Name: Obrazowanie żywych komórek szlaku sygnałowego TGF-β/Smad3 in vitro i in vivo przy użyciu systemu reporterowego adenowirusa (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 6 s
Description: Poznaj metodę obrazowania żywych komórek szlaku TGF-β/Smad3 przy użyciu systemu reporterowego adenowirusa. Technika umożliwia nieinwazyjne śledzenie sygnałowania komórkowego w czasie rzeczywistym in vitro i in vivo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez granty od Narodowej Rady Zdrowia i Badań Medycznych (NHMRC) dla H-JZ. TMBW jest laureatem australijskiej nagrody podyplomowej od rządu australijskiego oraz stypendium Ann Henderson Top-Up Scholarship od Australian Rotary Health we współpracy z Rotary of Templestowe i Dine for a Cure.

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Komitet Etyki Zwierząt Uniwersytetu w Melbourne.
Uwaga: Sekwencja, budowa i protokół generowania wektorów adenowirusowych pAd-CMV-Td-Tom, pAd-CMV-GFP i pAd-CAGA12-Luc/Td-Tom zostały wcześniej opisane11,12,13. Wszystkie wektory są dostępne na rynku.
1. Oznaczanie miana wirusa przy użyciu 50% dawki zakaźnej w kulturze tkankowej (TCID50)
<ol>
	<li>Przygotuj 1 x 106 HEK293A komórek w 10 ml pożywki DMEM + 10% FBS.</li>
	<li>Umieść 100 μl zawiesiny komórkowej w każdym dołku 96-dołkowej płytki do hodowli komórek płaskodennych.</li>
	<li>Przygotować 1 ml roztworu wirusa o rozcieńczeniu 1:100 w kompletnym podłożu. Dodać 11 μl rozcieńczonego wirusa do każdego studzienki w kolumnie 1.</li>
	<li>Wykonać seryjne 10-krotne rozcieńczenia bezpośrednio na płytce 96-dołkowej, mieszając 11 μl rozcieńczonego wirusa ze 100 μl zawiesiny komórek, aż do osiągnięcia końcowego rozcieńczenia 1x10 12. Chociaż na tym etapie komórki nie przylegają, liczba komórek przenoszonych między studzienkami pozostaje stała.</li>
	<li>Odpipetować 11 μl każdego rozcieńczenia do każdej kolumny, zaczynając od najwyższego rozcieńczenia 10:4. Wymieniaj końcówki pipet przy każdym rozcieńczeniu, aby ograniczyć przenikanie się cząstek wirusa.</li>
	<li>Dodać 11 μl kompletnej pożywki wolnej od wirusów do kolumny 12 jako kontrolę ujemną.</li>
	<li>Inkubować płytkę przez 7 - 10 dni w temperaturze 37 °C z 10% CO2 .</li>
	<li>Za pomocą mikroskopu oceń liczbę dołków w każdej kolumnie wykazujących oznaki działania cytopatycznego lub cytotoksycznego. Rozważ dobrze pozytywny, jeśli występują jakiekolwiek oznaki infekcji.</li>
	<li>Oblicz frakcję dołków dodatnich dla każdego rozcieńczenia, korzystając z metody statystycznej Reeda i Muencha (1938)14.</li>
	<li>Oblicz odległość proporcjonalną (PD) za pomocą: (A-50)/(A-B), gdzie A jest odpowiedzią procentową powyżej lub równą 50%, a B jest odpowiedzią procentową poniżej 50%.</li>
	<li>Obliczać TCID50 za pomocą: 10X-PD, gdzie X jest rozcieńczeniem dającym odpowiedź większą niż 50%.</li>
	<li>Oblicz miano wirusa na podstawie następujących metod: 0,69/(0,011 x TCID50) PFU/ml</li>
</ol>
2. Oznaczanie MOI adenowirusa
<ol>
	<li>Nasiona 1,0 - 1,5 x 105 komórek MDA-MB-231 z 500 μl pożywki hodowlanej DMEM zawierającej 5% FBS w każdym dołku płytki 12-dołkowej (35% konfluencji komórek, łącznie 6 dołków).</li>
	<li>Oblicz objętości zapasów Ad-CMV-Td-Tom wymagane dla 0, 250, 500, 2500 i 5000 MOI, korzystając z następującego wzoru: MOI = (objętość [μL] x PFU/μL)/liczba komórek. W przypadku Ad-CMV-Td-Tom o mianie 1 x10 10 (PFU/ml) wymagane objętości MOI infekcji wirusowej wynoszą odpowiednio 0, 3,75, 7,5, 37,5 i 75 μl.</li>
	<li>Zakażone komórki objętościami obliczonymi w sekcji 2.2 należy zainfekować je poprzez bezpośrednie pipetowanie zapasów wirusa do studzienek z dokładnym wymieszaniem.</li>
	<li>Umieścić płytkę w inkubatorze w temperaturze 37 °C z 10% CO2 na 24 godziny.</li>
	<li>Usunąć pożywkę z dołków i natychmiast utrwalić komórki 500 μl 10% formaliny przez 5 minut. </li>
	<li>Odessać formalinę ze studzienek i przemyć studzienki jednorazowo 500 μl PBS.</li>
	<li>Wybarwić jądro komórkowe 500 μl roztworu Hoechsta przez 5 minut.</li>
	<li>Usunąć roztwór Hoechst i przemyć studzienki 3 razy 500 μl PBS.</li>
	<li>Zobrazuj sygnał białka Td-Tomato i jądra komórkowego przy użyciu 200-krotnego powiększenia pod mikroskopem fluorescencyjnym. Wzbudz białko Td-Tomato przy 554 nm i barwnik Hoechst przy 352 nm.</li>
	<li>Analizuj obrazy za pomocą ImageJ, aby określić roboczy MOI wymagany do 100% infekcji Td-Tomato15.</li>
</ol>
3. Transdukcja podwójnego adenowirusa w żywych pojedynczych komórkach
<ol>
	<li>Nasiona 1,0 - 1,5 x 105 komórek MDA-MB-231 z 500 μl pożywki hodowlanej DMEM zawierającej 5% FBS w każdym dołku płytki 12-dołkowej (35% konfluencji komórek, łącznie 2 dołki).</li>
	<li>Zainfekuj komórki 75 μl Ad-CMV-GFP (miano = 5 x 109 PFU/ml) i 7,5 μl Ad-CAGA 12-Td-Tom (miano = 5 x10 10 PFU/ml), aby uzyskać 2,500 MOI, co może osiągnąć 100% dodatni wynik infekcji.</li>
	<li>Traktuj komórki z lub bez 0,25 μl TGF-β na studzienkę (10 mg / ml w magazynie, 5 ng / μl jako stężenie końcowe) natychmiast po zakażeniu adenowirusem.</li>
	<li>Umieścić płytkę w inkubatorze w temperaturze 37 °C z 10% CO2 na 24 godziny.</li>
	<li>Obrazuj żywe komórki za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego z kontrastem fazowym. Wzbudz GFP przy 470 nm i białko Td-Tomato przy 554 nm.</li>
	<li>Napraw komórki i wybarwij jądro komórkowe zgodnie z opisem w krokach 1.6 - 1.9.</li>
	<li>Zobrazuj białko Td-Tomato i barwienie Hoechsta za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego. Wzbudzić barwnik Hoechst przy długości fali 352 nm.</li>
	<li>Korzystając z ImageJ, oblicz procent komórek GFP i Td-Tomato-dodatnich15.</li>
</ol>
4. Żywa sygnalizacja jednokomórkowa w teście gojenia się ran
<ol>
	<li>Nasiona 4 - 5 x 105 komórek MDA-MB-231 z 1 ml pożywki hodowlanej DMEM zawierającej 5% FBS w każdym dołku płytki 6-dołkowej (50% zbieżności komórek, łącznie 2 dołki).</li>
	<li>Zainfekuj komórki 22,5 μl Ad-CAGA 12-Td-Tom (miano = 5 x 1010 PFU/ml, MOI = 2,500).</li>
	<li>Umieścić płytkę w inkubatorze w temperaturze 37 °C z 10% CO2 na 24 godziny.</li>
	<li>Zdrap dwie skrzyżowane linie na warstwie komórkowej każdej studzienki za pomocą końcówki pipety P200.</li>
	<li>Usuń stare pożywki z dołków i zastąp je 2 ml świeżej 5% pożywki FBS z lub bez 0,5 μl TGF-β na studzienkę (10 mg / ml w magazynie, 5 ng / μl jako stężenie końcowe).</li>
	<li>Umieścić płytkę w inkubatorze w temperaturze 37 °C z 10% CO2 na 5 min i wykonać zdjęcia wybranych obszarów rany przy użyciu 100-krotnego powiększenia na mikroskopie z kontrastem fazowym.</li>
	<li>Umieścić płytkę w inkubatorze w temperaturze 37 °C z 10% CO2 na 24 godziny.</li>
	<li>Zrób zdjęcia zamknięcia rany w tych samych miejscach, co wcześniej.</li>
	<li>Napraw komórki, wybarwij jądro komórkowe zgodnie z opisem w krokach 1.6 - 1.9 i wizualizuj sygnał Td-Tomato w obszarze rany i obszarze bez rany za pomocą 200-krotnego powiększenia pod mikroskopem fluorescencyjnym.</li>
	<li>Określ ilościowo procent komórek Td-pomidorowo-dodatnich w obszarze rany i bez rany za pomocą oprogramowania ImageJ15.</li>
</ol>
5. Test lucyferazy in vitro
<ol>
	<li>Przygotować zawiesinę komórek składającą się z 3 - 5 x 104 komórek MDA-MB-231 w 1 ml pożywki DMEM zawierającej 5% FBS.</li>
	<li>Zawiesinę komórek zainfekować 2,5 μl Ad-CAGA12-Luc (miano = 5 x 1010 PFU/mL, MOI = 2,500).</li>
	<li>Zasiać zainfekowane komórki na 96-dołkowej płytce w 3,000 komórek/100 μl/dołk.</li>
	<li>Umieścić płytkę w inkubatorze w temperaturze 37 °C z 10% CO2 na 24 godziny.</li>
	<li>Usunąć stare pożywki z dołków i zastąpić je 100 μl świeżych 5% pożywki FBS z lub bez 0,1 μl TGF-β na studzienkę (1 mg/ml w magazynie, 1 ng/μl jako stężenie końcowe) i w obecności lub bez 0,17 μl inhibitora TGF-β na studzienkę (7 mg/ml w magazynie, 12 ng/μL jako stężenie końcowe) (nowe białko pułapki liganda TGF-β, Chen i wsp., praca niepublikowana).</li>
	<li>Umieścić płytkę w inkubatorze w temperaturze 37 °C z 10% CO2 na 24 godziny.</li>
	<li>Rozmrozić substrat systemu oznaczania lucyferazy i przygotować 1x odczynnik do lizy hodowli komórkowych w wodzie podwójnie destylowanej (DDW).</li>
	<li>Usunąć pożywkę z 96 dołków i poddać lizie studzienki z 50 μl 1x buforu do lizy hodowli komórkowych na lodzie za pomocą wytrząsarki orbitalnej z delikatnym mieszaniem przez 30 minut.</li>
	<li>Przenieść 30 μl lizatu z każdej studzienki do nieprzezroczystej płytki lucyferazy i pozostawić płytkę do ogrzania do temperatury pokojowej.</li>
	<li>W oprogramowaniu luminometru utwórz nowy protokół. Wybierz dla 1 wtryskiwacza z pomiarami przed i po wstrzyknięciu. Ustaw pomiary przed wstrzyknięciem na 1 s zarówno dla opóźnienia pomiaru, jak i czasu integracji. W przypadku pomiaru po wstrzyknięciu należy ustawić objętość wtrysku na 40 μl z opóźnieniem pomiaru wynoszącym 1 s po wstrzyknięciu i czasem integracji 5 s. Potwierdź ustawienia, wybierając przycisk OK.</li>
	<li>Umieść rurkę wtryskiwacza w DDW i kliknij przycisk Wtryskiwacz 1 w ustawieniach Prime, aby wyczyścić rurkę wtryskiwacza przed użyciem. Następnie wyjmij rurkę wtryskiwacza z DDW i umieść ją w powietrzu, a następnie dwa kolejne Primes wtryskiwacza 1, aby wypłukać cały roztwór z rurki. Umieść rurkę wtryskiwacza w podłożu Firefly i ponownie zagruntuj dwukrotnie, aby przygotować podłoże.</li>
	<li>Umieść nieprzezroczystą płytkę lucyferazy z próbkami w luminometrze i wybierz Opcje w oprogramowaniu. Zaznacz interesujące Cię źródła i kliknij przycisk Zastosuj. Naciśnij Start, aby zmierzyć sygnał lucyferazy.</li>
	<li>Po zakończeniu pomiarów wyjmij płytkę i spłucz ją wodą. Odzyskaj pozostały substrat do rurki wtryskiwacza, umieszczając rurkę w powietrzu i zalej wtryskiwacz 1 z powrotem do rurki z substratem świetlika. Umieść rurkę wtryskiwacza w DDW i wykonaj dwa kolejne zapoczątkowania, aby oczyścić rurkę wtryskiwacza z pozostałego podłoża.</li>
</ol>
6. Przygotowanie komórek do obrazowania sygnalizacji na żywo in vivo
<ol>
	<li>48 h przed implantacją nowotworu, nasiona 2 - 3x106 komórek MDA-MB-231 do 175 cm2 kolby (łącznie 10 kolb). Hodowla komórek w 20 ml pożywki DMEM zawierającej 5% FBS w temperaturze 37 °C, 10% CO2 .</li>
	<li>24 godziny później dodać 300 μl Ad-CAGA12-Luc (miano = 5 x10 10 PFU/ml, MOI = 2,500) do każdej kolby. Trzymaj komórki w kulturze przez kolejne 24 godziny.</li>
	<li>W dniu implantacji należy usunąć stare podłoże i przemyć komórki zakażone adenowirusem jednorazowo 20 ml PBS o pH 7,4. Dodać 2 ml 0,05% trypsyny-EDTA do kolby i lekko potrząsnąć kolbą, aby trypsyna pokryła całą powierzchnię kolby. Umieścić kolbę w inkubatorze w temperaturze 37 °C, 10% CO2 na 3 minuty.</li>
	<li>Ugasić trypsynę, dodając 8 ml pożywki DMEM zawierającej FBS do kolb. Przenieś wszystkie zawiesiny komórek do szklanej butelki z odczynnikiem.</li>
	<li>Policz liczbę komórek za pomocą hemocytometru i przenieś 4,8 x 107 komórek do dwóch probówek wirówkowych o pojemności 50 ml.</li>
	<li>Odwirować komórki przy 400 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej w celu usunięcia trypsyny i ponownego zawieszenia komórek w 720 ml świeżej pożywki FBS-DMEM.</li>
	<li>Przenieść zawiesiny komórek do sterylnej probówki o pojemności 5 ml i dodać 160 μl Matrigel (10% całkowitej zawiesiny matrigelu).</li>
	<li>Utrzymuj komórki na lodzie do momentu implantacji.</li>
</ol>
7. Implantacja ortotopowa
<ol>
	<li>Zważ 12 myszy SCID i losowo przydziel myszy do grup kontrolnych i leczonych (6 myszy / grupę).</li>
	<li>Wykonaj implantację w sterylnym biogabinecie, aby utrzymać sterylne środowisko. Znieczulij mysz za pomocą 2,5 - 4,5% izofluranu o natężeniu przepływu tlenu 1 l/min. Umieść mysz na poduszce grzewczej i nałóż kroplę nawilżającej maści do oczu na oba oczy, aby uniknąć uszkodzenia rogówki. Przymocuj mysz do poduszki grzewczej w pozycji leżącej, zachowując znieczulenie, umieszczając pysk w stożku nosowym połączonym z izofluranem.</li>
	<li>O skuteczności znieczulenia świadczy brak reakcji na uszczypnięcie palca u nogi. Zmniejsz dawkę izofluranu do dawki podtrzymującej 1,5 - 2,5% z 1 l/min tlenu w celu przypomnienia o implantacji.</li>
	<li>Oczyść skórę od czwartego sutka po obu stronach do linii środkowej za pomocą bawełnianego wacika zamoczonego w 80% etanolu.</li>
	<li>Znajdź 4. poduszeczkę tłuszczową sutka poprzez badanie palpacyjne i ściśnij poduszeczkę tłuszczową, aby jeszcze bardziej odsłonić tkankę.</li>
	<li>Dobrze wymieszać zawiesinę komórkową, pipetując w górę i w dół. Delikatnie odessać 50 μl mieszaniny komórek do strzykawki insulinowej 27G i wstrzyknąć do poduszeczki tłuszczowej po obu stronach myszy.</li>
	<li>Potwierdź udane wstrzyknięcie, wyczuwając obrzęk poduszeczki tłuszczowej. Delikatnie zwolnij poduszeczkę tłuszczową i umieść mysz z powrotem w klatce.</li>
	<li>Pozostaw klatki na poduszce grzewczej na co najmniej 30 minut, aby myszy odzyskały przytomność, a następnie umieść klatki z powrotem w pomieszczeniu przetrzymywania na 3 dni.</li>
</ol>
8. Obrazowanie IVIS
<ol>
	<li>Otwórz oprogramowanie Living Image.</li>
	<li>Zainicjuj system IVIS, klikając przycisk Zainicjuj system IVIS na panelu sterowania. Poczekaj, aż znak temperatury zmieni kolor na zielony.</li>
	<li>Wybierz tryb obrazowania luminescencyjnego na panelu sterowania.</li>
	<li>Włączyć znieczulenie izofluranem do komory i systemu IVIS.</li>
	<li>Znieczulenie myszy za pomocą 2,5 - 4,5% izofluranu z 1 l / min tlenu. Po znieczuleniu należy ustawić izofluran na poziomie 1,5 - 2,5% w celu konserwacji. Wstrzyknąć 150 mg / kg masy ciała D-lucyferyny myszom przez wstrzyknięcie dootrzewnowe (i.p.).</li>
	<li>Natychmiast przenieś myszy do systemu IVIS, umieść je na platformie obrazowania o kontrolowanej temperaturze i umieść ich nos w stożku nosowym.</li>
	<li>Kliknij przycisk Sequence Setup (Ustawienia sekwencji) na panelu sterowania i wybierz opcję Medium Binning.</li>
	<li>Ustaw czas ekspozycji obrazowania w następujący sposób: 10 s, 20 s, 30 s, 60 s i 120 s. Rozpocznij obrazowanie około 3 minuty po wstrzyknięciu lucyferyny i kontynuuj obrazowanie, aż sygnał zacznie spadać (zwykle zajmie to około 20 minut).</li>
	<li>Usuń myszy z IVIS, utrzymując znieczulenie izofluranem przez stożek nosowy i potraktuj myszy 50 μl PBS lub 50 μl inhibitora sygnalizacji TGF-β (50 μg / guz) poprzez wstrzyknięcie do guza.</li>
	<li>Włóż myszy z powrotem do klatki i pozostaw je na poduszce grzewczej na co najmniej 30 minut. Następnie umieść klatkę z powrotem w pomieszczeniu do przechowywania.</li>
	<li>Powtórz procedurę obrazowania IVIS zgodnie z powyższym opisem następnego dnia po zabiegu.</li>
</ol>
9. Analiza danych
<ol>
	<li>Otwórz zapisane pliki w oprogramowaniu Living Image.</li>
	<li>Znajdowanie informacji o obrazie za pomocą punktu menu Widok | Informacje o obrazie.</li>
	<li>Wybierz zdjęcia zrobione w podobnym punkcie czasowym z tym samym czasem ekspozycji. Wczytywanie zdjęć jako grupa.</li>
	<li>Usuń zaznaczenie pola Indywidualne w obszarze Image Adjust, aby znormalizować intensywność.</li>
	<li>Wybierz tryb Photon, aby przeanalizować intensywność. Określ ilościowo intensywność sygnału, wybierając przycisk Region of Interest (ROI) w narzędziach ROI.</li>
	<li>Przeciągnij okrąg ROI do obszaru zawierającego sygnał bioluminescencyjny i kliknij przycisk Zmierz, aby uzyskać intensywność sygnału.</li>
</ol>

<ol><li>Massague, J., Like, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+receptors+for+type+beta+transforming+growth+factor.+Ligand+binding+and+affinity+labeling+in+human+and+rodent+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">Cellular receptors for type beta transforming growth factor. Ligand binding and affinity labeling in human and rodent cell lines.</a> The Journal of biological chemistry. 260, 2636-2645 (1985).</li>
<li>Xu, L., Chen, Y. G., Massague, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nuclear+import+function+of+Smad2+is+masked+by+SARA+and+unmasked+by+TGFbeta-dependent+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The nuclear import function of Smad2 is masked by SARA and unmasked by TGFbeta-dependent phosphorylation.</a> Nature Cell Biology. 2, 559-562 (2000).</li>
<li>Massague, J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22992590">TGFbeta signaling in context.</a> Nature reviews. Molecular cell biology. 13, 616-630 (2012).</li>
<li>Massague, J., Seoane, J., Wotton, D. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16322555">Smad transcription factors.</a> Genes Development. 19, 2783-2810 (2005).</li>
<li>Blobe, G. C., Schiemann, W. P., Lodish, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+transforming+growth+factor+beta+in+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+journal+of+medicine%22%5BJournal%5D)">Role of transforming growth factor beta in human disease.</a> The New England journal of medicine. , 1350-1358 (2000).</li>
<li>Zhu, H. J., Burgess, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+transforming+growth+factor-beta+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+cell+biology+research+communications+%3A+MCBRC%22%5BJournal%5D)">Regulation of transforming growth factor-beta signaling.</a> Molecular cell biology research communications : MCBRC. 4, 321-330 (2001).</li>
<li>Massagué, J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3512574/">TGFβ in Cancer.</a> Cell. 134, 215-230 (2008).</li>
<li>Luwor, R. B., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25744371">Single live cell TGF-beta signaling imaging: breast cancer cell motility and migration is driven by sub-populations of cells with dynamic TGF-beta-Smad3 activity.</a> Molecular cancer. 14, 50(2015).</li>
<li>Clarke, D. C., Liu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decoding+the+quantitative+nature+of+TGF-beta%2FSmad+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cell+Biol.ogy%22%5BJournal%5D)">Decoding the quantitative nature of TGF-beta/Smad signaling.</a> Trends in Cell Biol.ogy. 18, 430-442 (2008).</li>
<li>Zhao, R., Li, N., Xu, J., Li, W., Fang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+single-molecule+study+of+TGF-beta%2FSmad+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biochimica+et+Biophysica+Sinica+%28Shanghai%29%22%5BJournal%5D)">Quantitative single-molecule study of TGF-beta/Smad signaling.</a> Acta Biochimica et Biophysica Sinica (Shanghai). 50, 51-59 (2017).</li>
<li>Luwor, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+reagents+for+improved+in+vitro+and+in+vivo+examination+of+TGF-beta+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Growth+factors%22%5BJournal%5D)">New reagents for improved in vitro and in vivo examination of TGF-beta signalling.</a> Growth factors. 29, 211-218 (2011).</li>
<li>Dennler, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+binding+of+Smad3+and+Smad4+to+critical+TGF+beta-inducible+elements+in+the+promoter+of+human+plasminogen+activator+inhibitor-type+1+gene%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Direct binding of Smad3 and Smad4 to critical TGF beta-inducible elements in the promoter of human plasminogen activator inhibitor-type 1 gene.</a> EMBO J. 17, 3091-3100 (1998).</li>
<li>Luwor, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+Stat3+and+Smad7+to+restore+TGF-beta+cytostatic+regulation+of+tumor+cells+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Targeting Stat3 and Smad7 to restore TGF-beta cytostatic regulation of tumor cells in vitro and in vivo.</a> Oncogene. 32, 2433-2441 (2013).</li>
<li>Reed, L. J., Muench, H. <a target="_blank" href="https://academic.oup.com/aje/article-abstract/27/3/493/99616">A Simple Method of Estimating Fifty Per Cent Endpoints.</a> American Journal of Epidemiology. 27, 493-497 (1938).</li>
<li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NIH+Image+to+ImageJ%3A+25+years+of+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+methods%22%5BJournal%5D)">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature methods. 9, 671-675 (2012).</li>
<li>Dennler, S., Prunier, C., Ferrand, N., Gauthier, J. M., Atfi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((c-Jun+inhibits+transforming+growth+factor+beta-mediated+transcription+by+repressing+Smad3+transcriptional+activity%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">c-Jun inhibits transforming growth factor beta-mediated transcription by repressing Smad3 transcriptional activity.</a> The Journal of biological chemistry. 275, 28858-28865 (2000).</li>
<li>Fink, S. P., Mikkola, D., Willson, J. K., Markowitz, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGF-beta-induced+nuclear+localization+of+Smad2+and+Smad3+in+Smad4+null+cancer+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">TGF-beta-induced nuclear localization of Smad2 and Smad3 in Smad4 null cancer cell lines.</a> Oncogene. 22, 1317-1323 (2003).</li>
<li>Zinn, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninvasive+bioluminescence+imaging+in+small+animals%5BTitle%5D)+AND+%22ILAR+J%22%5BJournal%5D)">Noninvasive bioluminescence imaging in small animals.</a> ILAR J. 49, 103-115 (2008).</li>
<li>Kim, T. K., Eberwine, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+cell+transfection%3A+the+present+and+the+future%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+and+Bioanalytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Mammalian cell transfection: the present and the future.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 397, 3173-3178 (2010).</li>
<li>Russell, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Update+on+adenovirus+and+its+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+General+Virology%22%5BJournal%5D)">Update on adenovirus and its vectors.</a> Journal of General Virology. 81, 2573-2604 (2000).</li>
<li>Lee, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenovirus-Mediated+Gene+Delivery%3A+Potential+Applications+for+Gene+and+Cell-Based+Therapies+in+the+New+Era+of+Personalized+Medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Diseases%22%5BJournal%5D)">Adenovirus-Mediated Gene Delivery: Potential Applications for Gene and Cell-Based Therapies in the New Era of Personalized Medicine.</a> Genes & Diseases. 4, 43-63 (2017).</li>
<li>Wang, I. I., Huang, I. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenovirus+technology+for+gene+manipulation+and+functional+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discovery+Today%22%5BJournal%5D)">Adenovirus technology for gene manipulation and functional studies.</a> Drug Discovery Today. 5, 10-16 (2000).</li>
<li>Kochanek, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+adenoviral+vector%3A+Replacement+of+all+viral+coding+sequences+with+28+kb+of+DNA+independently+expressing+both+full-length+dystrophin+and+beta-galactosidase%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">A new adenoviral vector: Replacement of all viral coding sequences with 28 kb of DNA independently expressing both full-length dystrophin and beta-galactosidase.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93, 5731-5736 (1996).</li>
<li>Wang, Q., Finer, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Second-generation+adenovirus+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Second-generation adenovirus vectors.</a> Nature Medicine. 2, 714-716 (1996).</li>
<li>Durham, H. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxicity+of+replication-defective+adenoviral+recombinants+in+dissociated+cultures+of+nervous+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Neurology%22%5BJournal%5D)">Toxicity of replication-defective adenoviral recombinants in dissociated cultures of nervous tissue.</a> Experimental Neurology. 140, 14-20 (1996).</li>
<li>MacKenzie, K. L., Hackett, N. R., Crystal, R. G., Moore, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenoviral+vector-mediated+gene+transfer+to+primitive+human+hematopoietic+progenitor+cells%3A+assessment+of+transduction+and+toxicity+in+long-term+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Adenoviral vector-mediated gene transfer to primitive human hematopoietic progenitor cells: assessment of transduction and toxicity in long-term culture.</a> Blood. 96, 100-108 (2000).</li>
<li>Zhang, W. W., Koch, P. E., Roth, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+wild-type+contamination+in+a+recombinant+adenoviral+preparation+by+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Detection of wild-type contamination in a recombinant adenoviral preparation by PCR.</a> Biotechniques. 18, 444-447 (1995).</li>
<li>Choi, Y., Chang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+vectors+for+vaccine+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Experimental+Vaccine+Research%22%5BJournal%5D)">Viral vectors for vaccine applications.</a> Clinical and Experimental Vaccine Research. 2, 97-105 (2013).</li>
<li>de Cassan, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+requirement+for+potent+adjuvants+to+enhance+the+immunogenicity+and+protective+efficacy+of+protein+vaccines+can+be+overcome+by+prior+immunization+with+a+recombinant+adenovirus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+immunology%22%5BJournal%5D)">The requirement for potent adjuvants to enhance the immunogenicity and protective efficacy of protein vaccines can be overcome by prior immunization with a recombinant adenovirus.</a> Journal of immunology. 187, 2602-2616 (2011).</li>
<li>Krasnykh, V. N., Mikheeva, G. V., Douglas, J. T., Curiel, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+recombinant+adenovirus+vectors+with+modified+fibers+for+altering+viral+tropism%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Generation of recombinant adenovirus vectors with modified fibers for altering viral tropism.</a> Journal of Virology. 70, 6839-6846 (1996).</li>
<li>Wickham, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+in+vitro+and+in+vivo+gene+transfer+by+adenovirus+vectors+containing+chimeric+fiber+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Increased in vitro and in vivo gene transfer by adenovirus vectors containing chimeric fiber proteins.</a> Journal of Virology. 71, 8221-8229 (1997).</li>
<li>Smith, F., Jacoby, D., Breakefield, X. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virus+vectors+for+gene+delivery+to+the+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Restorative+neurology+and+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Virus vectors for gene delivery to the nervous system.</a> Restorative neurology and neuroscience. 8, 21-34 (1995).</li>
<li>Zhou, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+receptor+NR4A1+promotes+breast+cancer+invasion+and+metastasis+by+activating+TGF-beta+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+communications%22%5BJournal%5D)">Nuclear receptor NR4A1 promotes breast cancer invasion and metastasis by activating TGF-beta signalling.</a> Nature communications. 5, 3388(2014).</li>
</ol>

Autorzy nie zgłaszają konfliktu interesów.

Opracowaliśmy technikę pozwalającą na obrazowanie w czasie rzeczywistym sygnalizacji TGF-β/Smad3 w pojedynczych żywych komórkach. Korzystając z tej nowatorskiej metody, wcześniej zidentyfikowaliśmy subpopulację komórek z dynamiczną aktywnością transkrypcyjną TGF-β / Smad3, która była związana ze zwiększoną inwazją i migracją8. Metoda ta ulepsza tradycyjne testy sygnalizacji TGF-β, takie jak zachodnie plamy fosforylacji Smad3 i ukierunkowana ekspresja genu TGF-β, poprzez uchwycenie heterogenicznośc...

Transforming Growth Factor β (TGF-β) to niezbędna cytokina związana z rozwojem człowieka, która przesyła sygnały przez heterodimeryczny kompleks składający się z receptorów typu II i I1. Wiązanie się z receptorem typu II powoduje rekrutację i fosforylację receptora typu I, który z kolei fosforyluje białka Smad2/3 w dalszej części łańcucha2,3. Te aktywowane białka Smad2/3 wiążą się z Smad4, tworząc kompleks, który przemieszcza się do jądra i reguluje transkrypcję genów4. W warunkach homeostatycznych sygnalizacja TGF-β/Smad jest ściśle regulowana; Jednak w wielu chorobach szlak sygnałowy jest rozregulowany i często nadmiernie eksprymowany, co prowadzi do postępu choroby5,6,7. Ostatnie badania wykazały, że odpowiedź komórkowa na TGF-β jest niejednorodna, a subpopulacje aktywnych komórek TGF-β/Smad są odpowiedzialne za funkcje biologiczne w sposób zależny od czasu8,9. Powszechna analiza komórkowa sygnalizacji TGF-β/Smad obejmuje użycie testów stałego punktu końcowego, które zapewniają tylko migawkę aktywności komórkowej i często określają ilościowo średni efekt TGF-β/Smad10. Metody te mogą jednak nie odzwierciedlać dokładnie zachowań molekularnych sygnalizacji TGF-β/Smad w stanie fizjologicznym podczas progresji choroby. Oparta na obrazie analiza żywych komórek pozwala uchwycić dynamikę procesów komórkowych i biologicznych zarówno w ujęciu przestrzennym, jak i czasowym.
Naszym celem było opracowanie czułej, wysokoprzepustowej metody obrazowania żywych komórek sygnalizacji TGF-β/Smad przy użyciu odczynników na bazie adenowirusa. Tutaj zainfekowaliśmy ludzką linię komórkową raka piersi MDA-MB-231 adenowirusem wyrażającym sekwencję wiążącą motyw CAGA Smad3 i genem reporterowym lucyferazy (Luc) lub Td-pomidora (Td-Tom). Systemy reporterowe adenowirusa zapewniają szybką i tanią metodę wprowadzania plazmidu, która może skutkować 100% wskaźnikiem infekcji w liniach komórek rakowych. Adenowirusowe systemy reporterowe zostały również z powodzeniem zastosowane do linii komórkowych, które są trudne do transfekcji za pomocą konwencjonalnego plazmidu11. W tym protokole opiszemy powtarzalny i nieinwazyjny proces uzyskiwania obrazowania żywych komórek szlaku sygnałowego TGFβ / Smad zarówno in vivo, jak i in vitro.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>ThermoFisher</td><td>1881024</td><td>Ciepły w 37 stopniach; C Kąpiel wodna przed użyciem</td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>Scientifix Life</td><td>FBS500-S</td><td>Ciepło inaktywowane przed użyciem</td></tr><tr><td>Rekombinowany ludzki TGF-&beta; 1</td><td>PEPROTECH</td><td>100-21</td><td>Podwielokrotność w DDW do uzyskania końcowego stężenia 10 mg/ml</td></tr><tr><td>Hoechst-33258</td><td>Tocris Bioscience</td><td>5117</td><td>Rozcieńczyć do PBS w celu uzyskania końcowego stężenia przy 1 &mu; L/ml</td></tr><tr><td>Lucyferazy Reporter Zestaw testowy</td><td>Promega</td><td>197897</td><td>Rozcieńczyć 5x w PBS przed użyciem</td></tr><tr><td>Luminometr</td><td>Promega</td><td>9100-002</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskopia fluorescencyjna z kontrastem fazowym</td><td>Wirówka OLYMPUS</td><td>IX50</td><td></td></tr><tr><td></td><td>eppendorf</td><td>5810 R</td><td></td></tr><tr><td>VivoGl Lucyferyna</td><td>Promega</td><td>P1041</td><td></td></tr><tr><td>IVIS Lumina III In Vivo System obrazowania</td><td>PerkinElmer</td><td>CLS136334</td><td></td></tr><tr><td>0,5% Trypsyna-EDTA (10x)</td><td>ThermoFisher</td><td>15400-054</td><td>Rozcieńczenie do 0,05% (1x) w PBS</td></tr><tr><td>Liza kultur komórkowych 5x Odczynnik</td><td>Promega</td><td>E153A</td><td>Rozcieńczony do 1x w DDW</td></tr><tr><td>10% Formalina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F5554-4L</td><td></td></tr><tr><td>HEK 293A</td><td>ThermoFisher</td><td>R70507</td><td></td></tr><tr><td>MDA-MB-231</td><td>ATCC</td><td>CRM-HTB-26</td><td></td></tr><tr><td>PRKDC-SCID</td><td>Centrum Zasobów Zwierzęcych</td><td>SCIDF6</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>354234</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Zoetis</td><td>26675-46-7</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Chem-supply</td><td>EA043-10L-P</td><td></td></tr><tr><td>Refresh Night Time</td><td>Allergan</td><td>1750D</td><td>Nawilżająca maść do oczu</td></tr><tr><td><mocna>Roztwór</mocny></td><td></td><td></td><td><silny>Skład</mocny></td></tr><tr><td>sól fizjologiczna buforowana fosforanem (PBS)</td><td></td><td></td><td>NaH2PO4,2H2O (4 mM); NaHPO4 (16 mM); NaCl (0,12 mln)</td></tr><tr><td>FBS-DMEM&nbsp;</td><td></td><td></td><td>5% inaktywowany termicznie FBS; 10 &mu; g/ml penicyliny; 100 &mu; g/ml streptomycyny</td></tr></tbody></table>

obrazowanie żywych komórek szlaku sygnałowego tgf-β/smad3 in vitro i in vivo przy użyciu systemu reporterowego adenowirusa

Live Cell Imaging of the TGF-	&beta;/Smad3 Signaling Pathway In Vitro and In Vivo Using an Adenovirus Reporter System

Transforming Growth Factor β (TGF-β) reguluje wiele ważnych funkcji wymaganych do homeostazy komórkowej i jest powszechnie spotykane w nadekspresji w wielu chorobach, w tym w raku. TGF-β jest silnie zaangażowany w przerzuty podczas progresji raka w późnym stadium, aktywując podzbiór migrujących i inwazyjnych komórek nowotworowych. Obecne metody analizy szlaków sygnałowych koncentrują się na modelach punktów końcowych, które często próbują zmierzyć sygnalizację post hoc zdarzenia biologicznego i nie odzwierciedlają postępującego charakteru choroby. W tym miejscu demonstrujemy nowy system reporterowy adenowirusa specyficzny dla szlaku sygnałowego TGF-β/Smad3, który może wykrywać aktywację transkrypcji w żywych komórkach. Wykorzystując reporter Ad-CAGA 12-Td-Tom, możemy osiągnąć 100% wskaźnik infekcji komórek MDA-MB-231 w ciągu 24 godzin in vitro. Zastosowanie reportera fluorescencyjnego pozwala na obrazowanie żywych pojedynczych komórek w czasie rzeczywistym z bezpośrednią identyfikacją komórek aktywnych transkrypcyjnie. Stymulacja zakażonych komórek TGF-β wyświetla tylko podzbiór komórek, które są aktywne transkrypcyjnie i zaangażowane w określone funkcje biologiczne. Takie podejście pozwala na uzyskanie wysokiej swoistości i czułości na poziomie pojedynczej komórki, aby lepiej zrozumieć funkcje biologiczne związane z sygnalizacją TGF-β in vitro. Aktywność transkrypcyjna Smad3 może być również raportowana in vivo w czasie rzeczywistym za pomocą aplikacji reportera Ad-CAGA12-Luc. Ad-CAGA12-Luc można mierzyć w taki sam sposób, jak tradycyjne, stabilnie transfekowane linie komórkowe lucyferazy. Aktywność transkrypcyjna Smad3 komórek wszczepionych in vivo może być analizowana za pomocą konwencjonalnego obrazowania IVIS i monitorowana na żywo podczas progresji guza, zapewniając unikalny wgląd w dynamikę szlaku sygnałowego TGF-β. Nasz protokół opisuje korzystny system dostarczania reporterowego, który pozwala na szybkie, wysokoprzepustowe obrazowanie szlaków sygnałowych żywych komórek, zarówno in vitro, jak i in vivo. Metoda ta może być rozszerzona na szereg testów opartych na obrazie i przedstawia się jako czułe i powtarzalne podejście zarówno do podstawowej biologii, jak i rozwoju terapeutycznego.

Obrazowanie pojedynczych żywych komórek in vitro
Aby dokładnie ocenić aktywację sygnalizacji TGF-β/Smad w pojedynczych komórkach przy użyciu odczynników opartych na adenowirusach, ważne jest, aby najpierw określić optymalną wielokrotność infekcji (MOI) dla każdej linii komórkowej. Optymalne MOI zostaje określone, gdy 100% komórek jest pozytywnych pod kątem infekcji adenowirusowej, przy jednoczesnym braku efektów cytopatycz...

Tutaj prezentujemy protokół obrazowania aktywności sygnalizacyjnej TGF-β/Smad3 na żywo komórek za pomocą systemu reporterskiego adenowirusa. System ten śledzi aktywność transkrypcyjną w czasie rzeczywistym i może być stosowany zarówno do pojedynczych komórek in vitro, jak i do żywychmodeli zwierzęcych.

Obrazowanie żywych komórek szlaku sygnałowego TGF-β/Smad3 in vitro i in vivo przy użyciu systemu reporterowego adenowirusa

Transforming Growth Factor &#946; (TGF-&#946;) signaling regulates many important functions required for cellular homeostasis and is commonly found ...

Ta metoda może odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie sygnalizacji komórkowej poprzez nieinwazyjne śledzenie sygnalizacji komórkowej w czasie rzeczywistym. Główną zaletą tej techniki jest to, że systemy adenowirusowe zapewniają szybką i łatwą metodę wykrywania sygnalizacji komórkowej, która może osiągnąć 100% wskaźnik infekcji w liniach komórek rakowych. Implikacje tej techniki rozciągają się w kierunku rozwoju terapeutycznego nowotworów i mogą być rozszerzone na inne szlaki sygnałowe.Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w modele raka piersi, można ją również zastosować do innych typów raka, takich jak mózg, kości i płuca. W dniu zakażenia adenowirusem zasiej dołki 12-dołkowej płytki około 1,25 razy 10 do piątej komórki MDA-MB-231 w 500 mikrolitrach pożywki, aby uzyskać zbieg 35%Zainfekuj komórki we wszystkich studzienkach 75 mikrolitrami adenowirusa-CMV-GFP i 7,5 mikrolitrami adenowirusa CAGA12-Td-Tomato, aby uzyskać 2,500 MOI, który może osiągnąć 100% dodatni wynik infekcji. Następnie dobrze dodaj TGF-beta do kuracji natychmiast po zakażeniu adenowirusem.Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 10% dwutlenkiem węgla przez 24 godziny. Następnego dnia zobrazuj żywe komórki za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego z kontrastem fazowym. Następnie, po utrwaleniu komórek i zabarwieniu jąder barwnikiem Hoechst, zobrazuj białko TD-Tomato i barwnik Hoechst za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego.Po zobrazowaniu wszystkich dołków oblicz procent komórek GFP i Td-Tomato dodatnich za pomocą ImageJ. W przypadku testu gojenia się ran należy rozpocząć od wysiewu studzienek sześciodołkowej płytki z około 4,5 razy 10 do piątej komórki MDA-MB-231 w jednym mililitrze pożywki, aby uzyskać 50% konfluencji w dniu infekcji. Zainfekuj komórki 22,5 mikrolitrami adenowirusa CAGA12-Td-Tomato, a następnie umieść płytkę w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 10% dwutlenkiem węgla na 24 godziny.Po 24 godzinach użyj końcówki pipety P200, aby zarysować dwie skrzyżowane linie na warstwie komórkowej każdej studzienki. Usuń pożywkę z dołków i potraktuj TGF-beta, jak pokazano wcześniej, a następnie umieść płytkę w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 10% dwutlenkiem węgla na pięć minut. Po pięciu minutach inkubacji wykonaj zdjęcia wybranych obszarów rany przy użyciu 100-krotnego powiększenia pod mikroskopem z kontrastem fazowym przed powrotem płytki do inkubatora.24 godziny później wykonaj zdjęcia z kontrastem fazowym tych samych obszarów, aby ocenić zamknięcie rany. Po utrwaleniu komórek i zabarwieniu jąder wizualizuj sygnał Td-Tomato w obszarze rany i obszarze bez rany za pomocą 200-krotnego powiększenia pod mikroskopem fluorescencyjnym. Na 48 godzin przed implantacją guza wysiewaj około 2,5 razy 10 do szóstych komórek MDA-MB-231 do 10 kolb o powierzchni 175 centymetrów kwadratowych.Po 24 godzinach w hodowli dodać 300 mikrolitrów adenowirusa CAGA12-lucyferazy do każdej kolby przed powrotem komórek do inkubatora na kolejne 24 godziny. W dniu implantacji należy usunąć stare podłoże i raz umyć komórki zakażone adenowirusem 20 mililitrami PBS. Dodać dwa mililitry 0,05% trypsyny-EDTA do kolby i lekko wstrząsnąć kolbą, aby trypsyna pokryła całą powierzchnię kolby.Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez trzy minuty, a następnie ugasić trypsynę, dodając do kolb osiem mililitrów pożywki DMEM zawierającej FBS. Przenieś wszystkie zawiesiny komórek do szklanej butelki z odczynnikiem. Policz liczbę komórek za pomocą hemocytometru.Następnie przenieś 4,8 razy 10 do siedmiu komórek do 250-mililitrowych probówek wirówkowych i odwiruj komórki z prędkością 400 razy g przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Po odwirowaniu ponownie zawiesić komórki w 720 mikrolitrach świeżej pożywki i przenieść zawiesinę do pięciomililitrowej probówki. Następnie dodać pożywkę zawierającą 10% Matrigel, aby rozcieńczyć zawiesinę komórek trzy razy od 10 do szóstych komórek na 50 mikrolitrów.Przenieś zawiesinę komórkową do sterylnej pięciomililitrowej probówki i trzymaj na lodzie do momentu implantacji. Zważ 12 myszy SCID i losowo przydziel myszy równo między grupy kontrolne i leczone. Po znieczuleniu myszy naniech kroplę smarującej maści do oczu na oba oczy, aby uniknąć uszkodzenia rogówki, a następnie przymocuj mysz do poduszki grzewczej w sterylnej bioszafce i utrzymuj znieczulenie, umieszczając pysk w stożku połączonym z izofluranem.Potwierdź sukces znieczulenia przez brak reakcji na uszczypnięcie palca u nogi. Należy zmniejszyć dawkę izofluranu do dawki podtrzymującej przez pozostałą część implantacji. Następnie użyj bawełnianego wacika zamoczonego w 80% etanolu, aby oczyścić skórę od co czwartego sutka do linii środkowej.Znajdź czwartą poduszeczkę tłuszczową sutka poprzez badanie palpacyjne i ściśnij poduszkę tłuszczową, aby jeszcze bardziej odsłonić tkankę, a następnie wymieszaj zawiesinę komórkową, pipetując w górę iw dół. Delikatnie odessać 50 mikrolitrów mieszaniny komórek do strzykawki insulinowej o rozmiarze 27 i wstrzyknąć do poduszeczki tłuszczowej sutka. Potwierdź pomyślne wstrzyknięcie i delikatnie uwolnij poduszkę tłuszczową.Umieść mysz z powrotem w klatce domowej. Po tym, jak myszy odzyskają przytomność, należy umieścić klatkę z powrotem w pomieszczeniu przetrzymywania przez trzy dni przed przystąpieniem do obrazowania IVIS. Żywe komórki MDA-MB-231 wykazywały różne poziomy ekspresji Td-Tomato pomimo 100% infekcji, na co wskazuje ekspresja GFP, co wskazuje na niejednorodną aktywację zależnej od TGF-beta transkrypcji Smad3 w komórkach.Analiza stałych komórek ponownie wykazała 100% ekspresję GFP, podczas gdy tylko około 26% komórek wykazywało wykrywalną aktywność transkrypcyjną TGF-beta / Smad3 24 godziny po stymulacji TGF-beta bez TGF-beta w porównaniu z 0% pozytywnym traktowaniem. W teście gojenia się ran komórki MDA-MB-231 zakażone adenowirusem CAGA12-Td-Tomato wykazywały normalne zachowanie migracyjne, a komórki leczone TGF-beta wykazywały lepsze zamykanie ran. Warto zauważyć, że około 62% komórek w obszarze rany wykazywało dodatnią aktywność transkrypcyjną Smad3 zależną od TGF-beta, która jest znacznie wyższa niż obserwowana w obszarze niezranionym po leczeniu TGF-beta.Odczynnik adenowirusa CAGA12-lucyferazy przetestowano w zwierzęcym modelu implantacji ortotopowej guza piersi. Zarówno grupa kontrolna, jak i grupa leczona inhibitorem TGF-beta wykazywała podobną aktywność reporterową CAGA12-lucyferazy przed leczeniem. Jednak w grupie kontrolnej sygnał lucyferazy nie zmienił się po leczeniu PBS, podczas gdy myszy leczone inhibitorem TGF-beta wykazywały około trzykrotne zmniejszenie sygnału.Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w mniej niż godzinę, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, że zbyt duże ilości adenowirusa mogą mieć działanie cytotoksyczne i cytopatyczne, co może mieć wpływ na dokładność wyników. Zgodnie z tą procedurą, system ten można rozbudować o jednoczesną analizę wielu ścieżek sygnałowych w celu uzyskania odpowiedzi na dodatkowe pytania związane z przesłuchami sygnalizacji komórkowej.Po jej opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się sygnalizacją komórek nowotworowych do zbadania zachowań związanych z progresją guza w modelach raka piersi.

live-cell-imaging-tgf-smad3-signaling-pathway-vitro-vivo-using-an

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

W związku z rosnącym zainteresowaniem terapiami komórkami macierzystymi, techniki obrazowania molekularnego są idealne do monitorowania zachowania tych komórek po transplantacji. Geny reporterowe lucyferazy umożliwiły nieinwazyjną, powtarzalną ocenę przeżywalności, lokalizacji i proliferacji komórek in vivo. W niniejszym filmie zaprezentrowano sposób śledzenia proliferacji hESC w żywej myszy.

Obrazowanie genem reporterowym bioluminescencyjnym ludzkich embrionalnych komórek macierzystych in vitro i in vivo

W tym filmie wykorzystujemy adenowirus niosący gen rekombinazy Cre do zakażenia pierwotnych embrionalnych fibroblastów myszy posiadających floxowany allel Rac1.

Genetyczne usuwanie cząsteczek sygnałowych w hodowanych pierwotnych fibroblastach embrionalnych myszy za pomocą adenowirusów

W niniejszej pracy opisujemy metody konstruowania, wizualizacji i kwantyfikacji reakcji bioluminescencyjnych enzymów lucyferazy świetlikowej oraz renilla, wykazujących ekspresję w komórkach przerzutowego raka piersi podczas ich wzrostu i przerzutowania in vivo.

In vivo dwusubstratowe obrazowanie bioluminescencyjne

Opisano test do ilościowego pomiaru inwazji indukowanej przez czynnik wzrostu transformującego (TGF)-β w trójwymiarowych żelach kolagenowych. Test ten wykorzystuje serię linii komórkowych MCF10A, które reprezentują różne stadia rozwoju raka piersi. Metodę tę można dostosować do użytku z innymi liniami komórkowymi oraz wykorzystać do badania innych potencjalnych aktywatorów lub inhibitorów inwazji.

Test sferoidów do pomiaru inwazji indukowanej przez TGF-β

Source: Chen, H. et. al. Live Cell Imaging of the TGF-β/Smad3 Signaling Pathway In Vitro and In Vivo Using an Adenovirus Reporter System. J. Vis. Exp. (2018)This video demonstrates the preparation of luciferase-expressing breast cancer cells using recombinant adenoviruses for in vivo imaging.

Preparation of Reporter-Expressing Cancer Cells for In Vivo Imaging

Opisujemy metodę eksperymentów ratujących zubożenie, która zachowuje integralność komórkową i homeostazę białek. Adenofection umożliwia analizę funkcjonalną białek w procesach biologicznych, które opierają się na precyzyjnie dostrojonej dynamice opartej na aktynie, takiej jak mitotyczny podział komórek i miogeneza, na poziomie pojedynczej komórki.

Adenofekcja: metoda badania roli molekularnych białek opiekuńczych w morfodynamice komórkowej za pomocą eksperymentów depletion-rescue

Śledzenie na żywo poszczególnych komórek progenitorowych siatkówki WT w różnych tłach genetycznych pozwala na ocenę udziału nieautonomicznej sygnalizacji komórek podczas neurogenezy. W tym celu wykorzystano kombinację knockdownu genów, generowania chimer poprzez przeszczep zarodka i poklatkowego obrazowania konfokalnego in vivo.

In vivo (in vivo)Obrazowanie ekspresji genów transgenicznych w poszczególnych progenitorach siatkówki w chimerycznych zarodkach danio pręgowanego w celu zbadania nieautonomicznych wpływów komórek

Opisano protokół indukcji in vitro przejścia śródbłonkowo-mezenchymalnego (EndMT), który jest przydatny do badania szlaków sygnalizacji komórkowej związanych z EndMT. W tym modelu eksperymentalnym EndMT jest indukowany przez leczenie TGF-β w komórkach śródbłonka MS-1.

Analiza molekularna przejścia śródbłonkowo-mezenchymalnego wywołanego sygnalizacją transformacji czynnika wzrostu β

Zmiany morfologiczne występują w komórkach fibroblastów reagujących immunologicznie po aktywacji i sprzyjają zmianom w rekrutacji komórek. Wykorzystanie obrazowania 2-fotonowego w połączeniu z genetycznie modyfikowanym białkiem 1 specyficznym dla fibroblastów (FSP1)-cre; Linia myszy tdTomato floxed-stop-floxed (TB / TB) i zielony fluorescencyjnie oznaczony lipopolisacharyd-FITC, możemy zilustrować wysoce specyficzny wychwyt lipopolisacharydu w fibroblastach skóry i zmiany morfologiczne in vivo.

Dwukolorowe obrazowanie 2-fotonowe in vivo genetycznie znakowanych komórek reporterowych w skórze

Opisujemy systematyczny proces badania sygnalizacji TGF-β i EMT indukowanego przez TGF-β, badając ekspresję białek i genów zaangażowanych w ten szlak sygnałowy. Metody obejmują Western blotting, test reporterowy lucyferazy, qPCR i barwienie immunofluorescencyjne.

Badanie sygnalizacji TGF-β i indukowanego przez TGF-β przejścia nabłonkowego do mezenchymalnego w raku piersi i prawidłowych komórkach

Tutaj ustalamy protokół jednoczesnej wizualizacji i analizy wielu kompleksów SMAD za pomocą testu ligacji zbliżeniowej (PLA) w komórkach śródbłonka narażonych na patologiczne i fizjologiczne warunki stresu ścinającego płyny.

Wizualizacja i kwantyfikacja sygnalizacji TGFβ/BMP/SMAD w różnych warunkach naprężeń ścinających płyn przy użyciu testu podligowania zbliżeniowego

Poznaj metodę obrazowania żywych komórek szlaku TGF-β/Smad3 przy użyciu systemu reporterowego adenowirusa. Technika umożliwia nieinwazyjne śledzenie sygnałowania komórkowego w czasie rzeczywistym in vitro i in vivo.

Obrazowanie żywych komórek szlaku sygnałowego TGF-β/Smad3 in vitro i in vivo przy użyciu systemu reporterowego adenowirusa

Przeglądaj więcej filmów