Analiza sekwencji genów immunoglobulin w przewlekłej białaczce limfocytowej: od materiału pacjenta do interpretacji sekwencji
26 listopada 2018
Niniejszym przedstawiamy protokół, który szczegółowo opisuje aspekty techniczne i zasadnicze wymagania w celu zapewnienia solidnej analizy sekwencji genów IG u pacjentów z przewlekłą białaczką limfocytową (CLL), w oparciu o zgromadzone doświadczenie Europejskiej Inicjatywy Badawczej nad PBL (ERIC).
Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie przewlekłej białaczki limfocytowej, takie jak dokładne rokowanie pacjentów. Główną zaletą tej techniki jest to, że jest prosta, szybka i bardzo dokładna. Implikacje tej techniki rozciągają się w kierunku solidnego rokowania, w szczególności certyfikatów ryzyka u pacjentów z przewlekłą białaczką limfocytową, ponieważ dokładne prognozowanie może później określić leczenie choroby.
Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, np. wybór produktu PCR i analiza sekwencji trawienia są trudne do nauczenia, ponieważ wymagają zarówno precyzji, jak i doświadczenia. Aby rozpocząć tę procedurę, dodaj 200 mikrolitrów EDTA do 50-mililitrowej sterylnej probówki zbiorczej. Dodaj 20 mililitrów krwi obwodowej i 15 mililitrów pożywki RPMI do probówki i pipetuj w górę iw dół dwa do trzech razy, aby wymieszać.
Następnie dodaj 15 mililitrów pożywki o gradiencie gęstości do nowej 50-mililitrowej probówki zbiorczej. Powoli nałóż roztwór krwi obwodowej na podłoże o gradiencie gęstości, upewniając się, że nie zakłóca gradientu. Wirować przy 800 razy G przez 20 minut przy wyłączonym hamulcu wirówki.
Następnie za pomocą sterylnej pipety Pasteura zebrać jednojądrzasty pierścień komórkowy, który utworzył się między górną warstwą płytek krwi osocza a warstwą pożywki gradientu gęstości i przenieść go do nowej sterylnej probówki o pojemności 15 mililitrów. Dodaj pożywkę RPMI tak, aby końcowa objętość wynosiła 12 mililitrów i pipetuj roztwór w górę iw dół, aby wymieszać. Wirować w temperaturze 800 razy G przez osiem minut.
Wyrzuć supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy z 10 mililitrami pożywki RPMI. Odwirować ponownie w temperaturze 750 razy G przez osiem minut. Następnie wyrzuć supernatant i rozpuść osad komórkowy w jednym mililitrze PBS.
Używając nowej płytki Bauera, uformuj liczbę komórek, mieszając 20 mikrolitrów próbki i 80 mikrolitrów jednego do 10 roztworu Turka. Jeżeli dalsze przetwarzanie próbki nie jest zaplanowane na ten sam dzień, należy odwirować próbkę w temperaturze 750 razy G przez osiem minut. Odrzucić supernatant i przechowywać osad komórkowy w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.
Najpierw przygotuj mieszankę starterów, używając równomolowych ilości każdego startera podgrupy, aby zapewnić bezstronną amplifikację. Wymieszać odczynniki PCR zgodnie z tabelą drugą protokołu tekstowego. Dodać 0,5 mikrolitra polimerazy TAP do probówki PCR zawierającej zmieszane odczynniki PCR.
Następnie dodaj 100 nanogramów gDNA lub dwa mikrolitry cDNA. Uruchom protokół thermal PCR zgodnie z opisem w tabeli trzeciej protokołu tekstowego. Następnie sprawdź, czy nie ma produktów PCR zawierających około 500 par zasad w przypadku stosowania litrowych starterów IGHV lub 350 par zasad w przypadku stosowania IGHPFR1 mieszanek starterów.
Aby rozpocząć oczyszczanie produktu PCR, załaduj całkowitą objętość produktu PCR na trzyprocentowy niskotopliwy żel agarozowy. Pozwól produktom PCR spływać po żelu, aż oddzielą się od tła. Wyciąć ostre, wydatne prążki PCR, a następnie oczyścić je i wymyć.
W przypadku wykrycia dwóch rearanżacji, oba prążki należy wyciąć i zsekwencjonować oddzielnie. Aby przeprowadzić czyszczenie exo-sap, postępuj zgodnie z instrukcjami producenta dotyczącymi określonych woluminów do użycia. Delikatnie zwiruj każdą próbkę, aby wymieszać i inkubować je na bloku PCR w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut.
Dezaktywuj enzymy, podgrzewając je do 85 stopni Celsjusza przez 15 minut. Następnie załaduj niewielką ilość produktów PCR na trzyprocentowy żel agarozowy, aby ocenić czystość produktu. Ostatnim punktem kontrolnym przed sekwencjonowaniem jest określenie klonalności próbki za pomocą analizy fragmentów.
Aby rozpocząć analizę sekwencji, uruchom odpowiednie oprogramowanie. Należy określić gatunki, takie jak homo sapiens, oraz typ receptora lub locus. Tempo sekwencji, które mają być analizowane, w formacie fasta i dołączanie identyfikatorów do obszaru tekstowego w partiach do 50 sekwencji na przebieg.
Następnie wybierz jedną z trzech poniższych opcji wyświetlania wyników. Widok szczegółowy: wybierz tę opcję, aby uzyskać wyniki dla każdej sekwencji z osobna. Widok syntezy: wybierz tę opcję, aby skompilować tabelę podsumowania uporządkowaną według nazwy genu IGHV i allelu lub według kolejności wprowadzania sekwencji.
Ta opcja zapewnia również wyrównanie sekwencji, które w dowolnej przesłanej partii są przypisane do tego samego genu i allelu IGHV, a na końcu pliku Excel. Wybierz tę opcję, aby udostępnić wszystkie pliki wyjściowe jako arkusze kalkulacyjne połączone w jeden plik. Tylko zastosowanie litrowych starterów IGHV umożliwia wzmocnienie pełnej długości przegrupowanego IGHV, co pozwala na określenie rzeczywistego obciążenia HSM.
Oczekiwany produkt PCR to około 500 par zasad. W rzadkich przypadkach, gdy litrowe startery IGHV nie mogą wzmocnić klonotypowego przegrupowania IG, można zastosować IGHBFR1 startery. Oczekiwany produkt PCR to około 350 par zasad.
Uzyskane sekwencje są następnie analizowane za pomocą narzędzia IMG TV Quest. Pierwszy wiersz w tabeli wyników określa funkcjonalność sekwencji, ponieważ sekwencja przegrupowana IG może być produktywna lub nieproduktywna. Rearanżacja genu IGH jest nieproduktywna, jeśli kodony stop są obecne w regionie VDJ i / lub jeśli rearanżacja jest poza ramką z powodu insercji/delecji.
Ważne jest, aby pamiętać, że tylko produktywne, a tym samym funkcjonalne przegrupowania powinny być dalej analizowane. W przypadku korzystania z domyślnych parametrów IMG TV Quest wstawienia i usunięcia nie są automatycznie wykrywane, jednak narzędzie dostarcza silnych wskazówek, że sekwencja może zawierać takie zmiany, a pod tabelą podsumowania wyników pojawia się ostrzeżenie. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, aby produkty PCR wylądować na żelu na tyle długo, aby można było odróżnić wiązanie klonalne od tła poliklonalnego.
Po opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się immunogenetyką przewlekłej białaczki limfocytowej do zbadania prognostycznego wpływu statusu epimutacji somatycznej u pacjentów. Nie zapominaj, że praca z bromkiem etylu może być niezwykle niebezpieczna, a podczas wykonywania tej procedury należy zawsze podejmować środki ostrożności, takie jak praca pod maską.
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia protokół solidnej analizy sekwencji genów IG u pacjentów z przewlekłą białaczką limfocytową (CLL), oparty na Europejskiej Inicjatywie Badawczej nad CLL (ERIC). Metoda ta jest prosta, szybka i wysoce dokładna, co wspomaga precyzyjne prognozowanie przebiegu choroby u pacjentów.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Onkologia
- Immunogenetyka
- Badania kliniczne
Wstęp
- Przewlekła białaczka limfocytowa (CLL) jest powszechnym typem białaczki u osób dorosłych.
- Dokładne prognozowanie ma kluczowe znaczenie dla prowadzenia terapii.
- Omówiona technika pogłębia zrozumienie mutacji somatycznych w CLL.
- Demonstracja wizualna jest niezbędna ze względu na złożoność stosowanych metod.
Cel badania
- Aby przedstawić szczegółowy protokół analizy sekwencji genów IG.
- Aby poprawić dokładność prognostyczną u pacjentów z CLL.
- Aby ułatwić podejmowanie lepszych decyzji terapeutycznych w oparciu o analizę genetyczną.
Zastosowane metody
- Przygotowanie próbek krwi i izolacja komórek mononuklearnych.
- Reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR) w celu amplifikacji segmentów genu IG.
- Elektroforeza żelowa w celu rozdziału i analizy produktów PCR.
- Analiza sekwencji przy użyciu narzędzia IMG TV Quest w celu oceny funkcjonalnej.
Główne wyniki
- Protokół umożliwia amplifikację pełnej długości przeorganizowanych genów IG.
- Analiza funkcjonalna pozwala odróżnić przeorganizowania produktywne od nieproduktywnych.
- Dokładna identyfikacja mutacji somatycznych wspomaga prognozowanie przebiegu choroby u pacjenta.
- Metoda ta ma znaczenie dla stratyfikacji ryzyka w CLL.
Wnioski
- Technika ta pogłębia zrozumienie immunogenetyki CLL.
- Zapewnia ona wiarygodne ramy dla ocen prognostycznych.
- Przyszłe badania mogą opierać się na tej metodzie w celu zbadania wpływu terapeutycznego.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Dokładna analiza sekwencji genów immunoglobulin dostarcza sygnatury molekularnej do śledzenia klonalnego i stratyfikacji prognostycznej w przewlekłej białaczce limfocytowej, co umożliwia podejmowanie decyzji terapeutycznych z uwzględnieniem ryzyka przed rozpoczęciem leczenia. Metoda ta wspiera walidację celów terapeutycznych poprzez powiązanie statusu somatycznej hipermutacji z biologią choroby i wynikami klinicznymi, oferując mechanistyczną redukcję ryzyka we wczesnych etapach procesu odkrywania leków. Niezawodne sekwencjonowanie IG zwiększa pewność predykcyjną w doborze pacjentów na podstawie biomarkerów do badań przedklinicznych i klinicznych.
Zastosowania strategiczne w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie ewolucji klonalnych limfocytów B oraz testowanie hipotez terapeutycznych poprzez analizę rearanżacji genów IGHV.
- Wartość operacyjna: Zapewnia powtarzalną sygnaturę molekularną do śledzenia populacji komórek nowotworowych w modelach przedklinicznych.
- Wartość naukowa: Wspiera funkcjonalną walidację celu poprzez odróżnianie produktywnych od nieproduktywnych rearanżacji IG za pomocą analizy w narzędziu IMG TV Quest.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Dostarcza ilościowych pomiarów obciążenia somatyczną hipermutacją, które są niezbędne do standaryzacji testów i kwalifikacji biomarkerów.
- Wartość operacyjna: Umożliwia przygotowanie zwalidowanych systemów biologicznych dla dalszych etapów przesiewowych poprzez standaryzowaną izolację komórek jednojądrowych oraz amplifikację PCR.
- Wartość operacyjna: Zapewnia powtarzalność testu dzięki standaryzowanemu oczyszczaniu produktów PCR, analizie fragmentów oraz punktom kontrolnym sekwencjonowania.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Łączy analizę sekwencji genu IG z istotnymi dla choroby etapami dojrzewania limfocytów B, wspierając dopasowanie biomarkerów translacyjnych w modelach CLL.
- Wartość operacyjna: Ułatwia zachowanie ciągłości od etapu odkrycia po walidację przedkliniczną, zapewniając mechanizm śledzenia klonalnego w kolejnych pasażach próbek.
- Wartość strategiczna: Wspiera podejmowanie decyzji o dalszym rozwoju projektu w oparciu o analizę ryzyka poprzez korelację statusu mutacji somatycznych z wynikami prognostycznymi.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum odkryć – od wczesnej walidacji celu, przez identyfikację związku wiodącego, aż po badania przedkliniczne – umożliwiając śledzenie klonów, profilowanie mutacji somatycznych oraz ocenę biomarkerów prognostycznych w modelach CLL.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków poprzez analizę wykorzystania genów IGHV oraz wzorców hipermutacji somatycznej jako markerów pochodzenia komórek B i ekspozycji na antygen.
- Przesiewanie: Umożliwia przygotowanie do analizy poprzez standaryzowaną amplifikację PCR segmentów genów IG oraz walidację produktów w żelu w celu zapewnienia spójnego materiału wejściowego do sekwencjonowania.
- Analityka: Generuje odczyty funkcjonalne i mutacyjne za pomocą narzędzia IMG TV Quest, co pozwala na porównanie charakterystyk sekwencji IG w różnych warunkach eksperymentalnych.
- Badania translacyjne: Zapewnia ciągłość przedkliniczną poprzez wykorzystanie rearanżacji IG jako stabilnych markerów klonalnych do monitorowania progresji choroby w systemach modelowych.
- Zastosowania przedsiębiorstwa: Tworzy powtarzalne możliwości podłużnego monitorowania dynamiki klonalnej i oceny biomarkerów w wielu badaniach i na różnych platformach.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną poprzez powiązanie statusu hipermutacji somatycznej z rokowaniem klinicznym i zachowaniem biologicznym w CLL.
- Wartość operacyjna: Zapewnia standaryzację i powtarzalność dzięki zdefiniowanym protokołom przetwarzania próbek, PCR, oczyszczania oraz analizy sekwencji.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji typu go/no-go, dostarczając obiektywnych danych biomarkerowych do stratyfikacji pacjentów w programach rozwoju terapeutycznego.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko, umożliwiając wczesną identyfikację wysokoryzykownych podtypów molekularnych dla ukierunkowanych strategii interwencyjnych.
Kwestie związane z wdrożeniem
- Wymaga wiedzy specjalistycznej z zakresu immunogenetyki, biologii molekularnej oraz obsługi oprogramowania do analizy sekwencji.
- Zależność od aparatury do PCR, systemów elektroforezy żelowej oraz możliwości sekwencjonowania w celu dokładnej amplifikacji i detekcji genów IG.
- Konieczność międzyzespołowej standaryzacji obchodzenia się z próbkami, kontroli zanieczyszczeń oraz progów analitycznych w celu uzyskania spójnych wyników.
- Wymaga rozważenia adaptacji protokołu przy zastosowaniu go do różnych typów próbek lub systemów modelowych innych niż krew obwodowa.
- Ograniczenie wynikające z konieczności precyzyjnego wycinania fragmentów żelu i etapów oczyszczania, aby uniknąć zakłóceń tła poliklonalnego w ocenie klonalności.
