowych
<ol>
	<li>Zdecyduj się na substrat do analizy statusu SHM genów IG. Genomowe DNA (gDNA) jest najpopularniejszym wyborem, ponieważ nie ma potrzeby wykonywania etapu odwrotnej transkrypcji; alternatywnie, zastosowanie RNA/komplementarnego DNA (cDNA) zapewnia, że przynajmniej na poziomie transkrypcji produktywna, funkcjonalna klonotypowa rearanżacja IG jest "preferowanym" celem.</li>
	<li>Użyj jednego z wielu dostępnych na rynku zestawów odpowiednich do ekstrakcji gDNA lub całkowitego RNA i syntezy cDNA (patrz Tabela materiałów).</li>
	<li>Oceń integralność DNA lub RNA za pomocą czułych systemów kwantyfikacji kwasów nukleinowych. W przypadku stosowania materiału FFPE do analizy, należy ocenić jakość i ilość wyekstrahowanego gDNA/cDNA za pomocą amplifikacji PCR znanego genu porządkowego, np. receptora kwasu retinowego alfa (RARa), beta-aktyny itp.</li>
</ol>
4. Amplifikacja i sekwencjonowanie rearanżacji genów IGHV-IGHD-IGHJ
<ol>
	<li>Wybór startera IGH PCR
	<ol>
		<li>Najlepiej wykonać multipleksową reakcję PCR ze starterami 5' specyficznymi dla podgrupy IGHV i starterami 3' specyficznymi dla genu IGHJ25,26. Jeśli wyniki nie są optymalne, przygotuj oddzielne mieszaniny PCR, używając pojedynczych starterów specyficznych dla podgrupy IGHV.</li>
		<li>Użyć starterów 5', które wyżarzają się do regionu lidera znajdującego się bezpośrednio przed przegrupowaniem IG lub w regionie kodującym (np. Framework 1, FR1) genu IGHV.
		<ol>
			<li>Stosować startery liderów, które pozwalają na amplifikację całej przegrupowanej sekwencji genu IGHV-IGHD-IGHJ, co z kolei umożliwi dokładne oszacowanie poziomów SHM. W związku z tym startery lidera IGHV są zalecane przez ERIC w ich zaktualizowanych wytycznych dotyczących analizy sekwencji genów IG27.</li>
			<li>W przypadkach, gdy startery liderowe nie wzmacniają klonotypowego przegrupowania IG, należy użyć starterów IGHV FR1. Jednak startery szkieletowe nie amplifikują całej rearanżacji klonotypowego genu IG, co może prowadzić do niedokładnego określenia poziomu SHM. W przypadku tego scenariusza należy wyraźnie zaznaczyć w raporcie klinicznym, że użycie starterów IGHV FR1 może zawyżać rzeczywistą tożsamość procentową z najbliższym genem linii zarodkowej.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Dla końca 3' użyj starterów konsensusu ukierunkowanych na geny IGHJ, multipleksowych zestawów starterów specyficznych dla genu IGHJ lub starterów specyficznych dla izotypu, w zależności od substratu. Sekwencje podkładów są przedstawione w Tabeli 1, podczas gdy Rysunek 1 przedstawia różne miejsca wyżarzania podkładu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Amplifikacja PCR rearanżacji genu IGHV-IGHD-IGHJ
	<ol>
		<li>Przygotuj mieszankę starterów, używając równomolowych ilości każdego startera (starterów) podgrupy, aby zapewnić bezstronne amplifikację.
		<ol>
			<li>Na przykład, podczas stosowania starterów lidera, dwa różne startery są używane do wzmacniania przegrupowań należących do podgrupy IGHV1. Dlatego użyj ilości tych 2 starterów (IGHV1L i IGHV1bL) o połowę mniejszej niż IGHV4L, który jest jedynym starterem do rearanżacji podgrup IGHV4.</li>
			<li>Odwrotne podejście należy zastosować w przypadku starterów IGHJ1-2 i IGHJ4-5. Ponieważ startery te celują w dwie różne podgrupy genów IGHJ, ich ilość jest dwukrotnie większa w porównaniu ze starterami IGHJ3 i IGHJ6.</li>
			<li>Skorzystaj z tabeli 1, aby określić dokładne ilości podkładu podczas przygotowywania odpowiednich mieszanek podkładów.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Wymieszać odczynniki PCR zgodnie z tabelą 2. Po połączeniu wszystkich odczynników PCR w probówce do PCR dodać 0,5 μl polimerazy Taq i 100 ng gDNA lub 2 μl cDNA (cDNA należy przygotować przy użyciu 1 μg RNA). 
		UWAGA: Enzym Taq o aktywności korektorskiej nie jest niezbędny, ponieważ poziom błędu amplifikacji jest bardzo niski i dlatego nie wpływa na poziom SHM.</li>
		<li>Uruchom protokół thermal PCR wyszczególniony w Tabeli 3.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ocena klonalności 
	UWAGA: Kolejnym krytycznym krokiem jest ocena wzorca klonalności produktu PCR. Podczas oceny klonalności u pacjentów z PBL, najczęstszym objawem jest pojedynczy monoklonalny pik/pasmo.
	<ol>
		<li>Do oceny klonalności należy używać metod o wysokiej czułości, takich jak analiza fragmentów lub heterodupleksów28,29.</li>
		<li>Analiza fragmentów
		<ol>
			<li>Wykonać multipleksowe PCR przy użyciu starterów PCR specyficznych dla lidera IGHV lub podgrupy FR1 znakowanych 5'; pozwoli to uzyskać produkty PCR, które można oddzielić za pomocą elektroforezy kapilarnej, umożliwiając w ten sposób ocenę klonalności produktów IGH PCR w oparciu o ich długość regionu 3 (CDR3) określającą komplementarność IGHV.</li>
			<li>Stosować startery, odczynniki i warunki termiczne identyczne z wymienionymi wcześniej (patrz tabele 1-3). Niestandardowe podkłady oznaczone 5' to fluorescencyjnie znakowane oligonukleotydy z wyborem barwników na końcu 5'. Przykładami barwników reporterowych są 6-FAM, HEX, NED lub TET. W związku z tym wymagane są 2 oddzielne reakcje w oparciu o użycie 3 różnych barwników na reakcję.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Oceń rozmiar produktów PCR na sześcioprocentowym (6%) żelu poliakrylowym (ten procent daje optymalną rozdzielczość), używając 1x TBE jako bufora bieżącego. Praca pod napięciem 80 V przez 45 min. 
		UWAGA: Zaleca się, aby produkty PCR mogły migrować po żelu przez wystarczająco długi czas, aby próbki monoklonalne mogły zostać oddzielone od tła poliklonalnego, a marker wielkości DNA mógł się odpowiednio oddzielić. Czynniki takie jak rozmiar i grubość żelu mogą wpływać na migrację, więc żadne pojedyncze ustawienie (napięcie i czas) nie może zagwarantować optymalnego wyniku To powiedziawszy, ustawienie napięcia na 80 V na 45 minut jest dobrym punktem wyjścia, ponieważ minimalizuje ryzyko zbyt szybkiej migracji próbki i "sciekania" z żelu.</li>
		<li>Sprawdź, czy produkty PCR zawierają około 500 par zasad w przypadku stosowania starterów liderowych IGHV i 350 par zasad w przypadku stosowania mieszanek starterów IGHV FR1. 
		UWAGA: W rzadkich przypadkach stwierdzono, że przypadki PBL zawierają podwójne produkty monoklonalne, a w jeszcze rzadszych przypadkach przypadki mogą wykazywać wzór oligoklonalny. Czynnik interkalacyjny, taki jak bromek etydyny (EtBr) lub mniej niebezpieczne i bardziej wrażliwe dostępne na rynku barwienia DNA, można zastosować do wizualizacji DNA na żelach akrylowych za pomocą wzbudzenia UV lub światła niebieskiego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Oczyszczanie produktu metodą PCR 
	UWAGA: Produkty PCR są oczyszczane w celu usunięcia tła poliklonalnego pochodzącego z normalnych komórek B w próbce CLL, a także dimerów starterów, które mogą prowadzić do nieoptymalnego sekwencjonowania. Użyj dowolnej metody, która usuwa niewbudowane dNTP i startery do czyszczenia PCR, takiej jak zabieg enzymatyczny, np. Sap (fosfataza alkaliczna krewetek)/Exo (egzonukleaza I) lub oczyszczanie kolumnowe.
	<ol>
		<li>Załaduj całkowitą objętość produktu PCR na 3% niskotopliwy żel agarozowy.</li>
		<li>Pozwól produktom PCR spływać po żelu, aż oddzielą się od tła.</li>
		<li>Wyciąć ostre, wydatne prążki PCR, oczyścić i wymyć. W przypadku wykrycia dwóch rearanżacji, oba prążki powinny zostać wycięte i zsekwencjonowane oddzielnie.</li>
		<li>Aby przeprowadzić oczyszczanie Sap/Exo, postępuj zgodnie z instrukcjami producenta dotyczącymi konkretnych objętości, których należy użyć; jednak typowa reakcja może zawierać 1 μL Sap, 0,5 μL Exo i 2 μL 5x bufor inkubacyjny na 5-10 μL reakcji PCR. Wymieszać poprzez delikatne wirowanie każdej próbki i inkubować na bloku PCR w temperaturze 37 °C przez 30 minut. Dezaktywować enzymy przez ogrzewanie do temperatury 85 °C przez 15 minut.</li>
		<li>Załaduj niewielką ilość produktów PCR na 3% żel agarozowy, aby ocenić czystość produktu.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Sekwencjonowanie Sangera
UWAGA: Istnieje kilka strategii sekwencjonowania, jednak niezależnie od dokładnego podejścia, bezpośrednie sekwencjonowanie obu pasm jest obowiązkowe, aby zapewnić wiarygodny wynik.
<ol>
	<li>Ogólne protokoły sekwencjonowania
	<ol>
		<li>Jeśli amplifikacja została przeprowadzona przy użyciu pojedynczych starterów, należy przystąpić do sekwencjonowania przy użyciu odpowiednich starterów IGHV i IGHJ lub starterów specyficznych dla stałego regionu. Podejście to można również przyjąć, jeśli użyto multipleksowanych starterów znakowanych fluorescencyjnie, a produkt PCR oceniono za pomocą analizy fragmentów (startery sekwencjonowania nie powinny być znakowane).</li>
		<li>Jeśli użyto starterów multipleksowanych, a klonalność oceniono na żelu, wówczas w pierwszym etapie sekwencjonowania należy użyć startera znajdującego się poniżej, np. startera IGHJ konsensusu o sekwencji 5'-GTGACCAGGGTNCCTTGGCCCCAG-3'. Alternatywnie można użyć startera CH, jeśli jako substrat użyto cDNA. Następnie użyj specyficznych dla podgrupy liderów IGHV lub starterów FR1 do drugiego etapu sekwencjonowania.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przykładowy protokół sekwencjonowania 
	UWAGA: Istnieje kilka protokołów sekwencjonowania, a przykładowy protokół jest szczegółowo opisany poniżej.
	<ol>
		<li>Rozcieńczyć 33 ng produktu PCR w całkowitej objętości 11,5 μl, używając np. sterylnej wody. Denaturować produkt PCR przez ogrzewanie do temperatury 95 °C przez 5 minut. Natychmiast umieść na lodzie na 10 minut, aby zapobiec tworzeniu się struktur wtórnych.</li>
		<li>Dodać 8 μl mieszanki wzorcowej do każdej probówki wraz z 0,5 μl (odpowiadającym 5 pmol) startera.</li>
		<li>Jako kontrolę należy przygotować probówkę zawierającą 8 μl mieszanki wzorcowej, 0,5 μl matrycy kontrolnej pUC18, 2 μl (-)47 startera sekwencjonującego i 9,5 μl sterylnej wody. Ostateczna całkowita objętość w każdej probówce powinna wynosić 20 μl.</li>
		<li>Dla reakcji sekwencjonowania należy stosować warunki cykli termicznych, jak wyszczególniono w tabeli 4.</li>
		<li>Przygotować roztwór zatrzymujący, mieszając 2 μl octanu sodu 3M (pH 5,2), 2 μl EDTA 100 Mm (pH 8,0) i 1 μl glikogenu (stężenie 20 mg/ml), a następnie dodać 5 μl do każdej próbki. Przenieść produkt do nowej probówki do mikrowirówki.</li>
		<li>Dodaj 60 μl 100% etanolu (-20 °C) i delikatnie wymieszaj. Wirować z prędkością 14 000 obr./min przez 15 minut (4 °C). Odrzucić supernatant.</li>
		<li>Dodaj 100 μl 70% etanolu (-20 °C) i delikatnie wymieszaj. Wirować z prędkością 14 000 obr./min przez 10 minut (4 °C). Odrzucić supernatant. Powtórz raz.</li>
		<li>Suszyć granulki przez 90 minut w temperaturze pokojowej. Dodać 40 μl roztworu dodecylosiarczanu sodu (SDS) do każdej próbki.</li>
		<li>Przenieść próbkę na płytkę sekwencjonującą, przykryć nasadkami paskowymi lub uszczelkami taśmowymi, załadować do maszyny i wykonać sekwencjonowanie Sangera. Płytka sekwencjonująca jest zwykle 96-dołkową płytką PCR z dnem w kształcie litery V, kompatybilną z sekwencerem. Tabliczki mogą być oznaczone kodami kreskowymi w zależności od tego, czy sekwencjonowanie ma być wykonane we własnym zakresie, w firmie komercyjnej czy w akademickim centrum/platformie sekwencjonowania.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po sekwencjonowaniu "zszyj ze sobą" 2 odczyty wygenerowane z poszczególnych etapów sekwencjonowania, aby utworzyć kompletną rearanżację genu IGHV, tj. sekwencję konsensusu.</li>
</ol>
6. Analiza sekwencji
UWAGA: Poniższe sekcje skupiają się na wynikach uzyskanych z narzędzia IMGT/V-QUEST30 podczas analizy przearanżowanych sekwencji IG oraz IMGT/JunctionAnalysis31, które są szczególnie istotne dla raportów klinicznych i badań naukowych. IMGT/V-QUEST to narzędzie do wyrównywania, które porównuje sekwencje IG przesłane przez użytkownika z katalogiem referencyjnym IMGT sets30. Dane wyjściowe narzędzia zawierają kilka sekcji, w ramach których użytkownik może zdefiniować określone parametry.
<ol>
	<li>Należy określić gatunek, np. Homo sapiens (człowiek) oraz typ receptora lub locus (np. IGH, IGK lub IGL).</li>
	<li>Wklej sekwencje do analizy, w formacie FASTA i łącznie z nagłówkami, do obszaru tekstowego (w partiach do 50 sekwencji na przebieg). Alternatywnie dostępna jest opcja wprowadzenia ścieżki do pliku lokalnego zawierającego sekwencje FASA.</li>
	<li>Wybierz jedną z następujących 3 opcji wyświetlania wyników:
	<ol>
		<li>Widok szczegółowy: wybierz tę opcję, aby uzyskać wyniki dla każdej sekwencji z osobna.</li>
		<li>Widok syntezy: wybierz tę opcję, aby skompilować tabelę podsumowania uporządkowaną według nazwy genu i allelu IGHV lub według kolejności wprowadzania sekwencji. Ta opcja zapewnia również wyrównanie sekwencji, które w dowolnej przesłanej partii są przypisane do tego samego genu i allelu IGHV.</li>
		<li>Plik Excel: wybierz tę opcję, aby udostępnić wszystkie pliki wyjściowe jako arkusze kalkulacyjne połączone w jeden plik. Wszystkie opcje przeglądania mają duży wybór podstawowych i zaawansowanych parametrów do wyboru, jednak tylko czynniki najbardziej istotne dla analizy sekwencji IG CLL są omówione poniżej w sekcji "Reprezentatywne wyniki".</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. Narzędzie ARResT/AssignSubsets
<ol>
	<li>Aby zbadać stereotypowość BcR IG w PBL (dodatkowe szczegóły podane poniżej w sekcji 'Reprezentatywne wyniki'), prześlij sekwencje IGHV-IGHD-IGHJ FASTA do narzędzia ARResT/AssignSubsets tool32. Narzędzie raportuje przypisanie do głównych podzbiorów stereotypowych CLL. Narzędzie do przypisywania podzbiorów wraz ze szczegółowymi instrukcjami jest dostępne na stronie ARResT/AssignSubset website32, a także na stronie internetowej ERIC w zakładce usługi.</li>
</ol>

<ol><li>Swerdlow, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSwerdlow%2C+SH+%22WHO+classification+of+tumors+of+haematopoietic+and+lymphoid+tissues%22">WHO classification of tumors of haematopoietic and lymphoid tissues</a>. 2, IARC publications. (2017).</li>
<li>Baliakas, P., Mattsson, M., Stamatopoulos, K., Rosenquist, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prognostic+indices+in+chronic+lymphocytic+leukaemia%3A+where+do+we+stand+how+do+we+proceed%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Internal+Medicine%22%5BJournal%5D)">Prognostic indices in chronic lymphocytic leukaemia: where do we stand how do we proceed?</a> Journal of Internal Medicine. 279 (4), 347-357 (2016).</li>
<li>Sutton, L. A., Rosenquist, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+complex+interplay+between+cell-intrinsic+and+cell-extrinsic+factors+driving+the+evolution+of+chronic+lymphocytic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Cancer+Biology%22%5BJournal%5D)">The complex interplay between cell-intrinsic and cell-extrinsic factors driving the evolution of chronic lymphocytic leukemia.</a> Seminars in Cancer Biology. , (2015).</li>
<li>Mina, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+prognostic+models+in+CLL+to+personalize+approach+to+clinical+care%3A+Are+we+there+yet%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Reviews%22%5BJournal%5D)">Using prognostic models in CLL to personalize approach to clinical care: Are we there yet?</a> Blood Reviews. , (2017).</li>
<li>Sutton, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunoglobulin+genes+in+chronic+lymphocytic+leukemia%3A+Key+to+understanding+the+disease+and+improving+risk+stratification%5BTitle%5D)+AND+%22Haematologica%22%5BJournal%5D)">Immunoglobulin genes in chronic lymphocytic leukemia: Key to understanding the disease and improving risk stratification.</a> Haematologica. 102 (6), 968-971 (2017).</li>
<li>Damle, R. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ig+V+gene+mutation+status+and+CD38+expression+as+novel+prognostic+indicators+in+chronic+lymphocytic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Ig V gene mutation status and CD38 expression as novel prognostic indicators in chronic lymphocytic leukemia.</a> Blood. 94 (6), 1840-1847 (1999).</li>
<li>Hamblin, T. J., Davis, Z., Gardiner, A., Oscier, D. G., Stevenson, F. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unmutated+Ig+V%28H%29+genes+are+associated+with+a+more+aggressive+form+of+chronic+lymphocytic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Unmutated Ig V(H) genes are associated with a more aggressive form of chronic lymphocytic leukemia.</a> Blood. 94 (6), 1848-1854 (1999).</li>
<li>Burger, J. A., Chiorazzi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B+cell+receptor+signaling+in+chronic+lymphocytic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">B cell receptor signaling in chronic lymphocytic leukemia.</a> Trends in Immunology. 34 (12), 592-601 (2013).</li>
<li>Packham, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+outcome+of+B-cell+receptor+signaling+in+chronic+lymphocytic+leukemia%3A+proliferation+or+anergy%5BTitle%5D)+AND+%22Haematologica%22%5BJournal%5D)">The outcome of B-cell receptor signaling in chronic lymphocytic leukemia: proliferation or anergy.</a> Haematologica. 99 (7), 1138-1148 (2014).</li>
<li>Messmer, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+distinct+sets+of+stereotyped+antigen+receptors+indicate+a+role+for+antigen+in+promoting+chronic+lymphocytic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Multiple distinct sets of stereotyped antigen receptors indicate a role for antigen in promoting chronic lymphocytic leukemia.</a> The Journal of Experimental Medicine. 200 (4), 519-525 (2004).</li>
<li>Stamatopoulos, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Over+20%25+of+patients+with+chronic+lymphocytic+leukemia+carry+stereotyped+receptors%3A+Pathogenetic+implications+and+clinical+correlations%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Over 20% of patients with chronic lymphocytic leukemia carry stereotyped receptors: Pathogenetic implications and clinical correlations.</a> Blood. 109 (1), 259-270 (2007).</li>
<li>Agathangelidis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stereotyped+B-cell+receptors+in+one-third+of+chronic+lymphocytic+leukemia%3A+a+molecular+classification+with+implications+for+targeted+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Stereotyped B-cell receptors in one-third of chronic lymphocytic leukemia: a molecular classification with implications for targeted therapies.</a> Blood. 119 (19), 4467-4475 (2012).</li>
<li>Stamatopoulos, K., Agathangelidis, A., Rosenquist, R., Ghia, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen+receptor+stereotypy+in+chronic+lymphocytic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Antigen receptor stereotypy in chronic lymphocytic leukemia.</a> Leukemia. 31 (2), 282-291 (2017).</li>
<li>Baliakas, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+effect+of+stereotyped+B-cell+receptor+immunoglobulins+in+chronic+lymphocytic+leukaemia%3A+A+retrospective+multicentre+study%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet+Haematology%22%5BJournal%5D)">Clinical effect of stereotyped B-cell receptor immunoglobulins in chronic lymphocytic leukaemia: A retrospective multicentre study.</a> The Lancet Haematology. 1 (2), 74-84 (2014).</li>
<li>Gounari, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excessive+antigen+reactivity+may+underlie%2C+the+clinical+aggressiveness+of+chronic+lymphocytic+leukemia+stereotyped+subset+%238%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Excessive antigen reactivity may underlie, the clinical aggressiveness of chronic lymphocytic leukemia stereotyped subset #8.</a> Blood. 125 (23), 3580-3587 (2015).</li>
<li>Ntoufa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B+cell+anergy+modulated+by+TLR1%2F2+and+the+miR-17+approximately+92+cluster+underlies+the+indolent+clinical+course+of+chronic+lymphocytic+leukemia+stereotyped+subset+%234%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">B cell anergy modulated by TLR1/2 and the miR-17 approximately 92 cluster underlies the indolent clinical course of chronic lymphocytic leukemia stereotyped subset #4.</a> Journal of Immunology. 196 (10), 4410-4417 (2016).</li>
<li>Mansouri, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+loss+of+IkappaBepsilon+leads+to+NF-kappaB+deregulation+in+aggressive+chronic+lymphocytic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Functional loss of IkappaBepsilon leads to NF-kappaB deregulation in aggressive chronic lymphocytic leukemia.</a> The Journal of Experimental Medicine. 212 (6), 833-843 (2015).</li>
<li>Navrkalova, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATM+mutations+in+major+stereotyped+subsets+of+chronic+lymphocytic+leukemia%3A+enrichment+in+subset+%232+is+associated+with+markedly+short+telomeres%5BTitle%5D)+AND+%22Haematologica%22%5BJournal%5D)">ATM mutations in major stereotyped subsets of chronic lymphocytic leukemia: enrichment in subset #2 is associated with markedly short telomeres.</a> Haematologica. 101 (9), e369-e373 (2016).</li>
<li>Rossi, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+between+molecular+lesions+and+specific+B-cell+receptor+subsets+in+chronic+lymphocytic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Association between molecular lesions and specific B-cell receptor subsets in chronic lymphocytic leukemia.</a> Blood. 121 (24), 4902-4905 (2013).</li>
<li>Sutton, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+spectra+of+recurrent+gene+mutations+in+subsets+of+chronic+lymphocytic+leukemia+harboring+stereotyped+B-cell+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Haematologica%22%5BJournal%5D)">Different spectra of recurrent gene mutations in subsets of chronic lymphocytic leukemia harboring stereotyped B-cell receptors.</a> Haematologica. 101 (8), 959-967 (2016).</li>
<li>Fischer, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+remissions+after+FCR+chemoimmunotherapy+in+previously+untreated+patients+with+CLL%3A+Updated+results+of+the+CLL8+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Long-term remissions after FCR chemoimmunotherapy in previously untreated patients with CLL: Updated results of the CLL8 trial.</a> Blood. 127 (2), 208-215 (2016).</li>
<li>Rossi, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+prediction+of+durable+remission+after+first-line+fludarabine-cyclophosphamide-rituximab+in+chronic+lymphocytic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Molecular prediction of durable remission after first-line fludarabine-cyclophosphamide-rituximab in chronic lymphocytic leukemia.</a> Blood. 126 (16), 1921-1924 (2015).</li>
<li>Thompson, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fludarabine%2C+cyclophosphamide%2C+and+rituximab+treatment+achieves+long-term+disease-free+survival+in+IGHV-mutated+chronic+lymphocytic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Fludarabine, cyclophosphamide, and rituximab treatment achieves long-term disease-free survival in IGHV-mutated chronic lymphocytic leukemia.</a> Blood. 127 (3), 303-309 (2016).</li>
<li>Hallek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+for+diagnosis%2C+indications+for+treatment%2C+response+assessment+and+supportive+management+of+chronic+lymphocytic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Guidelines for diagnosis, indications for treatment, response assessment and supportive management of chronic lymphocytic leukemia.</a> Blood. , (2018).</li>
<li>van Dongen, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+standardization+of+PCR+primers+and+protocols+for+detection+of+clonal+immunoglobulin+and+T-cell+receptor+gene+recombinations+in+suspect+lymphoproliferations%3A+report+of+the+BIOMED-2+Concerted+Action+BMH4-CT98-3936%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Design and standardization of PCR primers and protocols for detection of clonal immunoglobulin and T-cell receptor gene recombinations in suspect lymphoproliferations: report of the BIOMED-2 Concerted Action BMH4-CT98-3936.</a> Leukemia. 17 (12), 2257-2317 (2003).</li>
<li>Campbell, M. J., Zelenetz, A. D., Levy, S., Levy, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+family+specific+leader+region+primers+for+PCR+amplification+of+the+human+heavy+chain+variable+region+gene+repertoire%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Immunology%22%5BJournal%5D)">Use of family specific leader region primers for PCR amplification of the human heavy chain variable region gene repertoire.</a> Molecular Immunology. 29 (2), 193-203 (1992).</li>
<li>Rosenquist, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunoglobulin+gene+sequence+analysis+in+chronic+lymphocytic+leukemia%3A+updated+ERIC+recommendations%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Immunoglobulin gene sequence analysis in chronic lymphocytic leukemia: updated ERIC recommendations.</a> Leukemia. 31 (7), 1477-1481 (2017).</li>
<li>Linke, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+high+resolution+PCR+fragment+analysis+for+identification+of+clonally+rearranged+immunoglobulin+heavy+chain+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Automated high resolution PCR fragment analysis for identification of clonally rearranged immunoglobulin heavy chain genes.</a> Leukemia. 11 (7), 1055-1062 (1997).</li>
<li>Gonzalez, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heteroduplex+analysis+of+VDJ+amplified+segments+from+rearranged+IgH+genes+for+clonality+assessments+in+B-cell+non-Hodgkin%27s+lymphoma.+A+comparison+between+different+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Haematologica%22%5BJournal%5D)">Heteroduplex analysis of VDJ amplified segments from rearranged IgH genes for clonality assessments in B-cell non-Hodgkin's lymphoma. A comparison between different strategies.</a> Haematologica. 84 (9), 779-784 (1999).</li>
<li>Brochet, X., Lefranc, M. P., Giudicelli, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IMGT%2FV-QUEST%3A+The+highly+customized+and+integrated+system+for+IG+and+TR+standardized+V-J+and+V-D-J+sequence+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">IMGT/V-QUEST: The highly customized and integrated system for IG and TR standardized V-J and V-D-J sequence analysis.</a> Nucleic Acids Research. 36 (Web Server issue), W503-W508 (2008).</li>
<li>Yousfi Monod, M., Giudicelli, V., Chaume, D., Lefranc, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IMGT%2FJunctionAnalysis%3A+The+first+tool+for+the+analysis+of+the+immunoglobulin+and+T+cell+receptor+complex+V-J+and+V-D-J+JUNCTIONs%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">IMGT/JunctionAnalysis: The first tool for the analysis of the immunoglobulin and T cell receptor complex V-J and V-D-J JUNCTIONs.</a> Bioinformatics. 20, Suppl 1. i379-i385 (2004).</li>
<li>Bystry, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ARResT%2FAssignSubsets%3A+A+novel+application+for+robust+subclassification+of+chronic+lymphocytic+leukemia+based+on+B+cell+receptor+IG+stereotypy%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">ARResT/AssignSubsets: A novel application for robust subclassification of chronic lymphocytic leukemia based on B cell receptor IG stereotypy.</a> Bioinformatics. 31 (23), 3844-3846 (2015).</li>
<li>Belessi, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IGHV+gene+insertions+and+deletions+in+chronic+lymphocytic+leukemia%3A+%26%2334%3BCLL-biased%26%2334%3B+deletions+in+a+subset+of+cases+with+stereotyped+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">IGHV gene insertions and deletions in chronic lymphocytic leukemia: &#34;CLL-biased&#34; deletions in a subset of cases with stereotyped receptors.</a> European Journal of Immunology. 36 (7), 1963-1974 (2006).</li>
<li>Langerak, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunoglobulin+sequence+analysis+and+prognostication+in+CLL%3A+guidelines+from+the+ERIC+review+board+for+reliable+interpretation+of+problematic+cases%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Immunoglobulin sequence analysis and prognostication in CLL: guidelines from the ERIC review board for reliable interpretation of problematic cases.</a> Leukemia. 25 (6), 979-984 (2011).</li>
<li>Heyman, B., Volkheimer, A. D., Weinberg, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double+IGHV+DNA+gene+rearrangements+in+CLL%3A+Influence+of+mixed-mutated+and+-unmutated+rearrangements+on+outcomes+in+CLL%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Cancer+Journal%22%5BJournal%5D)">Double IGHV DNA gene rearrangements in CLL: Influence of mixed-mutated and -unmutated rearrangements on outcomes in CLL.</a> Blood Cancer Journal. 6 (7), e440(2016).</li>
<li>Farooqui, M. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ibrutinib+for+previously+untreated+and+relapsed+or+refractory+chronic+lymphocytic+leukaemia+with+TP53+aberrations%3A+A+phase+2%2C+single-arm+trial%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet+Oncology%22%5BJournal%5D)">Ibrutinib for previously untreated and relapsed or refractory chronic lymphocytic leukaemia with TP53 aberrations: A phase 2, single-arm trial.</a> The Lancet Oncology. 16 (2), 169-176 (2015).</li>
<li>Furman, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Idelalisib+and+rituximab+in+relapsed+chronic+lymphocytic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Idelalisib and rituximab in relapsed chronic lymphocytic leukemia.</a> The New England Journal of Medicine. 370 (11), 997-1007 (2014).</li>
<li>Burger, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ibrutinib+as+initial+therapy+for+patients+with+chronic+lymphocytic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Ibrutinib as initial therapy for patients with chronic lymphocytic leukemia.</a> The New England Journal of Medicine. 373 (25), 2425-2437 (2015).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia istotnego konfliktu interesów.

Badanie genów IG w PBL było niezbędne nie tylko dla lepszego zrozumienia patobiologii choroby, ale także dla poprawy stratyfikacji ryzyka dla pacjentów. Dlatego tak ważne jest, aby wieloetapowa procedura analizy sekwencji genów IG i późniejsza interpretacja danych sekwencji była przeprowadzana w ustandaryzowany sposób. Dostępność odpowiedniego i wystarczającego materiału pacjenta oraz czas pobierania próbek nie powinny mieć wpływu na zdolność do przeprowadzenia analizy mutacji genu IG, ponieważ badanie można przeprowadzić na PB i na dowolnej próbce z dużą liczbą komórek nowotworowych PBL. Rozdzielanie komórek jednojądrzastych krwi przy użyciu metod rozdzielania gradientowego jest rutynowo wykonywane w laboratoriach diagnostycznych i jak zawsze, należy zachować ostrożność podczas dodawania roztworu krwi/RPMI do probówki zawierającej gradient; Zadanie to powinno być wykonywane powoli, delikatnie, aby uniknąć zakłócenia gradientu i zapobiec utracie komórek.
Po oddzieleniu komórek ekstrahuje się kwasy nukleinowe. Zarówno gDNA, jak i cDNA nadają się do analizy SHM klonotypowego przegrupowania IGH, jednak istnieją zalety i wady stosowania obu materiałów. Przebieg pracy w laboratorium przebiega szybciej przy użyciu gDNA, ponieważ przed amplifikacją PCR nie trzeba wykonywać odwrotnej transkrypcji. To powiedziawszy, użycie gDNA jako substratu do PCR może skutkować amplifikacją zarówno produktywnych, jak i nieproduktywnych rearanżacji, co z kolei może prowadzić do dodatkowej praktycznej pracy laboratoryjnej, tj. oczyszczania lub wycinania żelu z wielu produktów PCR i indywidualnego sekwencjonowania wszystkich przegrupowań. Porównując podejścia gDNA i cDNA, w przypadku tych ostatnich należy wykonać etap odwrotnej transkrypcji przed przystąpieniem do amplifikacji PCR. Jednak w tym przypadku, w większości przypadków, tylko produktywne przegrupowania IG zostaną wzmocnione, a następnie zsekwencjonowane. W ten sposób tylko jeden produkt PCR zostanie oczyszczony i zsekwencjonowany, a interpretacja wyników będzie prostsza.
Skuteczność amplifikacji w dużej mierze zależy od jakości gDNA/cDNA, którą należy ocenić za pomocą czułej metody kwantyfikacji, oraz od zastosowanych starterów. Zastosowane startery mają kluczowe znaczenie dla całej procedury analitycznej, ponieważ dokładne określenie poziomu SHM można osiągnąć tylko poprzez amplifikację całej sekwencji przegrupowanego genu IGHV. Całkowite przegrupowanie można ocenić tylko wtedy, gdy stosuje się 5' startery liderowe IGHV, co uzasadnia niedawne zalecenia ERIC dotyczące stosowania starterów liderowych27. Stosowanie alternatywnych starterów, prowadzących do amplifikacji niekompletnych rearanżacji genów IGHV-IGHD-IGHJ, nie jest odpowiednie do analizy mutacji genu IGHV i dlatego zdecydowanie się je odradza. Jedyny wyjątek dotyczy przypadków, które wielokrotnie dają wynik ujemny, gdy stosowane są startery lidera IGHV, a analiza nowego materiału pacjenta nie jest możliwa lub również nie daje wyników. Jeśli użycie innej próbki i/lub materiału pacjenta (gDNA/cDNA) i różnych zestawów starterów nadal nie pozwala na wytworzenie produktu PCR, możliwymi przyczynami mogą być zbyt niskie obciążenie komórek nowotworowych lub to, że limfocytoza nie jest spowodowana klonem PBL (w takim przypadku immunofenotyp powinien zostać ponownie oceniony). Startery użyte do analizy powinny być zawsze podane w raporcie klinicznym.
Ponieważ PBL wynika z akumulacji monoklonalnych limfocytów B posiadających tę samą rearanżację genu IGHV-IGHD-IGHJ, w zdecydowanej większości przypadków ocena klonalności ujawni unikalny pik monoklonalny, tj . pojedynczy klon. W rzadkich przypadkach można zaobserwować podwójne przegrupowania, a nawet wzorce oligoklonalne35. W takich przypadkach elektroforeza żelowa nie jest preferowaną techniką oceny klonalności i należy zastosować bardziej czułe metody, takie jak analiza fragmentów. Po potwierdzeniu klonalności ostatnim etapem przed sekwencjonowaniem jest oczyszczanie produktu PCR w celu zapewnienia uzyskania sekwencji o wysokiej jakości. Wreszcie, narzędzie IMGT/V-QUEST jest zasobem zalecanym do analizy sekwencji IG przez ERIC. Ponieważ bazy danych IMGT są stale aktualizowane, a wyniki są raportowane w sposób spójny i dobrze opisany, narzędzie to zapewnia ustandaryzowaną analizę i ułatwia analizę porównawczą między różnymi placówkami klinicznymi lub akademickimi.
Ponieważ analiza immunogenetyczna w PBL ma implikacje prognostyczne i w szczególności predykcyjne, solidna analiza rearanżacji genu IGHV-IGHD-IGHJ, w tym przypisanie do głównych podgrup stereotypowych PBL, jest już nie tylko pożądana, ale ma kluczowe znaczenie. Jest to szczególnie widoczne w erze nowatorskich terapii i potencjału, jaki analiza genów IG ma w podejmowaniu decyzji dotyczących leczenia 5,21,22,23,36,37,38, jak oficjalnie wskazano w niedawnej aktualizacji wytycznych sponsorowanych przez NCI z Międzynarodowych Warsztatów na temat CLL24. To powiedziawszy, rygorystyczne standardy są uzasadnione, zwłaszcza, że określenie statusu SHM klonotypowego przegrupowanego genu IGHV u pacjentów z PBL nie jest sprawą trywialną i obejmuje wieloetapowy proces. Co ważne, niektóre etapy eksperymentalne, w szczególności wybór starterów, dają lepsze wyniki, gdy przestrzegane są określone opcje i/lub podejścia, inne aspekty techniczne, takie jak wybór materiału lub metoda oceny klonalności, są podatne na pewien stopień elastyczności, ze względu na fakt, że prowadzą do subtelnych różnic, jeśli takie istnieją, w odniesieniu do wyników końcowych.
W ciągu ostatniej dekady ERIC dążył do promowania standaryzacji i harmonizacji różnych metod związanych z diagnostyką i prognozowaniem PBL. Znajduje to odzwierciedlenie w opublikowanych zaleceniach i wytycznych dotyczących analizy immunogenetycznej27,34, licznych zorganizowanych warsztatach i wydarzeniach edukacyjnych, ustanowieniu sieci IG, a także eksperckiego forum internetowego do dyskusji i udzielania wskazówek dotyczących interpretacji sekwencji genów IG w PBL. Ogólnym celem ERIC poprzez te działania jest promowanie optymalnego zarządzania klinicznego i opieki nad pacjentem. Pomimo intensywnych wysiłków, zadanie to jest dalekie od ukończenia, a w rzeczywistości stało się bardziej złożone ze względu na opracowanie nowatorskiego sekwencjonowania wysokoprzepustowego mającego na celu profilowanie immunologiczne. Niemniej jednak, mimo że wyzwania nadal istnieją, intensywne wysiłki na rzecz solidnej standaryzacji analizy genów IG w PBL są kontynuowane i są obecnie przedmiotem bieżących działań w ramach ERIC.

Przewlekła białaczka limfocytowa (CLL), najczęstsza forma białaczki u dorosłych w krajach zachodnich, charakteryzuje się klonalną ekspansją dojrzałych nowotworowych komórek B1. Z klinicznego punktu widzenia przebieg choroby jest niezwykle zmienny, a niektórzy pacjenci doświadczają agresywnej choroby, wymagającej leczenia bardzo wcześnie po rozpoznaniu i często nawrotowej lub opornej na leczenie. Jest to wyraźny kontrast ze znacznym odsetkiem pacjentów (~30%), u których występuje powolna choroba, nigdy nie wymagają leczenia i mają oczekiwaną długość życia podobną do zdrowych osób w tym samym wieku2. Ta kliniczna heterogeniczność znajduje odzwierciedlenie w różnorodności nieprawidłowości molekularnych występujących u pacjentów z PBL, które ostatecznie napędzają patogenezę i progresję tej choroby3.
Ustalenie dokładnej diagnozy PBL jest zazwyczaj proste, jednak wspomniana wcześniej niejednorodność kliniczna może utrudniać skuteczne leczenie pacjentów z PBL i podkreśla potrzebę markerów prognostycznych i predykcyjnych, które mogłyby pomóc w podejmowaniu decyzji dotyczących leczenia2. Liczne badania miały na celu udoskonalenie prognozowania PBL, czego kulminacją było zaproponowanie wielu nowych markerów klinicznych i biologicznych4. Status mutacji genu ciężkiej zmiennej immunoglobuliny klonotypowej (IGHV) jest jednym z najsolidniejszych markerów prognostycznych w PBL, głównie ze względu na fakt, że (i) pozostaje stabilny w czasie i wraz z postępem choroby oraz (ii) jest niezależny od innych parametrów klinicznych i biologicznych5. Niezależnie od tego, bardzo niewiele, jeśli w ogóle, markerów, w tym status mutacji IGHV, jest obecnie stosowanych w rutynie klinicznej w momencie diagnozy.
Początkowe doniesienia na temat klinicznej użyteczności sekwencjonowania genu IG w PBL pochodzą z 1999 roku, kiedy to 2 niezależne badania wykazały, że pacjenci bez lub z minimalnym obciążeniem hipermutacją somatyczną (SHM) (niezmutowana CLL, U-CLL) mają gorsze rokowanie niż pacjenci z wyższym obciążeniem SHM (zmutowany CLL, M-CLL)6,7. Mówiąc dokładniej, grupa U-CLL składała się z przypadków będących nosicielami klonotypowych genów IGHV z niewielką ilością SHM lub bez SHM, a zatem wysokim procentem tożsamości z najbliższym genem IGHV linii zarodkowej (≥98%), podczas gdy M-CLL składała się z przypadków z wyższym ładunkiem mutacji (procent tożsamości z najbliższym genem IGHV linii zarodkowej <98%). Od czasu tych wczesnych badań stale wykazano, że przypadki U-PBL wykazują krótszy czas do pierwszego leczenia (TTFT) i całkowite przeżycie (OS) w porównaniu z M-CLL.
Patrząc z perspektywy czasu, te przełomowe badania podkreśliły kluczową rolę receptora komórek B (BcR) IG w patobiologii CLL, torując w ten sposób drogę do szeroko zakrojonych badań nad interakcjami CLL z mikrośrodowiskiem, które z kolei doprowadziły do bardziej wszechstronnego zrozumienia biologicznej heterogeniczności tej choroby8,9. Nowsze badania dostarczyły dodatkowego wsparcia dla znaczenia analiz immunogenetycznych w CLL, ujawniając, że poszczególne przypadki mogą grupować się w podzbiorach ze względu na dzielenie (quasi) identycznych sekwencji genów BcR IG, zjawisko określane jako stereotypy BcR IG10,11,12,13. Gromadzące się dowody potwierdzają pogląd, że pacjenci przypisani do tej samej stereotypowej podgrupy mają podobne właściwości kliniczno-biologiczne, które wyraźnie odróżniają ich od innych pacjentów z PBL w tej samej kategorii SHM, ale z różnymi sekwencjami genów IG; rzeczywiście doniesiono, że kategoryzacja pacjentów z PBL na podstawie stereotypii BcR IG dodatkowo udoskonala masową segregację pacjentów z PBL na grupy U-CLL lub M-CLL14,15,16,17,18,19,20.
Z klinicznego punktu widzenia warto zauważyć, że status SHM klonotypowego genu IGHV wydaje się korelować ze specyficzną odpowiedzią na chemoimmunoterapię. W szczególności pacjenci z M-PBL leczeni kombinacją fludarabiny/cyklofosfamidu/rytuksymabu (FCR), złotego standardu leczenia dla sprawnych medycznie pacjentów z PBL bez defektów genu TP53, wykazywali znacznie dłuższe przeżycie wolne od progresji choroby (PFS) i OS w porównaniu z pacjentami z U-CLL, którzy otrzymali to samo leczenie21,22,23. W związku z tym identyfikacja statusu SHM stała się ważna, w szczególności dla pomocy w leczeniu pacjentów z PBL, tj. markera predykcyjnego, a nie dla oceny przebiegu klinicznego choroby, tj. markera prognostycznego. W rzeczywistości, zgodnie z niedawną aktualizacją sponsorowanych przez NCI wytycznych z Międzynarodowych Warsztatów na temat CLL, status SHM przegrupowanych genów IGHV powinien być określony we wszystkich przypadkach PBL przed rozpoczęciem leczenia, zarówno w praktyce ogólnej, jak i badaniach klinicznych24. Ponadto, ze względu na niedawne zatwierdzenie nowych środków terapeutycznych i rosnącą liczbę leków w badaniach, status SHM cząsteczki IG może odgrywać jeszcze większą rolę w postępowaniu terapeutycznym z pacjentami z PBL w najbliższej przyszłości5.
Ten raport szczegółowo opisuje wszystkie aspekty analizy sekwencji genów IG, zaczynając od wyboru odpowiedniego materiału, a kończąc na klinicznej interpretacji wyników sekwencjonowania. Dogłębna ocena tych etapów jest ważna w rutynowej diagnostyce w celu uzyskania wiarygodnych wyników i zapewnienia dokładnej stratyfikacji pacjentów w ramach badań klinicznych. Dostarczono protokoły, które pomagają w harmonizacji analizy sekwencji genów IG, zapewniając w ten sposób porównywalność wyników między różnymi laboratoriami.

<table><tbody><tr><td>BD Vacutainer Plastikowe probówki do pobierania krwi z K2EDTA: Korek do probówki</td><td>ThermoFisher scientific</td><td>02-689-4</td><td>przechowywanie materiału</td></tr><tr><td>BD Vacutainer CPT Probówka do przygotowania komórek jednojądrzastych - Heparyna sodowa</td><td>Becton Dickinson</td><td>362753</td><td>przechowywanie materiału</td></tr><tr><td>BD Vacutainer Heparyna Probówki do pobierania krwi FAQ</td><td>Daigger Scientific</td><td>366480</td><td>magazyn materiałów</td></tr><tr><td>UltraPure 0.5 M EDTA pH 8,0</td><td>Invitrogen</td><td>15575038</td><td>przetwarzanie komórek</td></tr><tr><td>Probówki wirówkowe 15 ml CS500</td><td>Corning</td><td>352096</td><td>przetwarzanie komórek</td></tr><tr><td>Probówki wirówkowe PP 50 ml CS500</td><td>Corning</td><td>352070</td><td>przetwarzanie komórek</td></tr><tr><td>RPMI Medium 1640 (1X) płyn</td><td>Invitrogen</td><td>21875-091</td><td>przetwarzanie komórek</td></tr><tr><td>Ficoll-Paque PLUS, 6 x 100 mL</td><td>STEMCELL Technologie</td><td>17-1440-02</td><td>Przetwarzanie komórek</td></tr><tr><td>Pipety serologiczne 5 ml</td><td>Sarstedt</td><td>861,253,001</td><td>przetwarzanie komórek</td></tr><tr><td>Pipety serologiczne 10 ml</td><td>Sarstedt</td><td>861,254,001</td><td>przetwarzanie komórek</td></tr><tr><td>Pipety serologiczne 25 ml</td><td>Sarstedt</td><td>861,685,001</td><td>przetwarzanie komórek</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanem Dulbecco (D-PBS) (1X)</td><td>Invitrogen</td><td>14190250</td><td>przetwarzanie komórek</td></tr><tr><td>Płytka Neubauera</td><td>Marienfeld-Superior</td><td>640010</td><td>Przetwarzanie komórek</td></tr><tr><td>Rozwiązanie Tuerk</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>93770</td><td>Przetwarzanie komórek</td></tr><tr><td>PureLink Genomic DNA Mini Kit</td><td>Invitrogen</td><td>K1820-01</td><td>Ekstrakcja DNA</td></tr><tr><td>QIAamp RNA Blood Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>52304</td><td>Ekstrakcja RNA</td></tr><tr><td>AllPrep DNA/RNA Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>80204</td><td>Ekstrakcja DNA/RNA</td></tr><tr><td>5X bufor pierwszej nici</td><td>Invitrogen</td><td>P/N Y02321</td><td>synteza cDNA</td></tr><tr><td>Startery losowe, 20 i mikro; g</td><td>Promega</td><td>C1181</td><td>Synteza cDNA</td></tr><tr><td>RNaseOUT& handel; Rekombinowany inhibitor rybonukleazy</td><td>Invitrogen</td><td>10777019</td><td>synteza cDNA</td></tr><tr><td>DTT</td><td>Invitrogen</td><td>P/N Y00147</td><td>synteza cDNA</td></tr><tr><td>SuperScript II odwrotna transkryptaza</td><td>Invitrogen</td><td>18064-014</td><td>synteza cDNA</td></tr><tr><td>10 mM dNTP Mix</td><td>Invitrogen</td><td>18427013</td><td>synteza cDNA,</td></tr><tr><td>PCR PCR Bufor</td><td>Invitrogen</td><td>O00065</td><td>PCR</td></tr><tr><td>MgCl2 (chlorek magnezu) (25 mM)</td><td>ThermoFisher scientific</td><td>AB0359</td><td>PCR</td></tr><tr><td>Taq DNA Polimeraza, rekombinowany</td><td>Invitrogen</td><td>10342-020</td><td></td></tr><tr><td>PCR Applied Biosystems 5&prime; Znakowane startery</td><td>ThermoFisher naukowa-PCR</td><td></td><td>/Ocena klonalności</td></tr><tr><td>Zestaw DNA Agilent o wysokiej czułości</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-4626</td><td>Kwantyfikacja produktu PCR</td></tr><tr><td>Bufor UltraPure TBE, 10X</td><td>ThermoFisher 15581044 naukowa</td><td></td><td>elektroforeza żelowa</td></tr><tr><td>UltraPure Ethidium Bromde, 10 mg/ml</td> Naukowy żel <td>15585011</td><td>ThermoFisher</td><td> elektroforeza</td></tr><tr><td>SYBR Safe DNA Gel Stain</td><td>ThermoFisher scientific</td><td>S33102</td><td>elektroforeza żelowa</td></tr><tr><td>10X BlueJuice Gel Loading Buffer</td><td>Invitrogen</td><td>16500100</td><td>żel elektroforeza</td></tr><tr><td>DNA Ladder 1000 bp/1 kb NIEBIESKI gotowy do użycia</td><td>Geneon</td><td>305-105</td><td>elektroforeza żelowa</td></tr><tr><td>UltraPure Agaroza</td><td>ThermoFisher scientific</td><td>16500500</td><td>żel elektroforeza</td></tr><tr><td>Agaroza niska temperatura żelowania</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9414-250G</td><td>Elektroforeza żelowa</td></tr><tr><td>Żele Novex TBE, 10%, 10-dołkowa</td><td>ThermoFisher naukowa</td><td>EC6275BOX</td><td>elektroforeza żelowa</td></tr><tr><td>ExoSAP-IT PCR Odczynnik do czyszczenia produktu ThermoFisher</td><td>scientific</td><td>78201.1.mL</td><td>PCR</td></tr><tr><td>Zestaw do ekstrakcji żelu QIAquick (50)</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td>Czyszczenie produktu PCR</td></tr><tr><td>Zestaw szybkiego startu GenomeLab DTCS Beckman</td><td>Coulter</td><td>608120</td><td>Sekwencjonowanie Sangera</td></tr><tr><td>Roztwór octanu sodu (3 M), pH 5,2</td><td>ThermoFisher scientific</td><td>R1181</td><td>Sekwencjonowanie Sangera</td></tr><tr><td>Glikogen, klasa biologii molekularnej</td><td>ThermoFisher scientific</td><td>R0561</td><td>Sekwencjonowanie Sangera</td></tr><tr><td>Etanol absolutny</td><td>EMD Millipore</td><td>1024282500</td><td>Sekwencjonowanie Sangera</td></tr><tr><td>Probówka SafeSeal 1,5 ml</td><td>Sarstedt</td><td>72,706</td><td>ogólnego zastosowania</td></tr><tr><td>Kubek Multiply-Pro 0,2 ml, PP</td><td>Sarstedt</td><td>72,737,002</td><td>ogólnego zastosowania</td></tr><tr><td>Sprzęt do wirówek</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wyposażenie</td>maszyny <td></td><td></td><td>PCR</td></tr><tr><td>Bioanalizator</td><td>Sprzęt Agilent Technologies</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

analiza sekwencji genów immunoglobulin w przewlekłej białaczce limfocytowej: od materiału pacjenta do interpretacji sekwencji

Immunoglobulin Gene Sequence Analysis In Chronic Lymphocytic Leukemia: From Patient Material To Sequence Interpretation

Podczas dojrzewania limfocytów B, złożony proces rekombinacji genu immunoglobuliny (IG) V(D)J w połączeniu z hipermutacją somatyczną (SHM) powoduje powstanie unikalnej sekwencji DNA w każdej pojedynczej limfocytacji B. Ponieważ nowotwory złośliwe komórek B wynikają z klonalnej ekspansji pojedynczej komórki, geny IG reprezentują unikalną sygnaturę molekularną wspólną dla wszystkich komórek nowotworowych w obrębie pojedynczego pacjenta; w związku z tym rearanżacje genów IG mogą być wykorzystywane jako markery klonalne. Oprócz tego, że służy jako ważny identyfikator klonalny, sekwencja genu IG może działać jako "molekularna oś czasu", ponieważ jest związana z określonymi etapami rozwoju, a zatem odzwierciedla historię komórki B biorącej udział w transformacji nowotworowej. Ponadto w przypadku niektórych nowotworów złośliwych, w szczególności przewlekłej białaczki limfocytowej (PBL), sekwencja genu IG ma zdolności prognostyczne i potencjalnie predykcyjne. To powiedziawszy, ekstrapolacja znaczących wniosków z analizy sekwencji genów IG byłaby niemożliwa, gdyby nie były dostępne solidne metody i narzędzia pomagające w ich analizie. Niniejszy artykuł, opierając się na bogatym doświadczeniu Europejskiej Inicjatywy Badawczej nad PBL (ERIC), szczegółowo opisuje aspekty techniczne i zasadnicze wymagania niezbędne do zapewnienia wiarygodnej i odtwarzalnej analizy sekwencji genu IG w PBL, testu, który jest obecnie zalecany dla wszystkich pacjentów z PBL przed leczeniem. Dokładniej rzecz ujmując, opisano różne etapy analityczne, począwszy od identyfikacji klonotypowego przegrupowania genu IG i określenia sekwencji nukleotydów, a skończywszy na dokładnej interpretacji klinicznej danych sekwencji genu IG.

Niniejszym przedstawiamy protokół, który szczegółowo opisuje aspekty techniczne i zasadnicze wymagania w celu zapewnienia solidnej analizy sekwencji genów IG u pacjentów z przewlekłą białaczką limfocytową (CLL), w oparciu o zgromadzone doświadczenie Europejskiej Inicjatywy Badawczej nad PBL (ERIC).

Analiza sekwencji genów immunoglobulin w przewlekłej białaczce limfocytowej: od materiału pacjenta do interpretacji sekwencji

During B cell maturation, the complex process of immunoglobulin (IG) gene V(D)J recombination coupled with somatic hypermutation (SHM) gives rise to a ...

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie przewlekłej białaczki limfocytowej, takie jak dokładne rokowanie pacjentów. Główną zaletą tej techniki jest to, że jest prosta, szybka i bardzo dokładna. Implikacje tej techniki rozciągają się w kierunku solidnego rokowania, w szczególności certyfikatów ryzyka u pacjentów z przewlekłą białaczką limfocytową, ponieważ dokładne prognozowanie może później określić leczenie choroby.Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, np. wybór produktu PCR i analiza sekwencji trawienia są trudne do nauczenia, ponieważ wymagają zarówno precyzji, jak i doświadczenia. Aby rozpocząć tę procedurę, dodaj 200 mikrolitrów EDTA do 50-mililitrowej sterylnej probówki zbiorczej. Dodaj 20 mililitrów krwi obwodowej i 15 mililitrów pożywki RPMI do probówki i pipetuj w górę iw dół dwa do trzech razy, aby wymieszać.Następnie dodaj 15 mililitrów pożywki o gradiencie gęstości do nowej 50-mililitrowej probówki zbiorczej. Powoli nałóż roztwór krwi obwodowej na podłoże o gradiencie gęstości, upewniając się, że nie zakłóca gradientu. Wirować przy 800 razy G przez 20 minut przy wyłączonym hamulcu wirówki.Następnie za pomocą sterylnej pipety Pasteura zebrać jednojądrzasty pierścień komórkowy, który utworzył się między górną warstwą płytek krwi osocza a warstwą pożywki gradientu gęstości i przenieść go do nowej sterylnej probówki o pojemności 15 mililitrów. Dodaj pożywkę RPMI tak, aby końcowa objętość wynosiła 12 mililitrów i pipetuj roztwór w górę iw dół, aby wymieszać. Wirować w temperaturze 800 razy G przez osiem minut.Wyrzuć supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy z 10 mililitrami pożywki RPMI. Odwirować ponownie w temperaturze 750 razy G przez osiem minut. Następnie wyrzuć supernatant i rozpuść osad komórkowy w jednym mililitrze PBS.Używając nowej płytki Bauera, uformuj liczbę komórek, mieszając 20 mikrolitrów próbki i 80 mikrolitrów jednego do 10 roztworu Turka. Jeżeli dalsze przetwarzanie próbki nie jest zaplanowane na ten sam dzień, należy odwirować próbkę w temperaturze 750 razy G przez osiem minut. Odrzucić supernatant i przechowywać osad komórkowy w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.Najpierw przygotuj mieszankę starterów, używając równomolowych ilości każdego startera podgrupy, aby zapewnić bezstronną amplifikację. Wymieszać odczynniki PCR zgodnie z tabelą drugą protokołu tekstowego. Dodać 0,5 mikrolitra polimerazy TAP do probówki PCR zawierającej zmieszane odczynniki PCR.Następnie dodaj 100 nanogramów gDNA lub dwa mikrolitry cDNA. Uruchom protokół thermal PCR zgodnie z opisem w tabeli trzeciej protokołu tekstowego. Następnie sprawdź, czy nie ma produktów PCR zawierających około 500 par zasad w przypadku stosowania litrowych starterów IGHV lub 350 par zasad w przypadku stosowania IGHPFR1 mieszanek starterów.Aby rozpocząć oczyszczanie produktu PCR, załaduj całkowitą objętość produktu PCR na trzyprocentowy niskotopliwy żel agarozowy. Pozwól produktom PCR spływać po żelu, aż oddzielą się od tła. Wyciąć ostre, wydatne prążki PCR, a następnie oczyścić je i wymyć.W przypadku wykrycia dwóch rearanżacji, oba prążki należy wyciąć i zsekwencjonować oddzielnie. Aby przeprowadzić czyszczenie exo-sap, postępuj zgodnie z instrukcjami producenta dotyczącymi określonych woluminów do użycia. Delikatnie zwiruj każdą próbkę, aby wymieszać i inkubować je na bloku PCR w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut.Dezaktywuj enzymy, podgrzewając je do 85 stopni Celsjusza przez 15 minut. Następnie załaduj niewielką ilość produktów PCR na trzyprocentowy żel agarozowy, aby ocenić czystość produktu. Ostatnim punktem kontrolnym przed sekwencjonowaniem jest określenie klonalności próbki za pomocą analizy fragmentów.Aby rozpocząć analizę sekwencji, uruchom odpowiednie oprogramowanie. Należy określić gatunki, takie jak homo sapiens, oraz typ receptora lub locus. Tempo sekwencji, które mają być analizowane, w formacie fasta i dołączanie identyfikatorów do obszaru tekstowego w partiach do 50 sekwencji na przebieg.Następnie wybierz jedną z trzech poniższych opcji wyświetlania wyników. Widok szczegółowy: wybierz tę opcję, aby uzyskać wyniki dla każdej sekwencji z osobna. Widok syntezy: wybierz tę opcję, aby skompilować tabelę podsumowania uporządkowaną według nazwy genu IGHV i allelu lub według kolejności wprowadzania sekwencji.Ta opcja zapewnia również wyrównanie sekwencji, które w dowolnej przesłanej partii są przypisane do tego samego genu i allelu IGHV, a na końcu pliku Excel. Wybierz tę opcję, aby udostępnić wszystkie pliki wyjściowe jako arkusze kalkulacyjne połączone w jeden plik. Tylko zastosowanie litrowych starterów IGHV umożliwia wzmocnienie pełnej długości przegrupowanego IGHV, co pozwala na określenie rzeczywistego obciążenia HSM.Oczekiwany produkt PCR to około 500 par zasad. W rzadkich przypadkach, gdy litrowe startery IGHV nie mogą wzmocnić klonotypowego przegrupowania IG, można zastosować IGHBFR1 startery. Oczekiwany produkt PCR to około 350 par zasad.Uzyskane sekwencje są następnie analizowane za pomocą narzędzia IMG TV Quest. Pierwszy wiersz w tabeli wyników określa funkcjonalność sekwencji, ponieważ sekwencja przegrupowana IG może być produktywna lub nieproduktywna. Rearanżacja genu IGH jest nieproduktywna, jeśli kodony stop są obecne w regionie VDJ i / lub jeśli rearanżacja jest poza ramką z powodu insercji/delecji.Ważne jest, aby pamiętać, że tylko produktywne, a tym samym funkcjonalne przegrupowania powinny być dalej analizowane. W przypadku korzystania z domyślnych parametrów IMG TV Quest wstawienia i usunięcia nie są automatycznie wykrywane, jednak narzędzie dostarcza silnych wskazówek, że sekwencja może zawierać takie zmiany, a pod tabelą podsumowania wyników pojawia się ostrzeżenie. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, aby produkty PCR wylądować na żelu na tyle długo, aby można było odróżnić wiązanie klonalne od tła poliklonalnego.Po opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się immunogenetyką przewlekłej białaczki limfocytowej do zbadania prognostycznego wpływu statusu epimutacji somatycznej u pacjentów. Nie zapominaj, że praca z bromkiem etylu może być niezwykle niebezpieczna, a podczas wykonywania tej procedury należy zawsze podejmować środki ostrożności, takie jak praca pod maską.

immunoglobulin-gene-sequence-analysis-chronic-lymphocytic-leukemia

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Tutaj opisujemy protokół, który łączy dwie techniki proteomiczne, mianowicie dwuwymiarową elektroforezę (2DE) i spektrometrię mas (MS), w celu identyfikacji różnie wyrażonych/potranslacyjnych zmodyfikowanych białek wśród dwóch lub więcej grup próbek pierwotnych. Takie podejście, wraz z eksperymentami funkcjonalnymi, pozwala na identyfikację i charakterystykę markerów prognostycznych/celów terapeutycznych.

Od plamki 2DE-Gel do funkcji białka: lekcja wyciągnięta z HS1 w przewlekłej białaczce limfocytowej

Ten protokół opisuje podejście do badania rekombinowanych regionów VDJ łańcucha ciężkiego immunoglobuliny chłoniaków poprzez głębokie sekwencjonowanie i odzyskanie rearanżacji VDJ i statusu hipermutacji somatycznej w celu nakreślenia klonalnej architektury pojedynczego guza. Porównanie architektury klonalnej między sparowaną diagnozą a próbkami nawrotu chłoniaka ujawnia tryby ewolucji klonalnej nawrotu chłoniaka.

VDJ-Seq: Analiza głębokiego sekwencjonowania przegrupowanego genu łańcucha ciężkiego immunoglobuliny w celu ujawnienia wzorców ewolucji klonalnej chłoniaka z komórek B

Opisany tutaj protokół reprezentuje łatwą i powtarzalną metodę, która wykorzystuje wysokosprawną chromatografię cieczową z odwróconymi fazami (RP-HPLC) do pomiaru metabolizmu puryn na komórkach przewlekłej białaczki limfocytowej (CLL) hodowanych w różnych warunkach.

Test oparty na HPLC do monitorowania zewnątrzkomórkowego metabolizmu nukleotydów/nukleozydów w ludzkich komórkach przewlekłej białaczki limfocytowej

Tutaj opisujemy połączone sortowanie komórek metodą cytometrii przepływowej i protokół budowy biblioteki nowej generacji o niskim wkładzie przeznaczony do generowania wysokiej jakości danych o całym eksomie z komórek Hodgkina Reeda-Sternberga (HRS) klasycznego chłoniaka Hodgkina (CHL).

Sortowanie przepływowe i sekwencjonowanie egzomu komórek Reeda-Sternberga klasycznego chłoniaka Hodgkina

Ta praca opisuje zoptymalizowany protokół sekwencjonowania domeny wiążącej metylo-CpG (MBD) oraz potok obliczeniowy do identyfikacji różnie metylowanych regionów bogatych w CpG u pacjentów z przewlekłą białaczką limfocytową (CLL).

Kompleksowa analiza metylacji DNA przy użyciu metody opartej na wychwytywaniu domeny wiążącej metylo-CpG u pacjentów z przewlekłą białaczką limfocytową

Przewlekła białaczka limfocytowa (CLL) jest najczęstszą białaczką w zachodnim świecie. Czynniki transkrypcyjne NFAT są ważnymi regulatorami rozwoju i aktywacji w wielu typach komórek. W tym miejscu przedstawiamy protokół stosowania immunoprecypitacji chromatyny (ChIP) w ludzkich komórkach PBL w celu identyfikacji nowych genów docelowych NFAT2.

Test immunoprecypitacji chromatyny w celu identyfikacji nowych genów docelowych NFAT2 w przewlekłej białaczce limfocytowej

Tutaj opisujemy protokoły analizy i wizualizacji struktury i budowy całego repertuaru przeciwciał. Wiąże się to z pozyskiwaniem ogromnych sekwencji RNA przeciwciał za pomocą sekwencjonowania nowej generacji.

Identyfikacja repertuaru przeciwciał mysich i ludzkich za pomocą sekwencjonowania nowej generacji

Ten protokół umożliwia optymalizację i późniejsze efektywne generowanie frakcji jądrowych i cytoplazmatycznych z pierwotnych komórek przewlekłej białaczki limfocytowej. Próbki te są wykorzystywane do określenia lokalizacji białek, a także zmian w transporcie białek, które zachodzą między przedziałami jądrowymi i cytoplazmatycznymi po stymulacji komórek i leczeniu farmakologicznym.

Subkomórkowe frakcjonowanie pierwotnych komórek przewlekłej białaczki limfocytowej w celu monitorowania transportu białek jądrowych/cytoplazmatycznych

Obecny protokół opisuje metodę izolacji DNA z próbek krwi i biopsji jelitowych, generowania bibliotek TCRβ i IGH PCR do sekwencjonowania nowej generacji, wykonywania przebiegu NGS i podstawowej analizy danych.

Analiza repertuaru immunologicznego receptorów limfocytów T i B przy użyciu sekwencjonowania nowej generacji

Uzyskanie wysokiej jakości genomowego DNA z tkanek nowotworowych jest niezbędnym pierwszym krokiem do analizy zmian genetycznych za pomocą sekwencjonowania nowej generacji. W tym artykule przedstawiamy prostą i szybką metodę wzbogacania komórek nowotworowych i uzyskiwania nienaruszonego DNA z próbek cytologicznych odcisku dotykowego.

Prosta i szybka metoda uzyskiwania wysokiej jakości DNA guza z próbek kliniczno-patologicznych za pomocą cytologii odcisku dotykowego

Poznaj protokół analizy sekwencji genów immunoglobulin w przewlekłej białaczce limfocytowej. Metoda PCR i analiza sekwencji IMG TV Quest umożliwiają dokładną prognozę i stratyfikację ryzyka u pacjentów z CLL.

Analiza sekwencji genów immunoglobulin w przewlekłej białaczce limfocytowej: od materiału pacjenta do interpretacji sekwencji

Przeglądaj więcej filmów