Korekta i test naprawy DNA przy użyciu przedłużenia pojedynczego nukleotydu i analizy spektrometrii mas MALDI-TOF
19 czerwca 2018
Nieoznakowana, nieradio-izotopowa metoda korekty polimerazy DNA i testu naprawy DNA została opracowana przy użyciu spektrometrii mas MALDI-TOF o wysokiej rozdzielczości i strategii przedłużania pojedynczego nukleotydu. Test okazał się bardzo specyficzny, prosty, szybki i łatwy do wykonania w przypadku korekty i naprawy łatek krótszych niż 9-nukleotydy.
Metoda ta może pomóc w znalezieniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie polimerów DNA, wierności i naprawy DNA, takie jak metody korekty i analizy oraz zdefiniowanie łatki naprawczej DNA. Główną zaletą tej techniki jest to, że jest bardzo specyficzna, prosta, szybka i łatwa do wykonania. Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które są nowe w tej metodzie, będą miały trudności, ponieważ nadal zajmują się replikacją DNA i dziedziną naprawy, mogą nie być zaznajomione z oprzyrządowaniem do spektrometrii mas i interpretacją danych.
Myślę, że najważniejsze jest to, że demonstracja wizualna jest bardzo ważna, ponieważ możemy pokazać, w jaki sposób nasza komercyjnie opracowana spektrometria mas do zastosowań klinicznych, takich jak mutacje i deputacja, może być wygodnie zaadaptowana do korekty DNA i badania naprawy. Procedurę zademonstrują absolwenci Rong-Syuan i Kuei-Ching z mojego laboratorium. Rozpocznij tę procedurę od przygotowania podkładu i szablonu zgodnie z opisem w protokole tekstowym.
Jako przykład użyj niezgodności TG podłoża P21 z T28 do korekty. Rozcieńczyć podpłomę P21 i matrycę T28 do 12,5 pikomoli na mikrolitr wodą. Następnie przenieś 12 mikrolitrów rozcieńczonego startera i 12 mikrolitrów rozcieńczonej matrycy do 1,5 mililitrowej sterylizowanej mikroprobówki wirówkowej.
Po szczelnym zamknięciu probówki inkubować probówkę przez 30 minut w łaźni wodnej pod przykryciem o temperaturze 65 stopni Celsjusza. Następnie inkubuj przez 30 minut w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza. I na koniec umieść rurkę na lodzie, aby zapewnić prawidłowe wyżarzanie.
Do 1,5 mililitrowej wysterylizowanej mikroprobówki wirówkowej dodaj osiem mikrolitrów mieszanki startera i szablonu, dwa mikrolitry 10-krotnego buforu reakcyjnego do korekty, cztery mikrolitry mieszanki 4ddNTPs i wodę do 18 mikrolitrów. Przesuń rurkę, aby wymieszać. Rozcieńczyć polimerazę DNA w lodowatym 1x buforze reakcyjnym korekty do pożądanego stężenia.
Rozcieńczony enzym należy zawsze przechowywać na lodzie. Podgrzej wstępnie probówkę mikrowirówki z mieszanką substratów do żądanej temperatury reakcji. Następnie przenieś dwa mikrolitry rozcieńczonej polimerazy DNA do wstępnie podgrzanej mieszaniny substratów i przesuń probówkę, aby wymieszać jej zawartość.
Odwiruj probówki z enzymem i substratem przez kilka sekund przy 3200-krotności grawitacji w temperaturze otoczenia, aby odwirować składniki reakcji. Natychmiast przenieś reakcję do bloku grzewczego lub łaźni wodnej o żądanej temperaturze inkubacji. Aby zakończyć reakcję, dodaj równą objętość buforowanego fenolu i mieszaj reakcję, wirując przez kilka sekund.
Następnie odwiruj reakcję w mikrowirówce przy 3200-krotności grawitacji w temperaturze otoczenia przez pięć minut. Przenieść fazę wodną do czystej probówki z mikrowirówką i dodać równą objętość chloroformu. Po wymieszaniu przez wirowanie przez kilka sekund, odwirować próbkę w mikrowirówce pod 3200-krotnością grawitacji w temperaturze otoczenia przez trzy minuty.
Przenieś fazę wodną do czystej probówki do mikrowirówki. Po inkubacji reakcji w temperaturze 95 stopni Celsjusza przez pięć minut umieść probówkę na lodzie. Następnie wykonaj dodatkowo żywicę, aby wyeliminować zanieczyszczenie solą w płytce 384-dołkowej, jak opisano w protokole tekstowym.
Umieść płytki z próbkami w dozowniku nanolitrów. Umieść chip matrycowy i przygotowaną płytkę 384-dołkową na odpowiedniej tacy. Uruchom nano-dozownik, aby dostrzec produkty reakcji na chipie.
Naciśnij przycisk uruchamiania na ekranie dotykowym nanodozownika, aby rozpocząć. Sprawdź automatycznie przechwycony obraz plamek próbki zawierających informacje o nasyceniu na ekranie, aby upewnić się, że całkowita objętość plam na chipie wynosi około pięciu do 10 nanolitrów. Powtórzyć plamienie próbki, jeśli objętość jest niewystarczająca.
Przygotuj plik w formacie Excel zawierający przewidywane informacje o sygnale do zaimportowania. Utwórz i zdefiniuj nowy test w aplikacji, klikając prawym przyciskiem myszy import grupy testów w formacie projektanta i wybierając plik Excel. Ustal docelową płytkę testową za pomocą drzewa opcji płytki projektu klienta po lewej stronie ekranu, klikając prawym przyciskiem myszy wierzchołek drzewa i nadając mu nazwę pliku.
Wybierz typ płytki 384-dołkowej i naciśnij przycisk OK. Pojawi się pusta płyta. Wybierz odpowiedni test po lewej stronie ekranu. Przypisz wybrany test do każdej wykrytej pozycji próbki na chipie, podświetlając studzienkę i klikając prawym przyciskiem myszy, aby wybrać opcję dodaj pleks.
Następnie przygotuj roboczą listę wszystkich testów na chipie w formacie Excel bez nagłówka. Zaimportuj listę roboczą za pomocą opcji dodaj nowy przykładowy projekt. Przypisz test i listę roboczą do każdej pozycji testu P21T28 i wybierz, klikając prawym przyciskiem myszy.
Połącz spektrometr mas z chipem za pomocą programu aplikacyjnego. Wybierz ustawienie domyślne po prawej stronie ekranu. Wpisz nazwę testu i identyfikator chipa w rogu chipa.
Zapisz ustawienia i uruchom program sterujący MS. Naciśnij przycisk wsiadania/wyłączania i wyjmij płytkę zwiadowczą. Umieść zauważony chip na płytce zwiadowczej i naciśnij przycisk wsiadania/wyłączania, aby zauważony chip wszedł do spektrometru masowego.
Kliknij przycisk pobierania w aplikacji, aby uruchomić spektrometrię mas i uzyskać dane. Otwórz program do analizy danych. Przejrzyj drzewo bazy danych w lewym górnym rogu i wybierz identyfikator chipa.Otwórz plik danych po prawej stronie ekranu.
Kliknij ikonę widma, aby wyświetlić widmo masowe. Aby przyciąć określony zakres masy nad obciążeniem, kliknij prawym przyciskiem myszy, aby wybrać okno dialogowe dostosowywania. W nowym oknie kliknij oś x i ustaw żądaną górną i dolną granicę, a następnie naciśnij OK, aby wyświetlić określony zakres widma.
Wyeksportuj widmo do prowadzenia dokumentacji, klikając prawym przyciskiem myszy przycisk eksportu. Wybierz typ pliku JPEG, kliknij miejsce docelowe, wybierz przeglądaj dysk, wpisz nazwę pliku, a następnie kliknij eksportuj. Aby określić ilościowo dane, użyj kursora i kliknij szczyt, aby wyświetlić wysokość piku w lewym górnym rogu.
W MALDI-TOF MS występuje odwrotna zależność między intensywnością piku w masie oligonukleotydów. Oligonukleotydy od 17 do 24 nukleotydów poddano analizie MS. Obliczono względne natężenia sygnału, które można wykorzystać do ilościowego określenia korekty lub testu naprawy.
W widmie masowym można znaleźć zarówno sygnały matrycowe, jak i starterowe. Ze względu na różnice w rozmiarach, sygnały z szablonów i ich niespecyficznych produktów częściowej degradacji były dobrze oddzielone od niedopasowanych starterów i produktów korekty. Pokazano tutaj korektę trzech głównych końcówek TG.At ciągu pięciu minut, poprawiony produkt wynosił 23% w porównaniu z 17% dla produktu wycinanego.
Różnica ta nadal rosła do 69% w porównaniu z 14% po 20 minutach. Zwróć uwagę na wysoką rozdzielczość MS wyraźnie oddzielającą sygnały podproste i sygnały produktu przy różnicy masowego przeładowania wynoszącej zaledwie 32. Łatwo można było również rozwiązać dwie formy produktów do ostatecznej korekty TG pióra.
Jeden produkt pośredni do wycinania nukleotydów i dwa produkty do wycinania nukleotydów. Korekta wewnętrznych niezgodności wykazała wyraźną tendencję w zakresie efektywności korekty. Jak dowodzi obszerny tekst o produkcie z korektą, zwiększoną wydajność zaobserwowano, gdy podproste miały niedopasowania w ostatnim, przedostatnim, trzecim i czwartym nukleotydach z trzech głównych końców, w porównaniu z niedopasowaniami w innych pozycjach.
Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu czterech godzin, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Po tej procedurze można wykonać inne zastosowania, takie jak badanie przesiewowe z korektą polimerową, w celu odkrycia i wynalezienia nowego leku do badań farmaceutycznych. Technika ta toruje również drogę naukowcom zajmującym się replikacją i naprawą DNA, aby uzyskać lepszy wgląd w medycynę krasnala i jej wierną replikację dla wszystkich żywych organizmów.
Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przeprowadzić korektę DNA i test naprawczy przy użyciu analizy spektrometrii mas MADI-TOF. Nie zapominaj, że praca ze sfenochloroformem może być niebezpieczna, a środki ostrożności, takie jak noszenie środków ochrony osobistej, powinny być zawsze podejmowane podczas wykonywania zabiegu. Alternatywny protokół zawarty w tekście można uznać za bezpieczniejszy substytut.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Opracowano nową metodę analizy korekty polimerazy DNA oraz naprawy DNA, która nie wymaga znakowania ani izotopów promieniotwórczych, wykorzystującą wysokorozdzielczą spektrometrię mas MALDI-TOF. Technika ta charakteryzuje się specyficznością, prostotą, szybkością oraz łatwością wykonania w analizie fragmentów korekty i naprawy o długości krótszej niż 9 nukleotydów.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Wierność polimerazy DNA
- Mechanizmy naprawy DNA
- Zastosowania spektrometrii masowej
Wprowadzenie
- Wierność polimeraz DNA jest kluczowa dla zachowania integralności genetycznej.
- Zrozumienie procesów naprawy DNA jest niezbędne dla uzyskania wiedzy na temat mutacji i chorób.
- Spektrometria mas stanowi potężne narzędzie do analizy kwasów nukleinowych.
- Nowe metody mogą zwiększyć efektywność badań nad naprawą DNA.
Cel badania
- Opracowanie szybkiego i specyficznego testu korekty DNA.
- Ułatwienie analizy krótkich fragmentów naprawczych DNA.
- Zaprezentowanie możliwości zastosowania spektrometrii mas w warunkach klinicznych.
Zastosowane metody
- Wysokorozdzielcza spektrometria mas MALDI-TOF.
- Strategia pojedynczego przedłużenia nukleotydu.
- Przygotowanie starterów i matryc zgodnie z protokołem.
- Demonstracje wizualne w celu zapewnienia przejrzystości metodologii.
Główne wyniki
- Analiza wykazała wysoką swoistość w badaniu korekty i naprawy DNA.
- Metoda okazała się prosta i szybka, odpowiednia do różnorodnych zastosowań.
- Demonstracje wizualne ułatwiły zrozumienie procedury.
- Studenci z sukcesem przeprowadzili tę metodę w warunkach laboratoryjnych.
Wnioski
- Metoda ta usprawnia badanie wierności polimerazy DNA oraz procesów naprawy.*
- Zapewnia ona przystępne podejście dla badaczy rozpoczynających pracę ze spektrometrią mas.*
- Technikę tę można zaadaptować do zastosowań klinicznych w analizie mutacji.*
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Ta metoda spektrometrii mas MALDI-TOF umożliwia precyzyjne ilościowe określenie aktywności korektorskiej i naprawczej polimerazy DNA, zapewniając nieradyjną i beznadznacznikową metodę oceny wierności replikacji. Dzięki rozdzieleniu różnic mas pojedynczych nukleotydów, metoda ta wspiera minimalizację ryzyka mechanistycznego podczas walidacji celów dla terapeutyków kwasów nukleinowych oraz w inżynierii enzymów. Test dostarcza ilościowe, powtarzalne dane, które mogą służyć do podejmowania decyzji o kontynuacji lub przerwaniu prac (go/no-go) w programach wczesnego odkrywania leków skoncentrowanych na czynnikach modyfikujących DNA.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Pozwala na pomiar wydajności korekty DNA polimeraz w określonych pozycjach niedopasowań, umożliwiając funkcjonalną walidację wariantów enzymów.
- Wartość operacyjna: Wykorzystuje prosty i szybki schemat pracy, kompatybilny z platformami spektrometrii mas o wysokiej rozdzielczości, które znajdują się w wielu laboratoriach badawczo-rozwojowych.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Pozwala na uzyskanie ilościowych danych o intensywności piku w celu porównania aktywności korektorskiej lub naprawczej w różnych mutantach enzymów lub warunkach.
- Wartość operacyjna: Generuje widma masowe z wyraźną separacją sygnałów substratu i produktu, co umożliwia wiarygodną kwantyfikację bez konieczności znakowania.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Ocenia zdolność polimeraz do naprawy DNA na substratach zawierających uszkodzenia, co jest istotne przy ocenie genotoksyczności lub zaangażowania szlaków naprawczych.
- Wartość operacyjna: Możliwość adaptacji do testów naprawczych, takich jak naprawa uszkodzeń zasad, co wspiera badania mechanistyczne w ramach przedklinicznej oceny bezpieczeństwa.
Integracja potoku i procesu roboczego
Metoda ta wpisuje się w wczesne etapy procesów odkrywania leków, w których analizuje się wierność polimerazy oraz mechanizmy naprawy DNA w celu minimalizacji ryzyka związanego z wybranymi celami przed identyfikacją związku wiodącego.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez dotyczących funkcji korekcyjnych i naprawczych polimerazy poprzez bezpośredni pomiar zdarzeń wycinania i przedłużania nukleotydów.
- Przesiewanie: Umożliwia przygotowanie testu poprzez dostarczenie ilościowych wyników opartych na spektrometrii mas, które nadają się do przesiewania wariantów.
- Analityka: Zapewnia pomiary wysokości piku i względnej intensywności sygnału, które pozwalają na kwantyfikację wydajności korekcji lub naprawy w różnych punktach czasowych.
- Badania translacyjne: Odnosi się do istotności przedklinicznej poprzez ocenę naprawy uszkodzeń zasad, dostarczając informacji o potencjalnym ryzyku mutagennym kandydatów na leki.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Stanowi wielokrotnego użytku potencjał analityczny do charakterystyki enzymów kwasów nukleinowych w wielu projektach.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Dostarcza wglądu w mechanizmy wierności i naprawy polimerazy, zmniejszając niejednoznaczność w określaniu docelowego mechanizmu działania.
- Wartość operacyjna: Oferuje prostą, szybką i specyficzną metodę, która eliminuje konieczność stosowania radioaktywności i znakowania, co upraszcza procesy robocze oraz wymagania dotyczące bezpieczeństwa.
- Wartość strategiczna: Zwiększa pewność w wyborze celu poprzez dostarczenie ilościowych danych na temat funkcji enzymów krytycznych dla terapii celowanych w kwasy nukleinowe.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację celów związanych z polimerazą lub naprawą z uwzględnieniem ryzyka, w oparciu o empiryczne dane dotyczące wierności i naprawy.
Uwagi dotyczące implementacji
- Wymagana jest wiedza specjalistyczna z zakresu biochemii kwasów nukleowych oraz obsługi aparatury do spektrometrii mas.
- Metoda zależy od dostępu do urządzenia MALDI-TOF MS oraz powiązanych narzędzi do przygotowania próbek, takich jak dozowniki nanolitrowe.
- Aby uzyskać powtarzalne wyniki, niezbędne jest zastosowanie zestandaryzowanych procedur hybrydyzacji starterów z matrycą oraz przerywania reakcji.
- Adaptacja do różnych polimeraz lub enzymów naprawczych może wymagać optymalizacji składu buforów i czasów inkubacji.
- Ograniczenia praktyczne obejmują konieczność ostrożnego obchodzenia się z fenolem i chloroformem oraz biegłość w akwizycji i interpretacji danych z MALDI-TOF.
Najczęściej zadawane pytania dot. Biofarmacji
Chapters in this video
0:05
Title
1:17
Proofreading Reactions
3:16
Terminate the Reaction and Transfer Reaction Products to a Matrix Chip
4:54
Setup the Assay Information on the Mass Spectrometry
6:18
MALDI-TOF Mass Spectrometry (MS) Operation and Data Analysis
8:00
Results: DNA Proofreading and Repair Analyzed by MALDI-TOF MS
9:49
Conclusion
