Name: Korekta i test naprawy DNA przy użyciu przedłużenia pojedynczego nukleotydu i analizy spektrometrii mas MALDI-TOF (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-19T14:45:00.000+00:00
Duration: 11 min 8 s
Description: Poznaj metodę korekty DNA i analizy naprawy przy użyciu spektrometrii mas MALDI-TOF. Technika ta umożliwia szybkie i specyficzne badanie krótkich fragmentów naprawczych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dziękujemy NCFPB Integrated Core Facility for Functional Genomics (Tajpej, Tajwan) oraz NRPB Pharmacogenomics Lab (Tajpej, Tajwan) za ich wsparcie techniczne. Praca ta była wspierana przez granty badawcze z Tajwańskiej Fundacji Zdrowia (L-I.L.) oraz Ministerstwa Nauki i Technologii, Tajpej, Tajwan, ROC [MOST 105-2320-B-002-047] dla Woei-horng Fang, [MOST 105-2628-B-002 -051-MY3] dla Kang-Yi Su i [MOST-105-2320-B-002-051-MY3] dla Liang-In Lin.

1. Przygotowanie podkładu/szablonu
<ol>
	<li>Zaprojektuj startery/szablony o zrównoważonej zawartości G+C od 40% do 60%, jak w przypadku sekwencjonowania lub PCR startera. Użyj starterów od 18 do 21 nt dla odpowiedniego wyżarzania i lepszych sygnałów MS.</li>
	<li>Zaprojektuj szablon, ustawiając 50 °C jako minimalną temperaturę topnienia dla obszaru dupleksu z co najmniej 7 nt zwisu 5', aby oddzielić sygnały między starterem a szablonem. 
	UWAGA: Na przykład dla podłoża P21/T28 w tabeli 1 podkład 21-nt jest sparowany z matrycą 28-nt. Opcja: zastosowanie alternatywnych kwasów nukleinowych, takich jak wiązania fosforopianowe odporne na nukleazy, w celu zastąpienia ostatnich 4 wiązań fosfodiestrowych na końcu 3' matrycy, może zapobiec ewentualnym zakłóceniom spowodowanym niespecyficzną degradacją końcówki 3' matryc (np. T28S4 w tabeli 1), chociaż spowoduje to pewne koszty przygotowania matrycy.</li>
	<li>Użycie standardowych odsolonych oligonukleotydów bez dalszego oczyszczania jest zadowalające dla tego badania. Stosować startery/matryce oligonukleotydowe o stężeniu 100 pmol/μL wH2Ojako zapas i przechowywać w temperaturze -20 °C. Sprawdź jakość i czystość starterów i matryc, uruchamiając oligonukleotydy na MALDI-TOF MS (kroki 4 - 7), aby zapewnić unikalne sygnały pikowe i dobry stosunek sygnału do szumu.</li>
	<li>Określ względne intensywności sygnału MALDI-TOF MS (krok 7) równych starterów molowych odpowiednich sekwencji w reakcji w celu kalibracji i normalizacji stężenia (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2).</li>
</ol>
2. Reakcje korektorskie
Uwaga: Ten sam warunek reakcji korekty i protokół stosuje się do naprawy DNA A-I, G-I, C-I i T-I.
<ol>
	<li>Wykorzystując niezgodność T-G substratu P21/T28 do korekty w tabeli 1 jako przykład, rozcieńczyć starter P21 i matrycę T28 do 12,5 pmol/μL za pomocąH2O; następnie przenieść 12 μl rozcieńczonego startera i 12 μl rozcieńczonej matrycy do 1,5 ml wysterylizowanej probówki mikrowirówkowej. 
	UWAGA: Ilość mieszaniny matrycy/startera jest wystarczająca na 2 reakcje; Proporcjonalnie zwiększyć objętość odczynników odpowiednio dla wielu reakcji.</li>
	<li>Zamknij szczelnie rurkę. Inkubować przez 30 minut w przykrytej łaźni wodnej o temperaturze 65 °C, następnie przez 30 minut w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C, a na koniec na lodzie, aby zapewnić prawidłowe wyżarzanie.</li>
	<li>Do wysterylizowanej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml dodaj 8 μl mieszaniny startera i matrycy (50 pmol), 2 μl 10x buforu reakcyjnego korekty, 4 μl mieszanki 4 ddNTP (2 mM z każdych 4 dNTP) i H2Odo 18 μl. Przesuń probówkę, aby wymieszać. 
	UWAGA: 1x bufor reakcyjny korekty zawiera 50 mM NaCl, 10 mM MgCl2, 1 mM ditiotreitol i 10 mM Tris-HCl (pH 7,9 w 25 °C). Zapoznaj się z tabelą materiałów, aby zapoznać się z komercyjnym źródłem 10-krotnego bufora reakcyjnego korekty. Końcowe stężenie każdego ddNTP w reakcji wynosi 0,1 mM.</li>
	<li>Rozcieńczyć polimerazę DNA w lodowatym buforze reakcyjnym 1x korektorskim do pożądanego stężenia [np. do 1,5 ml probówki mikrowirówkowej dodać 4 μl 1x buforu reakcyjnego korekty i 1 μl polimerazy 5-U Klenowa ze źródła komercyjnego (tabela materiałów)]. Rozcieńczony enzym należy zawsze przechowywać na lodzie. 
	UWAGA: Ilość rozcieńczonej polimerazy DNA jest wystarczająca na 2 reakcje; proporcjonalnie zwiększyć objętość enzymów odpowiednio dla wielu reakcji. Objętość 2,0 μl, zawierająca 2,0 jednostek polimerazy Klenowa, może wykonać korektę ponad połowy z 50 pmol niedopasowanego terminala T-G P21 / T28 w ciągu 5 minut.</li>
	<li>Podgrzej wstępnie probówkę mikrowirówki z mieszanką substratu od kroku 2.3 do żądanej temperatury reakcji (np. zwykle 37 °C dla polimerazy Klenowa i 25 °C dla polimerazy DNA T4). Następnie przenieś 2,0 μl rozcieńczonej polimerazy DNA z kroku 2.4 do wstępnie podgrzanej mieszaniny substratów i przesuń probówkę, aby wymieszać jej zawartość.</li>
	<li>Odwirować probówki z enzymem i substratem przez kilka sekund przy 3 200 x g w temperaturze otoczenia, aby odwirować składniki reakcji. Natychmiast przenieść reakcję do bloku grzewczego lub łaźni wodnej o żądanej temperaturze inkubacji, jak w kroku 2.5.</li>
	<li>Zakończ reakcję
	<ol>
		<li>Dodać równą objętość buforowanego fenolu, wymieszać przez wirowanie przez kilka sekund i odwirować w mikrowirówce o stężeniu 3 200 x g w temperaturze otoczenia przez 5 minut.
		<ol>
			<li>Przenieść fazę wodną do czystej probówki do mikrowirówki i dodać równą objętość chloroformu, wymieszać przez wirowanie przez kilka sekund i odwirować w mikrodymie o stężeniu 3 200 x g w temperaturze otoczenia przez 3 minuty. Przenieść fazę wodną do czystej probówki do mikrofugi i inkubować w temperaturze 95 °C przez 5 minut, a następnie umieścić ją na lodzie. 
			UWAGA: Fenol i chloroform są niebezpiecznymi chemikaliami. Postępowanie z odpadami i ich utylizacja powinny być zgodne z regulacjami instytucjonalnymi.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Alternatywnie użyj protokołu hartowania kwasem. W tym celu dodać 2 μl 1 M HCl, aby zatrzymać reakcję na lodzie na 6 minut, a następnie dodać 0,64 μl 1 M dietanoloaminy (DEA) w celu zneutralizowania pH mieszaniny reakcyjnej i inkubować ją w temperaturze 95 °C przez 5 min; Następnie umieść go na lodzie.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Dodatek do żywicy w celu wyeliminowania zanieczyszczenia solą
<ol>
	<li>Używając miarki do żywicy z komercyjnego zestawu do odsalania (patrz tabela materiałów), weź wystarczającą ilość żywicy, aby pokryć wgłębienia płytki z żywicą z 384 wgłębieniami i 6 mg.</li>
	<li>Rozprowadź żywicę równomiernie na wszystkich wgłębieniach (6 mg/wgłębienie), zeskrobując górną część płytki. Odzyskaj nadmiar żywicy i umieść ją w butelce.</li>
	<li>Przenieść końcowe produkty reakcji z kroku 2.7 z probówek do mikrofuge na płytkę 384-dołkową. Dozować 16 μlH2Ow celu rozcieńczenia końcowych produktów reakcji w każdym dołku, a następnie uszczelnić płytkę i odwirować ją w celu usunięcia wszelkich pęcherzyków.</li>
	<li>Zdejmij uszczelkę, obróć płytkę 384-dołkową z produktami reakcji do góry nogami, aby zakryć płytkę z wgłębieniami wypełnionymi żywicą.</li>
	<li>Odwróć kanapkę z płytkami z wgłębieniami i ostrożnie pozwól, aby żywica wpadła do płytki 384-dołkowej (upewnij się, że płytka 384-dołkowa przylega do metalowego kołka na płytce z wgłębieniami wypełnionymi żywicą).</li>
	<li>Wyjąć płytkę z wgłębieniami na górze, uszczelnić płytkę 384-dołkową zawierającą mieszaniny produktów reakcji i żywicy, krótko ją odwirować przy 3 200 x g w celu usunięcia wszelkich pęcherzyków i umieścić na rotatorze na co najmniej 15 minut w temperaturze pokojowej w celu odsolenia jej zawartości.</li>
	<li>Po oczyszczeniu żywicy odwirować 384-dołkową płytkę o masie 3 200 x g przez 5 minut, aby zagęścić żywicę do dna studzienek.</li>
</ol>
4. Przenieś produkty reakcji do chipa matrycowego
<ol>
	<li>Umieść płytki próbek w dozowniku nanolitrów (nanodozownik, patrz tabela materiałów).</li>
	<li>Umieść chip matrycowy (patrz Tabela materiałów) i płytkę 384-dołkową z sekcji 3.7 w odpowiedniej tacy.</li>
	<li>Uruchom nanodozownik, aby dostrzec produkty reakcji na chipie; naciśnij przycisk RUN na ekranie dotykowym nanodozownika, aby rozpocząć.</li>
	<li>Sprawdź automatycznie przechwycony obraz plamek próbki zawierających informacje o nasyceniu na ekranie, aby upewnić się, że całkowita objętość plam na chipie wynosi około 5 - 10 nL. Powtórzyć plamienie próbki, jeśli objętość jest niewystarczająca.</li>
</ol>
5. Ustaw informacje o teście w spektrometrii mas
<ol>
	<li>Przygotuj plik w formacie .xls zawierający przewidywane informacje o sygnale do zaimportowania. Na przykład użyj ustawienia "P21_T28.xls" (Tabela 2) dla reakcji korekty P21/T28 w krokach 2, 3 i 4.</li>
	<li>Utwórz i zdefiniuj nowy test w programie użytkowym (patrz Spis materiałów), klikając prawym przyciskiem myszy opcję Importuj grupę testów w formacie Designer i wybierając plik .xls (np. "P21_T28.xls" z kroku 5.1).</li>
	<li>Ustal docelową płytkę testową za pomocą drzewa opcji Klient:Projekt:Płyta po lewej stronie ekranu, klikając prawym przyciskiem myszy wierzchołek drzewa i nadając mu nazwę pliku (np. "CTT20171201" oznacza kod testu i datę).</li>
	<li>Wybierz typ płytki 384-dołkowej i naciśnij OK; pojawi się pusta płytka.</li>
	<li>Wybierz odpowiedni test (np. P21_T28) po lewej stronie ekranu.</li>
	<li>Przypisz wybrany test (np. P21_T28) dla każdej próbki zauważonej pozycji próbki na chipie, podświetlając studzienkę i klikając prawym przyciskiem myszy, aby wybrać Dodaj pleks.</li>
	<li>Przygotuj roboczą listę wszystkich testów na chipie w .xlsx formacie bez nagłówka (np. 1201.xlsx w tabeli 3). Zaimportuj listę roboczą za pomocą opcji Dodaj nowy przykładowy projekt.</li>
	<li>Przypisz test z listy roboczej (np. od 1201.xlsx) do każdej pozycji testu P21_T28 i wybierz przez kliknięcie prawym przyciskiem myszy.</li>
</ol>
6. Operacja MALDI-TOF MS
<ol>
	<li>Połącz spektrometr mas z chipem za pomocą programu aplikacyjnego (patrz tabela materiałów).</li>
	<li>Wybierz ustawienie domyślne po prawej stronie ekranu.</li>
	<li>Wpisz nazwę testu z kroku 5.3 (np. CTT20171201), identyfikator chipa w rogu chipa i zapisz ustawienia.</li>
	<li>Uruchom program sterujący MS (patrz Tabela materiałów).</li>
	<li>Naciśnij przycisk In/Out i wyjmij płytę zwiadowczą. Umieść zauważony chip z kroku 4.4 na płytce zwiadowczej i naciśnij przycisk In/Out, aby zauważony chip wszedł do spektrometru masowego.</li>
	<li>Kliknij przycisk Acquire (Pobieranie) w programie aplikacyjnym (patrz tabela materiałów), aby uruchomić spektrometrię mas i uzyskać dane.</li>
</ol>
7. Analiza danych
<ol>
	<li>Otwórz program do analizy danych (patrz Tabela materiałów).</li>
	<li>Przejrzyj drzewo bazy danych w lewym górnym rogu i wybierz identyfikator chipa z kroku 6.3. Otwórz plik danych po prawej stronie ekranu.</li>
	<li>Kliknij ikonę widma, aby wyświetlić widmo masowe. Aby przyciąć określony zakres m/z, kliknij prawym przyciskiem myszy, aby wybrać Okno dialogowe dostosowywania, a w nowym oknie kliknij Oś X i ustaw żądany górny i dolny limit, a następnie naciśnij OK, aby wyświetlić określony zakres spektrum.</li>
	<li>Wyeksportuj widmo do prowadzenia rekordów, klikając prawym przyciskiem myszy Eksportuj. 
	UWAGA: Użycie skali o szerokości 1,600 / jednostki 1,200 to rozsądny rozmiar do kontroli danych na ekranie komputera.
	<ol>
		<li>Wybierz typ pliku JPEG, kliknij Miejsce docelowe, wybierz Przeglądaj dysk (np. dysk flash E:), wpisz nazwę pliku (np. 1201-1.jpg), a następnie kliknij Eksportuj.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Aby określić ilościowo dane, użyj kursora i kliknij szczyt, aby wyświetlić wysokość piku w lewym górnym rogu.
	<ol>
		<li>Możesz też wydrukować wyeksportowany plik JPEG i ręcznie zmierzyć wysokość piku za pomocą linijki.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Loeb, L. A., Kunkel, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fidelity+of+DNA+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Fidelity of DNA synthesis.</a> Annual Review of Biochemistry. 51, 429-457 (1982).</li>
<li>Kornberg, A., Baker, T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKornberg%2C+A+%22DNA+replication%22">DNA replication</a>. , W.H. Freeman. Oxford, UK. (1992).</li>
<li>Carroll, S. S., Benkovic, S. J. <a target="_blank" href="https://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/cr00105a011">Mechanistic aspects of DNA polymerases: Escherichia coli DNA polymerase I (Klenow fragment) as a paradigm.</a> Chemical Reviews. 90 (7), 1291-1307 (1990).</li>
<li>Echols, H., Goodman, M. F. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/1883202">Fidelity Mechanisms in DNA Replication.</a> Annual Review of Biochemistry. 60 (1), 477-511 (1991).</li>
<li>Johnson, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+kinetic+and+chemical+mechanism+of+high-fidelity+DNA+polymerases%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">The kinetic and chemical mechanism of high-fidelity DNA polymerases.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1804 (5), 1041-1048 (2010).</li>
<li>Reha-Krantz, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+polymerase+proofreading%3A+Multiple+roles+maintain+genome+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">DNA polymerase proofreading: Multiple roles maintain genome stability.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1804 (5), 1049-1063 (2010).</li>
<li>Fidalgo da Silva, E., Reha-Krantz, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+polymerase+proofreading%3A+active+site+switching+catalyzed+by+the+bacteriophage+T4+DNA+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">DNA polymerase proofreading: active site switching catalyzed by the bacteriophage T4 DNA polymerase.</a> Nucleic Acids Research. 35 (16), 5452-5463 (2007).</li>
<li>Petruska, J., Goodman, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+neighboring+bases+on+DNA+polymerase+insertion+and+proofreading+fidelity%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Influence of neighboring bases on DNA polymerase insertion and proofreading fidelity.</a> The Journal of Biological Chemistry. 260 (12), 7533-7539 (1985).</li>
<li>Mendelman, L. V., Petruska, J., Goodman, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Base+mispair+extension+kinetics.+Comparison+of+DNA+polymerase+%CE%B1+and+reverse+transcriptase%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Base mispair extension kinetics. Comparison of DNA polymerase α and reverse transcriptase.</a> The Journal of Biological Chemistry. 265 (4), 2338-2346 (1990).</li>
<li>Lutz, S., Burgstaller, P., Benner, S. A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10373598">An in vitro screening technique for DNA polymerases that can incorporate modified nucleotides. Pseudothymidine as a substrate for thermostable polymerases.</a> Nucleic Acids Research. 27 (13), 2792-2798 (1999).</li>
<li>Da Silva, E. F., Mandal, S. S. S., Reha-Krantz, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+2-aminopurine+fluorescence+to+measure+incorporation+of+incorrect+nucleotides+by+wild+type+and+mutant+bacteriophage+T4+DNA+polymerases%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Using 2-aminopurine fluorescence to measure incorporation of incorrect nucleotides by wild type and mutant bacteriophage T4 DNA polymerases.</a> The Journal of Biological Chemistry. 277 (43), 40640-40649 (2002).</li>
<li>Frey, M. W., Sowers, L. C., Millar, D. P., Benkovic, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nucleotide+analog+2-aminopurine+as+a+spectroscopic+probe+of+nucleotide+incorporation+by+the+Klenow+fragment+of+Escherichia+coli+polymerase+I+and+bacteriophage+T4+DNA+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">The nucleotide analog 2-aminopurine as a spectroscopic probe of nucleotide incorporation by the Klenow fragment of Escherichia coli polymerase I and bacteriophage T4 DNA polymerase.</a> Biochemistry. 34 (28), 9185-9192 (1995).</li>
<li>Leung, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+highly+sensitive+G-quadruplex-based+luminescent+switch-on+probe+for+the+detection+of+polymerase+3%27-5%27+proofreading+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">A highly sensitive G-quadruplex-based luminescent switch-on probe for the detection of polymerase 3'-5' proofreading activity.</a> Methods. 64 (3), 224-228 (2013).</li>
<li>Song, C., Zhang, C., Zhao, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+sensitive+detection+of+DNA+polymerase+fidelity+by+singly+labeled+smart+fluorescent+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors+and+Bioelectronics%22%5BJournal%5D)">Rapid and sensitive detection of DNA polymerase fidelity by singly labeled smart fluorescent probes.</a> Biosensors and Bioelectronics. 26 (5), 2699-2702 (2011).</li>
<li>Haff, L. A., Smirnov, I. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-nucleotide+polymorphism+identification+assays+using+a+thermostable+DNA+polymerase+and+delayed+extraction+MALDI-TOF+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Single-nucleotide polymorphism identification assays using a thermostable DNA polymerase and delayed extraction MALDI-TOF mass spectrometry.</a> Genome Research. 7 (4), 378-388 (1997).</li>
<li>Haff, L. A., Smirnov, I. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+genotyping+of+PCR+products+with+MassTag-labeled+primers%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Multiplex genotyping of PCR products with MassTag-labeled primers.</a> Nucleic Acids Research. 25 (18), 3749-3750 (1997).</li>
<li>Blondal, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+MALDI-TOF+based+methodology+for+genotyping+single+nucleotide+polymorphisms%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">A novel MALDI-TOF based methodology for genotyping single nucleotide polymorphisms.</a> Nucleic Acids Research. 31 (24), e155(2003).</li>
<li>Su, K. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pretreatment+Epidermal+Growth+Factor+Receptor+%28EGFR%29+T790M+mutation+predicts+shorter+EGFR+tyrosine+kinase+inhibitor+response+duration+in+patients+with+non-small-cell+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Pretreatment Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR) T790M mutation predicts shorter EGFR tyrosine kinase inhibitor response duration in patients with non-small-cell lung cancer.</a> Journal of Clinical Oncology. 30 (4), 433-440 (2012).</li>
<li>Lee, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endonuclease+V-mediated+deoxyinosine+excision+repair+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Repair%22%5BJournal%5D)">Endonuclease V-mediated deoxyinosine excision repair in vitro.</a> DNA Repair. 9, 1073-1079 (2010).</li>
<li>Lee, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+excision+of+3%27+penultimate+errors+by+DNA+polymerase+I+and+its+role+in+endonuclease+V-mediated+DNA+repair%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Repair%22%5BJournal%5D)">The excision of 3' penultimate errors by DNA polymerase I and its role in endonuclease V-mediated DNA repair.</a> DNA Repair. 12 (11), 899-911 (2013).</li>
<li>Kucera, R. B., Nichols, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA-Dependent+DNA+Polymerases%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">DNA-Dependent DNA Polymerases.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 84 (1), 3.5.1-3.5.19 (2008).</li>
<li>Tabor, S., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single+residue+in+DNA+polymerases+of+the+Escherichia+coli+DNA+polymerase+I+family+is+critical+for+distinguishing+between+deoxy-+and+dideoxyribonucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">A single residue in DNA polymerases of the Escherichia coli DNA polymerase I family is critical for distinguishing between deoxy- and dideoxyribonucleotides.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (14), 6339-6343 (1995).</li>
<li>Weiss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Removal+of+deoxyinosine+from+the+Escherichia+coli+chromosome+as+studied+by+oligonucleotide+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Repair%22%5BJournal%5D)">Removal of deoxyinosine from the Escherichia coli chromosome as studied by oligonucleotide transformation.</a> DNA Repair. 7 (2), 205-212 (2008).</li>
<li>Cao, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endonuclease+V%3A+an+unusual+enzyme+for+repair+of+DNA+deamination%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Endonuclease V: an unusual enzyme for repair of DNA deamination.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 70 (17), 3145-3156 (2013).</li>
<li>Su, K. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+single+nucleotide+extension+and+MALDI-TOF+mass+spectrometry+in+proofreading+and+DNA+repair+assay%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Repair%22%5BJournal%5D)">Application of single nucleotide extension and MALDI-TOF mass spectrometry in proofreading and DNA repair assay.</a> DNA Repair. 61, 63-75 (2018).</li>
<li>Carver, T. E., Hochstrasser, R. A., Millar, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proofreading+DNA%3A+recognition+of+aberrant+DNA+termini+by+the+Klenow+fragment+of+DNA+polymerase+I%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Proofreading DNA: recognition of aberrant DNA termini by the Klenow fragment of DNA polymerase I.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (22), 10670-10674 (1994).</li>
<li>Santa Lucia, J. Jr, Hicks, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+thermodynamics+of+DNA+structural+motifs%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biophysics+and+Biomolecular+Structure%22%5BJournal%5D)">The thermodynamics of DNA structural motifs.</a> Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 33, 415-440 (2004).</li>
<li>Su, K. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+polymerase+I+proofreading+exonuclease+activity+is+required+for+endonuclease+V+repair+pathway+both+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Repair%22%5BJournal%5D)">DNA polymerase I proofreading exonuclease activity is required for endonuclease V repair pathway both in vitro and in vivo.</a> DNA Repair. 64, 59-67 (2018).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W badaniu tym opisano krok po kroku test czynności korektorskich analizowany przez wybrany instrument komercyjny (patrz tabela materiałów) przy użyciu MALDI-TOF MS. Do głównych zalet należy to, że podkład i szablon są wolne od etykiet i łatwe do wykonania, co pozwala na większą elastyczność w projektowaniu eksperymentów. Kompletne przetworzenie 30 testów korektorskich metodą stream-lime zajęłoby 4 godziny, w tym 3 godziny na ręczne przeprowadzenie reakcji korektorskich i ich oczyszczenie, podczas gdy ana...

Funkcje korekty polimeraz DNA podczas replikacji DNA są niezbędne do zapewnienia wysokiej wierności informacji genetycznej, która musi zostać przekazana potomstwu1,2,3,4,5,6,7. Możliwość oceny wkładu egzonukleaz w korektę polimerazy pozwoliłaby wyjaśnić mechanizmy gwarantujące stabilność genetyczną.
Znakowanie radioizotopowe i testy żelowe w połączeniu z analizami densytometrycznymi autoradiogramów lub obrazowania luminoforowego8,9,10 tradycyjnie były używane do wykrywania aktywności korektorskiej polimeraz DNA. Chociaż testy te są funkcjonalne, są pracochłonne, drogie i nie nadają się do formatów o wysokiej przepustowości. Ponadto izotopy promieniotwórcze są zagrożone względami bezpieczeństwa, w tym z utylizacją odpadów. Alternatywnie, czynności korektorskie zostały przeanalizowane za pomocą technik fluorometrycznych. Na przykład 2-aminopuryna (2-AP) może być włączona do produktów przedłużających podczas testów polimerazy in vitro w celu wytworzenia sygnału fluorescencyjnego11,12. Niestety, podejścia te mają niską specyficzność, ponieważ 2-AP może łączyć się zarówno z tyminą, jak i cytozyną. Nowsze podejścia obejmują czułą sondę luminescencyjną opartą na G-quadruplex do testu egzonukleazy polimerazy 3'-5'13, a także pojedynczo znakowaną sondę fluorescencyjną do testu korekty polimerazy, który przezwycięża niektóre z wyżej wymienionych wad14. Entuzjazm dla tych metod fluorometrycznych jest zmniejszony ze względu na potrzebę specyficznego znakowania substratów DNA.
Przeciwnie, MALDI-TOF MS do analizy DNA został zastosowany w teście PinPoint, gdzie reakcje rozszerzenia startera z nieznakowanymi 4 ddNTP mogą być używane do identyfikacji polimorfizmów w danym locus15,16,17 i zostało szeroko przyjęte w zastosowaniach klinicznych do wykrywania mutacji i diagnozowania raka18. Korzystając z tych podstawowych zasad, stworzyliśmy bezznacznikowy test do oznaczania in vitro aktywności korektorskiej polimerazy DNA, wykorzystując wysoką rozdzielczość, wysoką specyficzność i potencjał wysokiej przepustowości MALDI-TOF MS. Wykorzystując fragment Klenowa polimerazy DNA E. coli I jako enzym modelowy, trifosforany dideoksyrybonukleotydowe (ddNTP) jako substraty mogą wykonać "migawkę" produktów korektorskich po rozszerzeniu pojedynczego nukleotydu za pomocą MALDI-TOF MS ( Rysunek 1).
Podobnie, ta metoda została również opracowana dla testu naprawy DNA, gdzie startery zawierające przedostatnie zmiany 3' dI są poddawane testowi naprawczemu pol I, który naśladuje pośrednie naprawa nacięć endo V. Chociaż nie jest to w pełni zrozumiałe, ścieżka naprawy endo V jest jedynym znanym systemem naprawczym, o którym wiadomo, że wykorzystuje aktywność egzonukleazy z korektą pol I do wycinania zmian chorobowych19,20. Za pomocą MALDI-TOF MS pokazujemy jasno zdefiniowaną łatkę naprawczą, w której dI może zostać wycięte przez pol I, gdy występuje w ostatnich 2 nt startera przed dodaniem prawidłowego uzupełnionego nukleotydu.
Do badania korekty i naprawy DNA, ta metoda jest szybsza i mniej pracochłonna niż poprzednie metody i dostarcza dodatkowych informacji na temat mechanizmu i funkcji.

<table><tbody><tr><td>Oligonukleotydy</td><td>Misja Biotech (Tajwan)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>fosforan modyfikowane oligonukleotydy</td><td>Zintegrowane technologie DNA (Tajwan)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polimeraza DNA I, duży (Klenow) fragment</td><td>New England Biolabs, MA</td><td>M0210L</td><td></td></tr><tr><td>Fragment Klenowa (3'&rzadko; 5' egzo-)</td><td>New England Biolabs, MA</td><td>M0212L</td><td></td></tr><tr><td>NEBuffer 2.1 (10X)</td><td>New England Biolabs, MA</td><td>B7202S</td><td></td></tr><tr><td>2', 3' ddATP</td><td>Trilink Biotechnologies, CA</td><td>N4001</td><td></td></tr><tr><td>2', 3' ddGTP</td><td>Trilink Biotechnologies, CA</td><td>N4002</td><td></td></tr><tr><td>2', 3' ddTTP</td><td>Trilink Biotechnologies, CA</td><td>N4004</td><td></td></tr><tr><td>2', 3' ddCTP</td><td>Trilink Biotechnologies, CA</td><td>N4005</td><td></td></tr><tr><td>dATP, dGTP, dCTP, zestaw dTTP</td><td>Clubio, Tajwan</td><td>CB-R0315</td><td></td></tr><tr><td>Macierz SpectroCHIP</td><td>Agena Bioscience, CA</td><td>#01509</td><td></td></tr><tr><td>MassARRAY</td><td>Agena Bioscience, CA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Typer 4.0 oprogramowanie</td><td>Agena Bioscience, CA</td><td>#10145</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw narzędzi do czystej żywicy</td><td>Agena Bioscience, CA</td><td>#08040</td><td></td></tr></tbody></table>

korekta i test naprawy dna przy użyciu przedłużenia pojedynczego nukleotydu i analizy spektrometrii mas maldi-tof

Proofreading and DNA Repair Assay Using Single Nucleotide Extension and MALDI-TOF Mass Spectrometry Analysis

Utrzymanie genomu i jego wierna replikacja jest najważniejsze dla zachowania informacji genetycznej. Aby ocenić replikację o wysokiej wierności, opracowaliśmy prostą, nieznakowaną i nieradioizotopową metodę wykorzystującą jonizację desorpcji laserowej wspomaganą matrycą z analizą spektrometrii mas (MS) czasu przelotu (MALDI-TOF) do badania korektorskiego. W tym przypadku polimeraza DNA [np. fragment Klenowa (KF) polimerazy DNA Escherichia coli I (pol I) w tym badaniu] w obecności wszystkich czterech trifosforanów dideoksyrybonukleotydowych jest używana do przetwarzania niedopasowanego dupleksu starter-matryca. Niedopasowany podkład jest następnie sprawdzany/rozszerzany i poddawany działaniu MALDI-TOF MS. Produkty wyróżniają się zmianą masy startera do zmian pojedynczych nukleotydów. Co ważne, korektę można również ustalić dla pojedynczych niezgodności wewnętrznych, choć przy różnej wydajności. Niedopasowania zlokalizowane na poziomie 2-4-nukleotydów (nt) od końca 3' zostały skutecznie sprawdzone przez pol I, a niedopasowanie na poziomie 5 nt od końca startera wykazało tylko częściową korektę. Nie przeprowadzono korekty dla wewnętrznych niedopasowań zlokalizowanych w odległości 6 - 9 nt od końca podkładu 3'. Metoda ta może być również stosowana do testów naprawy DNA (np. Ocena naprawy uszkodzeń zasad substratów dla szlaku naprawy endo V). Startery zawierające przedostatnie zmiany deoksyinozyny (dI) 3' mogą być korygowane przez pol I. Rzeczywiście, przedostatnie substraty T-I, G-I i A-I miały ostatnie 2 nukleotydy zawierające diI wycięte przez pol I przed dodaniem prawidłowego 5'-monofosforanu ddN (ddNMP), podczas gdy przedostatnie niedopasowania C-I były tolerowane przez pol I, co pozwoliło na przedłużenie startera bez naprawy, wykazując czułość i rozdzielczość testu MS do pomiaru naprawy DNA.

Szablony i startery:
Zgodnie z przedstawioną tutaj procedurą, syntetyczne matryce oligonukleotydowe i startery o odpowiednich sekwencjach w równomolowych ilościach, pozyskane od dostawców komercyjnych, zostały sprawdzone pod kątem czystości i jakości (Rysunek 3A; zwróć uwagę, że sygnały odpowiadają podanej masie i niskiemu tle) oraz pod kątem zależności między intensywnością szczytu...

Nieoznakowana, nieradio-izotopowa metoda korekty polimerazy DNA i testu naprawy DNA została opracowana przy użyciu spektrometrii mas MALDI-TOF o wysokiej rozdzielczości i strategii przedłużania pojedynczego nukleotydu. Test okazał się bardzo specyficzny, prosty, szybki i łatwy do wykonania w przypadku korekty i naprawy łatek krótszych niż 9-nukleotydy.

Korekta i test naprawy DNA przy użyciu przedłużenia pojedynczego nukleotydu i analizy spektrometrii mas MALDI-TOF

The maintenance of the genome and its faithful replication is paramount for conserving genetic information. To assess high fidelity replication, we have ...

Metoda ta może pomóc w znalezieniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie polimerów DNA, wierności i naprawy DNA, takie jak metody korekty i analizy oraz zdefiniowanie łatki naprawczej DNA. Główną zaletą tej techniki jest to, że jest bardzo specyficzna, prosta, szybka i łatwa do wykonania. Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które są nowe w tej metodzie, będą miały trudności, ponieważ nadal zajmują się replikacją DNA i dziedziną naprawy, mogą nie być zaznajomione z oprzyrządowaniem do spektrometrii mas i interpretacją danych.Myślę, że najważniejsze jest to, że demonstracja wizualna jest bardzo ważna, ponieważ możemy pokazać, w jaki sposób nasza komercyjnie opracowana spektrometria mas do zastosowań klinicznych, takich jak mutacje i deputacja, może być wygodnie zaadaptowana do korekty DNA i badania naprawy. Procedurę zademonstrują absolwenci Rong-Syuan i Kuei-Ching z mojego laboratorium. Rozpocznij tę procedurę od przygotowania podkładu i szablonu zgodnie z opisem w protokole tekstowym.Jako przykład użyj niezgodności TG podłoża P21 z T28 do korekty. Rozcieńczyć podpłomę P21 i matrycę T28 do 12,5 pikomoli na mikrolitr wodą. Następnie przenieś 12 mikrolitrów rozcieńczonego startera i 12

proofreading-dna-repair-assay-using-single-nucleotide-extension-maldi

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Opisujemy metodę ilościowego pomiaru aktywności glikozylazy DNA oraz endonukleazy AP w czasie rzeczywistym w lizatach jąder komórkowych. Analiza ta pozwala na wyznaczenie szybkości aktywności naprawy DNA umożliwiającej analizę kinetyczną i może być dostosowana do ilościowego oznaczania aktywności naprawy DNA w lizatach tkanek i nowotworów lub z użyciem oczyszczonych białek.

Ilościowa analiza w czasie rzeczywistym aktywności naprawy przez wycinanie zasad w lizatach komórkowych z wykorzystaniem specyficznych dla uszkodzeń sond molekularnych (molecular beacons)

Obrazowanie spektroskopowe elektronów może obrazować i odróżniać kwas nukleinowy od białka z rozdzielczością nanometrów. Można go połączyć z systemem miniSOG, który jest w stanie specyficznie znakować znakowane białka w próbkach z transmisyjnej mikroskopii elektronowej. Zastosowanie tych technologii ilustrujemy na przykładzie dwuniciowych ognisk naprawy pęknięć.

Wizualizacja białek naprawczych DNA oznaczonych tagami miniSOG w połączeniu z obrazowaniem spektroskopowym elektronów (ESI)

Tutaj pokazano badanie różnych podejść do rozpoznawania zmian DNA za pomocą obrazowania AFM pojedynczej cząsteczki na przykładzie systemu naprawy wycinania nukleotydów. Opisano procedury przygotowania próbek DNA i białek oraz szczegóły doświadczalne i analityczne dla doświadczeń AFM.

Badania mikroskopii sił atomowych rozpoznawania zmian DNA w naprawie przez wycinanie nukleotydów

Tutaj pokazano, jak test ligacji zbliżeniowej in situ (PLA) może być wykorzystany do wykrywania i wizualizacji bezpośrednich interakcji białko-białko między ATM i p53 w hodowlach komórek zawiesinowych narażonych na stres genotoksyczny.

Wykrywanie i wizualizacja kompleksów białkowych indukowanych uszkodzeniem DNA w hodowlach komórek zawiesinowych za pomocą testu ligacji zbliżeniowej

Nieoznakowana, nieradio-izotopowa metoda oznaczania aktywności glikozylazy uracylo-DNA została opracowana przy użyciu spektrometrii mas MALDI-TOF do bezpośredniej analizy produktu zawierającego miejsce apurinowe/apirymidynowe. Test okazał się dość prosty, specyficzny, szybki i łatwy w użyciu do pomiaru glikozylazy DNA.

Test glikozylazy uracylo-DNA za pomocą spektrometrii mas z desorpcją/jonizacją laserową wspomaganą matrycą

Tutaj opisujemy dwie modyfikacje testu włókien DNA w celu zbadania jednoniciowych luk w DNA podczas replikacji DNA po indukcji zmiany. Test włókien S1 umożliwia wykrycie luk poreplikacyjnych za pomocą endonukleazy S1 specyficznej dla ssDNA, podczas gdy test wypełniania luk umożliwia wizualizację i ilościowe określenie naprawy luki.

Wykrywanie akumulacji i naprawy luk poreplikacyjnych w komórkach ludzkich za pomocą testu włókien DNA

MALDI-TOF został użyty do scharakteryzowania fragmentów uzyskanych z reaktywności pomiędzy utlenionym RNA a egzorybonukleazą Xrn-1. Niniejszy protokół opisuje metodologię, która może być stosowana do innych procesów z udziałem RNA i/lub DNA.

Identyfikacja fragmentów RNA powstałych w wyniku degradacji enzymatycznej za pomocą spektrometrii mas MALDI-TOF

Ten protokół opisuje test pozachromosomalnego łączenia niehomologicznych końców (NHEJ) i test rekombinacji homologicznej (HR) w celu ilościowego określenia efektywności NHEJ i HR w komórkach HEK-293T.

Analiza niehomologicznego łączenia końców i skuteczności rekombinacji homologicznej w komórkach HEK-293T przy użyciu systemów reporterowych opartych na GFP

Prezentujemy protokoły oceny biegłości w naprawie szlaku pęknięć dwuniciowych w komórkach przy użyciu zestawu pozachromosomalnych substratów reporterowych opartych na luminescencji.

Ocena aktywności naprawczej pęknięć podwójnej nici DNA przy użyciu wysokoprzepustowych i ilościowych testów reporterowych opartych na luminescencji

Elastyczność konformacyjna odgrywa kluczową rolę w funkcjonowaniu białek. W tym artykule opisujemy zastosowanie czasowo-rozdzielczej spektrometrii mas z jonizacją elektronrozpylającą sprzężoną z wymianą wodorowo-deuterową do badania szybkich zmian strukturalnych, które napędzają funkcję w uporządkowanych i nieuporządkowanych białkach.

Spektrometria mas z jonizacją wodorowo-deuterową z jonizacją elektrorozpylającą do badania struktury i dynamiki białek

Poznaj metodę korekty DNA i analizy naprawy przy użyciu spektrometrii mas MALDI-TOF. Technika ta umożliwia szybkie i specyficzne badanie krótkich fragmentów naprawczych.

Korekta i test naprawy DNA przy użyciu przedłużenia pojedynczego nukleotydu i analizy spektrometrii mas MALDI-TOF

Przeglądaj więcej filmów